Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse

Současné možnosti a úskalí diagnostiky pertuse Mgr. Jana Zavadilová NRL pro pertusi a difterii Státní zdravotní ústav

Aktuality v diagnostice virových a bakteriálních infekcí, 26.5.2014, SZÚ

Výběr vhodné laboratorní metody Nástup symptomů

0

2

4

6

8

10

12

(týdny)

Kultivace PCR

Sérologie

 u novorozenců a malých dětí

kultivace a PCR co nejdříve

 u očkovaných dětí a dospělých - pokud kašel trvá méně než dva týdny - pokud kašel trvá déle než dva týdny

kultivace a PCR PCR a sérologie

Kultivace  100% specifická, sensitivita klesá s délkou trvání příznaků  Faktory ovlivňující senzitivitu: o načasování odběru – konec inkubační doby, a 2 týdny trvání příznaků o ATB terapie o spolupráce pacienta o technika odběru - výtěr nebo aspirát z nosohltanu, ne stěr z tonzil, nosu, laryngeální výtěr ….

Odběr materiálu na kultivaci  Výtěr z nosohltanu– ne vatový tampón Tampón ze syntetické bavlny na drátku s transportním médiem (Amies s aktivním uhlím)

 Aspirát z nosohltanu

http://www.copanswabs.com

Odběr na kultivaci a PCR ze zadní stěny nosohltanu Tampón jemně zasunout přes nosní průduch těsně podél nosní přepážky a po spodní stěně nosní dutiny až k zadní stěně nosohltanu. Několikrát jemně pootočíme a tampón vytáhneme.

U dětí je nutná fixace!

Obrázek podle M. Riffelmann, Kodaň 2010

Transport vzorků pro kultivaci  Materiál přepravovat a uchovávat do zpracování při pokojové teplotě – NE V LEDNICI !  Materiál zpracovat v laboratoři v den odběru, optimum do 4 hodin

 Vhodný odběr v odběrovém místě mikrobiologické laboratoře

Kultivační média  Charcoal agar (Regan-Lowe) neselektivní selektivní (+ cephalexin 40mg/l)  Bordet – Gengou neselektivní selektivní (+ cephalexin 40mg/l)  pH půdy 7,4±0.2, čerstvá krev půda na kultivační plotně vylitá do výšky 5 – 7 mm, skladovat max. 2 týdny  Kultivační podmínky 35-36°C, minimálně 7 dní, denní odečítání ploten

Roste Bordetella pertussis na krevním agaru ?  Zkoušeno na: o Columbia Oxoid o KA základ č. 3 Imuna o KA univerzální základ Imuna  Otestováno 70 kmenů

 Ano, ale jen na Columbia Oxoid krevním agaru  Růst na KA neznamená, že se nejedná o B. pertussis

Makroskopická identifikace kolonií I  B. pertussis vyrůstá za 48 až 72 hodin, vytváří drobné stříbřité polokulovité kolonie, při doteku kličkou se rozetřou (nepohybují se), po 3 - 4 dnech inkubace kolonie větší – „kapky rosy“, na Bordet-Gengou agaru zóna hemolýzy

;

www.hardydiagnostics.com ; faculty.matcmadison.edu/mljensen

Makroskopická identifikace kolonií II  B. parapertussis vyrůstá do 48 hodin, kolonie jsou větší, šedostříbrné, při delší inkubaci vpadlé do půdy, na Bordet-Gengou agaru výrazná zóna hemolýzy a černohnědý pigment

http://www.cdc.gov/pertussis/lab.html

Identifikace bakteriální kultury  Sklíčková aglutinace s diagnostickými séry po izolaci čisté kultury (ne starší než 48 hodin)  MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Desorption Ionization - Time Of Flight Spectrophotometry)

http://www.oxoid.com/CZ/blue/search/results.asp

Laser Mass

Sérotypizace izolátů B. pertussis v NRL  Monoklonální Ab proti fimbriím  Známy 2 typy fimbrií – Fim2 a Fim3  Rozeznáváme kmeny typu Fim2; Fim2,3 a Fim3  V současné době převažuje typ Fim3  Vzácně pasážováním může dojít ke změně sérotypu

Co dalšího děláme s izoláty B. pertussis ?  Grant IGA MZ ČR (31.5. 2013 - 31.12. 2015)  U izolátů provádíme: MAST MLST MLVA

Real-Time PCR  Rychlá a vysoce citlivá metoda - význam hlavně u novorozenců a neočkovaných malých dětí  Pozitivní výsledky i při ATB terapii (kultivace negativní)  Jen v časné fázi onemocnění (po 3. týdnu klesá citlivost)  Riziko kontaminace nižší než u klasického PCR – pozor na kontaminaci z prostředí

Riffelmann et al., 2005 J Clin Microbiol 43:4925-9

Odběr materiálu na PCR technika stejná jako u kultivace, jiná odběrová souprava  Výtěr z nosohltanu Nylonový tampón na flexibilní plastové tyčince nebo odběrová souprava s tekutým médiem (Eswab, pro průkaz respiračních virů)

 Aspirát z nosohltanu http://www.copanswabs.com

Transport vzorků pro PCR  Nylonový tampón je přepravován suchý - v den odběru přepravovat při pokojové teplotě - při nutnosti skladování přepravovat zmrazený (-20°C)

 Odběrová souprava s tekutým médiem - v den odběru transport při 2-8°C - při nutnosti skladování zmrazit (-20°C)  V laboratoři okamžitě zpracovat nebo skladovat při -20°C do zpracování

Real-Time PCR sekvence B. pertussis, B. parapertussis  IS481 – v mnoha kopiích u B.pertussis, ale není 100% specifická Tato sekvence se vyskytuje i u dalších bordetel: B. holmesii, B. bronchiseptica  PT promoter (ptxA-Pr)- sekvence specifická pro B. pertussis, ale má nižší sensitivitu  IS1001 – v rutinním provozu specifická pro B. parapertussis

Reischl et al., 2001

Real-Time PCR interpretace výsledků  IS481 pozitivní a ptxA-Pr pozitivní - infekce způsobená B.pertussis  IS481 pozitivní - infekce pravděpodobně způsobená B.pertussis  IS1001 pozitivní - infekce pravděpodobně způsobená B.parapertussis

Riffelmann et al. 2005; Caro et al. 2009

Využití odběrového systému ESwab  Recovery of Bordetella pertussis from PCR – positive nasopharyngeal samples is dependent on bacterial load (J. Clin. Microbiol. 12: 4114-4115)  Z této odběrové soupravy se úspěšně dařila kultivace u vzorků pozitivních v metodě Real-Time PCR

B. pertussis

 Vzorky byly před odesláním ke kultivaci skladovány při 4 °C max. týden  Laboratoře, které používají tuto odběrovou soupravu – poslat médium do NRL na kultivaci!

Sérologie pertuse I  Nelze odlišit protilátky postinfekční od postvakcinačních  Hodnota protektivní koncentrace protilátek proti pertusovému toxinu není stanovena – nemá smysl plošně vyšetřovat Ab u ohrožených skupin, je známa pouze hodnota séropozitivity (tzn. reakce IS na setkání s PT)

Riffelmann et al., 2010; Guiso et al., 2010; Watanabe et al., 2006

Sérologie pertuse II  Průkaz onemocnění (ELISA, IU/ml) – stanovení dynamiky IgG Ab proti pertusovému toxinu v párových vzorcích  Vyžaduje 2 vzorky séra (akutní a rekonvalescentní) s odstupem 3 týdnů - poskytuje pozdní, retrospektivní diagnózu  Séra se vyšetřují současně v jedné laboratoři!  Diagnostická sérologie nemůže být správně interpretována po dobu 1 roku od očkování acelulární pertusovou vakcínou (aP) – u těchto pacientů kultivace, PCR

Riffelmann et al., 2010; Guiso et al., 2010; Watanabe et al., 2006

Sérologie pertuse - interpretace výsledků  Pro správné hodnocení - data odběru obou vzorků - datum narození pacienta - vakcinační anamnéza pacienta  ELISA (Pertuse): jako signifikantní (svědčící pro proběhlé onemocnění) se hodnotí vzestup koncentrace Ab o 100% počáteční hodnoty (hodnota naměřená v prvním z párových sér) nebo pokles koncentrace Ab o 50% počáteční hodnoty (platí pro soupravy detekující IgG proti PT v IU/ml)

Doporučená literatura 

Guidance and protocol for the serological diagnosis of human infection with Bordetella pertussis (ECDC, Technical document)



Guidance and protocol for the use of real-time PCR in laboratory diagnosis of human infection with Bordetella pertussis or Bordetella parapertussis (ECDC, Technical document)



What to do and what not to do in serological diagnosis of pertussis: recommendations from EU reference laboratories (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30: 307-312)



Recovery of Bordetella pertussis from PCR – positive nasopharyngeal samples is dependent on bacterial load (J. Clin. Microbiol. 12: 4114-4115)



Laboratory manual for the diagnosis of whooping cough caused by Bordetella pertussis /Bordetella parapertussis (WHO/IVB/04.14 manual)

Poděkování  Laboratořím, které nám zasílají izoláty a séra ke konfirmaci  Epidemiologie: MUDr. Kateřině Fabiánové  Kolektiv laboratoře: MUDr. Daniele Lžičařové Haně Klemové Janě Šimlové

Děkuji za pozornost http://www.szu.cz/narodni-referencni-laborator-pro-pertusi-a-difterii

SZÚ- budova č. 2 1. patro, č.d. 17

Tel.: 267 082 242 E-mail: [email protected]