Blanka Říhová
Směrovaná léčiva a imunostimulace…jen experiment nebo nové možnosti? Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.
FARMAKOLOGICKÝ VÝZKUM
Imunitní systém hostitele
K čemu vlastně imunitní systém potřebujeme?
STATISTIKA 40 % žen mezi 40 – 50 lety má potenciální zhoubné nádory v prsu incidence je 1% 55% mužů mezi 50 – 60 lety má potenciální zhoubné nádory v prostatě incidence je 1% 90% populace ve věku 60 – 70 let má potenciální zhoubné nádory štítné žlázy incidence je 0.1%
Elimination
(Cancer Immunosurveillance)
Equilibrium γδ NK
Genetic instability/ immune selection
Protection
Effect of pulsed electromagnetic field (BEMER 3000) on the survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma (nude mice injected with 15 mg of DOX equiv. of DOX-HPMAHYD)
tumor size (mm3)
100 80 60 40 20 0 0
20
40
60
80
100
120
140
days 3,5 µT
10,5 µT
21 µT
35 µT
B 732
controls
Transformed
p53 Rb Ras
Carcinogens Radiation Chronic inflammation Inherited Viruses
Elimination
Cancer Immunoediting
e.G
„Danger“: uric acid, ECM products
(Cancer Immunosurveillance)
nádor
nádorové buňky
Rae-1 H60 (Mouse)
Normal
léčivo+EMF
10-12 dní
Tumor antigens MICA/B ULBP (Human)
γδ
NKT
CD8+
CD8+
γδ
Mφ φ NKT
γδ
NK NK
IFNγγ Perforin TRAIL
NK
CD4+CD25+ Treg
IDO
Galectin-1
Innate & Adaptive Immunity CD8++ CD4+ CD8+
Escape
Equilibrium
CD4+CD25+ Treg
sMICA/B
MHC-I IFNγγ resporse
Genetic instability/ immune selection
NK CD8+
CD8+ NK
Protection
4 měsíce nádor
nádor nádorové buňky
velikost nádoru (mm3)
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0
10
20
dny
30
40
50
Máme způsoby jak Omezit působení léčiva na zdravé tkáně podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky
Máme způsoby jak Zvýšit akumulaci léčiva v nádorové tkáni nádor je vystaven agresivnější terapii
Máme způsoby jak Zcela nebo podstatně omezit toxicitu vůči imunitnímu systému ten pak může pomoci při konečné likvidaci onemocnění
Paul Ehrlich a jeho „ kouzelná střela“ Psal se rok 1906………… Studies in Immunity, Plenum Press, New York, 1906
OD VÝZKUMU K LÉČBĚ 50 000
nové látky
5 000
testy in vitro
500
testy in vivo
5
klinické testy
1
použití v klinické praxi
POŽADAVKY NA LÉČIVA NOVÉ GENERACE musí se akumulovat v cílové tj. nádorové tkáni - agresivnější léčba vedlejší účinky musí být minimální - podávání ambulantně cirkulace v krevním oběhu musí být prodloužená - podávání nemusí být tak časté léčivo nesmí být během cirkulace toxické - působení je omezeno jen na postiženou tkáň/orgán náklady nesmí být příliš vysoké
LÉČIVA NOVÉ GENERACE SE SCHOPNOSTÍ PASIVNÍ NEBO AKTIVNÍ AKUMULACE a nerozpustné liposomy b rozpustné imunotoxiny c vodorozpustné polymerní systémy
SMĚROVANÁ POLYMERNÍ LÉČIVA
POLYMERNÍ NOSIČE Dextrany Polygalakturonová kyselina Polyglutamová kyselina PEG Poly-L-lysin Blokové kopolymery N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)
N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid HPMA
HPMA NOSIČ neimunogenní nemitogenní netoxický neaktivuje komplement neukládá se v organizmu
Volné léčivo
Směrované léčivo
volné léčivo
směrované léčivo
cílová buňka
cílová buňka
KONFERENCE NIH/NCI-WASHINGTON ZÁŘÍ 2002
a
aktivní směrování
b
pasivní směrování
SMĚRUJÍCÍ MOLEKULY Monoklonální i polyklonální protilátky IgG Lektiny Cukry Růstové hormony Transferin
STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ
PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ
STRUKTURA DOX-HPMA-Ig
DOX
Vazba štěpitelná katepsinem Štěpení katepsinem B B
STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ
PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ
Struktura nesměrovaného DOX-HPMA (PK1)
DOX Štěpení katepsinem B
a) Normální tkáň intaktní endotel lymfatická drenáž
b) Maligní tkáň diskontinuální endotel
omezená lymfatická drenáž
TESTOVÁNÍ In vitro
prokazuje přímý cytotoxický efekt na nádorové buňky
In vivo
kromě přímého cytotoxického efektu na nádorové buňky se účastní ještě další systémy (imunitní, nervový, hormonální..)
in vivo veritas
EXPERIMENTÁLNÍ MODELY
A
B Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD Vyléčené myši byly retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7
Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn´s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer
A
B Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD Vyléčené myši byly retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Ochrana před sekundární nádorovou atakou
Systemická resistence proti nádoru, kterou navozuje léčba polymerními cytostatiky, záleží na
dávce času imunitním systému hostitele
A
B Přežívání myší – PRIMÁRNÍ LÉČBA
Přežívání myší – RETRANSPLANTACE
Dox-HPMAHYD
Dox-HPMAHYD Vyléčené myši byly retransplantovány
controls
1x75 mg/kg
Dox
1x25 mg/kg
Agresivnější léčba
nižší protinádorová resistence
Systemická resistence proti nádoru, kterou navozuje léčba polymerními cytostatiky, záleží na
dávce času imunitním systému hostitele
Přežití po léčbě den 3, 6, 9, 12 nebo 15
počet et myší (%)
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
50
60
70
dny den 3
den 6
den 9
den 12
den 15
kontroly
“vakcinační okno”
léčba započatá příliš brzy, příliš agresivně nebo příliš pozdě vyvolává pouze omezenou protinádorovou resistenci
Léčba začíná příliš brzy (nebo příliš gresivně) imunitní system není vystaven dostatečnému množství nádorových antigenů (nádorových buněk)
Léčba začíná příliš pozdě efektorové mechanismy imunitního systému jsou vyčerpány
Systemická resistence proti nádoru, kterou navozuje léčba polymerními cytostatiky, záleží na
dávce času imunitním systému hostitele
Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7
Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn´s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer
Konvenční myši (B/6) mají dokonale vyvinutý imunitní systém s funkční vrozenou i získanou imunitou Imunodefektní (nu/nu) myši nemají, v důsledku vrozeného postižení, získanou imunitu
Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate BHYD or linear conjugate Dox-HPMAAM - conventional mice
surviving mice (%)
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
50
60
70
days Hyperbranched B/10mg Hyperbranched B/15mg Controls Dox Linear/15 mg Linear/10 mg
80
Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate BHYD or linear conjugate Dox-HPMAAM - nu/nu mice
surviving mice (%)
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30 40 days
50
60
Hyperbranched B/10mg Hyperbranched B/15mg Controls Dox Linear/15 mg Linear/10 mg
70
Konvenční myší až stoprocentní resistence
Imunokompromitované [(nu/nu) myši] žádná resistence
Testování protinádorového léčiva
konvenční myši
myši s poškozenou imunitou
makrofág (APC)
CD4 Th lymfocyt
dendritická buňka
CD8 CTL
NK buňka (LAK buňka)
plasmatická buňka protilátka sekretující protilátky
Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7
Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn´s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer
Winn´s assay
80
80
% surviving mice
100
% surviving mice
100
60 40 20 0
0
20
40
60
80
60 40 20 0
0
20
40
60
days control day 11, no therapy
control day 21, no therapy day 21, Dox-HPMA-HuIg
80
Winn ´s assay 120
survival %
100 80 60 40 20 0 0
10
.
20
30
40
50
60
days
DOX-HPMAAM-HuIg, tumor progression naive cells DOX-HPMAAM-HuIg, tumor regression Doxorubicin, tumor regression
Při léčbě vznikají nádorově specifické paměťové buňky, vznikající z populace CD8+ cytotoxických lymfocytů
Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7
Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn´s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer
Metastatic infiltration to lymph nodes after treatment with free doxorubicin a HPMA conjugates
GFP+/GFP-cells ratio GFP+/GFP
70 60 50 40 30 20 10 0 control
doxorubicin
day 7
DOX-HPMAAM DOX-HPMAHYD
day 14
Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7
Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn´s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer
Acute x chronic cancer Acute
mice were injected once with a lethal dose of cancer cells (1x105 EL4 mouse T cell lymphoma)
8 – 10 days a palpable tumor
chronic
mice were injected 5 times with a low dose of cancer cells (1x104 EL4 mouse T cell lymphoma)
without palpable tumor 6th injection of a low dose of cancer cells
In 10 – 14 days a palpable tumor
% of surviving mice
Survival of mice suffering from acute or chronic cancer (mouse EL4 T cell lymphoma) Dox-HPMAHYD Non-cleavable dendrimer 100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
controls – acute cancer 10 mg Dox-HPMAHYD - acute cancer
40
50
60
70
80
days controls – chronic cancer 10 mg Dox-HPMAHYD - chronic cancer
Polymerní léčiva na bázi HPMA cytotoxická
imunomodulační
složka
Cytotoxicita a imunomodulace
dvojí útok na nádorovou buňku při léčbě polymerními cytostatiky
Pacient nevyčerpaný imunitní systém
vyčerpaný imunitní systém
léčba je účinná
léčba má omezenou účinnost
účastní se obě složky polymerního léčiva
účastní se pouze cytotoxická složka polymerního léčiva
VÝHODY SMĚROVANÝCH LÉČIV NA BÁZI HPMA 1 2 3
4
5 6 7 8
Definovaná vazba léčiva na nosič Kontrolované uvolňování léčiva z nosiče Aktivní akumulace specificky směrovaného léčiva v cílové tkáni Pasivní akumulace léčiva v nádorové tkáni EPR efektem Snížená imunogenicita směrující bílkoviny Prodloužená cirkulace v krevním řečišti Snížená toxicita vůči zdravým orgánům Snížená imunotoxicita
Happy tumor cells hidden and growing in defenceless environment
Treatment with HPMA-based polymeric conjugates......
...has not only a direct cytotoxic effect on cancer cells but also causes their unmasking and exposing to effector mechanisms of immune system
HPMA polymer
Nádorové buňky citlivé S nebo rezistentní R na polymerní proléčivo
S
S R
S S R
polymerní proléčivo obsahující doxorubicin
S S
R S S S R R
R
S
„Imunogení“ buněčná smrt a uvolnění nádorových antigenů
Navození protinádorové immunity (aktivace dendritických buněk, přirozených zabíječů, T a B lymfocytů)
Převzato z: Říhová a spol., Trends in Biotechnology 27, 11-17, 2009
Poděkování Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. Karel Ulbrich Tomáš Etrych Martin Hrubý Petr Chytil Hana Krakovičová Daniela Plocová Robert Pola Jiří Strohalm Martin Studenovský Vladimír Šubr
Poděkování Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. Jaroslav Jan Ondřej Helena Markéta Martina Jiřina Marek Lubomír Veronika Milada Jakub David
Betka Bouček Hovorka Chmelová Ibrahimová Kabešová Kovářová Kovář Kovář Pakanová Šírová Tomola Větvička
Děkuji vám!
PRVNÍ ZKUŠENOSTI S PODÁNÍM U LIDSKÝCH PACIENTŮ
TAA – pacientka č. 6
cytokeratin
cytokeratin
NK A LAK AKTIVITA A ABSOLUTNÍ POČET NK BUNĚK U PACIENTKY Č. 6 700
K 562
70
600
Daudi 60
Raji
500
NK abs
50
400 40 300 30 200
20
100
10 0
0 0
20
40
60
80
dny dávka 1. 1. dávka
dávka 2. 2. dávka
dávka 3. 3. dávka
100
120
abs. počet NK
% zabíjených cílových bun buněk ěk
80
Aktivita NK buněk u pacientů podání
den
E.G.
J.K.
1
0 3
24 45
23 21
9 19
11 33
2
0 3
22 27
10 25
10 16
11 12
3
0 3
23 42
10 12
8 6
13 18
24
24
zdravý dárce NK
% zabitých buněk linie K562
K.R.
K.H.
Koncentrace léčiva v krvi pacientky E.G. po podání Dox-HPMA-HuIg (% injikované dávky) 1. podání
2. podání
*
% podané dávky
den 1 3 7 14 21
doxorubicin 69* 11 6 1 0.6
1 3 7 14 21
N.D. 25 4 3 2
PŘEDBĚŽNÉ VÝSLEDKY U PACIENTŮ a
podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky b není nutná hospitalizace, léčivo se podává ambulantně c léčivo přetrvává v oběhu výrazně déle d je dosahováno dlouhodobé stabilizace onemocnění e kostní dřeň a imunitní systém nejsou poškozeny f část laboratorních testů včetně nádorových znaků je upravena dočasně nebo trvale, další část vykazuje významné zlepšení
Apoptosis
immunogenic
non-immunogenic
cell death
cell death
„Imunogenní“ buněčná smrt
CRT
is a Ca2+ - binding lectin chaperone that is mostly present in the ER lumen
Phagocytosis, processing, maturation, cross-presentation
Translocation of CRT to cell surface P elF2α α Anthracyclins, GADD/PP1 inhibitors
elF2α α PS turnover, apoptosis
HMGB1 = high mobility group box 1
(a)
Engulfed (c) tumor cell in phagosome
(b) TLR4
Immature DC
MHC Class I
Phagocytosis Antigen processing and presentation Scavenger receptors
HMGB1 TLR4
Tumor cell
Binding of HMGB1 to TLR4 Released HMGB
Cell surface -CRT Dying tumor cell
Anthracyclines Anthracyclines
MHC Class II Mature DC
Expression of calreticulin (CRT) and heat shock protein (HSP) 110 on mouse EL4 T cell lymphomaa
sample
Expression of
induction local/systemic anti-cancer immune response
CRT
HSP 110
Dox - HPMAHYD
+
-
+
Dox - HPMAAM
-
+
+
free Dox
+
-
+c/-d
HuIg představuje nejlevnější, nejsnazší a všeobecně použitelné směrování.
Proč?
HuIg - obsahuje přirozené protilátky, z nichž některé mohou reagovat s receptory nádorů
- stimuluje produkci IL-12 a dalších protinádorových a anti-angiogenních cytokinů - zvyšuje aktivitu NK buněk - zvyšuje MW konjugátu (EPR efekt, pasivní akumulace)
Apoptóza
je fyziologický proces. Předpokládá se, že u lidí takto hyne každý den několik milionů buněk
STRUKTURA PROLÉČIV ENZYMATICKY
pH-SENZITIVNÍ
AKTIVOVANÉ PROLÉČIVO
PROLÉČIVO
CH3
CH3
H2C C
H2C C
C O
x
C O
CH3
y
CH3
H 2C C
H 2C C x
NH
Gly
C O
CH2
Phe
NH
X
Leu
CH2
NH
HC
OH
CH3
H3C
HC
Gly HO
OH
CH3
NH
C O
N O
OH
C CH2OH
O
OH
O
OH
O
OMe OMe O
HO CH2OH CH2
OH H
O O
CH3
OH
O
y
OH NH2.HCl
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B
day
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
conjugate B
8
288 600 726 256 320 405 550 405
256 320 550 500 320 288 288 550
11
726 600 320 256 550 600 221 550
600 172 600 320 864 500 256 196
15
600 600 352 196 365 446 1186 75
196 75 108 172 787 14 14 196
18
550 486 1080 600 446 1268 75 6
126 32 14 14 108 787 0 0
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B
day
22
25
28
2025 1080 1080 1080 2025 256 1080 4 6534 5400 6050 3468 10571 2816 5292 126
405 4 4 3240 172 0 0 0 1368 256 0 0 6912 2176 0 0
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A
31
3324 3726 2304 1960 5566 2890 1437 14 6613 9216 8438 12393 12152 4050 10816 1099
conjugate B 1352 0 14 0 4400 864 0 0 2890 600 0 0 9375 3078 0 0
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B 35 7497 650 9464 0 12166 0 6534 3564 1470 6200 6050 0 10140 0 ex ex
day
42
45
5808 17298 ex ex ex ex ex ex
0 0 0 0 2601 15857 10206 ex
38
velikost nádoru velikost nádoru
conjugate A 10571 8750 9688 2432 ex ex ex ex 17100 7142 ex ex ex ex ex ex
conjugate B 0 6613 0 1014 0 0 11300 ex 0 0 0 0 3179 ex ex ex
Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B
day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B
49
10571 ex ex ex ex ex ex ex
0 0 0 0 6613 ex ex ex
52
ex ex ex ex ex ex ex ex
0 0 0 0 ex ex ex ex
56
ex ex ex ex ex ex ex ex
0 0 0 0 ex ex ex ex
59
ex ex ex ex ex ex ex ex
0 0 0 0 ex ex ex ex
Základní pravidla - během dvou - tří dnů po léčbě nádory přestávají růst - první náznaky jejich zmenšení jsou patrné během 5 – 6 dnů po léčbě - pokud nádory do deseti dnů nezaniknou nebo se alespoň nezmenší, už na léčbu reagovat nebudou a musí se uvažovat o další dávce
DC phagocytosis in vitro 300
*
*
*
% of Control
250 200 150 100 50 0
EL-4
Spleen
% of CFSE+Dendritic Cells
6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0
DC phagocytosis in vivo
