MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie
Srážlivost krve a trombolýza se zaměřením na cévní mozkovou příhodu Diplomová práce
Diana Lamborová
Vedoucí práce: Mgr. Andrea Vítečková Wünschová, Ph.D.
Brno 2016
Bibliografický záznam
Autor:
Bc. Diana Lamborová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie
Název práce:
Srážlivost krve a trombolýza se zaměřením na cévní mozkovou příhodu
Studijní program:
Biochemie
Studijní obor:
Analytická biochemie
Vedoucí práce:
Mgr. Andrea Vítečková Wünschová, Ph.D.
Akademický rok:
2015/2016
Počet stran:
X + 49
Klíčová slova:
cévní
mozková
příhoda,
rtPA,
intravenózní
trombolýza, intraarteriální trombolýza, rekanalizace
Bibliographic Entry
Author:
Bc. Diana Lamborová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry
Title of Thesis:
A blood coagulation and thrombolysis focused on the stroke
Degree Programme:
Biochemistry
Field of Study:
Analytical biochemistry
Supervisor:
Mgr. Andrea Vítečková Wünschová, Ph.D.
Academic Year:
2015/2016
Number of Pages:
X + 49
Keywords:
stoke, rtPA, intravenous thrombolysis, intraarterial thrombolysis, recanalization
Abstrakt Cévní mozková příhoda je celosvětově třetí nejčastější příčinou úmrtí i invalidity a počet nemocných se neustále zvyšuje. Nejpoužívanějším způsobem léčby cévní mozkové příhody je trombolytická terapie. Tato terapie má svá omezení, jako je krátké léčebné okno a nízká rekanalizační účinnost. Proto je nutné vyvíjet nové léčebné postupy pro zvýšení efektivity léčby cévní mozkové příhody. Na začátku vývoje jsou využívány in vitro studie. V případě cévní mozkové příhody zejména ischemického typu jsou připravovány in vitro modely. Tyto modely do různé míry simulují situaci in vivo. Vývoj nových způsobu léčby probíhá nejvíce pomocí in vitro studií. Tyto studie mnohdy využívají in vitro modely, které napomáhají simulovat situaci in vivo a testovat tak účinnost nových terapeutik nebo technik napomáhající trombolýze. Tato diplomová práce se v teoretické části zabývá mechanizmem a patofyziologií srážení krve se zaměřením na cévní mozkovou příhodu zejména ischemického typu. Práce je dále zaměřena na možnosti terapie a studium nových léčebných způsobů in vitro a in vivo. Experimentální část práce je zacílena na studium trombolytického účinku klinicky užívaného trombolytika alteplázy a vlivu nízkofrekvenčních vibrací s využitím in vitro modelů.
VI
Abstract Stroke is the world's third leading cause of death and disability and the number of patients is increasing. The most widely used treatment for stroke is thrombolytic therapy. This therapy has its limitations, such as short therapeutic window and low recanalization efficacy. It is therefore necessary to develop new therapies to enhance the effectiveness of treatment of stroke. At the beginning of the development in vitro studies are used. In the case of stroke, in vitro models are particularly prepared for studying the ischemic type of stroke. These models in varying degrees simulate the in vivo situation. Development of new treatments is mostly runs by in vitro studies. These studies often used in vitro models, that simulate the in vivo situation and test the efficacy of new therapeutics or techniques enhancing thrombolysis. The theorethical part of this thesis is concerned with the mechanism and pathophysiology of blood clotting focusing on stroke, especially ischemic type. This part is also focused on the possibilities of therapy and study of new treatment methods in vitro and in vivo. The experimental part of this thesis is aimed at studying the thrombolytic effect of clinically used thrombolytic agent alteplase and the impact of low-frequency vibrations using in vitro models.
VII
Poděkování: Chtěla bych velmi poděkovat vedoucí mojí diplomové práce Mgr. Andrei Vítečkové Wünschové, Ph.D. za praktickou pomoc, cenné rady a trpělivost při zpracování celé diplomové práce. Dále patří mé poděkování Mgr. Janu Vítečkovi, Ph.D. za pomoc a spolupráci při výrobě silikonových čipů, Lence Vítečkové za odběry krve a také studentkám Bc. Sandře Thalerové a Lucii Šupolíkové za pomoc a asistenci při provádění in vitro trombolytických experimentů.
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Andrei Vítečkové Wünschové, Ph.D. a všechny zdroje informací a dat jsou v práci uvedeny.
V Brně dne:
………………………………… Diana Lamborová VIII
Obsah
1. Úvod ........................................................................................................................ 1 2. Fyziologie poruch hemostázy .................................................................................. 3 2.1. Složky hemostázy ............................................................................................. 3 2.2. Primární hemostáza ........................................................................................... 6 2.3. Plazmatický koagulační a fibrinolytický systém ............................................... 7 2.4. Systémy inhibitorů hemostázy...........................................................................11 2.5. Patofyziologie hemostázy ................................................................................. 12 3. Cerebrovaskulární choroby...................................................................................... 14 3.1. Cévní mozková příhoda .................................................................................... 14 3.2. Rozdělení cévních mozkových příhod ............................................................. 15 3.2.1. Rozdělení podle mechanizmu vzniku (etiologie) .................................. 16 3.2.2. Rozdělení podle lokalizace .................................................................... 16 3.2.3. Rozdělení podle doby trvání příznaků ................................................... 18 3.3. Patofyziologie ischemické cévní mozkové příhody ......................................... 19 3.4. Epidemiologie cévní mozkové příhody v České republice .............................. 21 4. Terapeutické možnosti akutní ischemické cévní mozkové příhody ........................ 22 4.1. Metody rekanalizace uzavřené cévy ................................................................. 22 4.1.1. Farmakologická trombolýza ................................................................. 22 4.1.2. Mechanické metody rekanalizace .......................................................... 26 5. Studium trombolýzy u akutní ischemické mozkové příhody .................................. 28 5.1.In vitro modely .................................................................................................. 28 5.1.1. Statické modely ..................................................................................... 29 5.1.2. Průtokové modely .................................................................................. 32 6. In vivo studie ischemické cévní mozkové příhody .................................................. 35 6.1. Preklinické studie na animálních modelech ..................................................... 35 6.2. Klinické studie ................................................................................................. 38 7. Seznam odborné literatury ....................................................................................... 40 Příloha I
IX
Seznam použitých zkratek AT
antitrombin
CS
chitosan
ECASS
European Cooperative Acute Stroke Study
FDA
Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration)
FDP
fibrin degradační produkty
GRGD
adhezivní peptid (glycin-arginin-glycin-kyselina asparagová)
IA
intraarteriální, intraarteriálně
IV
intravenózní, intravenózně
iCMP
ischemická cévní mozková příhoda
IMS
International Management of Stroke Trial
IU
jednotky enzymové aktivity (International Unit)
MERCI
Mechanical Embolus Removal in Cerebral Ischemia
MRI
magnetická rezonance (Magnetic Resonance Imaging)
NINDS
The National Institute of Neurological Disorders and Stroke
PAI I
inhibitor aktivátoru plazminogenu I
PLGA
poly-ε-kaprolakton
RECANALISE
Recanalisation Using Combined Intravenous Alteplase and Neuroiterventional Algortihm for Acute Ischemic Stroke
ROS
kyslíkové radikály (reactive oxygen species)
rtPA
rekombinantní tkáňový aktivátor plazminogenu
SIST-MOST
Safe Implementation of Treatments in Stroke Monitoring Study
sPA
streptokináza
STAT
The Stroke Treatment with Ancrod Trial
TIA
tranzistorní ischemická ataka
TOAST
Trial of ORG 10172 in Acute Stroke Treatment
tPA
tkáňový aktivátor plazminogenu
uPA
urokináza (urokinase-type plasminogen activator)
TF
tkáňový faktor
vWF
von Willebrandův faktor
X
1. Úvod Cévní mozková příhoda (CMP) neboli iktus je celosvětově třetí nejčastější příčinou úmrtí, způsobující zhruba jedno úmrtí z deseti [1, 2, 3]. V důsledku stárnutím populace se rovněž zvyšuje počet úmrtí na CMP [4, 5]. Od roku 1990 do roku 2010 se celkový počet případů CMP zdvojnásobil. Celosvětově dochází k nárůstu celkového počtu úmrtí za rok – v roce 2000 byl odhad úmrtí 4,5 milionů [4] za rok 2015 byl počet stanoven již na 5,9 milionů úmrtí následkem CMP nebo jiných onemocnění spojených s CMP. Přestože se ve vysoce vyspělých zemích daří díky primární prevenci předcházet mnoha případům a snižovat tak jejich počet, incidence ve středně rozvinutých a rozvojových státech se stále zvyšuje [6]. Dvě třetiny z celkového počtu pacientů umírajících v důsledku CMP pochází právě z rozvojových zemí [4]. V mnoha zemích je toto onemocnění rovněž nejčastějším původcem invalidit dospělých [4, 7]. Přibližně 10-15 % nemocných následkem iktu umírá během prvních dvou týdnů, do půl roku umírá dalších 30 %. Kolem 40 % přeživších pacientů zůstává díky reziduálnímu neurologickému deficitu trvale invalidizováno a stávají se závislými na pomoci druhé osoby [2, 7]. V České republice se dokonce úmrtnost v případě CMP zvyšuje rychleji než úmrtnost na ischemickou chorobu srdeční [8]. CMP však nelze považovat pouze za nemoc starších lidí, v posledních letech dochází k nárůstu incidence CMP i u mladších dospělých pacientů, tj. mezi 30. a 40. rokem života [3, 6]. Poruchy mozku mimo jiné patří mezi extrémně drahá onemocnění a představují velkou socioekonomickou zátěž [4, 8]. V České republice číní náklady spojené s těmito onemocněními více než 6 % hrubého národního produktu, každý obyvatel ČR na ně ročně vynakládá více než 24 tisíc Kč [8]. Co se týče Evropy, náklady spojené s poruchami mozku činí 35 % nákladů na všechny choroby. A nejnákladnější skupinou všech poruch mozku jsou CMP [9]. To vše je důvodem, proč se jednou z priorit světového medicínského výzkumu stalo studium právě CMP. Díky předpokladu neustále se zvyšující incidence CMP se očekává, že se v budoucnu stane toto onemocnění hlavním problémem veřejného zdravotnictví. Proto je potřeba zvýšené pozornosti a větší zaměřenosti nejen klinických studií právě na toto onemocnění [10].
1
Součástí experimentálních i klinických studií zaměřených na CMP je vývoj nových terapeutik, zejména vývoj nových trombolytik nebo antiagregačních léčiv. Od 90. let minulého století se začaly vyvíjet in vivo a postupně i in vitro studie. In vivo studie byly zaměřeny na pozorování trombolýzy uvnitř savčích anatomických modelů, jako je králík, pes, krysa nebo prase [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24]. Z ekonomického i etického hlediska bylo postupně od těchto in vivo anatomických modelů upuštěno a došlo k vývoji nových in vitro modelů [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32]. Tyto modely slouží k jednodušší simulaci CMP uvnitř anatomicky relevantního systému pro studium trombolýzy, a také k redukci počtu laboratorních zvířat. V posledních letech také dochází k vývoji nových technik a přístrojů na bázi nanočástic [31], sondačních [27, 28, 29] a vibračních zařízení [31], které by sloužily k rychlejší a bezpečnější léčbě CMP.
2
2. Fyziologie a poruchy hemostázy Udržení krve v tekutém stavu je zcela nezbytnou potřebou pro zachování integrity a funkční rovnováhy každého živého organismu [33, 34, 35]. Pokud není v organismu cévní systém porušen, zůstává tok krve nedotčen [33, 36]. V krvi se nachází plazmatické a buněčné komponenty, které se podílí na udržení jejího tekutého stavu [36]. Pokud dojde k poškození cév, probíhá aktivace hemostatických procesů. Tyto procesy vedou k uzavření poranění a následně k zahojení a zacelení rány [33]. Hemostáza zahrnuje několik mechanizmů, do kterých patří primární hemostáza, plazmatický koagulační systém, fibrinolytický systém a inhibitory krevního srážení a fibrinolýzy [33, 35, 37].
2.1. Složky hemostázy Schopnost krevního srážení neboli hemostáza je velmi důležitý proces pro zachování integrity celého oběhového systému [33]. Hemostáza hraje v oragnizmu dvě významné role – udržení tekutého stavu a toku krve v cévách (zabránění intravaskulární trombotizace) a ochrana před krvácením způsobeným poraněním cévy [35, 37]. Jde o velmi komplexní proces, ve kterém je zapojeno mnoho komponent a mechanismů vedoucí k zástavě krvácení. Tento velmi složitý mechanismus zahrnuje řadu pozitivních a negativních zpětných vazeb [33, 34, 36]. Obecně lze tyto procesy, které zabraňují krvácení během narušení cévní stěny, rozdělit do pěti po sobě jdoucích kroků:
Reakce cévní stěny (vazokonstrikce, tvá zlomky sekund)
Adheze a aktivace krevních destiček (trvá desetiny až jednotky sekund)
Agregace krevních destiček a tvorba primární fibrinové zátky (sekundy až minuty)
Hemokoaguace -
Aktivace koagulačních faktorů (trvá sekundy až minuty)
-
Tvroba stabilního fibrinového koagula (trvá několik minut) [34, 35, 38]
Podle velikosti a závažnosti poranění se odvíjí reakce těchto pěti složek [35]. Během celého procesu hemostázy dochází ke spuštění komplexních biochemických reakčních kaskád, které vedou k přeměně tekuté krve na krevní sraženinu – krevní trombus. Trombus je po nějaké době rozpuštěn a dochází k úplnému obnovení průtoku krve. Pokud není proces hemostázy ovlivněn nějakými patologickými stavy, hemostatická rovnováha zůstává zachována [33]. 3
Do procesu hemostázy je zapojeno několik složek – cevní stěna (endotel a subendotelové struktury), tkáňová složka (tkáňový faktor uvolněný z porušené tkáně), krevní destičky a plazmatický koagulační systém [34, 35, 36, 38]. Pro udržení krve v tekutém stavu je zapotřebí, aby neustále docházelo k interakcím mezi specifickými proteiny a adhezivními molekulami [34, 36]. Tyto proteiny a adhezivní molekuly se nachází uvnitř cirkulující krve nebo jsou navázány na povrchu buněk. Pokud je systém narušen, probíhá aktivace hemokoagulačních procesů končící fibrinolýzou a obnovením cévy. I mezi těmito procesy musí neustále probíhat rovnováha. V opačném případě – pokud není stav mezi prokoagulačními, inhibičními a fibrinolytickými procesy v rovnováze,
dochází
ke
krevnímu
srážení
(trombóza)
nebo
k nežádoucím
krvácení [33, 34].
Endoteliální buňky V procesu hemostázy je hlavní úlohou cévní stěny kontrola protrombotických dějů (v případě poškození cévy) a udržování fluidity krve [33, 35]. Pokud dochází k narušení cévní stěny, tak dochází k několika obranným mechanizmům. Mezi tyto mechanizmy patří – vazokonstrikce (stažení cévy), interakce složek jednotlivých systémů hemostázy a produkce látek důležitých pro zástavu krvácení (faktory a inhibitory hemokoagulace) [33, 35, 39]. Vazokonstrikce je dočasný a krátkodobý proces (t < 1 min) reflexního smrštění cévní stěny, který je navozen prostřednictvím sympatického nervového systému [35, 37]. Dochází zde k zúžení průsvitu cévy pomocí hladké svaloviny a elastických vláken ve střední vrstvě [33, 35]. Délka trvání reflexního smrštění je prodloužena pomocí serotoninu a fibrinopeptidu B. Serotonin se tvoří z tromboxanu A2 (T A2), fibrinopeptid B zvniká z fibrinogenu po štěpení trombinem [35, 39]. Díky vazokonstrikci probíhá také aktivace
ostatních
systémů,
dochází
především
k tvorbě
primární
(destičkové)
hemostatické zátky v oblasti porušené subendotelové pojivové tkáně v cévní stěně [33, 35, 39]. Tato primární destičková zátka je zpevněna pomocí kolagenu, endoteliálních buněk, krevních destiček a jejich glykoproteinových vazebných míst a von Willebrandova faktoru (vWF) [39]. Endoteliální buňky mají v procesu hemostázy dva účniky – aktivační a inhibiční. Během aktivace jsou buňky zapojeny v procesu zvaném primární hemostáza, během kterého dochází k agregaci krevních destiček [33]. Endoteliální buňky produkují vWF, který je uskladňován ve Wiebelových-Paladeho tělískách. Tento faktor má vliv na adhezi destiček a syntézu vazoaktivních enzymů [35]. Inhibiční účinek endoteliálních buněk 4
spočívá v udržení krevních destiček v intaktním stavu a zabránění jejich adhezi na cévní stěnu. Proti aktivaci destiček fungují endoteliální buňky více způsoby:
Tvoří bariéru mezi krví a tkáněmi – dochází k oddělení vysoce trombogenní subendoteliální vrstvy (kolagen typu III) od krevní cirkulace [33].
Nesou na svém povrchu negativní náboj – trombocyty také nesou negativní náboj, proto nemohou k endotelu přilnout [33].
Syntetizují prostacyklin – ten stimuluje tvorbu cAMP a tím jsou destičky stabilizovány [33, 35].
Uvolňují NO – NO ovlivňuje tvorbu cGMP [33, 35]. NO s prostacyklinem mají vliv na změnu průsvitu cévy [34].
Produkují endonukleázy (CD39/ADPáza) – tyto enzymy přeměňují ADP na neaktivní AMP [33, 35].
Dalším antagonistickým efektem endoteliálních buněk v hemostáze je produkce fibrinolytických enzymů alteplázy (tkáňový aktivátor plazminogenu, tPA) a urokinázy (urokinázový aktivátor plazminogenu, uPA) [34, 35, 39]. Endoteliální buňky mají na membránových receptorech navázán trombomodulin, který má rovněž antikoagulační aktivitu [33]. Trombomodulin váže trombin, který aktivuje protein C. Protein C tvoří komplex s proteinem S, a tím dochází k inaktivaci faktoru Va a VIIIa [35]. Buňky endotelu dále produkují heparansulfáty a další proteoglykany, které pozitivně ovlivňují aktivaci antitrombinu [33, 34, 35].
Tkáňová složka Poraněná část tkáně a okolní subendotelové buňky produkují a uvolňují ADP. ADP indukuje primární agregaci krevních destiček [33]. Buňky při poranění sekretují také tkáňový faktor (TF), který hraje významnou úlohu v aktivaci koagulační kaskády, kdy dochází k přeměně enzymu protrombinu na trombin [33, 40].
Krevní destičky Krevní destičky hrají při poškození cévní stěny významnou roli. V bezprostřední oblasti subendotelových buněk dochází k agregaci destiček. Subendotelové buňky produkují trombin, který indukuje shlukování krvinek a tvorbu nerozpustného fibrinu [33, 35]. Tento mechanizmus se nazývá primární hemostáza. Krevní destičky umožňují řadu interakcí mezi krví a cévní stěnou [33]. Plazmatická membrána tvořená fosfolipidy poskytuje vazebné místo pro Ca2+ ionty, na které se vážou koagulační faktory závislé 5
na vitaminu K. Krevní destičky také specificky interagují s faktory VIII a V, dále aktivují faktory XII a XI [33, 35]. Během aktivace krevních destiček dochází k expozici aktivovaných receptorů, např. selektinu (CD-62). Konkrétně p-selektin je uvolňován α-granulemi uvnitř destiček a po uvolnění se stává součástí membrány nebo je část p-selektinu uvolněna do krve. P-selektin je považován za receptor umožňující navázání leukocytů [33].
Adhezivní proteiny Jakmile dojde k vazbě bílých krvinek na krevní destičky, dochází k uvolňování adhezivních proteinů spolu s některými cytokiny. Mezi adhezivní proteiny patří fibronektin, trombospondin, tenascin a osteonektin.Tyto látky dále zprostředkovávají interakci mezi endoteliálními buňkami a bílými krvinkami, hlavně s granulocyty. Tato vazba vede v případě granulocytů k jejich rolování po endoteliální vrstvě, k adhezi a migraci do tkání [33].
2.2. Primární hemostáza Primární hemostáza je děj, při kterém dochází agregací krevních destiček k tvorbě primární hemostatické zátky [33]. Tato zátka slouží k uzavření poraněného místa cévní stěny a k zastavení krvácení. Primární hemostáza je spuštěna defektem endotelu cévy, při kterém dochází ke kontaktu mezi krví a endotelovými strukturami, jako je kolagen, fibronektin a vWF [33, 35]. Aktivace destiček probíhá přes kontakt mezi destičkami a obnaženým kolagenem cévní stěny, účinkem ADP nebo účinkem trombinu. Při aktivaci destičky se tvoří výběžky, které umožní jejich vzájemné propojení [7]. Během celého procesu dochází k adhezi krevních destiček, která je zprostředkována vazbou kolagenu na specifické glykoproteinové receptory (integriny) na povrchu membrány destiček [35]. Vazbu mezi kolagenem a krevními destičkami zprostředkovávají také bivalentní adhezivní proteiny -
fibronektin a vWF, který po vazbě na kolagen prochází konformačními
změnami, které umožňují jeho vazbu na destičkový receptor. Díky adhezi dochází u krevních destiček ke změně tvaru – v neaktivním stavu mají destičky oválný diskoidní tvar, po adhezi na kolagen dochází k aktivaci a změně tvaru na kulovitý tvar s pseudopodiemi prostřednictvím cytoskeletálního kontraktilního aparátu [33, 35]. Po adhezi destiček dochází k aktivaci a změně tvaru receptorů na jejich povrchu, která spouští další biochemické a metabolické pochody. Během aktivace nedochází pouze ke změně tvaru, ale také k hromadění destičkových α-granul a denzních tělísek [33, 35]. 6
Látky, které jsou uvnitř α-granul a denzních tělísek podporují pozitivně zpětnovazebně agregaci a adhezi dalších destiček [33]. Obsah α-granul a tělísek je uvolněn, pokud dojde k vazbě agonistů, jako je ADP, adrenalin (epinefrin), trombin nebo kolagen. Denzní tělíska uvolňují Ca2+ ionty, serotonin a ADP, které podporují probíhající agregaci. Α-granula obsahují destičkový faktor 3, β-trombomodulin, destičkový růstový faktor, trombospondin, faktor V, fibrinogen a IgG. ADP a adrenalin ve spolupráci s prostaglandinem (T A2) spouští uvolnění granulárního obsahu [35]. Postupně dochází ke změně tvaru destiček, k aktivaci a změně tvaru receptorů a k vzájemnému spojení destiček pomocí bivalentních proteinů. Agregace destiček se dělí na primární a sekundární. Primární agregace je vyvolána uvolněním ADP z buněk a tkání a vyvolává tvorbu nestabilního trombocytárního agregátu. Při sekundární agregaci dochází k uvolňování dalších proagregačních látek (ADP, TXA) a trombospondinu, které vytváří můstky mezi destičkami, a tím se trombocytární agregát stabilizuje – agregace je již nevratná. Proagregační látky aktivují další destičky, tím dochází k posílení celého děje, který končí tvorbou tzv. bílého trombu (destičkové zátky). Tento trombus se dál postupně zvětšuje a stává se hlavním hemostatickým činitelem [33].
2.3. Plazmatický koagulační a fibrinolytický systém Plazmatický koagulační systém Plazmatický koagulační systém zahrnuje několik po sobě jdoucích enzymových procesů, které vedou ke vzniku nerozpustného fibrinu [33, 37]. Během celého procesu probíhá přeměna fibrinogenu na fibrinové monomery, které polymerují za vzniku polymeru fibrinu. Fibrin vytváří vláknitou síť, do které se postupně zachycují krevní buňky a tak dochází k formaci stabilní fibrinové zátky [33]. Krevní zátka je nakonec tvořena červenými krvinkami, krevními destičkami navázanými na fibrinovou síť upevněnou k vrstvě subendotelových buněk [39]. Do plazmatického koagulačního systému patří několik koagulačních faktorů. Jednotlivé faktory jsou označeny římskými číslicemi přiřazenými podle časové posloupnosti jejich objevení (viz tab. č. I) [33, 35].
7
Tab. č. I: Seznam faktorů plazmatického koagulačního systému s názvy a přiřazenými čísly na základě časové posloupnosti jejich objevení: Č. faktoru
Název
FI
Fibrinogen
F II
Protrombin
F III
Tkáňový tromboplastin (tkáňový faktor, TF)
F IV
Ca2+ ionty
FV
Proakcelerin
F VII
Prokonvertin
F VIII
Antihemofilický faktor a
F IX
Antihemofilický faktor b (christmas faktor)
FX
Stuartův-Prowerové faktor (trombokináza)
F XI
Antihemofilický faktor c (rosenthalův faktor)
F XII
Hagemanův faktor
F XIII
Fibrin stabilizující faktor
Za faktor VI byl považován aktivovaný faktor V, nyní se již neuvádí. U většiny faktorů se jedná převážně o glykoproteiny patřící mezi proenzymy a kofaktory. Faktor I slouží jako substrát pro trombin, který jej štěpí. Faktor II, VII, IX, X, XI,
XII
a prekalikrein fungují po proteolytickém štěpení jako serinové proteázy (mají v aktivním místě serin). Faktor V a VIII se po štěpení stávají součástí koagulačně aktivních komplexů a chovají se jako kofaktory [33]. V průběhu krevního srážení u nich dochází ke strukturálním změnám. Většina z nich je tvořena v játrech, pro syntézu určitých faktorů (F II, VII, IX, X, XI a XII) je zapotřebí vitamin K [33, 35]. Játra jsou proto orgánem hrající v procesu hemostázy ústřední roli [35]. Mimo faktory I a II se ostatní zástupci nachází v plazmě ve velmi nízkých koncentracích [33]. Většina z faktorů je v plazmě přítomna ve formě neaktivního proenzymu (koenzymu). Pro vznik koagulačně aktivních enzymů je zapotřebí proteolytického štěpení, které způsobuje vznik aktivních forem enzymů. Enzymy poté působí jako další aktivátory a účastní se dalších aktivačních procesů koagulační kaskády [36]. Pouze v přápadě faktoru VIIa jde o vyjímku – cirkuluje v plazmě v neaktivní i v aktivní formě. Pokud se faktory vyskytují ve velmi nízkých koncentracích, nebo je jejich aktivita nedostačující, dochází ke krvácivým projevům [33].
8
Trombin je jako výsledný produkt všech koagulačních reakcí naprosto klíčovým enzymem – proteinázou, která způsobuje konverzi fibrinogen na nerozpustnou fibrinovou síť [36]. Přeměna neaktivního protrombinu na trombin může probíhat dvěma způsoby – vnější a vnitřní cestou [33, 35, 38, 39]. U vnější cesty dochází k narušení cévy, kdy přichází krev do kontaktu s okolní tkání, dochází zde ke styku s tkáňovým faktorem (TF) [39]. Naopak vnitřní cesta aktivace protrombinu probíhá většinou bez narušení integrity cév a je spuštěna kontaktem trombinu se subendotelovými buňkami [33]. Vnější cesta aktivace protrombinu: Pokud dojde k poranění cévní stěny, přichází krev do kontaktu s okolní tkání. Subendotelové buňky nesou na svém povrchu TF, který při styku s krví spouští vnější systém aktivace [33, 35, 40]. Dochází zde k vazbě TF s faktorem VIIa, který se volně nachází v plazmě [33, 35, 37, 39]. Touto vazbou vzniká koagulačně aktivní komplex TF+VIIa, který v přítomnosti Ca2+ iontů aktivuje faktor Xa (vnější tenáza) [33, 35]. Aktivace dalších molekul faktoru VII se zpětně spouští aktivovaným faktorem Xa, čímž dochází k aktivaci dalších molekul faktoru X pomocí aktivního komplexu TF+VIIa [35]. Faktor Xa dále ve spolupráci s faktorem Va vstupuje do komplexu protrombokinázy a způsobuje finální přeměnu protrombinu (faktor II) na trombin. Vytvořený trombin stimuluje přes pozitivní zpětnou vazbu aktivitu krevních destiček, což vyvrcholí masivní produkcí trombinu [39]. Trombin nakonec štěpí fibrinogen na fibrinové monomery, které polymerují. Tento fibrinový polymer je na konci stabilizován faktorem XIIIa (rovněž
aktivovaný trombinem) a umožňuje
tak vznik
nerozpustného fibrinu
[33, 36, 37, 39]. Vnitří cesta aktivace protrombinu: Vnitřní cesta aktivace je spuštěna v okamžiku, kdy se krev setká se subendoteliálními buňkami nesoucí negativní náboj [33]. V první fázi probíhá aktivace faktoru XII na XIIa díky štěpená proteolytického enzymu uvolněného z endotelových buněk. Faktor XIIa přeměňuje v malém množství prekallikrein na kallikrein, který zpětně aktivuje molekuly faktoru XII na XIIa [35, 37]. Faktor XIIa dále aktivuje faktory XI a IX. Tyto aktivace způsobí amplifikaci celé reakční kaskády a dochází k aktivaci dalších faktorů – faktoru V a faktoru VIII. Aktivovaný faktor F VIIIa tvoří spolu s aktivovaným faktorem IXa tenázu (vnitřní), která produkuje velké množství faktoru Xa [33, 35]. Faktor Xa s faktorem Va představují komplex protrombokinázy, který štěpí protrombin na trombin. 9
Dál funguje reakční kaskáda stejně jako v případě vnější cesty aktivace – trombin lyzuje fibrinogen na fibrinové monomery, poté dochází k jejich polymeraci a stabilizaci přes aktivovaný faktor XIIIa [33, 36]. Trombin je hlavní regulačním faktorem celého procesu koagulace [36]. V raných fázích koagulační reakční kaskády funguje trombin přes pozitivní zpětnou vazbu[39] – umožňuje průběh aktivačních reakcí díky aktivaci kofaktorů a faktoru XI, který je nezbytný pro počáteční fáze koagulace. Později však hraje roli ve formě negativní zpětné vazby díky jeho interakci s trombomodulinem a aktivaci proteinu C v přítomnosti proteinu S, které se podílí na proteolytické inaktivaci faktorů V a VIII. Inaktivace těchto faktorů dále vedou k útlumu reakcí vedoucí k tvorbě trombinu [36, 39]. Fibrinolytický systém: Fibrinolytický systém je enzymový komplex, který udržuje hemostatickou rovnováhu a hraje podstatnou úlohu v degradaci
fibrinového koagula.
Pokud
se v organizmu vyskytuje fibrinové koagulum nebo fibrinová vlákna, ihned dochází k aktivaci fibrinolytického systému [33, 35]. Funkcí tohoto systému je také rozpouštění kolagenu, dál má vliv na angiogenezi a ovlivňuje metastázy tumoru [33]. Také se podílí na obnově tkání během zánětu, ovulace, nidace a má vliv na funkci makrofágů [35]. Součástí fibrinolytického systému je plazminogen, plazmin, jejich aktivátory, inhibitory aktivátorů a antiplazminy [33,35, 39]. Plazminogen je proenzymem serinové protézy plazminu a díky aktivátorům dochází k jeho přeměně [33, 35]. Nejdůležitějším substrátem pro aktivaci plazminu je fibrin, který zde hraje roli kofaktoru přeměny plazminogenu na plazmin [33, 35, 38]. Na začátku dochází k vazbě mezi plazminogenem a fibrinovou sítí. Aktivátory potřebné pro přeměnu plazminogenu na plazmin jsou uvolňovány endotelovými buňkami [33, 38]. Dochází k formaci ternárního komplexu mezi lyzinovými zbytky na C-řetězci fibrinu, plazminogenem a tPA. Tímto způsobem dochází k efektivní přeměně plazminogenu na aktivní plazmin [33, 35]. Vzniklý plazmin proteolyticky štěpí nejen fibrinové polymery na jednotlivé fragmenty – tzv. fibrin degradační produkty (FDP), jeho působením dochází také k odstranění faktoru V, VIII a vWF [35, 38]. FDP obsahují lyzinové zbytky obsahující koncové karboxylové řetěze, které způsobem pozitivní zpětné vazby zvyšují tvorbu plazminu a účinnost fibrinolýzy díky interakcím s dalšími molekulami plazminogenu a tPA [33]. FDP jsou skupinou fragmentů, které se nacházejí v krevní cirkulaci v různém degradačním stupni – tyto fragmenty jsou označeny jako fragment D, E, X a Y. Fragmenty D a E jsou terminálními peptidy, u kterých už nedochází k další lýzi. Zatímco fragment X a Y jsou meziprodukty, 10
které mohou být rozloženy až na fragmenty D a E [33, 35]. FDP jsou obvykle odstraněny retikuloendotelovým systémem. Pokud se FDP nachází v krvi ve vysokých koncentracích, dochází k inhibici vazeb fibrinogenových monomerů a k zamezení tvorby fibrinu i agregace destiček [35]. Samotný plazmin jen nakonec degradován antiplazminy v krevní cirkulaci [33]. Tvorba plazminu probíhá pouze na povrchu fibrinového koagula. Díky zvýšené afinitě plazminogenu a tPA k fibrinu je zamezena možnost lýze fibrinogenu. Aktivátory plazminogenu jsou vnitřní a vnější. Mezi vnitřní aktivátory patří komponenty krevní plazmy, jako je faktor XII, prekalikrein, HMWK, trombin a trypsin. Mezi vnější aktivátory se řadí látky pocházející z míst mimo krevní oběh – tPA, uPA a faktor XIIa [33].
2.4. Systémy inhibitorů hemostázy Mezi aktivací a inhibicí koagulace musí neustále probíhat rovnováha. Pokud je tato rovnováha narušena, dochází ke krvácení nebo k tromboembolickým komplikacím [33, 35], které mohou vést až k smrti [33]. Do základního regulačního systému hemokoagulace patří inhibitory krevního srážení [33, 35]. Na udržování hemokoagulační rovnováhy se podílí několik mechanizmů, zejména to jsou fyziologické inhibitory koagulačního a fibrinolytického systému. Jsou to enzymy přirozeně se vyskytující v krvi, jejichž hlavním účinkem je inhibice aktivních složek koagulačního a fibrinolytického systému [33, 37]. Inhibitory fibrinolýzy přímo inhibují plazmin (tj. antiplazminy) nebo inhibují aktivátory plazminogenu [35]. Pokud je koncentrace hemostatických inhibitorů příliš nízká nebo dochází k funkčním abnormalitám, mohou tyto patologie vést ke vzniku trombózy. Inhibitory se dají rozdělit na inhibitory plazmatického koagulačního systému a inhibitory fibrinolýzy. Nejvíce se na inhibici koagulačního systému podílí antitrombin a α2-makroglobulin, které se nacházejí v plazmě v poměrně vysokých koncentracích [33]. Dále se na inhibici podílí heparin, protein C, protein S, inhibitor C1 esterázy, α1-antitrypsin a α2-antiplazmin [35, 37].
Antitrombin (AT, dříve označován jako antitrombin III) – nejvýznamnější fyziologický inhibitor serinových proteáz jako je trombin a další plazmatické protézy (např. faktor Xa). Z hlediska neutralizace účinku trombinu se jedná o antikoagulačně nejúčinnější enzym [35]. Jeho syntéza je spuštěna štěpením fibrinogenu na fibrin. Inaktivace probíhá přes vazbu antitrombinu na trombin nebo jinou plazmatickou proteázu. Vznik těchto 11
komplexů může být mnohonásobně urychlen přítomností heparinu nebo proteoglykanů pocházejících z endotelových buněk [33]. Vliv AT na inhibici plazminu je malý, dochází k ní pouze v 1 %[35].
α2-makroglobulin
–
serinová
proteáza,
syntéza
probíhá
v játrech,
v endotelových buňkách, v monocytech a v makrofázích. Je to další významný inhibitor plazminu. Jeho dalším účinkem je inhibice ostatních složek fibrinolytického systému (tPA, komplex streptokináza-plazminogen a kallikrein) [35].
α2-antiplazmin – glykoprotein produkován játry, je nejdůležitějším inhibitorem plazminu. Tato inhibice probíhá přes tvorbu komplexu α2-antiplazminu s plazminem v poměru 1:1 [35, 38].
2.5. Patofyziologie hemostázy Hemostatická rovnováha je jedním z důležitých mechanizmů udržující celistvost vnitřního prostředí. Pokud dochází k narušení hemostatické rovnováhy, může se tato anomálie projevit v podobě krvácivých nebo trombotických stavů. V případě krvácivých stavů dochází k nechtěnému krvácení, které je důsledkem poruchy jednoho nebo více mechanismů podílejících se na udržení hemostázy. Do těchto patologicky narušených mechanizmů patří krevní destičky (jejich počet a funkce), cévní stěna, plazmatický koagulační a fibrinolytický systém [33, 35]. Tyto poruchy jsou příčinou různých hemoragických onemocnění, jako jsou vaskulopatie, trombocytopenie, trombocytopatie a koagulopatie [35]. Trombotické stavy obnáší nitrocévní srážení (trombózy), jde o protikladný princip než v případě krvácivých stavů a proto je zde hemostatická rovnováha narušena opačným směrem. Příčinami krvácivých stavů může být postižení cévní stěny, porucha hemostatické dynamiky a abnormality ve složení a funkci krve. Do poruch funkce krve patří špatná funkce krevních destiček, narušení plazmatického koagulačního systému a jeho inhibitorů, a také porucha funkce fibrinolytického systému [33, 39]. Zvýšená krevní srážlivost Trombofilie je vrozená nebo dědičná porucha, která vede k tvorbě drobných i větších krevních sraženin (trombů) v žilách a tepnách [33, 35]. Trombofilie vzniká v důsledku narušené rovnováhy hemostatických a antihemostatických mechanizmů [37]. Proces vzniku krevních trombů se nazývá trombóza. Při vzniku trombózy může časem 12
dojít k uvolnění trombu a následnému ucpání některé z důležitých cév uvolněným trombem, tj. embolem [41]. Dochází k tzv. tromboembolickým příhodám, do kterých patří infarkt myokardu, plicní embolie a akutní cévní mozková příhoda. Tyto příhody jsou nejčastěji způsobeny embolem vzniklým v důsledku trombózy žil, zejména v případě hluboké
žilní
trombózy
[42].
V klinické
praxi
dochází
mnohem
častěji
k tromboembolickým komplikacím než ke krvácivým stavům [33]. Trombózy lze rozdělit na dva typy – venózní (žilní) a arteriální (tepenné) [33, 35]. Venózní trombóza vzniká často v důsledku hyperkoagulačních stavů. Dochází zde ke zpomalení přirozeného pohybu krve (krevní stáza) a k hyperkoagulaci plazmatického systému. Příčinou může být jeden nebo více patologických pochodů, kterými jsou: snížená hladina inhibitorů krevního srážení (hl. inhibitory plazmatického koagulačního systému), únik TF do krevního oběhu (chirurgické výkony), zpomalení cirkulace krve, hluboké a rozsáhlé poškození krevních kapilár, rozpad cévního endotelu, nádorová onemocnění, těhotenství a šestinedělí [35, 41]. Naopak příčinou arteriální trombózy bývá zvýšená agregace krevních destiček a ateromatózní změny cévní stěny [41]. Dalšími rizikovými faktory je hypertenze, kouření, diabetes mellitus, obezita a hypercholesterolemie [33, 35]. Poměr složení krevních destiček a fibrinu v trombech závisí na krevním toku a smykovém napětí v konkrétních cévách. V tepnách vznikají především tromby bohaté na krevní destičky, v žílách s menším krevním průtokem převládá aktivace koagulace [38].
13
3. Cerebrovaskulární choroby Cerebrovaskulární choroby jsou nejčastějším původcem úmrtí a invalidit ve všech studovaných společenství bez ohledu na typ společnosti (města, vesnice, průmyslové i zemědělské oblasti) [10]. Tvoří heterogenní skupinu různých typů onemocnění. Do této skupiny patří tranzistorní ischemické ataky, intrakraniální vaskulární poruchy, různé patogenické typy CMP a jejich podtypů s odlišnou etiologií. Mezi patogenické typy iktů patří ischemická cevní mozková příhoda (iCMP), mozková hemoragie a subarachnoidální krvácení. Ischemická CMP je nejčastěji se vyskytujícím projevem ze všech cerebrovaskulárních poruch [7, 43, 44, 45].
3.1. Cévní mozková příhoda CMP je nejčastější chorobou projevující se v důsledku cerebrovaskulárních patogenit. CMP set týká lidí všech věkových kategorií, obvykle se vyskytuje u pacientů ve věku 60-80 let [10]. Z klinického hlediska je CMP definována jako akutní neurologická dysfunkce vaskulárního původu s náhlým nebo postupným projevem symptomů odpovídající postiženým částem mozku [10, 46]. Definice podle WHO popisuje CMP jako syndrom rychle se rozvíjejících známek lokální nebo globální poruchy mozkové činnosti se symptomy trvající 24 hodin a více, které vedou až ke smrti bez žádné jasné příčiny než je porucha cévního zásobení [4]. Toto onemocnění je sekundárním projevem již dávno probíhajících patologických změn cévního systému mozku. Proto se také používá označení ischemický iktus. Přívlastek ischemický obecně vyjadřuje omezení nebo úplné zastavení přívodu krve do mozku způsobený okluzí cévy. Iktus je pojem označující náhlý úder či záchvat, který odpovídá neočekávanému propuknutí ischemie [44]. Symptomy této poruchy trvají obvykle 24 hodin nebo déle, a projevují se jako globální nebo ložisková porucha funkce mozku vedoucí až ke smrti v důsledku poruchy krevního oběhu v mozku [46]. Do syndromu CMP je zahrnuta iCMP, intracerebrální a subarachnoidální krvácení [4, 46, 2009]. Nepatří zde tranzistorní ischemická ataka, subdurální krvácení nebo hematomy, mozkový infarkt ani tzv. tichá mozková příhoda [4]. Ischemická CMP je sekundárním projevem již dávno probíhajících patologií uvnitř organizmu. Tyto patologie se týkají cévního systému v mozku a vedou k okluzi mozkové cévy. Většina těchto okluzí je způsobena trombem vznikajícím v tepnách uvnitř lebky (intrakraniálně), vně lebky (extrakraniálně) nebo na jiných místech v oraganismu (nejčastěji v srdci). Trombus vzniklý uvnitř cév se uvolňuje a putuje cévním systémem až 14
do oblasti intrakraniálních cév, kde dochází k okluzi. Jen ve vyjímečných případech je iCMP sekundárním projevem okluze vény nebo nontrombotické embolie [44]. První hodiny od vypuknutí nemoci je průběh velmi dynamický – může dojít jak ke zlepšení, tak ke zhoršení stavu pacienta. Toto časové pásmo je proto velmi důležité z hlediska nastavení správné terapie. Míra postižení mozkové tkáně závisí na poklesu krevního průtoku v mozku. Fyziologický krevní průtok dosahuje hodnot > 50 ml.min-1 (na 100 g tkáně). Při poklesu na hodnotu kolem 10 - 15 ml.min-1 (100 g tkáně) dochází k reverzibilnímu narušení funkce, které se nazývá ischemická penumbra (polostín). Pokud hodnota průtoku klesne na 10 ml.min-1 (na 100 g tkáně), tak dochází k ireverzibilním změnám, tj. k nekróze mozkové tkáně [47].
3.2. Rozdělení cévních mozkových příhod Ischemický iktus patří z hlediska příčiny vzniku do heterogenní skupiny onemocnění [8]. Tato choroba zahrnuje širší spektrum klinických příčin v závislosti na konkrétním typu iCMP. Rozdíly jednotlivých typů iCMP jsou –
délka trvání,
neurologické symptomy, zasažená oblast mozku, tepna zasažená okluzí a předpokládaný původ krevního trombu [4, 48]. Podle odhalené příčiny se iCMP dělí na několik typů. Zjištění konkrétního typu iCMP je velmi důležité pro výběr vhodného léčebného postupu akutní fáze, stanovení prognózy onemocnění [8, 43, 48, 49], a také pro výběr druhu sekundární prevence. Prevence je rovněž velmi důležitou součástí celkového léčebného procesu, protože v případě iCMP nejde o jev náhodný, nýbrž o chorobu, které se dá předejít [4, 48 ]. Určení konkrétního typu iCMP nelze stanovit pouze na základě klinických příznaků. Pro kvalitnější nastavení léčby je potřeba znát výsledky dalších vyšetření, jako je počítačová tomografie (CT) nebo magnetická rezonance (MRI), vyšetření srdce (echokardiografie), vyšetření cév (arteriografie) a také laboratorní vyšetření na protrombotické stavy [49]. Existuje více kritérií, podle nichž jsou iCMP rozděleny, zde jsou uvedeny nejužívanější klasifikační systémy.
15
3.2.1. Rozdělení podle mechanizmu vzniku (etiologie) Nejčastěji je CMP rozdělena na základě rozdílného mechanizmu vzniku, dělí tak se na:
Ischemickou CMP (iCMP, ischemický iktus) – tvoří asi 80 % všech CMP, tento typ je nejčastěji způsoben postupnou trombózou tepen nebo náhlým tromboembolickým uzávěrem v přívodné tepně (viz obr. č. 1) [3, 8, 46, 50, 51].
Hemoragickou CMP – tvoří zhruba 15 – 20 % případů, příčinou vzniku je ruptura mozkové tepny [3, 8, 46, 50, 51].
Subarachnoidální krvácení – tvoří pouze 5% CMP, je způsobeno výronem krve do subarachnoidálních prostor [8, 46, 50].
Neurčený typ – mechanizmus CMP nelze určit, asi 5% případů [8, 46].
3.2.2. Rozdělení podle lokalizace: Ischemická CMP může nastat prakticky v kterékoli části centrálního nervového systému. Přesto jsou určité zóny známé jako predilekční (tj. nejčastěji napadené oblasti) a jiné jako krajně vyjímečné zóny [8]. CMP se podle postižené oblasti mozkové tkáně dělí na:
Totální přední cirkulační syndrom (17 % iCMP) – zahrnuje velké kortikální ikty v povodí střední mozkové tepny nebo v oblasti střední a přední mozkové tepny.
Parciální přední cirkulační syndrom (34 % iCMP) – jedná se o ikty v oblasti přední nebo střední mozkové tepny.
Lakunární syndrom (25 % iCMP) – do této skupiny patří subkortikální ikty vznikající v postižených malých mozkových cévách. Nejčastěji se vyskytují v bazálních gangliích nebo pontu.
Zadní cirkulační syndrom (24 % iCMP) [8, 52]
Příčin, vedoucích ke vzniku iCMP, je hned několik – u 40 % případů je původcem trombóza (20 % ve velkých tepnách, 20 % v malých tepnách), v 25 - 30 % je příčinou embolie, další příčiny (např. hemodynamická porucha) představují necelých 5 % případů. Ve 25- 30 % případů nelze původce iCMP klasifikovat [46]. 16
Existuje také propracovanější systém klasifikace iCMP podle Adamse a kol. [49] – Trial of Organisation 10172 in Acute Stroke Treatment (TOAST) klasifikace, která rozděluje iCMP do pěti subtypů [49]. TOAST klasifikace rozděluje iCMP podle konkrétní příčiny jejího vzniku. Těmito příčinami jsou: 1) Ateroskleróza ve velkých tepnách (aterotromboembolický iktus, 20 % iCMP) – díky pokročilé ateroskleróze dochází k okluzi uvnitř hlavní mozkové tepny nebo ve větvení kortikálních tepen (viz obr. č. 1) z více jak 50 % [49, 54]. 2) Kardiogenní embolizace (kardioembolický iktus, 20 % iCMP) – příčinou je embolizace do mozkového řečiště z kardiálního zdroje [48, 49, 54]. Pokud je příčinou kardiogeního iktu více embolů, musí být alespoň u jednoho prokázán původ vzniku v srdci pro zařazení do tohoto subtypu [49]. 3) Okluze uvnitř malých tepen (arteropatie malých tepen, lakunární infarkt, 20 – 25 % iCMP) [48, 49, 55] – spojeno s tzv. lakunárním syndromem, který je charakterizován tvorbou mozkových lakun. Lakuny jsou drobné dutinky vzniklé po malých mozkových malácií (tj. chorobné změknutí a nekróza tkáně mozku v důsledku iCMP) [55, 56, 58, 59]. 4) Ostatní příčiny (5 %) – do této skupiny patří ischemické ikty způsobené ojedinělými příčinami. Původci vzniku mohou být neaterosklerotické vaskulopatie, hyperkoagulační stavy nebo hematologické anomálie [2, 49, 54]. 5) Neznámá příčina (30 %) – zde jsou zahrnuty případy, u kterých nelze s jistotou stanovit příčinu vzniku iCMP navzdory výsledkům z mnoha různých vyšetření. Také zde patří případy, kde jsou hlavní příčinou dva nebo více důvodů [49, 54].
17
Obr. č. 1: Schéma vzniku a průběhu ischemické cévní mozkové příhody (iCMP) [115]. Schéma popisuje možný průběh iCMP způsobený uvolněním aterosklerotického plátu (trombu) z cévní stěny krční tepny (karotidy). Uvolněný trombus putuje do mozkových tepen, kde způsobuje blokaci (okluzi) mozkové tepny. Okluze tepny částečně nebo úplně zamezuje tok krve do mozkové tkáně a dochází tak k nekróze.
3.2.3. Rozdělení podle doby trvání příznaků Jednotlivé typy CMP se mohou lišit také časovým průběhem, na základě kterého lze toto onemocnění dělí na:
Tranzistorní ischemické ataky (přechodná ischemická příhoda, TIA) – jsou charakterizovány částečnou nebo úplnou ischémií mozku. Jedná se o náhlou a krátkodobou funkční poruchu mozku trvající několik sekund, minut (obvykle 20 minut) nebo hodin [5, 44, 48]. Do 24 hodin dochází k odeznění příznaků bez trvalých následků [7, 48]. TIA může být mimo jiné považována za varovný signál blížící se iCMP , její odhalení je důležité pro sekundární prevenci většiny typů CMP [10].
Reverzibilní iktus (vratný neurologický defekt, reversible ischemic neurological deficit) – jedná se o déle trvající mozkovou ischémii, která trvá déle
18
než 24 hodin. Pokud dochází k odeznění symptomů, zůstává iktus bez následků [7, 43].
Progredující iktus (stroke-in-evolution) – jde o subakutní mozkovou příhodu, která se rozvíjí během několika hodin až dnů. Dochází k postupně narůstající fokální
mozkové
ischémii
s progresí
neurologických
příznaků.
Může
být způsobena postupně narůstajícím trombem nebo opakovanou embolizací [7, 43].
Dokončený iktus (completed stroke) – jde o uzavřený, chronický stav, při kterém nedochází k žádnému vývoji v posledních 24 hodinách. Dochází zde k vytvoření ireverzibilní ložiskové ischémie s nevratným neurologickým funkčním deficitem [7, 43].
3.3. Patofyziologie ischemické cévní mozkové příhody V průběhu iCMP dochází k okluzi hlavních mozkových cév (nejčastěji střední mozkové tepny), která vede ke snížení přísunu krve, kyslíku a živin do tkáně mozku. Díky nedostatku krevního zásobení je narušen přísun energie a dochází tak ke snížení energetického metabolizmu. Ten spouští řadu buněčných a molekulárních mechanizmů (viz obr. č. 2), díky kterým je na membránách narušena iontová rovnováha [51, 60, 61]. Tímto dochází k tvorbě několika patofyziologických mechanizmů, které se odvíjí od závažnosti ischémie, délce trvání a zasažené oblasti mozku [60]. Snížený přísun energie způsobuje depolarizaci neuronů, která vede k uvolnění excitačních aminokyselin (hlavně glutamátu) do extracelulárního prostoru. Toto uvolnění vede k aktivaci glutamátových receptorů, které mají vliv na změnu gradientu iontů Na+, K+, Ca2+ a Cl-
[59, 60].
Koncentrace glutamátu v extracelulárním prostoru se zvyšuje, což způsobuje vznik peri-infarktové depolarizace. Následkem depolarizace dochází k průniku molekul vody a iontů Na+ a Cl- do neuronů, a tím dochází k edému mozku [59, 60]. Průnikem a zvýšenou koncentrací Ca2+ iontů v mozku dochází ke zvýšené regulaci některých enzymatických systémů, jako jsou lipázy, protézy a endonukleázy [60]. Nahromaděním Na+/Ca2+ iontů dochází ke ztrátě membránového potenciálu, který vede k deregulaci toků iontů. Tyto změny dále indukují uvolnění excitotoxických neurotransmiterů jako je glutamát [51]. Další patofyziologickým důsledkem ischémie je vznik volných kyslíkových radikálů (ROS) [51, 59, 60, 62], které jsou syntetizovány fosfolipázou A2 a cyklooxygenázou po jejich aktivaci Ca2+ ionty [59]. Tento oxidativní stres způsobuje peroxidaci lipidů plazmatické membrány neuronů a vrcholí nekrózou neuronů [51, 59]. 19
Během pár hodin od vypuknutí ischémie dochází v mozkové tkáni vlivem ROS k akutní zánětlivé reakci, která je zcela odlišná od klasické zánětlivé reakce a může trvat až několik dní. Tento speciální typ zánětlivé reakce zahrnuje de novo expresi některých genů, syntézu proteinů a změny na buněčné úrovni, které se ve zdravé mozkové tkáni neodehrávají [51]. Do skupiny de novo syntetizovaných proteinů patří prozanětlivé molekuly a mediátory [51, 60], jako jsou selektiny endotelu a krevních destiček, destičkový aktivační faktor, tumor nekrotizující faktor α a řada interleukinů [60]. Na buněčné úrovni dochází k aktivaci mikroglií a k průniku leukocytů z řad T-lymfocytů, polymorfonukleárních neutrofilů, monocytů a makrofágů skrz hematoencefalickou bariéru [51, 62].
Okluze cév způsobená trombem nebo embolem
Snížený průtok krve v mozku
Selhání energetického metabolizmu
Apoptóza buněk
Uvolnění excitačních neurotransmiterů Aktivace glutamátových receptorů
Změna koncentrace iontů ↑Nai+ , ↑ Cai2+ , ↑ Cli -, ↑ Ke +
Aktivace napěťově řízených Ca2+ iontových kanálů a zpětná výměna iontů Na+ - Ca2+
Odtok Ca2+ iontů z buněk
Přítok Ca2+ iontů do buněk
Aktivace buněčných enzymů: kinázy, proteázy, lipázy
Syntéza ROS
Buněčná smrt
Peroxidace lipidové membrány
Zánětlivá reakce
Poškození organel
Obr. č. 2: Schéma patofyziologické kaskády iCMP na molekulární a buněčné úrovni [59; upraveno]. Schéma na sebe navazujících dějů uvnitř a vně neuronu během iCMP. Nai+ = nitrobuněčný sodík, Cai2+ = nitrobuněčný vápník, Cli- = nitrobuněčný chlorid, Ke+ = nitrobuněčný draslík
20
3.4. Epidemiologie cévní mozkové příhody v České republice Cévní mozková příhoda je třetí nejčastější příčinou úmrtí v České republice [2,3]. Počet úmrtí na CMP od druhé poloviny 90. let minulého století postupně klesal. Přesto naše republika patří do zemí s nejvyšší úmrtností na CMP, a to i ve srovnání s většinou rozvinutých zemí [46]. Nemoci oběhové soustavy patřily za rok 2013 mezi nejčastější příčiny hospitalizace pacientů v České republice. Z nich téměř 25 % byla tvořena pacienty trpícími hypertenzními onemocněními, 10 % pacienty s ischemickou chorobou srdeční a cévní nemoci mozku byly zaznamenány u 3 % pacientů. Z hlediska příčin úmrtnosti jsou cévní onemocnění mozku uvedeny u 7,7 % úmrtí mužů a 11,2 % úmrtí žen. Celkově toto onemocnění způsobilo 9,5 % úmrtí ze všech evidovaných úmrtí za rok 2013 [63]. Obecně je incidence CMP 0,15 % až 0,30 % z celkové populace, v případě České republiky (10,5 milionů obyvatel) to znamená 16 až 31,5 tisíc obyvatel je zasažených CMP během jednoho roku [2, 3, 8].
21
4. Terapeutické možnosti ischemické cévní mozkové příhody Jedním z prvních rozhodujících kroků pro volbu léčebného postupu je jasné vyloučení hemoragické příhody. Určení konkrétního typu CMP předchází vyšetření mozku pomocí počítačové tomografie spolu s neurologickým a kardiologickým vyšetřením [8, 64, 65]. Pro zjištění přesné etiologie se používají také ultrazvuková vyšetření a zobrazovací metody pro vyšetření intrakraniálních a extrakraniálních cév [64, 66]. Další vyšetření zahrnuje měření krevního tlaku, stanovení saturace kyslíku, neurologické vyšetření vč. vyšetření podle mezinárodní testovací škály pro CMP - National Institute of Health Stroke Scale. Dál se provádí laboratorní vyšetření krevního obrazu, biochemický screening a stanovení hemokoagulačních parametrů [3, 53]. Cílem léčby iCMP je co nejčasnější lékařský zásah a obnovení krevního zásobení v postižené oblasti. Testy by zbytečně neměly oddalovat zahájení léčby, protože jak se říká „čas je mozek“ [3, 64, 66]. Poté je dalším rozhodujícím parametrem tzv. farmakologické okno, tj. čas uplynulý od prvních příznaků mozkové příhody do přijetí pacienta v nemocničním zařízení [8].
4.1. Metody rekanalizace uzavřené cévy Pro zprůchodnění uzavřené cévy se používá farmakologická trombolýza, mechanická rekanalizace, angioplastika, nebo operační zákrok na postižené cévě [50]. V 75 - 90 % případů byla jako příčina vzniku akutní iCMP zjištěna okluze některé z mozkových
cév.
Proto
je
trombolytická
terapie
jednou
z nejpoužívanějších
terapeutických možností [54]. Pro zahájení léčby musí pacient splňovat časové kritérium (farmakologické okno). Pokud toto kritérium splňuje, může být pacientovi podáno trombolytikum rtPA buď intravenózně (IV, nitrožilně) v prvních 4,5 hodinách nebo intraarteriálně (IA, nitrotepenně) v prvních 6 hodinách Ve specializovaných nemocnicích může být poskytnut endovaskulární zákrok pomocí katetrů v časovém okně 6 – 8 hodin [3, 48, 67].
4.1.1. Farmakologická trombolýza IV
trombolýza
byla
zavedena
jako
první
léčebná
metoda
iCMP,
až v posledních letech došlo k zavedení a technickému zdokonalení IA metod trombolýzy [3]. V minulosti bylo klinicky používáno více typů trombolytik. První trombolytika se začala objevovat již v 30. letech 20. Století, mezi které patřily např. streptokináza (sPA), stafylokináza, uPA, plazmin, sliny z upíra obecného nebo rtPA [68]. 22
Nyní je však jediným klinicky schváleným trombolytikem používaným k terapii iCPM rtPA [68, 69] Tato terapie není doporučována v případě nejasně prokázané diagnózy akutní iCMP [64, 70]. Ačkoli je trombolytická terapie považována za efektivní léčbu, obnáší také mnohé vedlejší účinky. K nim patří – nitrolebeční a systematické krvácení, hypotenze, imunologická reakce a reperfúzní arytmie [35]. Vzniku a přetrvávajícímu krvácení lze alespoň částečně zamezit podáním hemostatické substance během prvních 4 hodin [66]. Mnoho studií však ukázalo, že výhody převyšují nad nevýhodami trombolytické terapie [35]. Altepláza (rtPA) Altepláza je fibrin-specifické trombolytikum, které patří také do skupiny přímých aktivátorů plazminogenu. Přímí aktivátoři plazminogenu jsou serinové proteázy, které štěpí jednoduché peptidické vazby mezi aminokyselinami argininem a valinem [71]. Terapií pomocí rtPA se zabývala The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) studie. Ta prokázala, že IV podaná rtPA významně zlepšuje výsledky léčby, pokud je podána do 3 hodin od nástupu příznaků [72]. V roce 1996 byla léčba pomocí rtPA schválena Úřadem pro kontolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) Jako bezpečný a efektivní prostředek pro léčbu mozkových příhod v časovém okně 3 hodin [73]. Bylo prokázáno, že léčba pomocí rt-PA s 30%ní pravděpodobností snižuje nebo zcela zamezuje vznik invalidity po dobu 3 a více měsíců od propuknutí akutní iCMP [70, 72]. V Evropě došlo ke schválení rtPA v roce 2002, v České republice až v dubnu 2003 [3]. IV trombolýzou se zabývalo mnoho dalších studií, mezi nejvýznamnější studie mimo patří evropské studie The European Cooperative Acute Stroke Studiy III (ECASS III)[69] a Safe Implementation of Treatments in Stroke Monitoring Study (SITSMOST)[74].
Výsledkem
ECASS
III
studie
bylo
prokázání
účinku
rtPA
ve farmakologickém okně 4,5 hodin. Studie SITS-MOST potvrdila bezpečnost a účinnost rutinního podávání rtPA v klinické praxi. Na základě těchto výsledků byla léčba pomocí rtPA rozšířena na 4,5 hod. U terapeutického okna vyššího než 4,5 hodiny, nebo v případě nejasné doby uplynuté od příchodu symptomů se aplikace rtPA nedoporučuje [69]. U novorozenců, kojenců a dětí postižených iCMP není podávání rtPA doporučováno kvůli riziku krvácení. Toto riziko je vysoké především u novorozenců, kteří nemají dostatečně vyvinutý hemostatický
23
a koagulační systém, mají nízkou koncentraci plazminogenu a cévní systém mozku je u nich stále proměnlivý [70]. Intravenózní trombolýza Koncept IV trombolýzy pochází z NINDS studie [72]. Výsledkem studie byl výrazně lepší klinický výsledek ve skupině pacientů léčených pomocí rtPA oproti kontrolní skupině. Z celkového počtu došlo u 30 % pacientů k minimálnímu nebo k žádnému neurologickému deficitu (hodnoceno dle modifikované Rankinovy škály mRS ≤ 1), mortalita byla po třech měsících u 17 % případů (proti 21 % léčených placebem). IV trombolýza je nejpoužívanější terapií v léčbě akutní iCMP. Cílem této léčby je rekanalizace (zprůchodnění) ucpané mozkové arterie a zachování krevního zásobení mozku [71]. IV trombolytická terapie probíhá aplikací trombolytika rtPA [3, 72]. IV terapie by měla být zahájena do 4,5 hodin od vzniku symptomů. Pacientům je podáván roztok enzymu rtPA (Actilyse®) v koncentraci 90 mg.kg-1, maximální celková dávka je stanovena na 90 mg. Tato terapie je započata jednorázovým podáním roztoku rtPA z 10 % z celkového množství, zbylých 90 % je dodáváno kontinuální infúzí po dobu 60 minut [3, 8, 48, 72]. IV trombolýza je výhodný způsob léčby z hlediska široké dostupnosti a možnosti včasného zahájení. Účinnost této léčby je celkem vysoká při okluzi menších tepen, v případě okluze hlavních arteriálních kmenů často již nemá takový vliv [3]. Intraarteriální trombolýza Problematice IA trombolýzy bylo věnováno několik studií. Aplikací rtPA, standardizací dávkování a její bezpečností při IA trombolýze se zabývala studie Qureshi a kol. [75]. Výsledkem této studie bylo stanovení 40 mg rtPA jako bezpečné a dostatečně účinné dávky. V roce 2003 vydaly American Stroke Association [76] a European Stroke Anitiative Executive Committee nové směrnice, které potvrdily účinnost intraarteriální trombolýzy na zlepšení průběhu léčby CMP do 6 hodin od jejího vzniku [77]. IA trombolýza je mechanizmus, při kterém dochází k rekanalizaci okludovaných tepen [71]. IA trombolýza je prováděna aplikací trombolytika rtPA pomocí zavedeného katetru přímo v místě okluze. IA trombolýzou je dosažena vyšší koncentrace trombolytika v místě okluze díky jeho podání přímo v místě tepenného uzávěru. Proto je tato terapie účinnější než IV trombolýza [3, 45, 71]. Díky této účinnosti je také sníženo riziko vzniku celkových komplikací [3]. Studie z minulosti prokázaly, že při provedení IA výkonů dochází častěji k rekanalizaci než je tomu u IV terapie. Dokonce i konečný zdravotní stav 24
pacientů je lepší a mortalita je nižší. Přesto je tato léčba zahájena jen u malého počtu pacientů [48]. Navzdory výhodám IA trombolýzy má v časovém okně do 4,5 hodin vždy přednost IV trombolýza. IA trombolýza je pouze doplňkovou metodou k IV trombolýze a mechanické rekanalizaci (katetrizaci). Používá se v případě selhání IV trombolýzy nebo špatné dostupnosti trombu pro katetrizační techniky [ 45, 78]. IA terapie zlepšuje výsledný stav léčby, pouze pokud je podána do 6 hodin od počátku ischemie [73]. Optimální dávka rtPA není známa a není aní FDA schválena k IA aplikaci [78]. IA trombolýza se provádí pouze ve specializovaných centrech s kvalitním technickým vybavením a speciálně vyškoleným personálem [3, 48, 73, 78]. Přestože se IA podání rtPA v současnosti používá, dosud není efekt této léčby potvrzen žádnou zaslepenou studií [45]. Kombinace intravenózní a intraarteriální trombolýzy Kombinovanou terapií se zabývaly studie International Management of Stroke Trial (IMS) I [79], II [80] a III [81], které studovaly možnosti provedení a bezpečnost IV a IA aplikované rtPA. IMS I studie prokázala srovnatelnou bezpečnost kombinovaného podání trombolytika rtPA, částečné nebo úplné rekanalizace bylo dosaženo v 56 % případů (studie nevytvořila kontrolní skupinu). Studie IMS II použila pro spojení kombinované IA a IV trombolýzy speciální mikroinfúzní katétr Ekos-MicroLYSUS (Ekos). Mikrokatétr sloužil k simultánnímu uvolňování trombolytika rtPA a k aplikaci nízkoenergetických ultrazvukových vln vysílaných sondou na konci mikrokatétru. Výsledkem IMS II studie bylo vysoké procento případů rekanalizací (73 %). Poslední byla studie IMS III, která testovala účinek kombinované trombolýzy s použitím Ekos katétru a zařízení MERCI Retriever® (viz kap. Mechanická rekanalizace). Tato studie byla však předčasně ukončena kvůli nesignifikantního rozdílu v účinku samotné IV trombolýzy a kombinované trombolýzy s endovaskulárním zákrokem. Vyšší účinnost kombinované léčby potvrdila Recanalisation Using Combined Intravenous Alteplase and Neuroiterventional Algortihm for Acute Ischemic Stroke (RECANALISE) [82]. Výsledkem RECANALISE studie byl vyšší počet rekanalizací (87 %) díky použití kombinované trombolýzy v porovnání se samotnou IV trombolýzou (52 %). Kombinovaná IA a IV trombolýza je další možností terapie iCMP, která kombinuje výhody jednoduchého a rychlého IV podání rtPA s účinnějším způsobem IA podáním rtPA [47, 82]. Tato metoda se stala na několika specializovaných pracovištích základem akutní terapie iCMP [47]. Bezpečná dávka rtPA byla dalšími studiemi stanovena na 24 mg [83] a 69 mg [84]. 25
4.1.2. Mechanické metody rekanalizace Metody mechanické (endovaskulární) rekanalizace jsou alternativním zákrokem pro léčbu iCMP [85]. Metody byly vyvinuty kvůli nedostatečnému počtu soběstačných pacientů (pouze 55 %) po IV trombolýze pomocí rtPA [45] nebo pro pacienty, kteří nemohou IV trombolýzu podstoupit [73]. U pacientů s uzávěry velkých mozkových tepen často metoda IV trombolýzy selhává. Proto byly v posledním desetiletí testovány mechanické metody pro urychlení rekanalizace mozkové tepny [45]. Mechanická rekanalizace (nebo také mechanická embolektomie) je metoda, která slouží k rekanalizaci ucpané cévy pomocí fragmentace trombu, zvětšení jeho povrhu a usnadnění působení trombolytika [3, 73]. Mechanická rekanalizace mozkových tepen zahrnuje tři hlavní kroky – aspiraci, exkratkci a fragmentaci trombu [45]. Pro tento zákrok se používají speciální vodiče, mikrovodiče, extrakční kličky nebo košíčky k zachycení pevných částic. Tyto nástroje jsou velice efektivní při rekanalizaci středních mozkových tepen i vnitřích karotických tepen [86]. První mechanické zařízení testované pro extrakci trombu v mozkovém cévním řečišti byl je katetr Merci Retriever® (The Merci Retrieval System, Concentric Medical) (viz obr. č. 3). Tento katétr byl testován ve studiích Mechanical Embolus in Cerebral Ischemia (MERCI) [85] a MultiMERCI [87]. MERCI studie potvrdila účinnost a bezpečnost použití Merci katétru v časovém okně 8 hodin. Na základě těchto výsledků byl Merci katetr v roce 2004 schválen FDA pro účely rekanalizací v klinické praxi v časovém okně 8 hodin. Výsledkem MultiMERCI studie bylo potvzení účinnosti a bezpečnosti použití Merci katétru v kombinaci s IA podáním rtPA (24 mg). Merci katetr slouží pro velmi bezpečné a účinné mechanické odstranění trombu. Zařízení obsahuje speciální nitinolové mikrovodiče, které mají na svém distálním konci tvarovou paměť. Tyto vodiče jsou na svém konci formovány do vývrtkovité části se snižujícím se průměrem (z 2,8 mm do 1,1 mm) – typ X6, nebo do šroubovice tvořené sítí filament – typ L5. Toto distální uspořádání napomáhá lepšímu zachycení a stažení trombu z cévního řečiště [88]. Metoda rekanalizace s použitím Merci katetru je vysoce efektivní metoda designovaná pro léčbu iCMP. Tato metoda se využívá jen ve vysoce specializovaných centrech, pro léčbu je použitelná do 6 – 8 hodin od propuknutí symptomů. Metoda obnáší mechanické odstranění trombu, často je doplněna IA trombolýzou s aplikací až 24 mg tPA. Kombinace těchto terapií zajišťuje vyšší úspěšnost rekanalizace, avšak velkou nevýhodou je i vyšší počet nitrolebečních krvácení díky reperfúzi do pokročilé ischemické oblasti [48]. Dalším používaným zařízením je např. systém Penumbra sloužící k mechanickému 26
rozrušení trombu a pohlcení vytvořených fragmentů [89]. Podle výsledků studie The Penumbra Investigators 2009 byl systém Penumbra uveden na trh, v České republice je k dispozici od února roku 2010 [3].
L5
X6 Obr. č. 3: Distální konce katetru Merci Retriever® s mikrovodiči typu L5 a X6 a schéma jejich zavedení do cévy in vivo [88, 90; upraveno].Merci Retriever® je katetr, který se používá pro velmi bezpečné a účinné mechanické odstranění trombu při léčbě iCMP. Katetr nese na svém distálním konci speciální nitinolové mikrovodiče, které mají tvarovou paměť a slouží k lepšímu zachycení a stažení trombu z cévního řečiště. Tyto vodiče jsou typu L5 (šroubovice tvořené sítí filament) nebo typu X6 (vývrtkovitá část se snižujícím se průměrem z 2,8 mm do 1,1 mm). Smith 2008, Charvát 2008
27
5. Studium trombolýzy u akutní ischemické cévní mozkové příhody Akutní iCMP a infarkt myokardu jsou celosvětově nejčastější příčinou úmrtí a častým původcem invalidity postižených pacientů. Proto je stále potřeba výzkumu a vývoje nových terapeutik, které by umožnily rychlejší a efektivnější trombolytickou léčbu [32]. Cílem terapie je zajistit co nejčasnější rekanalizaci a reperfuzi okludované cévy a záchranit tak postiženou mozkovou tkáň [71]. Studie zaměřené na trombolýzu obnáší preklinické studie s použitím in vitro [25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32] a in vivo modelů [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24], a potom klinické studie [91].
5.1. In vitro modely Cíle in vitro studií zahrnují nalezení nových možností léčby případně zvýšení efektivity současné léčby pomocí klinicky schváleného trombolytika rtPA [27]. Základem pro in vitro studie je vytvoření in vitro modelu. Modely se od sebe liší nejen použitými materiály, ale i dalšími vlastnostmi – do různé míry napodobují anatomické a fyziologické parametry iCMP. Základním rozdělením je dělení in vitro modelů do dvou skupin na statické [28, 29, 30, 31] a průtokové modely [25, 26, 27]. Statické modely nemají zavedený průtokový systém, není zde vytvořen tlak kapaliny a tromby jsou v některých modelech vystaveny trombolytiku po celém svém povrchu [30]. Průtokové modely již mají kontinuální průtok, v některých případech je v systému vytvořen tlakový gradient odpovídající tlaku uvnitř artérií [25, 26]. Uvedené studie využívající in vitro modely (viz Příloha I, tab. č. II, ) se odlišují také v uspořádání modelů, ve zpracování krevních trombů, v typu in vitro cévy v oblasti okluze, v typu použitého média uvnitř systému, v druhu aplikovaného trombolytika (většinou rtPA [26, 27, 28, 29, 31] , ale i uPA [25, 26] a sPA [26, 30]), technickým zařízením
zesilující
účinek
trombolytika
nebo
experimentálními
podmínkami.
Ve zmíněných studiích je testována účinnost trombolýzy za použití jednoho [27, 28,29,30,31] nebo i více [25, 26] klinicky používaných trombolytik. Někdy je použité trombolytikum testováno v kombinaci s aplikací nízkofrekvenčních ultrazvukových vln [27, 28, 29].
28
Účinnost trombolýzy je ve většině studií testována jako hmotnostní úbytek trombů po provedeném experimentu [27, 28, 29, 30] nebo v případě radioaktivně značených trombů je účinnost trombolýzy stanovena pomocí měření radioaktivně značeného materiálu, např. 125I-fibrinogenu uvolněného do média uvnitř modelového systému [25,26].
5.1.1. Statické modely Nejjednodušší typ statického in vitro modelu pro studium trombolýzy použil Prasad a kol. [30]. Model byl tvořen pouze plastovou mikrozkumavkou (viz obr. č. 4). V této studii bylo jako trombolytikum využito sPA o různých koncentracích (30 000 IU, 22 500 IU, 15 000 IU, 7 500 IU). Výsledkem studie bylo prokázání signifikantního účinku sPA na trombolýzu in vitro ve srovnání s negativní kontrolou. Nejvyšší hodnota úbytku hmotnosti byla pozorována v případě nejvyšší koncentrace sPA. U nižších koncentrací však nebyl pozorován signifikantní rozdíl v účinnosti sPA na trombolýzu.
Obr. č. 4: Foto statického in vitro modelu pro studium trombolýzy in vitro pomocí streptokinázy tvořený plastovou mikrozkumavkou [30]. Statický model byl tvořen zkumavkami se zavedenými tromby bez přídavku streptokinázy (sPA) (negativní kontrola, zkumavka č.1) nebo s přídavkem sPA o různých koncentracích (zkumavkyč. 2 – 5, sestupná hodnota koncentrace). Na konci experimentubyly zkumavky převráceny pro zviditelnění účinku trombolýzy. U zkumavky č. 1 jde vidět, že zde trombolýza neproběhla. Uvnitř zkumavek č. 2 – 5 došlo k trombolýze s různou intenzitou.
Pfaffenger a kol. [28] vytvořili statický in vitro model tvořený částí lidské lebky – temporální kostí, která byla ponořena do sonikační komory (viz obr. č. 5). In vitro céva s trombem byla umístěna v poloze odpovídající lokalizaci střední mozkové tepny, vzdálenost mezi trombem a transduktorem byla 50 mm, transduktor byl umístěn 5 mm od temporální kosti pod úhlem 35° k ose in vitro cévy se zavedeným trombem. Tato studie se zabývala vlivem ultrazvukových vln (1,8 MHz) ve formě kontinuálních nebo pulzních vln na trombolýzu zprostředkovanou rtPA. 29
Přítomnost temporální kosti způsobovala vysoké zeslabení účinku ultrazvukových vln. Jejich vliv na trombolýzu nebyl statisticky signifikantní.
Transkraniální dopplerovské ultrazvukové zařízení (1,8 MHz)
Transduktor
Lebka
In vitro céva
Temporální kost
Trombus
Sonikační komora
Vodní lázeň (37 °C)
Absorpční materiál
Obr. č. 5: Schéma statického in vitro modelu tvořeného lidskou lebkou pro studium účinku ultrazvukových vln na trombolýzu in vitro [28; upraveno]. Statický in vitro model se skládal z temporální kosti lidské lebky, vodní lázně, in vitro cévy se zavedeným trombem a ultrazvukovým dopplerovským zařízením. Temporální kost byla ponořena do sonikační komory. In vitro céva s trombem byla umístěna v poloze odpovídající lokalizaci střední mozkové tepny, vzdálenost mezi trombem a transduktorem byla 50 mm, transduktor byl umístěn 5 mm od temporální kosti pod úhlem 35° k ose in vitro cévy se zavedeným trombem.
Dalším statickým modelem byl in vitro model od Frenkela a kol. [29]. Model byl tvořen latexovou in vitro cévou, která byla po obou koncích uzavřena pomocí dialyzačních svorek. In vitro céva se zavedeným trombem byla ponořena do vodní lázně, v přímé blízkosti (autor neuvádí vzdálenost) byla umístěna ultrazvuková sonda. Studie pozorovala účinek ultrazvukových vln na trombolýzu, a to účinek ultrazvukových vln samotných nebo společně s aplikovaným rtPA. V daném modelu měla statisticky signifikantní účinek na trombolýzu jen kombinace ultrazvukových vln spolu s rtPA. Došlo k 50 % navýšení trombolýzy. Wang a kol. [31] použili statický in vitro model tvořený plastovou in vitro cévou se skleněnými uzávěry pro vytvoření fixní polohy trombu (viz obr. č. 6). Model byl navržen pro studium účinku zapouzdřeného rtPA v poly-ε-kaprolaktonových (PLGA) nanočásticích na urychlení permeace rtPA skrz trombus. PLGA nanočástice byly na svém povrchu navíc 30
pokryty
vrstvou
chitosanu
(CS)
nebo
(glycin-arginin-glycin-kyselina asparagová;
chitosanu
s adhezivním
tetrapeptidem
CS-GRGD), které usnadňují adhezi
na mukózní povrchy. Nanočástice sloužily k vytvoření tlaku uvnitř cévy, který by měl napomáhat proniknutí rtPA. Povrch trombů byl na konci experimentu mikroskopicky pozorován. Nanočástice způsobily proniknutí rtPA do větší hloubky trombu (100 µl) v porovnání s rtPA volně rozpuštěným v plazmě (12.µl).
Trombus (6 mm)
PBS
rtPA vázán na PLGA/CS nebo CS-GRGD nanočástice
PPP
Směr permeace (teplota 37 °C)
Míchadlo PLGA/CS nebo CS-GRGD nanočástice
Obr. č. 6: Statický in vitro model pro studium účinku nanočástic s navázaným rtPA na permeaci molekul rtPA skrz trombus [31; upraveno].In vitro model byl tvořen plastovou in vitro cévou se skleněnými uzávěry pro vytvoření fixní polohy trombu. Uvnitř modelu byly použity dvě médie – krevní plazma ve vstupní části in vitro cévy a fosfátový pufr (PBS) ve výstupní části. V krevní plazmě byly rozpuštěny poly-ε-kaprolaktonové(PLGA) nanočástice s navázaným rtPA. PLGA nanočástice byly na svém povrchu navíc pokryty vrstvou chitosanu (CS) nebo chitosanu s adhezivním tetrapeptidem (glycin-arginin-glycin-kyselina asparagová; CS-GRGD).
pa
31
5.1.2. Průtokové modely Jeden z prvních průtokových in vitro modelů vyvinul v roce 1994 Stoughton a kol. [25] (viz obr. č. 7). Model byl tvořen cévním in vitro obvodem s bifurkací (větvením). Systém obsahoval polytetrafluorethylenovou část, kde byl zaveden radioaktivně značený trombus (125I-fibrinogen). Uvnitř systému byl pomocí peristaltické pumpy vytvořen průtok média a také byl vytvořen tlakový gradient odpovídající systolickému tlaku (136 ± 2 mm Hg) v tepnách in vivo. Cílem studie bylo srovnání účinku uPA (333 IU/min) samotné nebo v kombinaci s plazminogenem (44 CU) na trombolýzu in vitro. Účinnost trombolýzy byla měřena stanovením uvolněného radioaktivního 125I-fibrinogenu do oběhu uvnitř modelu. Výsledek prokázal signifikantní účinek kombinace plazminogenu s uPA na trombolýzu in vitro ve srovnání s účinkem samotné uPA. Tento účinek neobnášel pouze vyšší hmotnostní úbytek trombu, ale vliv plazminogenu se projevil také v uniformitě rozkladu trombu během trombolýzy. Rozklad trombu proběhl bez tvorby drobných embolů komplikující další průběh trombolýzy, které byly pozorovány u skupiny s uPA bez plazminogenu.
Zásobník Měřič rychlosti průtoku
Trombus Katetrizační špička Bifurkace (větvení)
Infúzní katétr a pumpa
Převodník a záznamník tlaku
Ultrazvukový měřič průtoku
Peristaltická pumpa
Obr. č. 7: Průtokový in vitro model tvořený cévním in vitro systémem s bifurkací [25; upraveno]. Model byl tvořen cévním in vitro obvodem s bifurkací. Systém obsahoval polytetrafluorethylenovou část, kde byl zaveden radioaktivně značený trombus (125I-fibrinogen). Uvnitř systému byl pomocí peristaltické pumpy vytvořen průtok média, a také zde byl vytvořen tlakový gradient odpovídající systolickému tlaku (136 ± 2 mm Hg) v tepnách in vivo.
32
V roce 1995 Ouriel a kol. [26] použili průtokový in vitro model stejný jako ve studii Stoughton a kol [25]. Tato studie byla zaměřena na porovnání účinku třech běžně užívaných trombolytik – sPA, uPA a rtPA na trombolýzu a jejich specifitu vůči fibrinu. Tromby byly značeny radioaktivním jodem (125I-fibrinogen), účinnost trombolýzy byla vypočítána na základě měření uvolněného
125
I-fibrinogenu, specifita k fibrinogenu byla
stanovena jako úbytek koncentrace fibrinogenu v cirkulujícím pufru. Výsledky ukázaly, že nejvyšší rychlostí probíhala trombolýza v přítomnosti rtPA, střední rychlostí účinkem uPA a nejpomaleji docházelo k trombolýze účinkem sPA. Nejvyšší specifita k fibrinu byla pozorována u uPA. V roce 2004 vyvinul Cintas a kol. [27] průtokový in vitro model tvořený in vitro cévním systémem s částí s vytvořenou okluzí ponořenou do vodní lázně a s ultrazvukovou sondou (viz. obr. č. 8). Oblast in vitro cévy s trombem obsahovala filtrační a celofánovou membránu (viz. obr. č. 8). Tento model sloužil k testování efektu nízkofrekvenčních ultrazvukových vln (2 MHz), galaktózových mikrobublin (Levovist ®) a rtPA na trombolýzu in vitro. Výsledek studie prokázal signifikantní účinnost galaktózových mikrobublin na urychlení trombolýzy pomocí rtPA a nízkofrekvenčních ultrazvukových vln. Signifikantní účinek na trombolýzu měly i mikrobubliny s ultrazvukovými vlnami bez rtPA, a i rtPA s ultrazvukovými vlnami bez přítomnosti mikrobublin. Nejvyšší účinek na trombolýzu měla aplikace galaktózových mikrobublin spolu s rtPA v kombinaci s ultrazvukovými vlnami.
33
Ultrazvuková sonda (2 MHz)
Tenká membrána
Filtr
Trombus
Umístění aplikace mikrobublin Levovist ®
Obr. č. 8: Průtokový in vitro model tvořený in vitro cévním systémem s oblastí okluze ponořenou do vodní lázně a s ultrazvukovou sondou [27; upraveno]. Průtokový in vitro model se skládal z in vitro cévního systému, který byl částečně ponořen do vodní lázně. Ve vodní lázni byla ponořena část se zavedeným trombem, která obsahovala filtrační a celofánovou membránu. Do vodní lázně byla ponořena ultrazvuková sonda. Uvnitř systému byly zavedeny galaktózové mikrobubliny (Levovist ®) pro zvýšení trombolytického účinku rtPA.
34
6. In vivo studie ischemické cévní mozkové příhody 6.1. Preklinické studie na animálních modelech Animální modely slouží k hlubšímu pochopení rozmanitých fyziologických a patologických mechanizmů, molekulárních a buněčných procesů během iCMP. In vivo studie používají animální modely co nejvíce relevantní člověku. Studium iCMP se zaměřuje především na mechanizmus poškození mozkové tkáně, trombolýzu a neuroprotekci [60, 91, 92]. Animální modely, u kterých dochází k úplné okluzi cévy, jsou používány pouze ke studiu vlivu ischémie na mozkovou tkáň. Pro studium účinku rekanalizace na fyziologii mozkové tkáně už tyto modely používány nejsou [92]. Patofyziologie různých typů iCMP se liší, a proto je ve studiích volen kontrétní typ animálního modelu tak, aby splňoval požadavky dané studie [60, 92]. Díky velké rozmanitosti onemocnění, které mají velký vliv na prognózu iCMP u lidí dochází k značným rozdílům ve výsledcích preklinických a klinických studií [60]. Často se stává, že pokud jsou výsledky preklinických testů na animálních modelech signifikantně příznivé, výsledky klinických studií na pacientech se s nimi neshodují a příznivý efekt léčby zde není signifikantně prokázán [60, 90, 91, 92, 93]. Příčinou těchto nejednotných výsledků je více. Hraje zde roli délka trvání ischemie, čas podání farmakologické terapie, množství podaného léčiva, délka terapeutického okna, věk, pohlaví a jiné probíhající onemocnění [60]. Pomocí animálních modelů lze napodobit jen 25 % všech typů iCMP člověka, tzn. že testovaná farmaka úspěšné na animálních modelech jsou z hlediska léčby úspěšné zhruba jen u čtvrtiny případů testovaných lidí s iCMP [93]. Každý animální model obnáší řady výhod i nevýhod. Skupinu laboratorních zvířat používaných ke studiu mozkové ischemie lze dělit do dvou skupin – na velká a malá zvířata. [92]. Velká zvířata patří mezi méně používanou skupinu animálních modelů. Patří sem králíci, pískomilové, kočky, psi, ovce, prasata a opice (subhumánní primáti) [60]. Velká zvířata obnáší výhody, mezi které patří jednodušší provedení různých vyšetření, jako je fMRI, psychologická monitorování pomocí EEG, měření krevního tlaku a měření koncentrace kyslíku, glukózy, laktátu a hemoglobinu v krvi. Tato měření mohou být prováděna
najednou
spolu
s
jinými
neurologickými,
neurobehaviorálními,
neurochemickými a neuropatologickými testy. Jejich provedení je mnohem jednodušší než v případě zvířat menších velikostí. Další velkou výhodou je gyrencefalický mozek větších zvířat, který je anatomií a funkcí velmi podobný mozku lidskému. Nevýhodou experimentální práce s velkými zvířaty je náročnost invazivních chirurgických výkonů, 35
při kterých často musí docházet k otevření dury mater (tvrdé mozkové pleny). Další komplikací je rozdílnost v provedení anestezie a monitorování vytvořené ischemie. Další překážkou je vysoká variabilita jednotlivých zvířat ve velikosti a fyziologii, také variabilita vytvořeného poranění a výsledné ischémie. Práce s těmito zvířaty s sebou přináší také vysoké finanční náklady a zasahuje do etické problematiky laboratorních pokusů, zejména na psech, kočkách a opicích [60]. Do skupiny malých zvířat patří hlodavci, zejm. myši a krysy. Práce s malými zvířaty není tolik finančně náročná, proto jsou myši a krysy nejvíce používaným modelem [60, 91]. Jejich použití v experimentálních studiích není bráno za tak velký etický problém. Další výhodou je genetická homogenita, která souvisí s jednoduššími genetickými manipulacemi, jednoduchou produkcí transgenních myší a jejich reprodukcí [60, 91]. Tyto technologie také umožňují zásahy do exprese proteinů a enzymů spolu s inaktivací vybraných genů u konkrétních zvířat. Tím je usnadněno studium patologických mechanizmů během ischemie i možnosti neuroprotekce. Nevýhodou této skupiny zvířat je odlišná anatomie a funkční nastavení jejich lisencefalického mozku ve srovnání s lidským. Díky tomu je provedení psychologického monitorování souběžně s jinými vyšetřením značně komplikovanější a nelze jej stejně provádět jako u zvířat větších velikostí [60]. Hlavním cílem simulace mozkové ischemie na animálních modelech je zamezit přísunu krve do mozku, a tím snížit přísun kyslíku a glukózy [60]. Ve většině animálních modelů dochází k simulaci iCMP vytvořením okluze střední mozkové tepny [92]. Tato simulace se provádí více způsoby – jako globální, fokální (ložisková) a multifokální ischemie [60]. Globální ischemie znamená rapidní snížení nebo úplné zastavení krevního zásobení mozku, který zasahuje celý mozkový metabolizmus a funkci neuronů. Fokální ischemie znamená uzavření cévního zásobení pouze v určité oblasti mozku. Zde může docházet k výživě z oblasti penumbry pomocí kolaterálního systému cév do tzv. jádra ischemie [60, 92]. Multifokální ischemie zahrnuje snížení průtoku krve ve více oddělených oblastech mozku zároveň [60]. Simulace globální ischemie byla v minulosti prováděna dekapitací, nebo pomocí zástavy srdce [92, 93]. Zástava srdce je obecně častou příčinou iCMP u lidí, a proto byla často prováděna i u studovaných modelů [92]. Také se často vyvolávala komorová fibrilace, která je příčinou globální mozkové ischemie podobně jako zástava srdeční činnosti. Zástava srdce byla vyvolávána injekcí látky zastavující srdeční činnost (např. KCl) [22] nebo chirurgickým uzavřením velkých cév v oblasti mediastina 36
(mezihrudí). Tento chirurgický zákrok se prováděl u krys, koček, psů a opic [92]. Vyvolání globální ischemie pomocí zástavy srdce ovšem komplikuje získání experimentální dat díky systémovému efektu srdeční zástavy na celý organizmus a časté úmrtnosti [93]. Mezi další způsoby, které se v minulosti používaly pro vyvolání globální ischemie je indukce systemové hypotenze (pomocí ganglioplegika trimethafanu) a hypoxie (dýcháním 4% kyslíku) snižující přísun kyslíku a glukózy [11], indukce reverzibilní ischemie v předním mozku (u krys) pomocí okluze 4 mozkových cév (obě arteria karotis externa a interna) [12, 17] nebo okluzí obou krčních tepen v kombinaci se systémovou hypotenzí [13, 94, 95]. Experimentální design simulace globální ischemie na bázi srdeční zástavy byl podroben větší kritice než experimenty studující fokální ischémii. Přesto je však velkou výhodou tohoto způsobu vyvolání mozkové ischemie poškození neuronů, které výzkumníkům umožňuje pozorovat efektivitu neuroprotektivních léků lépe než u fokální ischemie, kde hraje roli více faktorů [93]. Fokální ischémie byla v animálních modelech provedena rovněž více způsoby. Nejčastěji používaným modelem je tzv. embolický model [91]. Tento model se nejvíce podobá klinickým vlastnostem lidské CMP, protože právě tromboembolická CMP je nejčastějším typem mozkové příhody (citace z kap. 2). Tromboembolická ischémie se vyvolává zavedením autologních trombů do extrakraniální tepny, pomocí které tromby putují do intrakraniálních tepen. Tromby bývaly vyrobeny z lidské krve nebo byla použita suspenze trombových fragmentů [14]. Z důvodu časté spontánní rekanalizace byla zavedena příprava autologních trombů bohatých na fibrin, které tolik nepodléhají autolýze a spontánní rekanalizaci [21]. Poslední moderní úpravou tohoto modelu je zavedení katétru PE-8 přes externí krční tepnu do interní krční tepny, kde dochází k uvolnění 2 UI α-trombinu, který se poté dostává do větvení střední mozkové tepny [24]. V některých studiích byly nativní tromby nahrazeny uměle připravenými tromby, které byly tvořeny stažitelným stříbrným balónkem [18], viskózním silikonem [96], polyvinylsiloxanem [97]. Tyto umělé tromby byly zavedeny přes hlavní krční tepnu do vnitřní krční tepny k vytvoření okluze a indukce fokální ischemie [92]. Dalším způsobem indukce fokální ischemie je okluze střední mozkové tepny pomocí intraluminálního (dovnitř cév) zavedení sutury (stehu). Zavedení sutury se provádí přes inzerci do vnitřní krční tepny, kde poté sutura postupuje a ucpává krevní průtok do střední mozkové tepny [19, 20]. Další možností je fototrombotický model, kde je fokální ischemie dosažena pomocí paprsku světelného záření o určité vlnové délce. Paprsek je zacílen na konkrétní arterii po intravenózní (u krys) nebo intraperitoneální (myši) injekci fotosenzitivní barvy 37
jako je bengálská růžová nebo erythrosin B. Tímto způsobem dochází k produkci kyslíkových radikálů, které způsobují narušení cévního endotelu, aktivaci a agregaci krevních destiček ve zvolených cévách. Výsledkem je tvorba vazogenního edému díky narušení cévní bariéry během pár minut po zásahu [15, 16, 23]. Fokální ischémie byla vytvořena také pomocí endotelinu-1, který má vazokonstrikční účinek a je spojen s mnoha kardiovaskulárními onemocněními [98]. Přímá aplikace endotelinu-1 přímo do střední mozkové tepny způsobuje snížení krevního průtoku a tím i ischémii v této oblasti mozku [99, 100].
6.2. Klinické studie Klinické studie jsou projekty, které se zaměřují na testování nových léčiv nebo nových léčebných a diagnostických postupů u léčiv používáných v klinické praxi. Součástí klinických studií je také testování účinnosti, bezpečnosti a zavedení nových léčiv a nových postupů v praxi. Tyto studie jsou poslední fází testování a navazují na předchozí preklinické studie. Preklinické studie jsou prováděny in vitro na buněčných či tkáňových kulturách. V klinických studiích probíhá testování na zdravých dobrovolnících i na pacientech [101,102]. Každý lék, který je v klinické praxi používán, musel v minulosti úspěšně projít klinickými studiemi. Tyto studie obnáší několik právních předpisů, jako je směrnice Správné klinické praxe [103] a ustanovení Helsinské deklarace. Pro schválení nového léčiva nebo nového léčebného a diagnostického postupu je potřeba splnit tato právní nařízení. Klinické studie jsou v každé zemi kontrolovány tzv. regulačními autoritami a etickou komisí. Ty kontrolují celý průběh studie a správnost jejích provedení [101]. Regulační autoritou v České republice je Státní úřad pro kontrolu léčiv [116]. Průběh klinického testování lze podle FDA klasifikace [117] rozdělit do čtyř fází. První fáze tvrá několik měsíců a jejím cílem je získáni iformací o bezpečnosti testované látky a určení
účinné dávky. Tato
fáze
se zabývá
určením
metabolických
a farmakologických vlastností testované látky a také jejími nežádoucími účinky. Testování probíhá většinou na zdravých dobrovolnících (skupina 20 – 100 dobrovolníků). Druhá fáze trvá měsíce až dva roky. V této fázi se zkoumá optimální dávka testované látky, její účinnost, nežádoucí účinky a také rizika krátkodobého užívání. Druhé fáze klinického testování se účastní skupina několika set nemocných pacientů.
38
Třetí fáze klinického testování trvá jeden až čtyři roky. Jejím cílem je získání ještě více informací o účinnosti a bezpečnosti při užívání dané látky. Ve třetí fázi probíhá také zkoumání výhod a rizik užívání testované látky. Testování se účastní tři sta až tři tisíce nemocných pacientů. Poslední čtvrtá fáze je zaměřena na účinnost a bezpečnost nové látky při dlouhodobém užívání. Testování se účastní několik tisíc nemocných pacientů. V této fázi probíhá testování nových léčiv nebo léčebných zařízení, které již prošly schválením FDA.
39
7. Seznam odborné literatury 1.
Higashida R, Furlan A. Trial design and reporting standards for intra-arterial cerebral thrombolysis for acute ischemic stroke. Stroke. 2003; 34(8):E109-E137.
2.
Ambler Z. Základy Neurologie. Praha : Galén, 2011.
3.
Lacman J, Janoušková L. Recent possibilities of the diagnostics and treatment of the acute brain ischemia. Ceska Radiologie. 2010; 64(2):137-144.
4.
Wolfe C. The impact of stroke. British Medical Bulletin. 2000; 56(2):275-286.
5.
Spence J, Petr V. Mozková Mrtvice : Prevence, Výživová Doporučení, Recepty. Praha : Triton, 2008.
6.
Béjot Y, Daubail B, Giroud M. Neuroepidemiology: Epidemiology of stroke and transient ischemic attacks: Current knowledge and perspectives. Revue Neurologique. 2016; 172:59-68.
7.
Kalvach P. Mozkové Ischemie A Hemoragie. Praha : Grada, 2010.
8.
Kalita Z. Akutní Cévní Mozkové Příhody : Diagnostika, Patofyziologie, Management. Praha: Maxdorf, c2006.
9.
Ehler E, Bednařík J, Höschl C, Winkler P, Suchý M, Pátá M. Cost of disorders of the brain in the Czech Republic. Ceska A Slovenska Neurologie A Neurochirurgie. 2013;76(3):282-291.
10. Stroke, W. H. O. Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke. 1989; 20(10):1407-1431. 11. Yatsu F, Lindquist P, Graziano C. An experimental model of brain ischemia combining hypotension and hypoxia. Stroke; 1974; 5(1):32-39. 12. Pulsinelli W, Brierley J. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979; 10(3):267-272. 13. Smith M, Auer R, Siesjö B. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathologica. 1984; 64(4):319.
40
14. Kaneko D, Nakamura N, Ogawa T. Cerebral infarction in rats using homologous blood emboli: Development of a new experimental model. Stroke. 1985; 16(1):76-84. 15. Watson B, Dietrich W, Busto R, Wachtel M, Ginsberg, M. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of neurology. 1985; 17(5):497-504. 16. Dietrich W, Busto R, Watson B, Scheinberg P, Ginsberg M. Photochemically induced cerebral infarction. Acta Neuropathologica. 1987; 72(4):326. 17. Pulsinelli W, Buchan A. The four-vessel occlusion rat model: Method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation. Stroke. 1988; 19(7):913-914 18. Molnár L, Hegedüs K, Fekete I. A new model for inducing transient cerebral ischemia and subsequent reperfusion in rabbits without craniectomy. Stroke. 1988; 19(10):12621266. 19. Longa E, Weinstein P, Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989; 20(1):84-91. 20. Belayev L, Alonso O, Busto R, Zhao W, Ginsberg M. Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture: Neurological and pathological evaluation of an improved model. Stroke. 1996; 27(9):1616-1623. 21. Busch E, Hossmann K, Krüger K. Improved model of thromboembolic stroke and rtPA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 1997; 778(1):16-24. 22. Kofler J, Hattori K, Traystman R, et al. Histopathological and behavioral characterization of a novel model of cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation in mice. Journal Of Neuroscience Methods. 2004;136:33-44. 23. Lu H, Li Y, Tong S, Yuan L, Li H, Lu X. Induction and imaging of photothrombotic stroke in conscious and freely moving rats. Journal Of Biomedical Optics. 2014; 19(9). 24. Chen Y, Zhu W, Alkayed N, et al. A novel mouse model of thromboembolic stroke. Journal Of Neuroscience Methods. 2015; 256:203-211. 25. Stoughton J, Ouriel K, Blebea J, et al. Plasminogen acceleration of urokinase thrombolysis. Journal Of Vascular Surgery. 1994; 19(2):298-305.
41
26. Ouriel K, Welch E, Shortell C, Geary K, Fiore W, Cimino C. Comparison of streptokinase, urokinase, and recombinant tissue plasminogen activator in an in vitro model of venous thrombolysis. Journal Of Vascular Surgery. 1995;22(5):593-597. 27. Cintas P, Nguyen F, Boneu B, Larrue V. Enhancement of enzymatic fibrinolysis with 2-MHz ultrasound and microbubbles. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. 2004; 2(7):1163-1166. 28. Pfaffenberger S, Kasl S, Benes E, et al. Can a commercial diagnostic ultrasound device accelerate thrombolysis?: An in vitro skull model. Stroke . 2005; 36(1):124128. 29. Frenkel V, Oberoi J, Li K, et al. Pulsed high-intensity focused ultrasound enhances thrombolysis in an in vitro model. Radiology. 2006; 239(1):86-93. 30. Prasad S, Kashyap R, Deopujari J, Taori G, Daginawala H, Purohit H. Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs. Thrombosis Journal. 2006. 31. Wang S, Chou N, Chung T. The t-PA-encapsulated PLGA nanoparticles shelled with CS or CS-GRGD alter both permeation through and dissolving patterns of blood clots compared with t-PA solution: An in vitro thrombolysis study. Journal Of Biomedical Materials Research. 2009; 91(3):753-761. 32. Yohannes F, Hoffmann A. Non-invasive low frequency vibration as a potential emergency adjunctive treatment for heart attack and stroke. An in vitro flow model. Journal Of Thrombosis And Thrombolysis. 2008; 25(3):251-258. 33. Pecka M. Laboratorní Hematologie v přehledu: Fyziologie A Patofyziologie Hemostázy. Český Těšín: FINIDR, 2004. 34. Šlechtová J. Hemostasis – As we possibly don’t know it. Klinicka Biochemie A Metabolismus. 2007; 15(2):97-101. 35. Baklaja R, Czarnecki J. Hemostasis and hemorrhagic disorders. Fermentation Biotec GmbH Bad Har zburg. 2008. 332. 36. Marder, V. J., Aird, W. C., Bennett, J. S., Schulman, S., & White, G. C. Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice. Lippincott Williams & Wilkins. 2012. 37. Vokurka, M. Patofyziologie pro nelékařské směry. Karolinum Press. 2006.
42
38. Grotta J, Albers G, Broderick J, Kasner S, Lo E, Sacco R, Mendelow A, Wong L. Stroke: pathophysiology, diagnosis, and management. Elsevier Health Sciences. 2016. 39. Colvin B. Physiology of haemostasis. Vox Sanguinis. 2004 ;87:43-46. 40. Mackman N. The role of tissue factor and factor VIIa in hemostasis. Anesthesia and analgesia. 2009; 108(5):1447. 41. Alving B. The hypercoagulable states. Hospital Practice, 1993; 28(2):109-121. 42. Tabernero M, Tomas J,Alberca I, Orfao A, Borrasca A, Vicente V. Incidence and clinical characteristics of hereditary disorders associated with venous thrombosis. American journal of hematology. 1991; 36(4): 249-254.
43. Fisher M. Ischemic cerebral vascular disease an overview . Arquivos De NeuroPsiquiatria. 1991; (1):01. 44. Adams H, Hachinski V, Norris J. Ischemic cerebrovascular dinase. New York, NY: Oxford University Press. 2001. 45. Škokolík D. Rekanalizační léčba mozkové ischemie – jak dál? Neurologie pro praxi. 2014; 15(3):125-130. 46. Bruthans J. Epidemiologie a prognóza cévních mozkových příhod. Remedia. 2009; 19:128-131. 47. Goldemund D, Mikulík R, Reif M. Trombolytická terapie mozkového infarktu. Kardiologická revue. 2008; 4(2):168-176. 48. Kalina M. Cévní mozková příhoda v medicínské praxi. Triton. 2008. 49. Adams H, Bendixen B, Kappelle L, Biller J, Love B, Gordon D, Marsh E. Classification of subtype of acute ischemic stroke. Definitions for use in a multicenter clinical trial. TOAST. Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment. Stroke. 1993; 24(1), 35-41. 50. Vítovec J, Špinar J. Farmakoterapie kardiovaskulárních onemocnění. Grada Publishing. 2004. 51. Wang X. Investigational anti-inflammatory agents for the treatment of ischaemic brain injury. Expert opinion on investigational drugs. 2005; 14(4):393-409.
43
52. Bamford J, Sandercock P, Dennis M, Warlow C, Burn J. Classification and natural history of clinically identifiable subtypes of cerebral infarction. The Lancet. 1991. 337(8756):1521-1526. 53. Goldstein L, Samsa G. Reliability of the National Institutes of Health Stroke Scale extension to non-neurologists in the context of a clinical trial. Stroke. 1997; 28(2):307310. 54. Kalita Z. Management akutní ischemické cévní mozkové příhody. Remedia. 2001; 11:385-400. 55. Bamford J., Sandercock P, Jones L, Warlow C. The natural history of lacunar infarction: the Oxfordshire Community Stroke Project.Stroke. 1987; 18(3):545-551. 56. Fisher C. Lacunes: small, deep cerebral infarcts. 1965. Neurology. 1998;50(4):841. 57. Fisher C. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathologica. 1969;12(1):1. 58. Kalvach Z. Geriatrie a gerontologie. Grada, 2004. 59. Fisher M, Schaebitz W. An overview of acute stroke therapy: past, present and future. Zhurnal Nevropatologii I Psikhiatrii Imeni S S Korsakova. 2001; 21-33. 60. Traystman J. Animal models of focal and global cerebral ischemia. ILAR journal. 2003; 44(2):85-95. 61. Woodruff T, Thundyil J, Tang S, Sobey C, Taylor S, Arumugam T. Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke. Mol Neurodegener. 2011; 6(1):11. 62. Jin R, Yang G, Li G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of leukocyte biology. 2010; 87(5):779-789. 63. ÚZIS ČR. Zdravotnická ročenka České republiky 2012. Praha: ÚZIS. 2013 64. Adams HP Jr, Brott TG, Crowell RM, Furlan AJ, Gomez CR, Grotta J, Helgason CM, Marler JR, Woolson RF, Zivin JA, Feinberg W, Mayberg M. Guidelines for the management of patients with acute ischemic stroke: a statement for healthcare professionals from a special writing group of the Stroke Council, American Heart Association. Stroke. 1994; 25:1901-1914. 65. Sulter G, Elting J, Langedijk M, Maurits N, De Keyser J. Admitting acute ischemic stroke patients to a stroke care monitoring unit versus a conventional stroke unit a randomized pilot study. Stroke. 2003; 34(1):101-104. 44
66. Davis S, Lees K, Donnan G. Treating the acute stroke patient as an emergency: current practices and future opportunities. International journal of clinical practice. 2006; 60(4):399-407. 67. Neumann J, Tomek A, Školoudík D, Škoda O, Mikulík R, Herzig R. Doporučený postup pro intravenózní trombolýzu v léčbě akutního mozkového infarktu–verze 2014. Cesk Slov Neurol. 2014; 77. 68. Röther J, Ford G,Thijs V. Thrombolytics in acute ischaemic stroke: historical perspective and future opportunities. Cerebrovascular Diseases. 2013; 35(4):313-319. 69. Hacke W, Kaste M, Bluhmki E, Brozman M, Dávalos A, Guidetti D, Schneider D. Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke. New England Journal of Medicine. 2008; 359(13):1317-1329. 70. Adams H, Brott T, Furlan J, Gomez C, Grotta J, Helgason C, Feinberg W. Guidelines for thrombolytic therapy for acute stroke: a supplement to the guidelines for the management of patients with acute ischemic stroke a statement for healthcare professionals from a special writing group of the stroke council, American heart association. Circulation. 1996; 94(5):1167-1174. 71. Barreto A. Intravenous thrombolytics for ischemic stroke.Neurotherapeutics. 2011; 8(3):388-399. 72. Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. N Engl J Med. 1995; 333:1581-7. 73. Brott T, Bogousslavsky J. Treatment of acute ischemic stroke.New England Journal of Medicine. 2000; 343(10):710-722. 74. Wahlgren N, Ahmed N, Dávalos A, Ford G, Grond M, Hacke W, Lees K. Thrombolysis with alteplase for acute ischaemic stroke in the Safe Implementation of Thrombolysis in Stroke-Monitoring Study (SITS-MOST): an observational study. The Lancet. 2007; 369(9558):275-282. 75. Qureshi A, Suri M, Shatla A, Ringer A, Fessler R, Ali Z, Hopkins L.Intraarterial recombinant tissue plasminogen activator for ischemic stroke: an accelerating dosing regimen. Neurosurgery. 2000; 47(2):473-6.
45
76. Adams H, Adams R , Brott T, del Zoppo G, Furlan A, Goldstein L,Marler J. Guidelines for the early management of patients with ischemic stroke a scientific statement from the stroke council of the american stroke association. Stroke. 2003; 34(4):1056-1083. 77. Klijn C, Hankey G. Management of acute ischaemic stroke: new guidelines from the American Stroke Association and European Stroke Initiative. The Lancet Neurology. 2003; 2(11):698-701. 78. Adams H, Adams R, Del Zoppo G, Goldstein L. Guidelines for the Early Management of Patients With Ischemic Stroke 2005 Guidelines Update A Scientific Statement From the Stroke Council of the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 2005; 36(4):916-923. 79. IMS Study Investigators. Combined intravenous and intra-arterial recanalization for acute ischemic stroke: the Interventional Management of Stroke Study. Stroke. 2004; 35(4):904-911. 80. IMS II Trial Investigators. The interventional management of stroke (IMS) II study. Stroke. 2007; 38(7):2127-2135. 81. Broderick J, Palesch Y, Demchuk A, Yeatts S, Khatri P, Hill M, Von Kummer R. Endovascular therapy after intravenous t-PA versus t-PA alone for stroke. New England Journal of Medicine. 2013; 368(10):893-903. 82. Mazighi M, Serfaty J, Labreuche J, Laissy J, Meseguer E, Lavallée P, Klein I. Comparison of intravenous alteplase with a combined intravenous–endovascular approach in patients with stroke and confirmed arterial occlusion (RECANALISE study): a prospective cohort study. The Lancet Neurology. 2009; 8(9):802-809. 83. Shaltoni H, Albright K, Gonzales N, Weir R, Khaja A, Sugg R, Noser E. Is intraarterial thrombolysis safe after full-dose intravenous recombinant tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke?. Stroke. 2007; 38(1):80-84. 84. Hassan A, Abd-Allah F, Chaudhry S, Adil M, Rostambeigi N, Qureshi A. A Critical Analysis of Intra-arterial Thrombolytic Doses in Acute Ischemic Stroke Treatment. Neurocritical care. 2014; 21(1):119-123. 85. Smith W, Sung G, Starkman S, Saver J, Kidwell C, Gobin Y, Silverman I. Safety and efficacy of mechanical embolectomy in acute ischemic stroke results of the MERCI trial. Stroke. 2005; 36(7):1432-1438.
46
86. Sorimachi T, Fujii Y, Tsuchiya N, Nashimoto T, Harada A, Ito Y, Tanaka R. Recanalization by mechanical embolus disruption during intra-arterial thrombolysis in the carotid territory. American journal of neuroradiology. 2004; 25(8):1391-1402. 87. Smith W, Multi MERCI Investigators. Safety of mechanical thrombectomy and intravenous tissue plasminogen activator in acute ischemic stroke. Results of the multi Mechanical Embolus Removal in Cerebral Ischemia (MERCI) trial, part I. American Journal of Neuroradiology. 2006; 27(6):1177-1182. 88. Charvát F, Lacman J, Mašková J, Elis J, Beneš V. Mechanická embolektomie pomocí Merci katétru u nemocných s akutním uzávěrem mozkových tepen. Čes a Slov Neurol Neurochir. 2008; 71(107):1. 89. Bose A, Henkes H, Alfke K, Reith W, Mayer T, Berlis A, Penumbra Phase 1 Stroke Trial Investigators. The Penumbra System: a mechanical device for the treatment of acute stroke due to thromboembolism. American Journal of Neuroradiology. 2008; 29(7):1409-1413. 90. Smith W, Sung G, Saver J, Budzik R, Duckwiler G, Liebeskind D, Gobin Y. Mechanical thrombectomy for acute ischemic stroke final results of the multi MERCI trial. Stroke. 2008; 39(4):1205-1212. 91. Durukan A,Tatlisumak T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 2007; 87(1):179-197. 92. Kumar A, Gupta V. A review on animal models of stroke: An update. Brain research bulletin. 2016; 122:35-44. 93. Small D,Buchan A. Animal models. British medical bulletin. 2000; 56(2):307-317. 94. Sanderson T,Wider, J. 2-vessel occlusion/hypotension: a rat model of global brain ischemia. JoVE (Journal of Visualized Experiments). 2013; (76):e50173-e50173. 95. Smith M, Auer R, Siesjö B. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2–10 min of forebrain ischemia. Acta neuropathologica. 1984; 64(4):319-332. 96. Lauer K, Shen H, Stein E, Ho K, Kampine J, Hudetz A. Focal cerebral ischemia in rats produced by intracarotid embolization with viscous silicone. Neurological research. 2002; 24(2):181-190.
47
97. Yang Y, Yang T, Li Q, Wang C, Shuaib A. A new reproducible focal cerebral ischemia model by introduction of polyvinylsiloxane into the middle cerebral artery: a comparison study. Journal of neuroscience methods. 2002; 118(2):199-206. 98. Briyal S, Gulati A, Gupta Y. Effect of combination of endothelin receptor antagonist (TAK-044) and aspirin in middle cerebral artery occlusion model of acute ischemic stroke in rats. Methods and findings in experimental and clinical pharmacology. 2007; 29(4):257-264 Molnár L, Hegedüs K, Fekete I. A new model for inducing transient cerebral ischemia and subsequent reperfusion in rabbits without craniectomy. Stroke. 1988; 19(10):1262-1266. 99. Robinson M, Macrae I, Todd M, Reid, J, McCulloch J. Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels by endothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neuroscience letters. 1990; 118(2):269-272. 100.Macrae I, Robinson M, Graham D, Reid J, McCulloch J. Endothelin-1-induced reductions in cerebral blood flow: dose dependency, time course, and neuropathological consequences. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1993; 13(2):276-284. 101. Chow, S. C., & Liu, J. P. (2008). Design and analysis of clinical trials: concepts and methodologies (Vol. 507). John Wiley & Sons. 102. Buchsel P, Yarbro C. Oncology nursing in the ambulatory setting: issues and models of care. Jones & Bartlett Learning. 2005. 103. Guideline, I. H. T. Guideline for good clinical practice. J Postgrad Med. 2001; 47(1):45-50. 104. Liebeskind D, Sanossian N, Yong W, Starkman S, Tsang M, Moya A, Shah S. CT and MRI early vessel signs reflect clot composition in acute stroke. Stroke. 2011; 42(5):1237-1243. 105. Meunier J, Wenker E, Lindsell C, Shaw G. Individual Lytic Efficacy of Recombinant Tissue Plasminogen Activator in an In Vitro Human Clot Model: Rate of “Nonresponse”. Academic Emergency Medicine. 2013; 20(5):449-455. 106. Poole J. A Study of Artificial Thrombi Produced by a Modification of Chandler’s Method. Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 1959, 44( 4):377-384. 107. Wang Z, Moehring M, Voie A, Furuhatha H. In vitro evaluation of dual mode ultrasonic thrombolysis method for transcranial application with an occlusive thrombosis model. Ultrasound in Med. & Biol. 2008; 34 (1): 96–102.
48
108. Sherman T. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. The Journal of general fysiology. 1981, 78(4):431-453. 109. Nonoyama A, Garcia-Lopez A, Garcia-Rubio L, Leparc G F, Potter R. Hypochromicity in red blood cells: an experimental and theoretical investigation. Biomedical optics express. 2001; 2(8): 2126-2143. 110. Camus S, De Moraes J, Bonnin P, Abbyad P, Le Jeune S, Lionnet F, Kiger L. Circulating cell membrane microparticles transfer heme to endothelial cells and trigger vasoocclusions in sickle cell disease. Blood. 2015; 125(24): 3805-3814. 111. Niessen F, Hilger T, Hoehn M, Hossmann K. Differences in Clot Preparation Determine Outcome of Recombinant Tissue Plasminogen Activator Treatment in Experimental Thromboembolic Stroke. Stroke. 2003; 34( 8):2019-2024. 112. Dubrul W, Evans M. U.S. Patent No. 5,380,273. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office. 1995. 113. Dubrul W,Evans M. U.S. Patent No. 5,713,848. Washington, DC: U.S. Patent and Trademark Office. 1998. 114. Hoffmann A, Gill H. Externally Applied Vibration at 50 Hz Facilitates Dissolution of Blood Clots In-Vitro. Am. J. Biomed. Sci. 2012; 4(4): 274-284. 115. URL1: http://trombofilik.cz/cevni-mozkova-prihoda/ 116. URL2: http://www.sukl.cz/ 117. URL3: http://www.fda.gov/forpatients/approvals/drugs/ucm405622.htm#Clinical_ Research_Phase_Studie 118. URL4: http://www.medila.cz/website/others/fibrinogen/
49
Příloha I
Vlastnosti trombu
Typ modelu
Autor Rok
PBS, H2O
Lidská venózní krev (500 µl), 45 min při 37 °C
Statický model tvořený mikrozkumavkou
Prasad 2006
rtPA (3000 UI/ml)
H2O, 0,9% NaCl
Lidská venózní krev, 1,5 ml, srážení 60 min při 37 °C
Statický model lidské lebky tvořené temporální kostí (tloušťka 1,9 mm) ve vodní lázni
Pfaffenger 2005
rtPA (0,01; 0,02; 0,1 mg/ml)
0,9 % NaCl
Statický model s uzavřenou in vitro cévou ve vodní lázni
Frenkel 2006
Model s in vitro cévou obsahující zátku stabilizující trombus, oddělující vstupní část cévy obsahující plazmu a výstupní část obsahující PBS pufr
Wang 2008
7,9 mm)
Stoughton 1994
Ouriel 1995
Cintas 2004
Průtokový model s kolaterální in vitro Průtokový model uvnitř vodní lázně s cévou, fyziologickým arteriálním Model podle Stoughton a kol. (1994) filtrační a celofánovou membránou v místě tlakem (136 ± 2 mm Hg) okluze.
Lidská venózní krev + heparin (0,75 IU/ml) + thrombin (50 IU/ml)
Fosfátový pufr (PBS)
Urokináza (333 IU/min), streptokináza (10 IU/min), rtPA (5,3 mg/min)
Fosfátový pufr (PBS)
rtPA (20 µg/ml)
+125I-fibrinogen (1,0 µCi), 90 min při 37 °C PBS pufr, krevní plazma
Urokináza (5000 IU/ml; 333 IU/min; 4 ml/h)
Lidská venózní krev (1 ml) + citrát sodný (0,1 ml; 105 mmol/l) + CaCl 2 (100 µl; 100 mmol/l); 120 min, 37 °C (vodní lázeň); průměr 10 mm, váha 476,8 ± 58,1 mg. Tris-albuminový pufr (0,9% NaCl, 0,02 mol/l Tris-HCl, 0,1% BSA, pH 7,4) rtPA (10 µg/ml; rozpuštěn v plazmě nebo vázán v PLGA nanočásticích)
Bez dalšího zařízení
In vitro céva ze silikonového elastomeru
60 min (při 37 °C), průtok 40 ml/min, v místě okluze 0 - 14,4 ml/min
30 min (při 37 °C), průtok 5 ml/min
In vitro céva z polyethylenu ( 12 mm) s celofánovou membránou v horní části
Bez dalšího zařízení Céva pokrytá vrstvou 0,01% chitosanu a PEGu; vnitřní průměr (8,0 mm)
120 min (při 37 °C)
⌀ In vitro céva z polytetrafluorethylenu (PTFE)( 5,0 mm)
Nízkofrekvenční ultrazvuk (2 MHz; ATL Ultramark HDI) a ultrazvukové mikrobubliny (povrch bublin tvořený galaktózou) ⌀
Lidská venózní krev + pufr (10:1; Lidská venózní krev (10 ml) + heparin Lidská venózní krev, 1,5 ml, srážení (0,75 IU/ml) + thrombin (500 IU) 90 min při 37 °C (v prostředí vodní 0,9% NaCl; 0,15% CaCl 2; pH 6,6) lázně oddělení pomocí latexové + thrombin (50 UI/ml), 0,3 g tromby, + 125I-fibrinogen (1,0 µCi; 0,813 Ci/ml); vrstvy ) rozměr 5 mmx5 cm; 90 min při 37 °C 60 - 120 min
Médium uvnitř modelu Streptokináza (30 000 IU, 22 500 IU, 15 000 IU, 7 500 IU)
Latexová trubice (
30 - 120 min (při 37 °C)
60 min (při 37 °C)
Diagnostické ultrazvukkové Pulzní ultrazvuková jednotka PLGA nanočástice pokryté vrstvou zařízení (Sonos 4500, Philips), (modifikace Sonoblate 5000 system), chitosanu CS nebo CS-GRGD průměrná hodnota 1,8 MHz akustický výkon 20 - 60 W. ⌀
60 min (při 37 °C)
⌀ Silikonový kopolymer (C-Flex, Cole-Parmer; 4,0 mm)
Aplikované trombolytikum
Bez in vitro cévy
Bez dalšího zařízení
Typ in vitro cévy
90 min (při 37 °C)
Typ zařízení použité na trombolýzu
Experimentální podmínky
Tab. č. II: Seznam in vitro modelů použitých různými autory pro studium trombolýzy in vitro, sežazeno vzestupně podle roku .Jednotlivé in vitro modely používané různými autory v letech 1994 – 2008 ke studiu trombolýzy in vitro. Tabulka obsahuje iformace o vlastnostech každého in vitro modelu, typu použitých trombů, média uvnitř systému, trombolytika, pomocného zařízení pro zvýšení efektu trombolýzy, typ použité in vitro cévy v místě okluze a experimentální podmínky.
