SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat. Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi. Diajukan oleh: Rosalia Lestari

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM ASKORBAT DALAM SEDIAAN LARUTAN INJEKSI OBAT PEMUTIH KULIT MEREK “X”

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi

Diajukan oleh: Rosalia Lestari NIM : 128114133

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2016

i


ii


iii


Halaman Persembahan

Matius 11:28 “Marilah kepadaku, hai kamu yang letih lesu dan berbeban berat Aku akan memberi kelegaan kepadamu”

Kupersembahkan untuk: Tuhan, mama, papa, Saudara, Sahabat, Teman, dan Almamaterku

iv


v


vi


PRAKATA

Puji dan syukur penulis haturkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-Nya yang telah diberikan selama proses pengerjaan skripsi ini dari awal hingga akhir, sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul “Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek “X” dapat berjalan dengan lancar dan terselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar sarjana farmasi (S. Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini, penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Aris Widayati, M.Si., Apt., Ph.D. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

2.

Prof. Dr. Sudibyo, M.S., Apt. dan Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing yang bersedia membimbing, memberi masukan dan jalan keluar serta saran yang sangat bermanfaat dalam menyelesaikan penelitian ini hingga penyusunan naskah skripsi.

3.

Dr. Christine Patramurti, M.Si., Apt. dan Jeffry Julianus, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberikn saran dan kritik yang membangun dalam penyusunan skripsi.

4.

Jeffry

Julianus,

M.Si.

selaku

dosen

pembimbing

akademik

atas

pendampingannya dari semester awal hingga akhir ini. Seluruh Dosen

vii


Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta yang telah mendampingi, membagi ilmu, dan pengalamannya yang sangat bermanfaat dalam bidang farmasi. 5.

Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma terutama Mas Bimo, Mas Ottok, Mas Kethul yang telah banyak membantu dan bersedia direpotkan selama penulis menyelesaikan penelitian skripsi.

6.

Mama, papa, mbak Tiwi, kak Kumala, Wulan, dan Elen yang telah mendoakan dan terus memberikan semangat agar cepat menyelesaikan skripsi dan kuliah.

7.

Petra Annie Anjani dan Eunike Lystia Florentien Kelana Jeversoon sebagai teman sekelompok skripsi yang telah berjuang bersama-sama dari awal penyusunan skripsi hingga selesai.

8.

Teman-teman semua yang telah membantu, mendukung, menyemangati penulis. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih atas dukungannya.

Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan di dalam skripsi ini. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun, sangat penulis harapkan. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

viii


DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL................................................................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..................................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................ iii HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................ iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................. v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI................................. vi PRAKATA ............................................................................................................ vii DAFTAR ISI .......................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ................................................................................................ xiii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xviii INTISARI............................................................................................................. xix ABSTRACT ............................................................................................................ xx BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 A. Latar Belakang................................................................................................ 1 B. Tujuan Penelitian ............................................................................................ 5 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...................................................................... 6 A. Asam Askorbat ............................................................................................. 6 B. Spektrofotometri Ultraviolet ........................................................................ 8

ix


C. Larutan Penyangga (Bufer) ........................................................................ 10 D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ............................................... 11 E. Validasi Metode Analisis ........................................................................... 13 F. Landasan Teori .............................................................................................. 16 G. Hipotesis ....................................................................................................... 17 BAB III METODELOGI PENELITIAN .............................................................. 18 A. Jenis dan Rancangan Penelitian.................................................................... 18 B. Variabel Penelitian ........................................................................................ 18 1. Variabel bebas ............................................................................................18 2. Variabel tergantung ....................................................................................18 3. Variabel pengacau terkendali .....................................................................18 C. Definisi Operasional ..................................................................................... 19 D. Bahan Penelitian ........................................................................................... 19 E. Alat Penelitian ............................................................................................... 20 F. Tatacara Penelitian ........................................................................................ 20 1. Pembuatan asam fosfat 0,1 M ....................................................................20 2. Pembuatan bufer fosfat 0,01 M ..................................................................20 3. Pembuatan fase gerak .................................................................................20 4. Pembuatan larutan stok dan intermediate asam askorbat...........................21

x


5. Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk penentuan panjang gelombang maksimum ................................................21 6. Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan spektrofotometer UV-Vis ...........................................................................21 7. Pembuatan seri larutan baku asam askorbat ...............................................22 8. Preparasi larutan sampel .............................................................................22 9. Preparasi adisi baku dalam sampel untuk penentuan akurasi dan presisi ..22 10. Validasi metode analisis ..........................................................................23 11. Uji kestabilan larutan baku ......................................................................24 G. Analisis Hasil................................................................................................ 24 1. Selektivitas .................................................................................................24 2. Linieritas .....................................................................................................24 3. Akurasi .......................................................................................................25 4. Presisi .........................................................................................................25 5. Rentang.......................................................................................................25 6. Uji Kestabilan Larutan Baku ......................................................................26 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................. 27 A. Pembuatan Fase Gerak ................................................................................. 27 B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat .................................................... 29 C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Asam Askorbat ...................... 30

xi


D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Asam Askorbat........... 31 E. Validasi Metode Analisis .............................................................................. 33 1. Selektivitas ..................................................................................................33 2. Linieritas .....................................................................................................35 3. Akurasi ........................................................................................................36 4. Presisi ..........................................................................................................38 5. Rentang .......................................................................................................38 F. Uji Kestabilan Larutan Baku ......................................................................... 38 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 40 A. Kesimpulan ................................................................................................... 40 B. Saran ............................................................................................................. 40 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 41 LAMPIRAN .......................................................................................................... 44

xii


DAFTAR TABEL Tabel I.

Penelitian Asam Askorbat Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .................................................................4

Tabel II.

Kategori metode pengujian validitas .................................................. 14

Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan ............................................. 14 Tabel IV. Kriteria persen recovery yang diperbolehkan .................................... 15 Tabel V.

Kriteria persen relative standard deviation (% RSD) yang diperbolehkan pada beberapa level analit ...........................................16

Tabel VI. Hasil perhitungan % recovery dan % RSD baku asam askorbat........ 37 Tabel VII. Hasil % perubahan uji kestabilan larutan baku asam askorbat .......... 39

xiii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur Asam Askorbat (Moffat et al., 2011) ................................... 6 Gambar 2. Skema eksitasi elektron (Gandjar dan Rohman, 2007) ....................... 8 Gambar 3. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan ................. 28 Gambar 4. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat .... 28 Gambar 5. Spektra penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat .. 30 Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat ............................... 31 Gambar 7. Kromatogram baku asam askorbat .................................................... 32 Gambar 8. Kromatogram sampel ........................................................................ 32 Gambar 9. Kromatogram asam askorbat yang terpisah ...................................... 34 Gambar 10. Asam askorbat dan produk degradasinya .......................................... 34 Gambar 11. Metil paraben..................................................................................... 35 Gambar 12. Propil paraben ................................................................................... 35 Gambar 13. Etiket sampel ..................................................................................... 46 Gambar 14. Kromatogram asam askorbat yang terpisah ...................................... 47 Gambar 15. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi I ................ 49 Gambar 16. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi I ................ 50 Gambar 17. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi I .............. 50 Gambar 18. Kromatogram baku asam askorbat 125 µg/mL Replikasi I .............. 51 Gambar 19. Kromatogram baku asam askorbat 150 µg/mL Replikasi I .............. 51 Gambar 20. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi II ............... 52 Gambar 21. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi II ............... 52 Gambar 22. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi II ............. 53

xiv


Gambar 23. Kromatogram baku asam askorbat 125 µg/mL Replikasi II ............. 53 Gambar 24. Kromatogram baku asam askorbat 150 µg/mL Replikasi II ............. 54 Gambar 25. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi III .............. 54 Gambar 26. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi III .............. 55 Gambar 27. Kromatogram baku asam askorbat 100 µg/mL Replikasi III ............ 55 Gambar 28. Kromatogram baku asam askorbat 125 µg/mL Replikasi III ............ 56 Gambar 29. Kromatogram baku asam askorbat 150 µg/mL Replikasi III ............ 56 Gambar 30. Kurva baku asam askorbat replikasi I ............................................... 57 Gambar 31. Kromatogram sampel Replikasi I...................................................... 58 Gambar 32. Kromatogram sampel Replikasi II .................................................... 58 Gambar 33. Kromatogram sampel Replikasi III ................................................... 59 Gambar 34. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi I ..... 60 Gambar 35. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi II .... 60 Gambar 36. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi III... 61 Gambar 37. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I ..... 61 Gambar 38. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I ..... 62 Gambar 39. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I ..... 62 Gambar 40. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi I ....... 63 Gambar 41. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi II ..... 63 Gambar 42. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi III .... 64 Gambar 43. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 .. 67 Gambar 44. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-1 .. 67 Gambar 45. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-2 .. 68

xv


Gambar 46. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-3 .. 68 Gambar 47. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-4 .. 69 Gambar 48. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-0 69 Gambar 49. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-1 70 Gambar 50. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-2 70 Gambar 51. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-3 71 Gambar 52. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-4 71 Gambar 53. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-0 72 Gambar 54. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-1 72 Gambar 55. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-2 73 Gambar 56. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-3 73 Gambar 57. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-4 74 Gambar 58. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 . 74 Gambar 59. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-1 .. 75 Gambar 60. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-2 .. 75 Gambar 61. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-3 .. 76 Gambar 62. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-4 .. 76 Gambar 63. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-0 77 Gambar 64. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-1 77 Gambar 65. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-2 78 Gambar 66. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-3 78 Gambar 67. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-4 79 Gambar 68. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-0 79

xvi


Gambar 69. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-1 80 Gambar 70. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-2 80 Gambar 71. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-3 81 Gambar 72. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-4 81 Gambar 73. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 .. 82 Gambar 74. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-1 .. 82 Gambar 75. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-2 .. 83 Gambar 76. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-3 .. 83 Gambar 77. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-4 .. 84 Gambar 78. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-0 84 Gambar 79. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-1 85 Gambar 80. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-2 85 Gambar 81. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-3 86 Gambar 82. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 100 µg/mL pada jam ke-4 86 Gambar 83. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-0 87 Gambar 84. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-1 87 Gambar 85. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-2 88 Gambar 86. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-3 88 Gambar 87. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 150 µg/mL pada jam ke-4 89

xvii


DAFTAR LAMPIRAN LAMPIRAN 1. Certificate of Analysis Baku Pembanding Asam Askorbat ...... 45 LAMPIRAN 2. Etiket sampel “X” ..................................................................... 46 LAMPIRAN 3. Kromatogram resolusi pemisahan asam askorbat dan puncak di sebelahnya pada sampel

47

LAMPIRAN 4. Data penimbangan kalium dihidrogen fosfat ............................ 48 LAMPIRAN 5. Data penimbangan baku asam askorbat .................................... 48 LAMPIRAN 6. Skema

pembuatan

larutan

baku

asam

askorbat

dan

perhitungan kadar larutan baku..................................................48 LAMPIRAN 7. Kromatogram kurva baku asam askorbat ................................. 49 LAMPIRAN 8. Data Kurva baku asam askorbat ............................................... 57 LAMPIRAN 9. Kromatogram sampel ................................................................ 58 LAMPIRAN 10. Kromatogram sampel adisi ....................................................... 60 LAMPIRAN 11. Data AUC sampel dan AUC sampel adisi, perhitungan % recovery, perhitungan konsentrasi baku yang terukur, perhitungan RSD baku asam askorbat yang terukur..................65 LAMPIRAN 12. Kromatogram baku asam askorbat untuk pengujian stabilitas larutan baku ...............................................................................67 LAMPIRAN 13. Data AUC uji stabilitas larutan baku, perhitungan % perubahan uji stabilitas larutan baku asam askorbat ..................90

xviii


VALIDASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK UNTUK PENETAPAN KADAR ASAM ASKORBAT DALAM SEDIAAN LARUTAN INJEKSI OBAT PEMUTIH KULIT MEREK “X”

INTISARI

Asam askorbat dapat digunakan sebagai agen pemutih kulit. Kadar asam askorbat dalam larutan injeksi pemutih kulit merek “X” harus memberikan efek yang diinginkan. Untuk menjamin efikasinya, maka perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan obat dengan metode yang telah divalidasi. Penelitian bersifat deskriptif non eksperimental, asam askorbat dianalisis menggunakan sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik dengan fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit dan menggunakan detektor UV-244 nm. Parameter validasi yang digunakan adalah selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. Hasil penelitian menunjukkan parameter selektivitas terpenuhi, akurasi dan presisi yang baik pada konsentrasi tinggi (konsentrasi asam askorbat = 120 µg/mL) dengan % recovery = 100,50–101,01% dan RSD = 0,28%. Linieritas yang dihasilkan pada metode ini telah memenuhi syarat dengan nilai r = 0,9989 pada konsentrasi asam askorbat 50–150 µg/mL. Kata kunci: asam askorbat, larutan injeksi pemutih kulit merek “X”, KCKT fase terbalik, validasi

xix


VALIDATION METHOD OF REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR THE ASSAY OF ASCORBIC ACID IN THE WHITENING SKIN INJECTION BRAND “X”

ABSTRACT Ascorbic acid can be used as agent for skin whitening. Ascorbic acid level inside skin whitening “X” injection should give the desired effect. To ensures the efficacy, it’s necessary to determine the ascorbic acid level in the dosage form with a method that has already been validated. This research is descriptive non exprimental. Ascorbic acid is using Reversed High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with stationary phase Phenomenex® C18 (250 x 4.6 mm, 5 µm) and mobile phase methanol : 0.01 M phosphoric buffer adjusting to pH 3 with 0.1 M phosphoric acid (40 : 60), flowrate 0.9 mL/min and detection with UV at 244 nm. Validation parameter used in this research are selectivity, linierity, acuration, precision, and range. This results of the study showed that selectivity reversed-phase HPLC method is reach, accuracy and precision are at high concentration (120 µg/mL) with % recovery = 100.50–101.01% and RSD = 0.28%. The good linierity for ascorbic acid with values (r) of 0.9989 at 50–150 µg/mL. Key Words: ascorbic acid, skin whitening “X” injection dosage form, KCKT reverse phase, validation

xx


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Asam askorbat telah dikembangkan menjadi berbagai macam produk obat, salah satunya sebagai sediaan injeksi pemutih kulit. Produk pemutih kulit dapat menunjang kecantikan kulit, sehingga produk ini diminati oleh banyak konsumen. Produk tersebut digunakan untuk mencerahkan kulit, baik dengan meratakan warna kulit maupun merawat kulit sehingga terhindar dari masalah pigmentasi seperti bintik-bintik hitam, melasma, tanda bekas hamil dan keriput. Beberapa agen pemutih kulit yang saat ini sering digunakan adalah arbutin, vitamin C (asam askorbat), kojic acid, licorice extract, burner root extract, Scutellaria extract dan mulberry (Thongchai et al., 2007). Asam askorbat digunakan dalam produk pemutih kulit karena kemampuannya sebagai antioksidan yang dapat mengikat radikal bebas sehingga mencegah terbentuknya melanin pada kulit, dan asam askorbat memiliki kemampuan untuk melindungi kulit dari bahaya radiasi UV (Arbab dan Eltahir, 2010). Peningkatan konsumsi produk pemutih kulit saat ini membuat banyak produsen yang memproduksi produk-produk pemutih kulit dengan harga produk yang relatif murah dan mengandung asam askorbat yang relatif tinggi, contohnya sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” mengandung asam askorbat 1000 mg per ampul. Jika jumlah asam askorbat tidak sesuai dengan yang tertera pada label, maka konsumen akan dirugikan dari sudut efikasi. Menurut Farmakope V (2014) sediaan obat injeksi asam askorbat mengandung asam

1

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2

askorbat tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari yang tertera pada label. Oleh karena itu, perlu dilakukan penetapan kadar asam askorbat dalam produk pemutih kulit yang mengandung asam askorbat relatif tinggi untuk menjamin

efikasi

produk.

Produk

sediaan

injeksi

intravena

memiliki

bioavailabilitas yang tinggi dibandingkan dengan sediaan peroral (Lullmann, et al., 2000), sehingga asam askorbat dalam sediaan intravena bekerja lebih efisien dan sediaan ini lebih diminati oleh konsumen daripada sediaan peroral. Analisis asam askorbat pernah diteliti sebelumnya

yaitu pada

pengembangan dan validasi metode kuantifikasi asam askorbat dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik oleh Ullah, Shafqat, Arshad Hussain, Javid Ali, Khaliqurrehman dan Asad Ullah (2012) dengan judul “A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan”, penelitian lain mengenai asam askorbat dilakukan oleh Wang, AChing, Shu-Hui Cheng, Ceshing Sheu dan Chang-Chin Kwan (2011) dengan judul “Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair ReversedPhase High Perfomance Liquid Chromatogrpahy”. Pengembangan metode dilakukan melalui tiga tahapan, yaitu: optimasi metode, validasi metode dan aplikasi metode untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sampel injeksi pemutih kulit (Supriyanto, 2014). Optimasi metode analisis untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” telah dilakukan oleh Jeversoon (2016) dengan kondisi KCKT yang optimal menggunakan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/min, fase diam Phenomenex®


C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), dan deteksi UV-244 nm. Validasi metode merupakan langkah yang penting untuk dilakukan dalam tahap penetapan kadar supaya dapat memberikan hasil yang terpercaya dan dapat dipertanggungjawabkan. 1. Perumusan masalah Apakah metode penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) fase terbalik menggunakan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit, fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), dan deteksi UV-244 nm memenuhi persyaratan validitas yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang? 2. Keaslian penelitian Pengembangan dan validasi metode kuantifikasi asam askorbat dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik pernah dilakukan oleh Ullah et al. (2012), dan Wang et al. (2011) yang terangkum dalam Tabel I. Terdapat beberapa perbedaan penelitian yang peneliti lakukan dengan penelitian sebelumnya, yaitu pada fase gerak, jenis kolom, panjang gelombang, dan sampel yang digunakan. Kelebihan penelitian ini adalah sampel yang digunakan merupakan sediaan injeksi pemutih kulit yang belum pernah diteliti oleh penelitian terdahulu. Pada penelitian ini peneliti menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan menggunakan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit, fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), deteksi


UV-244 nm, dan sampel asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”. Tabel I. Penelitian Asam Askorbat Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Peneliti (tahun)

Judul Penelitian

Parameter yang digunakan

Shafqat Ullah, Hussain Arshad, Javid Ali, Khaliqurrehman, and Asad Ullah (2012)

A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin-C in Local Packed Juices of Pakistan

Kolom Inertsil ODS-3 C18 (250 mm x 4,6 mm), fase gerak metanol : bufer fosfat (20 : 80, v/v) pH 3±0,1 dengan kecepatan alir 1,0 mL/menit, dan panjang gelombang 240 nm

A-Ching Wang, Shu-Hui Cheng, Ceshing Sheu, and Chang-Chin Kwan (2011)

Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by IonPair Reversed-Phase High Perfomance Liquid Chromatogrpahy

Kolom Inertsil ODS-3V (250 mm x 4,6 mm, 5 µm), fase gerak asetonitril : larutan bufer campuran (50 mM natrium fosfat monobasic dihidrat dan 2 mM nheksadesiltrimetil amonium bromida) dengan elusi gradien komposisi asetonitril : larutan bufer campuran (99 : 1, v/v) dari menit ke-0 hingga menit ke20, (70 : 30 v/v) dari menit ke-21 hingga menit ke-40, (1 : 99 v/v) dari menit ke41, dengan pH 4,5 dan panjang gelombang 270 nm

Sejauh yang telah peneliti ketahui, penelitian dengan judul Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik Untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat Dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek “X” belum pernah dilakukan sebelumnya. Dengan demikian, jika dilihat dari permasalahan yang ada dalam penelitian ini, maka dapat dikatakan bahwa penelitian ini merupakan karya ilmiah yang asli.


3. Manfaat Penelitian a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan ilmiah tentang penggunaan metode KCKT fase terbalik yang telah divalidasi dalam penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”. b. Manfaat praktis. Hasil penelitian ini diharapkan metode KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi dan divalidasi ini dapat dipergunakan/diaplikasikan pada penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”. B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui validitas metode KCKT fase terbalik dengan sistem yang telah dioptimasi sebelumnya memenuhi persyaratan validasi yang meliputi selektivitas, linearitas, akurasi, presisi, dan rentang, sehingga dapat digunakan pada penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Asam Askorbat Asam askorbat (Gambar 1) yang secara kimia dikenal sebagai (2R)-2[(1S)-1,2-Dihydroxyethyl]-4,5-dihydroxyfuran-3-one

merupakan

senyawa

berbentuk kristal tidak berwarna atau berbentuk serbuk kristal berwarna putih atau kuning pudar. Asam askorbat dengan rumus kimia C6H8O6 memiliki berat molekul

176,1 gram/mol, pKa = 4,2;

11,6 (pada suhu

25oC), dan

log P (oktanol/air) = 1,8. Kelarutan dalam air 1 : 3, dalam etanol 1 : 30, dalam metanol 1 : 10, dan dalam propilen glikol 1 : 20. Dapat larut dalam aseton, tidak larut dalam benzena, kloroform, eter, petroleum eter, minyak, lemak, dan pelarut lemak (Moffat et al., 2011). Asam askorbat sensitif terhadap cahaya dan mudah teroksidasi (Ahuja dan Dong, 2005).

Gambar 1. Struktur Asam Askorbat (Moffat et al., 2011)

Asam askorbat dapat digunakan sebagai agen pemutih kulit (Thongchai et al., 2007). Dosis asam askorbat adalah 0,2-3 g per hari (Moffat et al., 2011). Asam askorbat digunakan dalam produk pemutih kulit karena kemampuannya sebagai antioksidan yang dapat mengikat radikal bebas sehingga mencegah terbentuknya melanin pada kulit. Selain itu, asam askorbat memiliki kemampuan

6


untuk melindungi kulit dari bahaya radiasi UV. Keuntungan inilah yang mendasari pemakaian asam askorbat dalam produk pemutih kulit (Arbab dan Eltahir, 2010). Sediaan injeksi pemutih kulit merek “X” memiliki kandungan yang terdiri dari asam askorbat, metil paraben, propil paraben, natrium hidroksida, dan aqua for injection. Metil paraben merupakan pengawet berbentuk serbuk tak berwarna yang memiliki nilai log P 2,0 dan kelarutan 1 : 400 dalam air. Propil paraben merupakan pengawet serbuk tak berwarna yang memiliki nilai log P 3,0 dan kelarutan 1 : 2500 dalam air (Moffat et al., 2011). Natrium hidroksida sebagai agen untuk penyesuaian pH hingga mencapai 5,5-7,0 untuk menjamin stabilitas sediaan injeksi asam askorbat dan pH larutan mendekati pH darah yaitu 7,4 supaya bila sediaan diinjeksikan ke tubuh tidak terasa sakit (Sulistiyaningsih, 2007). Penelitian mengenai agen pemutih kulit juga dilakukan oleh Ullah et al. (2012) dan Wang et al. (2011) yang terangkum dalam Tabel I. Perbedaan penelitian yang peneliti lakukan dengan penelitian sebelumnya terletak pada fase gerak, jenis kolom, panjang gelombang, dan sampel yang digunakan. Pada penelitian ini, peneliti menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dengan kecepatan alir 0,9 mL/menit, fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), deteksi UV-244 nm, dan sampel asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”.


B. Spektrofotometri Ultraviolet Prinsip spektrofotometri ultraviolet (UV) adalah pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan molekul atau atom dari suatu zat kimia pada panjang gelombang (λ) 190-380 nm (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1995). Serapan atom menyebabkan paralihan atau transisi elektronik, yaitu peningkatan energi elektron dari keadaan dasar (ground state) ke satu atau lebih tingkat energi yang lebih tinggi (Gambar 2) atau tereksitasi (excited state). Transisi terjadi jika energi yang dihasilkan oleh radiasi sama dengan energi yang diperlukan untuk melakukan transisi (Watson, 2000). Radiasi elektromagnetik pada sinar ultraviolet dan sinar tampak memiliki suatu energi yang merambat dalam bentuk gelombang. Jarak linier antara titik pada satu gelombang dengan titik yang berada pada gelombang terdekatnya disebut sebagai panjang gelombang (Watson, 2000).

Gambar 2. Skema eksitasi elektron (Gandjar dan Rohman, 2007)

Molekul-molekul yang memerlukan energi yang lebih sedikit untuk mengeksitasi elektron maka akan menyerap energi pada panjang gelombang yang lebih panjang, sedangkan untuk molekul-molekul yang memerlukan energi yang


lebih banyak untuk mengeksitasi elektron maka akan menyerap energi pada panjang gelombang yang lebih pendek (Fessenden and Fessenden, 1997). Jumlah energi yang diserap oleh molekul-molekul disebut sebagai absorban. Hukum Lambert-Beer menunjukkan bahwa absorbansi suatu senyawa dipengaruhi oleh absorptivitas molar, tebal kuvet dan konsentrasi molekul senyawa analit (Gandjar dan Rohman, 2007). Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam persamaan: A= bc

(1)

Keterangan: A = absorbansi = absorptivitas molar (M-1. cm-1) b = tebal kuvet (cm) c = konsentrasi molekul dalam senyawa analit

(Gandjar dan Rohman, 2007)

Nilai absorptivitas molar tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. Dikatakan sebagai absorptivitas molar ( ) apabila konsentrasi molekul zat analit dalam satuan Molar (M), namun jika konsentrasi molekul zat analit dalam satuan persen berat/volume (g/100 mL), maka absorptivitas ditulis dengan

. Nilai absorptivitas menunjukkan sensitivitas

senyawa untuk diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Semakin besar nilai

suatu senyawa, maka semakin sensitif senyawa tersebut untuk

dideteksi dan diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis (Gandjar dan Rohman, 2007). Hubungan antara =

dengan dapat dilihat dalam persamaan:

x

(2)

= absorptivitas molar (M-1. cm-1)

Keterangan:

= absorptivitas molekul dalam satuan konsentrasi (g/100 mL) BM

= bobot molekul (g/mol)

(Gandjar dan Rohman, 2007)


Asam askorbat (antioksidan) dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang ditunjukkan pada Gambar 6 (Ahuja dan Dong, 2005). Kromofor adalah gugus fungsional tak jenuh yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet dan sinar tampak (Gandjar dan Rohman, 2007), sedangkan auksokrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum (Sastrohamidjojo, 2001). Asam askorbat dalam larutan asam pada panjang gelombang 243 nm memiliki nilai absorptivitas: =556a. Nilai tersebut dapat menunjukkan bahwa senyawa asam askorbat dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai absorptivitas molar asam askorbat adalah 9791,15 M-1.cm-1. Nilai asam askorbat akan mengalami transisi

tersebut menunjukkan bahwa dan dapat diaplikasikan pada

daerah ultraviolet (Rohman dan Gandjar, 2007). C. Larutan Penyangga (Bufer) Bufer dapat mencegah perubahan pH yang disebabkan oleh penambahan baik sedikit asam ataupun sedikit basa. Larutan bufer dapat dibuat dengan mencampurkan asam lemah atau basa lemah dengan garamnya masing-masing. Ketahanan bufer dipengaruhi oleh pH larutan yang dibuat karena jika pH larutan bufer sama dengan pKa asam atau basa yang membentuknya maka bufer dapat bekerja dengan baik (Snyder Kirkland, and Dolan, 2010). Menurut Snyder et al. (2010) terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam pemilihan bufer sebagai fase gerak pada KCKT, yaitu


kapasitas bufer, kelarutan komponen bufer, stabilitas bufer, dan serapan bufer pada daerah UV pada sistem KCKT. Kemampuan suatu bufer untuk mempertahankan pH disebut sebagai kapasitas bufer. Hal ini dipengaruhi oleh nilai pKa asam atau basa lemah penyusun bufer, dan kapasitas bufer berada dalam rentang pH±1,0 unit dari nilai pKa asam atau basa lemah penyusun bufer tersebut. Nilai pKa buffer fosfat adalah 2,1 dan kapasitas buffer fosfat dalam rentang pH 1,1–3,1 (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Menurut Kromidas (2005) nilai UV cut-off

bufer fosfat 50 mM dengan nilai pH = 2,0-3,0 adalah pada panjang

gelombang 210 nm. D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan salah satu metode analisis untuk pemisahan suatu campuran senyawa kimia. Pemisahan pada sistem KCKT terjadi akibat adanya interaksi antara zat analit dengan fase diam dan fase gerak yang kemudian akan menghasilkan perbedaan waktu migrasi dari zat analit (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Ada dua jenis KCKT dalam analisis, yaitu KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik. KCKT fase normal menggunakan fase diam bersifat lebih polar daripada fase geraknya, sedangkan KCKT fase terbalik menggunakan fase diam bersifat lebih non-polar daripada fase geraknya (Snyder et al., 2010). Salah satu keunggulan KCKT dibandingkan dengan kromatografi gas yaitu dapat digunakan untuk menganalisis senyawa yang tidak menguap atau tidak tahan panas tanpa peruraian (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik

Indonesia,

1995).

Kelebihan

HPLC

dibandingkan

metode


spektrofotometri yaitu pada sensitifitas dan selektivitas dalam kemampuan pemisahannya (Ahuja dan Dong, 2005). Instrumen KCKT terdiri atas kolom, detektor, wadah fase gerak, pompa, injector, dan komputer atau perekam data (Ahuja dan Dong, 2005). Salah satu jenis kolom KCKT fase terbalik yang sering digunakan adalah tipe C18 yang tersusun oleh suatu penyangga silika gel (SiO2). Pada bagian permukaan silika terdapat gugus-gugus hidroksil (-OH), sehingga silika gel relatif bersifat polar. Silica gel dapat dimodifikasi dengan menutup gugus silanol dengan hidrokarbon rantai panjang untuk menghilangkan gugus hidroksil. Kebanyakan fase diam dengan penyusun silica memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi pada pH 2-7 (Kazakevich and Lobrutto, 2007). Detektor KCKT digolongkan menjadi dua golongan, yaitu golongan detektor universal dan golongan detektor spesifik. Beberapa karakteristik detektor adalah memiliki respon yang cepat dan reprodusibel terhadap analit, memiliki sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, dan sinyal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Detektor UV merupakan salah satu jenis detektor spesifik yang mendeteksi analit secara spesifik sesuai panjang gelombang yang digunakan. Detektor UV dapat digunakan dalam sistem KCKT untuk senyawa-senyawa yang memiliki serapan pada panjang gelombang 200-400 nm (Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997). Fase gerak yang digunakan harus bersih, tidak berinteraksi dengan analit, dan tidak toksik. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat


bercampur dan berpengaruh pada daya elusi dan resolusi. Pada KCKT, daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas seluruh pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen sampel. Komposisi fase gerak akan mempengaruhi pemisahan dan waktu retensi analit. Sebelum digunakan, fase gerak harus disaring terlebih dahulu untuk menghilangkan partikel-partikel kecil. Adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, karena gas akan mengganggu analisis, terutama mengacaukan bagian pompa dan detektor (Rohman, 2009). Perlu diperhatikan agar nilai UV cutoff fase gerak tidak mengganggu pembacaan hasil analit pada detektor UV. Nilai UV cut-off metanol adalah 205 nm (Kazakevich and Lobrutto, 2007). E. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis merupakan suatu prosedur untuk membuktikan apakah suatu metode analisis telah memenuhi persyaratan yang ditentukan, sehingga

hasil

analisis

dapat

dipertanggungjawabkan

(Unites

States

Pharmacopeial Convention, 2007). Suatu metode perlu divalidasi jika metode tersebut baru dikembangkan untuk analisis senyawa tertentu, revisi dari metode yang sudah baku untuk menyesuaikan dengan perkembangan, metode baku dilakukan di laboratorium yang berbeda oleh analis berbeda atau dikerjakan dengan alat yang berbeda, untuk membandingkan kesetaraan antara dua metode (Rohman, 2009). United States Pharmacopeia (USP, 2007) dan International Conference on Harmonization (ICH, 2005) menyatakan bahwa tidak selalu semua parameter untuk mengevaluasi validasi metode harus diuji. Menurut The United States Pharmacopeia 30 dan The National Formulary 25 tahun 2007, metode analisis


dapat dikelompokkan menjadi empat kategori (Tabel II). Pengelompokkan kategori tergantung pada sifat uji yang dilakukan untuk tujuan validasi metode analisis. Tabel II. Kategori metode pengujian validitas (United States pharmacopeial Convention, 2007) Kategori I II III IV

Keterangan Penentuan kuantitatif komponen-komponen utama obat atau zat aktif (termasuk pengawet) di dalam produk obat jadi Penentuan kemurnian/adanya pengotor (impurities) atau produk-produk hasil degradasi. Kategori II ini dibagi lagi menjadi uji kuantitatif dan uji batas Penentuan karakteristik/sifat-sifat khusus kinerja produk obat jadi, seperti kecepatan disolusi dan uji pelepasan obat Uji identifikasi

Tujuan validasi metode pada penelitian ini adalah untuk penentuan kuantitatif komponen-komponen utama obat atau zat aktif (termasuk pengawet) di dalam produk obat jadi, maka dalam penelitian ini dilakukan validasi metode analisis untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” termasuk dalam kategori I (Tabel III). Parameter yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis ini adalah selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis (United States pharmacopeial Convention, 2007) Kategori II Uji Kuantitatif batas Akurasi Ya Ya * Presisi Ya Ya Tidak Selektivitas Ya Ya Ya Batas deteksi Tidak Tidak Ya Batas kuantitasi Tidak Ya Tidak Linieritas Ya Ya Tidak Rentang Ya Ya * *Mungkin dibutuhkan (tergantung sifat tes yang spesifik) Parameter

Kategori I

Kategori III

Kategori IV

* Ya * * * * *

Tidak Tidak Ya Tidak Tidak Tidak Tidak

Selektivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel (Harmita, 2004).


Selektivitas dapat dibuktikan melalui pemisahan puncak-puncak berdekatan dengan perhitungan nilai resolusi (Rs). Bila hasil perhitungan nilai Rs menunjukkan angka 1,0 berarti puncak kromatogram analit tidak terpisah sampai ke baseline, nilai Rs = 1,5 menunjukkan puncak analit telah terpisah sampai baseline, dan nilai Rs > 1,5 menunjukkan puncak analit telah terpisah sempurna satu sama lain (Gandjar dan Rohman, 2007). Akurasi adalah kedekatan antara nilai kadar terukur (nilai rata-rata hasil analisis) dengan nilai kadar sebenarnya yang diterima. Akurasi dapat dijadikan sebagai penunjuk kesalahan sistematik (Rohman, 2009). Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai % recovery antara 98,0-102,0% (Tabel IV) untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007). Tabel IV. Kriteria persen recovery yang diperbolehkan pada beberapa level analit (Gonzalez dan Herrador, 2007) Analit (%) 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001

Fraksi analit 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Unit 100% 10% 1% 0,1% 100 ppm 10 ppm 1 ppm 100 ppb 10 ppb 1 ppb

Rentang recovery (%) 98-102 98-102 97-103 95-105 90-107 80-110 80-110 80-110 60-115 40-120

Presisi adalah ukuran kedekatan antara serangkaian hasil analisis yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel. Konsep presisi diukur dengan koefisien variasi (KV) atau standar deviasi relatif (RSD) (Rohman, 2009). Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki nilai RSD ≤ 2,0% (Tabel V) untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador, 2007).


Tabel V. Kriteria persen RSD yang diperbolehkan pada beberapa level analit (Gonzalez dan Herrador, 2007) Analit (%) 100 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001 0,0000001

Fraksi analit 1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9

Unit 100% 10% 1% 0,1% 100 ppm 10 ppm 1 ppm 100 ppb 10 ppb 1 ppb

% RSD Horwitz 2 2,8 4 5,7 8 11,3 16 22,6 32 45,3

% RSD AOAC 1,3 1,8 2,7 3,7 5,3 7,3 11 15 21 30

Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon secara langsung dan proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Data respon dan konsentrasi analit yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan matematika untuk mendapatkan linieritas antara konsentrasi dan respon analit (USP, 2007). Persyaratan linieritas yang dapat diterima adalah jika memenuhi nilai koefisien korelasi (r) ≥ 0,998 (Kazakevich dan Lobrutto, 2007). Rentang merupakan interval antara kadar terendah hingga kadar tertinggi yang dapat diukur secara kuantitatif dengan menggunakan metode analisis tertentu dan menghasilkan linieritas, akurasi dan presisi yang baik (Rohman, 2009). F. Landasan Teori Asam askorbat merupakan salah satu agen pemutih kulit yang dapat diformulasikan sebagai larutan injeksi. Asam askorbat mudah terdegradasi oleh oksigen, paparan cahaya, peningkatan suhu, dan katalis logam. Jumlah asam askorbat dalam produk injeksi pemutih kulit perlu untuk dipastikan kesesuaiannya dengan klaim label supaya konsumen tidak dirugikan. Tujuan penelitian ini adalah


untuk memvalidasi metode KCKT fase terbalik yang dapat dipergunakan dalam penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”. Asam askorbat dapat dipisahkan dari matriks sampel larutan injeksi obat pemutih kulit berdasarkan perbedaan kepolarannya dan interaksi antara analit, fase gerak, dan fase diam dalam sistem KCKT. Asam askorbat memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada strukturnya, dalam larutan asam pada panjang gelombang 243 nm dengan detektor UV memiliki nilai

=556a dan nilai

=9791,15 M-1.cm-1, sehingga sistem KCKT fase terbalik dengan detektor UV dapat diaplikasikan untuk analisis kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X”. Validasi metode perlu dilakukan untuk menjamin bahwa hasil aplikasi menggunakan

metode

yang

telah

dioptimasi,

dapat

dipercaya

dan

dipertanggungjawabkan. Validasi metode analisis yang peneliti lakukan termasuk dalam kategori 1, sehingga parameter validasi yang diuji meliputi akurasi, presisi, selektivitas, linieritas dan rentang. G. Hipotesis Validasi metode KCKT fase terbalik dengan fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60), pada penetapan kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” dapat memenuhi persyaratan parameter-parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang.


BAB III METODELOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis dan rancangan penelitian ini adalah deskriptif non eksperimental, karena pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi pada subjek uji dan hanya menggambarkan keadaan yang ada. B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah sistem KCKT yang telah dioptimasi yang meliputi komposisi fase gerak dan kecepatan alir fase gerak yang telah dioptimasi. 2. Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah parameter validasi metode analisis yang meliputi selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. 3. Variabel pengacau terkendali Kemurnian pelarut yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan pelarut dengan kemurnian tinggi, yaitu pelarut pro analysis. Kemurnian baku asam askorbat yang digunakan, untuk mengatasinya digunakan baku yang telah terjamin kualitasnya seperti tercantum pada Certificate of Analysis (CoA).

18


C. Definisi Operasional 1. Sistem KCKT yang digunakan terdiri dari fase diam berupa kolom Phenomenex® (250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) dan fase gerak campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60). 2. Baku asam askorbat yang divalidasi adalah baku yang tercantum pada Certificate of Analysis (CoA). 3. Penelitian yang dilakukan termasuk dalam validasi metode katergori I, yaitu metode yang digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif komponen utama dalam suatu matriks. Validasi yang dilakukan meliputi pengukuran terhadap parameter validasi yaitu selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. D. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah reference standard asam askorbat (Supelco) dengan kemurnian 98,7% yang tertera pada CoA di Lampiran 1, metanol grade

HPLC (E.Merck), asam fosfat 85% (E.Merck),

kalium dihidrogen fosfat p.a (E.Merck), akua demineralisata (PT. Brataco), penyaring Whatman 0,45µm, dan produk pemutih kulit merek “X” diperoleh dari online shop “Y”.

yang


E. Alat Penelitian Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT dengan

detektor

ultraviolet,

Shimadzu

LC-2010C,

kolom

C18

merek

Phenomenex® (250 x 4,6 mm, 5 µm), seperangkat komputer (merek Dell B6RDZ1S Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625730), UV-Vis Spechtrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA dengan detektor silicon photo diode, milipore, ultrasonikator Refsch, Tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ:35 kHz), timbangan analitik SCALTEC (max 60/210 g, min 0,001 g), alat vakum GAST, dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis. F. Tatacara Penelitian 1.

Pembuatan asam fosfat 0,1 M Larutan H3PO4 85% diambil sebanyak 0,3 mL, kemudian diencerkan

dengan akua demineralisata 25,0 mL sehingga konsentrasi H3PO4 menjadi 0,1 M. 2.

Pembuatan bufer fosfat 0,01 M Dilarutkan 0,68 g KH2PO4 dalam 500 mL akua demineralisata, kemudian

pH diatur dengan penambahan asam fosfat 0,1 M hingga mencapai pH 3. 3.

Pembuatan fase gerak Fase gerak dibuat dengan mencampur antara metanol dan 0,1 M bufer

fosfat pH 3,0 (40 : 60). Campuran fase gerak tersebut disaring dengan penyaring Whatman 0,45 µm yang dibantu dengan pompa vakum kemudian didegassing selama 15 menit menggunakan ultrasonicator.


4.

Pembuatan larutan stok dan intermediate asam askorbat a. Pembuatan larutan stok asam askorbat. Ditimbang saksama 20,0 mg asam askorbat, dilarutkan dalam metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga 10,0 mL sehingga kadar lebih kurang 2000 µg/mL. b. Pembuatan larutan baku intermediate asam askorbat. Sebanyak 1,25 mL larutan stok diambil dan diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga 25,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi larutan intermediate 100 µg/mL.

5.

Pembuatan larutan baku asam askorbat yang digunakan untuk penentuan panjang gelombang maksimum Dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 40; 50; dan 60

µg/mL dengan mengencerkan 4,0; 5,0; dan 6,0 mL larutan intermediate menggunakan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga 10,0 mL. 6.

Penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dengan spektrofotometer UV-Vis Masing-masing konsentrasi larutan seri baku asam askorbat 40; 50; dan

60 µg/mL dengan pelarut campuran metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60), discan antara panjang gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Spektrum yang dihasilkan akan menunjukkan panjang gelombang maksimum yang akan digunakan untuk deteksi pada sistem KCKT.


7.

Pembuatan seri larutan baku asam askorbat Diambil sejumlah 250; 375; 500; 625 dan 750 µL larutan stok asam

askorbat (2000 µg/mL), kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan ditambahkan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga tanda batas, sehingga didapatkan konsentrasi sebesar 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, kemudian diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). 8.

Preparasi larutan sampel Sediaan larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” yang mengandung

200 mg/mL asam askorbat, diambil sebanyak 50 µL dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi asam askorbat 1000 µg/mL sebagai larutan stok sampel, kemudian diambil sebanyak 1,4 mL dan dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL, diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) sampai tanda batas sehingga diperoleh konsentrasi asam askorbat 140 µg/mL. Larutan sampel disaring dengan menggunakan milipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit. 9.

Preparasi adisi baku dalam sampel untuk penentuan akurasi dan presisi Diambil sejumlah 1,0; 3,0 dan 5,0 mL larutan intermediate asam askorbat

100 µg/mL, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL dan ditambahkan 1,4 mL stok sampel asam askorbat 200 µg/mL ke dalam masing-masing labu takar dan diencerkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga batas tanda. Larutan disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama


15 menit, kemudian diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). 10. Validasi metode analisis a. Penentuan selektivitas. Sejumlah 20,0 µL larutan sampel yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). Dihitung nilai Rs dari puncak yang diperoleh. b. Penentuan linieritas. Sejumlah 20 µL larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali dan dihitung nilai r (koefisien korelasi). c. Penentuan akurasi dan presisi adisi baku dalam sampel. Sejumlah 20 µL larutan sampel dan larutan sampel yang telah ditambahkan larutan baku asam askorbat (sampel adisi) dengan konsentrasi asam askorbat sebesar 80; 100; dan 120 µg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016). Replikasi dilakukan sebanyak tiga kali dan dihitung nilai % recovery dan koefisien variasi. d. Penentuan rentang. Rentang konsentrasi sampel uji yang memenuhi persyaratan linieritas, akurasi, dan presisi.


11. Uji kestabilan larutan baku Larutan baku asam askorbat dengan konsentrasi 50; 100 dan 150 µg/mL yang telah disaring dengan millipore dan didegassing dengan ultrasonicator selama 15 menit, diinjek ke sistem KCKT fase terbalik hasil optimasi Jeversoon (2016) dalam jam yang berbeda untuk dilihat seberapa besar perubahan konsentrasi yang dihasilkan dari masing-masing larutan baku. Konsentrasi diukur dalam pengukuran selama 4 jam. Dihitung nilai persen perubahan yang diperoleh. G. Analisis Hasil 1. Selektivitas Selektivitas ditentukan dari kemampuan metode KCKT fase terbalik yang telah dioptimasi untuk memisahkan asam askorbat dalam larutan injeksi pemutih kulit. Selektivitas ditentukan dengan parameter resolusi (Rs) dengan rumus: (2) Keterangan: Rs = resolusi tR1 = waktu retensi puncak analit pertama tR2 = waktu retensi puncak analit kedua W1 = lebar dasar puncak pertama W2 = lebar dasar puncak kedua

Nilai Rs > 1,5 menunjukkan puncak analit telah tepisah sempurna satu sama lain (Gandjar dan Rohman, 2007). 2. Linieritas Linieritas dinyatakan dengan koefisien korelasi (r). Konsentrasi larutan baku asam askorbat yang diperoleh diplotkan terhadap luas puncak pada


kromatogram sehingga diperoleh nilai r dari persamaan y = bx + a. Persyaratan linieritas yang dapat diterima adalah jika memenuhi nilai r ≥ 0,998 (Kazakevich and Lobrutto, 2007). 3. Akurasi Akurasi metode dinyatakan dengan nilai % recovery adisi baku yang dihitung dengan rumus: (3) Keterangan:

Xn = Konsentrasi larutan n setelah adisi Xo = Konsentrasi tanpa adisi (blanko) X’ = Konsentrasi adisi (perhitungan manual)

Akurasi dikatakan baik bila memiliki nilai % recovery antara 98,0-102,0% untuk kadar analit 10-100% (Gonzalez dan Herrador, 2007). 4. Presisi Presisi dihitung sebagai standar deviasi relatif (RSD) atau koefisien variasi (RSD), dengan rumus perhitungan: (4) Keterangan:

RSD = standar deviasi relatif SD = standar deviasi

Suatu metode dikatakan memiliki keterulangan/presisi yang baik jika memiliki nilai RSD ≤ 2,0% untuk kadar analit 100% (Gonzalez dan Herrador, 2007). 5. Rentang Rentang konsentrasi sampel uji yang memenuhi persyaratan linieritas, akurasi, dan presisi (USP, 2007).


6. Uji Kestabilan Larutan Baku Uji kestabilan larutan baku asam askorbat dihitung dari nilai persen perubahan, dengan rumus perhitungan: % perubahan = | Keterangan:

| x 100%

(5)

Xn = konsentrasi akhir Xo = konsentrasi awal

Suatu larutan baku dikatakan stabil apabila persen perubahan yang dihasilkan tidak lebih dari 2% (Ahuja dan Dong, 2005).


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pembuatan Fase Gerak Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT fase terbalik adalah campuran metanol dan 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mL/menit. Campuran metanol dan bufer fosfat bersifat polar sedangkan kolom Phenomenex® C18 yang digunakan sebagai fase diam bersifat lebih nonpolar, sehingga metode KCKT ini merupakan metode KCKT fase terbalik. Sistem elusi fase gerak yang digunakan dalam penelitian adalah isokratik karena pada sistem ini tidak dilakukan perubahan perbandingan selama proses elusi. Prinsip kerja KCKT adalah memisahkan solut karena adanya perbedaan kecepatan elusi saat melewati kolom KCKT. Pemisahan ini terjadi karena adanya interaksi antara analit, fase diam, dan fase gerak (Rohman, 2009). Interaksi yang terjadi diantara fase diam dan asam askorbat adalah interaksi gaya London, yang ditunjukkan pada Gambar 3. Interaksi gaya London ini merupakan gaya tarikan lemah yang disebabkan oleh dipol induksi sesaat pada suatu atom yang terjadi karena pergerakan elektron dalam suatu orbital (Levita dan Mustarichie, 2012). Interaksi asam askorbat dan fase gerak (metanol dan bufer fosfat) merupakan interaksi hidrogen yang ditunjukkan pada Gambar 4. Interaksi hidrogen merupakan interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara suatu hidrogen yang terikat pada gugus yang memiliki atom elektronegatif dengan suatu atom elektronegatif lain yang memiliki pasangan elektron bebas.

27


Interaksi gaya London Gambar 3. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan

Gambar 4. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat

Larutan bufer fosfat terdiri dari KH2PO4, aqua demineralisata, dan asam fosfat. Aqua demineralisata digunakan sebagai pelarut karena air ini bebas ion atau mineral karena ion seperti ion tembaga dan besi, ion hidroksida dan kuinon dapat menyebabkan kecepatan degradasi asam askorbat menjadi asam dehidroaskorbat meningkat (Wechtersbach and Cigic, 2007). Metanol dan bufer fosfat digunakan sebagai fase gerak karena dapat melarutkan asam askorbat dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit, tidak toksik, dan memiliki nilai UV cut-off jauh dari panjang gelombang asam askorbat, metanol memiliki nilai UV cut-off 205 nm (Rohman dan Gandjar), sedangkan nilai UV cut-off bufer fosfat di bawah 200 nm (Supelco, 2001). Penggunaan bufer fosfat sebagai fase gerak agar


pH dalam kolom dapat relatif stabil sehingga waktu retensi yang dihasilkan oleh senyawa asam askorbat menjadi reprodusibel selama tiga menit. Fase gerak disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom, kemudian fase gerak didegassing dengan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu pengukuran. Larutan metanol dan bufer fosfat masing-masing ditempatkan di dalam chamber fase gerak dengan kapasitas 500 mL. B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat Baku asam askorbat yang digunakan merupakan reference standard Supelco dengan kemurnian 98,7%. Larutan baku asam askorbat dibuat dengan cara melarutkan baku asam askorbat dalam metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) yang berperan pula sebagai fase gerak dalam metode KCKT fase terbalik ini. Fase gerak yang digunakan bersifat polar karena sebagian besar terdiri dari metanol dan air, sehingga dapat melarutkan asam askorbat yang bersifat polar pula, selain itu metanol dan 0,01 M bufer fosfat memenuhi syarat sebagai pelarut, yaitu murni, dapat melarutkan asam askorbat dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit, dan tidak toksik. Komposisi pelarut dan fase gerak yang digunakan sama, sehingga dapat bercampur dan tidak membutuhkan waktu yang lama untuk membentuk puncak yang stabil. Larutan baku asam askorbat dibuat dalam volume 10 mL untuk menghemat pelarut yang digunakan. Konsentrasi larutan stok asam askorbat yang dibuat adalah sebesar 2000 µg/mL, larutan intermediate 100 µg/mL, larutan seri


baku 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. Larutan seri baku digunakan dalam pembuatan kurva baku asam askorbat. Sebelum larutan seri baku dimasukkan ke dalam vial dan diinjek ke sistem KCKT, larutan tersebut disaring terlebih dahulu menggunakan millipore untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom, dan didegassing untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu pengukuran. C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Asam Askorbat Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga konsentrasi yang berbeda, yaitu 40; 50 dan 60 µg/mL menggunakan pelarut campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60). Penggunaan tiga level konsentrasi bertujuan untuk membuktikan bahwa perubahan konsentrasi sampai batas tertentu tidak menyebabkan perubahan panjang gelombang maksimum dan dapat menunjukkan semakin besar konsentrasi yang diukur maka puncak spektra yang dihasilkan semakin tinggi (berbanding lurus). Spektra asam askorbat dapat dilihat pada Gambar 5.

Gambar 5. Spektra penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dalam pelarut campuran metanol : bufer fosfat (40 : 60) pH 3


Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat

Pada Gambar 5 terjadi kenaikkan tinggi spektra seiring dengan kenaikkan konsentrasi. Panjang gelombang maksimum asam askorbat menurut Moffat et al. (2011) adalah 243 nm, sedangkan pada pengukuran didapatkan panjang gelombang maksimum adalah 244 nm. Asam askorbat dapat memberikan serapan di daerah UV karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom seperti pada Gambar 6. Menurut Farmakope Indonesia edisi V (2014), pergeseran panjang gelombang yang digunakan dalam rentang 1 nm dari panjang gelombang teoritis yaitu di daerah 242-244 nm, sehingga panjang gelombang 244 nm dapat digunakan dalam pengukuran menggunakan KCKT fase terbalik. D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi (tR) Asam Askorbat Sampel injeksi obat pemutih kulit merek “X” memiliki beberapa kandungan senyawa yang tertera pada label produk, yaitu: asam askorbat, natrium hidroksida, metil paraben, propil paraben, dan aqua pro injection. Tes identifikasi dalam sistem KCKT ini menggunakan nilai waktu retensi dari senyawa asam askorbat yang terdapat dalam baku asam askorbat. Tes ini bertujuan untuk membuktikan adanya asam askorbat dalam sampel injeksi obat pemutih kulit merek “X”. Di dalam sampel, asam askorbat dapat diketahui dari nilai waktu retensi yang mirip dengan nilai waktu retensi asam askorbat pada baku. Waktu


retensi asam askorbat yang diperoleh merupakan waktu analit untuk melewati fase diam dengan bantuan fase gerak.

Gambar 7. Kromatogram baku asam askorbat Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Gambar 8. Kromatogram sampel Parameter KCKT= Gambar 7

Sistem KCKT pada penelitian ini menggunakan sistem KCKT terbalik sehingga asam askorbat yang bersifat polar memiliki waktu retensi yang singkat karena sistem KCKT yang digunakan merupakan sistem KCKT fase terbalik. Pada Gambar 7 terlihat bahwa baku asam askorbat memiliki waktu retensi selama


3,033 menit, dan pada Gambar 8 (kromatogram sampel) terdapat puncak pada 3,033 menit pula. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam sampel injeksi pemutih kulit merek “X” terdapat asam askorbat, sesuai yang tertera pada label produk tersebut. E. Validasi Metode Analisis Validasi metode analisis perlu dilakukan untuk menjamin bahwa hasil aplikasi

metode

yang

telah

dioptimasi

dapat

dipercaya

dan

dipertanggungjawabkan. Validasi metode analisis yang peneliti lakukan termasuk dalam kategori 1, sehingga parameter validasi yang diuji meliputi selektivitas, linieritas, akurasi, presisi, dan rentang. 1. Selektivitas Selektivitas adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur dengan akurat respon analit di antara seluruh komponen sampel (Harmita, 2004). Menurut Gandjar dan Rohman (2007), puncak analit telah terpisah sempurna satu sama lain jika nilai Rs > 1,5. Hasil penelitian dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik dengan fase diam Phenomenex® C18 dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60) pada panjang gelombang 244 nm didapatkan nilai Rs hasil pemisahan asam askorbat terhadap puncak di sebelahnya dalam sampel pada waktu retensi 3,095 menit sebesar 11,443 (Gambar 9) yang menunjukkan bahwa analit terpisah sempurna dengan puncak di sebelahnya.


Gambar 9. Kromatogram asam askorbat yang terpisah dengan puncak di sebelahnya Parameter KCKT = Gambar 7

Kelemahan pada penelitian ini yaitu tidak dilakukan penginjekan larutan plasebo dan pembanding asam dehidroaskorbat (degradan utama dari asam askorbat). Menurut Deutsch dalam Nováková, Solichová, and Solich (2008), larutan asam dehidroaskorbat memberikan nilai absorbansi kecil pada panjang gelombang di atas 220 nm, senyawa asam dehidroaskorbat (Gambar 10) memiliki kepolaran yang mirip dengan asam askorbat. Asam dehidroaskorbat memiliki gugus kromofor yang lebih pendek daripada asam askorbat, sehingga senyawa ini memiliki nilai panjang gelombang yang lebih pendek pula daripada nilai panjang gelombang asam askorbat. Panjang gelombang yang digunakan pada penelitian ini pada 244 nm dengan konsentrasi asam askorbat yang tinggi, sehingga berdasarkan teori dapat disimpulkan bahwa asam dehidroaskorbat tidak memberikan gangguan yang bermakna pada puncak asam askorbat.

Gambar 10. Asam askorbat dan produk degradasinya (Nováková et al., 2008)


Di dalam sampel terdapat metil paraben, propil paraben, dan NaOH. Jika plasebo diinjekkan dalam sistem KCKT fase terbalik pada panjang gelombang 244 nm ini, maka NaOH tidak terdeteksi, puncak metil paraben dan propil paraben memiliki waktu retensi yang lebih lama daripada puncak asam askorbat. Hal tersebut disebabkan karena NaOH tidak memiliki kromofor, adanya perbedaan kepolaran antara asam askorbat, metil paraben, dan propil paraben. Metil paraben (Gambar 11) dan propil paraben (Gambar 12) yang masing-masing memiliki nilai log P 2,0 dan 3,0, memiliki index lipofilisitas yang besar dibandingkan dengan asam askorbat yang memiliki nilai log P -1,8. Berdasarkan teori tersebut, peneliti dapat menyatakan bahwa puncak asam askorbat terpisah dari puncak matrik sampel.

Gambar 11. Metil paraben (Moffat et al., 2011) Gambar 12. Propil paraben (Moffat et al., 2011)

2. Linieritas Linieritas dalam suatu prosedur analisis menunjukkan korelasi yang proporsional antara respon detektor yang terukur dan konsentrasi analit. Penentuan linieritas menggunakan persamaan regresi linier pada kurva baku. Pada penelitian ini, pembuatan kurva baku menggunakan lima seri konsentrasi (ICH, 2005) baku asam askorbat yang terdiri dari konsentrasi 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. Koefisien korelasi (r) dapat menunjukkan linieritas kurva baku. Nilai r semakin mendekati satu menunjukkan linieritas yang semakin baik, sehingga


dapat digunakan untuk perhitungan kadar analit dalam sampel. Terdapat pertimbangan lain yang harus diperhatikan dalam pemilihan kurva baku, yaitu nilai intersept (A) dan slope (B). Nilai A dari persamaan y = Bx+A merupakan baseline error yang seharusnya pada konsentrasi nol respon yang dihasilkan juga nol, tetapi jika pada konsentrasi nol terdapat respon maka hal ini dapat mengacaukan data yang ada, sedangkan nilai B yang diharapkan adalah yang semakin besar atau mendekati sudut 45o. Pada pemilihan kurva baku digunakan persamaan kurva baku replikasi I karena nilai A replikasi I yang paling kecil di antara nilai A dari ketiga replikasi. Kurva baku pada penelitian ini dengan nilai r = 0,9989 telah memenuhi syarat linieritas kurva baku menurut Kazakevich dan Lobrutto

(2007).

Persamaan

kurva

baku

yang

digunakan

adalah

y = 70202x – 296485 dengan rentang konsentrasi dari 50 µg/mL sampai dengan 150 µg/mL. 3. Akurasi Akurasi prosedur analisis menunjukkan kedekatan hasil analisis analit dengan nilai konsentrasi analit sebenarnya yang diterima. Parameter akurasi dapat dinyatakan dalam % recovery. Jika asam askorbat yang tertera pada label kemasan merupakan zat aktif dari sediaan injeksi tersebut dan kadar asam askorbat yang tertera pada label kemasan berada dalam rentang kadar analit 10-100%, maka metode ini dapat dikatakan akurat jika memiliki % recovery sebesar 98,0-102,0%. Pada penelitian ini, % recovery diperoleh dengan menggunakan metode standar adisi

atau

metode

penambahan

baku.

Pengukuran

dilakukan

dengan

menambahkan tiga level konsentrasi baku yang kadarnya diketahui, ke dalam


sejumlah sampel yang kadarnya tidak diketahui secara pasti sehingga diukur sebagai sampel adisi, dilakukan pula pengukuran pada sampel tanpa baku, sehingga dari kedua pengukuran tersebut didapatkan konsetrasi baku yang terukur dalam sampel adisi tersebut. Hal ini mengikuti aturan dari ICH bahwa akurasi sebaiknya dilakukan pada tiga level konsentrasi (80, 100, dan 120%) dan setiap level konsentrasi dilakukan pengulangan sebanyak tiga kali, sehingga dapat diperoleh sembilan data % recovery. Selisih antara konsentrasi sampel adisi dan sampel (tanpa adisi), dibandingkan dengan konsentrasi baku secara teoritis untuk mendapatkan % recovery. Level konsentrasi rendah, tengah, dan tinggi yang digunakan pada penelitian ini berturut-turut adalah 80; 100; dan 120 µg/mL. Tabel VI. Hasil perhitungan % recovery dan RSD baku asam askorbat yang terukur Level konsentrasi

Replikasi I

Rendah

Sedang

Tinggi

Konsentrasi asam askorbat (µg/mL) RSD baku yang terukur Sampel Sampel adisi Baku (%) yang terukur yang terukur yang terukur 70,99 82,32 11,32 11,01

7,94

% Recovery (%) 114,73

II

72,46

83,47

III

77,00

86,73

9,72

98,49

I

70,99

99,84

28,84

97,41

II

72,46

99,97

27,51

III

77,00

107,43

30,42

102,75

I

70,99

120,83

49,83

100,97

II

72,46

122,05

49,59

III

77,00

126,85

49,85

5,05

0,28

111,51

92,89

100,50 101,01

Dalam penelitian ini, nilai % recovery pada konsentrasi rendah adalah 98,49-114,73%, pada konsentrasi sedang adalah 92,89-102,75%, pada konsentrasi tinggi adalah 100,50-101,01% (dapat dilihat pada Tabel VI). Pada level konsetrasi rendah, konsentrasi yang digunakan lebih kecil daripada level konsentrasi tinggi, sehingga perubahan sedikit saja memberikan nilai % recovery dalam rentang yang lebih luas daripada % recovery level konsentrasi tinggi. Parameter akurasi


terpenuhi pada level konsentrasi tinggi, sehingga disarankan untuk melakukan pengukuran di atas level konsentrasi tinggi (120 µg/mL). 4. Presisi Menurut Horwitz dalam Gonzalez dan Herrador (2007), suatu metode memiliki presisi yang baik jika nilai RSD ≤ 2,0% untuk kadar analit 100%. Dalam penelitian ini, nilai RSD baku asam askorbat dalam sampel adisi yang diperoleh pada level konsentrasi rendah = 7,94%, level konsentrasi sedang = 5,05%, level konsentrasi tinggi = 0,28%. Pada level konsentrasi rendah, konsentrasi yang digunakan lebih kecil daripada level konsentrasi tinggi, sehingga perubahan sedikit saja memberikan nilai RSD lebih besar daripada nilai RSD level konsentrasi tinggi. Parameter presisi terpenuhi pada level konsentrasi tinggi. 5. Rentang Parameter rentang pada penelitian ini tidak terpenuhi karena hanya satu level konsentrasi yang memenuhi parameter akurasi, presisi, dan linieritas, yaitu pada level konsetrasi tinggi (120 µg/mL). F. Uji Kestabilan Larutan Baku Uji kestabilan larutan baku merupakan hal penting dalam melakukan analisis untuk kuantifikasi suatu senyawa, terutama untuk senyawa-senyawa yang labil seperti asam askorbat. Pengujian kestabilan larutan baku asam askorbat minimal dilakukan dalam rentang waktu dari saat pembuatan larutan baku asam askorbat hingga berakhir semua pengukuran larutan baku asam askorbat tersebut. Pada penelitian ini, peneliti melakukan pengukuran larutan baku asam askorbat


kurang lebih selama 2 jam, sehingga jika larutan baku tetap stabil selama 2 jam maka pengukuran asam askorbat selama 2 jam ini dapat digunakan secara pasti dalam kuantifikasi. Menurut Ahuja dan Dong (2005), larutan baku dapat dikatakan stabil jika persen perubahan yang terjadi kurang dari 2% selama waktu yang diperlukan untuk pengukuran yang menggunakan larutan baku. Pada penelitian ini dilakukan pengujian stabilitas larutan baku pada konsentrasi 50; 100 dan 150 µg/mL selama 4 jam. Pada Tabel VII menunjukkan besarnya perubahan yang terjadi pada uji kestabilan larutan baku asam askorbat. Berdasarkan data pada Tabel VII dapat dilihat bahwa persen perubahan yang terjadi pada 50; 100 dan 150 µg/mL kurang dari 2%, maka larutan baku asam askorbat yang diukur selama 4 jam merupakan larutan baku yang stabil dan dapat digunakan untuk kuantifikasi baik dalam validasi metode analisis maupun pengukuran kadar asam askorbat dalam sampel. Tabel VII. Hasil % perubahan uji kestabilan larutan baku asam askorbat konsentrasi 50; 100; dan 150 µg/mL Kadar Teoritis Replikasi (µg/mL) I 50 II III I 100 II III I 150 II III

Kadar terukur (µg/mL) pada jam ke0 58,91 54,27 50,54 101,09 99,55 103,14 148,86 138,74 143,91

1 58,87 54,27 50,53 101,08 99,48 103,10 148,83 138,67 143,91

2 58,86 54,25 50,53 101,07 99,48 103,09 148,79 138,63 143,87

3 58,86 54,20 50,52 101,05 99,46 103,07 148,78 138,56 143,86

4 58,84 54,18 50,52 100,93 99,30 103,07 148,74 138,52 143,82

Persen perubahan (%) jam ke1 2 3 4 0,064 0,087 0,089 0,119 0,000 0,040 0,135 0,167 0,028 0,029 0,048 0,050 0,009 0,022 0,033 0,158 0,068 0,075 0,094 0,248 0,031 0,048 0,064 0,067 0,022 0,50 0,053 0,085 0,051 0,075 0,129 0,157 0,000 0,024 0,033 0,061


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Metode KCKT fase terbalik dengan fase diam Phenomenex® C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm) dan fase gerak metanol : 0,01 M bufer fosfat dengan penambahan larutan 0,1 M asam fosfat hingga pH 3 (40 : 60), pada penetapan kadar asam askorbat dalam larutan injeksi obat pemutih kulit merek “X” memenuhi persyaratan parameter selektivitas, linieritas pada konsentrasi 50-150 µg/mL dengan nilai (r) sebesar 0,9989, akurasi dan presisi pada level konsentrasi tinggi (120 µg/mL). B. Saran 1.

Perlu ditambahkan plasebo sampel dan baku pembanding asam dehidroaskorbat pada 6analisis asam askorbat dalam sampel injeksi obat pemutih kulit merek “X”.

2.

Perlu dilakukan validasi pengukuran menggunakan standar adisi pada level konsentrasi lebih tinggi daripada 120 µg/mL untuk memperoleh daerah atau rentang yang memenuhi syarat akurasi dan presisi.

3.

Penelitian analisis asam askorbat dapat menggunakan kolom kiral-Pirkle untuk memisahkan L-asam askorbat dan D-asam askorbat.

40


DAFTAR PUSTAKA Ahuja, S., and Dong, M.W., 2005, Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC, vol. 6, Elsevier Inc., USA, pp. 49, 58-62, 138, 384, 210- 211. Arbab, A.H.H., and Eltahir, M.M., 2010, Review on Skin Whitening Agents, Khartoum Pharmacy Journal, Vol. 13 (1), pp. 5-7. Direktorat jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 1009, 1061. Direktorat jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 2014, Farmakope Indonesia, Edisi V, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 142, 143, 931, 1323. Fessenden, R.J., and Fessenden, J.S., 1997, Kimia Organik, Edisi III, Jilid 1, diterjemahkan oleh Aloysius Handayana Pudjaatmaka, Penerbit Erlangga, Jakarta, hal. 436. Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis Farmasi, cetakan I, Pustaka Pelajar, Yogyakarta, hal. 220-225, 228-243, 339. Gonzalez, A.G., and Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to Analytical Method Validation, Including Measurement Uncertainty and Accuracy Profiles, Trends in Analytical Chemistry, Department of Analytical Chemistry, Vol. 26, No. 3, pp. 227-238. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya, Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. 1, No. 3, hal. 117-134. Jeversoon, E.L.F.K., 2016, Optimasi Komposisi dan Kecepatan Alir Fase Gerak Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek “X”, Skripsi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, Yogyakarta. Kazakevich, Y., and Lobrutto, R., 2007, More Practical Problem Solving in HPLC, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA Weinheim, Germany, p. 34. Kromidas, S., 2005, More Practical Problem Solving in HPLC, Wiley-VCH Verlag GmbH, Jerman, p. 34. Levita, J., dan Mustarichie, R., 2012, Pemodelan Molekul dalam Kimia Medisinal, Graha Ilmu, Yogyakarta, hal. 22-25. Lullmann, H., Mohr, K., Ziegler, A., Bieger, D., 2000, Color Atlas of Pharmacology, Edisi II, Thieme Stuttgrat, New York, p. 18.


Moffat, A.C., Osselton, M.D., and Widdop, B., 2011, Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons in Pharmaceuticals, Body Fluids and Postmortem Material, 4th Edition, Pharmaceutical Press, USA, pp. 923, 1670, 1976. Nováková, L., Solichová, D., and Solich, P., 2008, HPLC Methods for Simultaneous Determination Ascorbic Acid and Dehydroascorbic Acids, Trends in Analytical Chemistry, 27 (10), pp. 950, 956. Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta, hal. 111-116, 217, 223-226, 232, 380. Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, cetakan II, Liberty, Yogyakarta, hal. 9. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method Development, 2nd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 296300. Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Dolan, J.W., 2010, Introduction to Modern Liquid Chromatography, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, p. 311. Sulistiyaningsih, R., 2007, Pengujian Potensi Sediaan Injeksi Kering Amoksisilin dalam Aqua pro Injeksi pada Variasi Suhu Penyimpanan dan Konsentrasi, Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran, Bandung, hal. 4. Supelco,

2001, Buffered Mobile Phases in Reversed-Phase Liquid Chromatography, Sigma-Aldrich Co., http://www.lcresources.com, diakses tanggal 10 Maret 2016.

Supriyanto, 2014, Pengembangan Metode Penetapan Kadar Campuran Pemanis, Pengawet, dan Pewarna Secara Simultan dalam Sirup Esens dengan Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Tesis, 4, Universitas Sumatera Utara, Sumatera Utara. Thongchai, W., Liawruangrath, B., and Saisunee L., 2007, High Perfomance Liquid Chromatograpic Determination of Arbutin in Skin-Whitening Creams and Medicinal Plant Extracts, J.Cosmet. Sci., Vol. 58, pp. 35-44. Ullah, A., Hussain, A., Ali, J., Khaliqurrehman, and Ullah, A., 2012, A Simple and Rapid HPLC Method for Analysis of Vitamin C in Local Packed Juices of Pakistan, Middle-East Journal of Scientific Research, Vol. 12 (8), pp. 1085-1091. United States Pharmacopeial Convention, 2007, United States Pharmacopeia, Edisi 30, United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville.


Wang, A., Cheng, S., Sheu, C., and Kwan, C., 2011, Simultaneous Determination of Five Whitening Agents by Ion-Pair Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography, Int. Journal of Applied Science and Engineering, Vol. 9 (4), pp. 287-299. Watson, D.G., 2000, Pharmaceutical Analysis: A Textbook for Pharmacy Students and Pharmaceutical Chemists, Churchill Livingstone, London, pp. 7680. Wechtersbach, L., and Cigic, B., 2007, Reduction of Dehydroascorbic Acid at Low pH, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, Vol. 70, pp. 767-772.


LAMPIRAN


LAMPIRAN 1. Certificate of Analysis (CoA) Baku Pembanding Asam Askorbat


LAMPIRAN 2. Etiket sampel “X”

Gambar 13. Etiket sampel


LAMPIRAN 3. Kromatogram resolusi pemisahan asam askorbat dan puncak di sebelahnya pada sampel

Gambar 14. Kromatogram asam askorbat yang terpisah dari puncak di sebelahnya Rs = 11,443 Fase diam Fase gerak Kecepatan alir Volume injeksi Detektor

: Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) : 0,9 mL/min : 20 µL : UV-244 nm


LAMPIRAN 4. Data penimbangan kalium dihidrogen fosfat Berat (g) Wadah Wadah+zat Zat

15-01-2016 0,25400 0,93418 0,68018

16-01-2016 0,25866 0,93813 0,67947

08-02-2016 0,24792 0,92840 0,68048

09-02-2016 0,24001 0,92013 0,68012

10-02-2016 0,23990 0,92028 0,68038

LAMPIRAN 5. Data penimbangan baku asam askorbat 1. Baku dalam Pembuatan Kurva Baku Berat (g) Replikasi 1 Wadah 0,12001 Wadah+zat 0,14003 Zat 0,02002

Replikasi 2 0,11444 0,13444 0,02000

Replikasi 3 0,11980 0,13982 0,02002

2. Baku dalam Sampel Adisi Berat (g) Wadah Wadah+zat Zat

Replikasi 2 0,12488 0,14488 0,02000

Replikasi 3 0,12246 0,14246 0,02000

Replikasi 2 0,12245 0,14244 0,01999

Replikasi 3 0,11844 0,13843 0,01999

Replikasi 1 0,11202 0,13202 0,02000

3. Baku dalam Pengujian Stabilitas Larutan Baku Berat (g) Replikasi 1 Wadah 0,13436 Wadah+zat 0,15437 Zat 0,02001

LAMPIRAN 6. Skema pembuatan larutan baku asam askorbat dan perhitungan kadar larutan baku 1. Skema pembuatan larutan baku asam askorbat Timbang seksama sebanyak 20,0 mg asam askorbat. Larutkan dalam metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) dalam labu 10,0 mL hingga batas tanda, sehingga mendapat stok dengan konsentrasi 2000 µg/mL. Ambil larutan stok masing-masing sebanyak 250; 375; 500; 625 dan 750 µL ke dalam labu 10,0 mL, tambahkan dengan metanol : bufer fosfat pH 3 (40 : 60) hingga batas tanda sehingga diperoleh konsentrasi seri larutan baku 50; 75; 100; 125 dan 150 µg/mL. 2. Perhitungan kadar larutan baku asam askorbat Sebagai contoh pada perhitungan konsentrasi pada kurva baku replikasi 1 berat zat = 0,02002 g, maka konsentrasi larutan stok adalah 20,02 mg/10,0 mL

= 2,002 mg/mL. Baku

pembanding yang digunakan memiliki kemurnian sebesar 98,7% konsentrasi stok asam askorbat yang sebenarnya adalah 2,002 mg/mL x 98,7% = 1,976 mg/mL atau 197,60 µg/mL. Konsentrasi seri baku: C1 x V1 = C2 x V2 197,60 µg/mL x 0,25 mL = C2 x 10,0 mL C2 = 49,40 µg/mL


Seri baku 1 2 3 4 5

V1 (mL) 0,250 0,375 0,500 0,625 0.750

C2 (µg/mL) 49,40 74,10 98,80 123,50 148,20

LAMPIRAN 7. Kromatogram kurva baku asam askorbat 1. Replikasi I

Gambar 15. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi I Fase diam Fase gerak Kecepatan alir Volume injeksi Detektor



Gambar 16. Kromatogram baku asam askorbat 75 µg/mL Replikasi I Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm






2. Replikasi II

Gambar 20. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi II Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm






Gambar 24. Kromatogram baku asam askorbat 150 µg/mL Replikasi II Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm 3. Replikasi III

Gambar 25. Kromatogram baku asam askorbat 50 µg/mL Replikasi III Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm








LAMPIRAN 8. Data Kurva baku asam askorbat Replikasi I Replikasi II C (µg/mL) AUC (mAU) C (µg/mL) AUC (mAU) 49,40 3160706 49,35 2381747 74,10 4878178 74,03 4256354 98,80 6595833 98,70 6234766 123,50 8585494 123,38 7847710 148,20 9976942 148,05 10021626 A = -296485 A = -1400005 B = 70202 B = 76479 r = 0,9989 r = 0,9992 Keterangan: C = konsentrasi baku asam askorbat (µg/mL) AUC = Area Under Curve (mAU)

Replikasi III C (µg/mL) AUC (mAU) 49,40 2980232 74,10 4611913 98,80 6713632 123,50 8626599 148,20 10469801 A = -917094 B = 76898 r = 0,9993

Persamaan kurva baku yang digunakan adalah kurva baku replikasi I, yaitu: y = 70202x - 296485

Area Under Curve (mAU)

12000000 y = 70202x - 296485 R² = 0,9979

10000000 8000000 6000000

Series1

4000000

Linear (Series1)

2000000 0 0

50

100

150

200

Konsentrasi (µg/mL) Gambar 30. Kurva baku asam askorbat replikasi I


LAMPIRAN 9. Kromatogram sampel 1. Replikasi I

Gambar 31. Kromatogram sampel Replikasi I Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm 2. Replikasi II

Gambar 32. Kromatogram sampel Replikasi II Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


3. Replikasi III

Gambar 33. Kromatogram sampel Replikasi III Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


LAMPIRAN 10. Kromatogram sampel adisi 1. Sampel adisi level konsentrasi rendah

Gambar 34. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi I Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Gambar 35. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi II Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


Gambar 36. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi rendah Replikasi III Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm 2. Sampel adisi level konsentrasi sedang

Gambar 37. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi sedang Replikasi I Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm





3. Sampel adisi level konsentrasi tinggi

Gambar 40. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi I Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm

Gambar 41. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi II Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


Gambar 42. Kromatogram sampel adisi level konsentrasi tinggi Replikasi III Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm


LAMPIRAN 11. Data AUC sampel dan AUC sampel adisi, perhitungan % recovery, perhitungan konsentrasi baku yang terukur, perhitungan RSD baku asam askorbat yang terukur 1. Nilai AUC sampel dan sampel adisi yang terukur Level Konsentrasi

AUC (mAU) Sampel Sampel adisi 4687498 5482436 4790335 5563003 5109401 5791819 4687498 6712301 4790335 6721307 5109401 7245216 4687498 8185720 4790335 8271998 5109401 8608726

Replikasi I II III I II III I II III

Rendah

Sedang

Tinggi

2. Perhitungan % recovery Pada konsentrasi rendah replikasi I, AUC sampel = 4687498 dan AUC sampel adisi = 5482436. Konsentrasi sampel dan sampel adisi dihitung menggunakan persamaan kurva baku y = 70202x – 296485. Konsentrasi sampel



4687498 = 70202x – 296485 70202 x = 4983983 x = 70,99 µg/mL

Konsentrasi sampel adisi5482436 = 70202x – 296485 70202 x = 5778921 x = 82,32 µg/mL Konsentrasi baku asam askorbat teoritis = 9,87 µg/mL % recovery

= =

x 100% x 100%

= 114,73% 3. Perhitungan baku asam askorbat yang terukur Baku asam askorbat yang terukur = konsentrasi sampel adisi – konsentrasi sampel = 82,32 – 70,99 µg/mL = 11,32 µg/mL


4. Perhitungan RSD asam askorbat yang terukur Pada konsentrasi rendah rata-rata konsentrasi baku yang terukur = 10,68 µg/mL dan nilai SD = 0,84876, maka nilai % RSD =

x 100% = 7,94%

Level konsentrasi

Replikasi

I Rendah

Sedang

Tinggi

Konsentrasi asam askorbat (µg/mL) Baku Sampel Sampel yang adisi terukur 70,99 82,32 11,32

II

72,46

83,47

11,00

III

77,00

86,73

9,72

RSD baku yang terukur (%)

% Recovery (%) 114,73

7,94

111,51 98,49

I

70,99

99,84

28,84

II

72,46

99,97

27,51

97,41

III

77,00

107,43

30,42

102,75

I

70,99

120,83

49,83

100,97

II

72,46

122,05

49,59

III

77,00

126,85

49,85

5,05

0,28

92,89

100,50 101,01


LAMPIRAN 12. Kromatogram baku asam askorbat untuk pengujian stabilitas larutan baku asam askorbat replikasi 1, 2, dan 3 pada konsentrasi 50; 100; dan 150 µg/mL 1. Replikasi 1

Gambar 43. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-0 Fase diam : Phenomenex® C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5 µm Fase gerak : metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 (40 : 60) Kecepatan alir : 0,9 mL/min Volume injeksi : 20 µL Detektor : UV-244 nm




Gambar 46. Kromatogram uji stabilitas larutan baku 50 µg/mL pada jam ke-3 Fase diam Fase gerak Kecepatan alir Volume injeksi Detektor
























2. Replikasi 2







































3. Replikasi 3







































LAMPIRAN 13. Data AUC uji stabilitas larutan baku, perhitungan % perubahan uji stabilitas larutan baku asam askorbat 1. Nilai AUC uji stabilitas larutan baku asam askorbat Kadar

AUC (mAU) pada jam ke-

Teoritis Replikasi (µg/mL)

50

100

150

0

1

2

3

4

I

3839183 3836529 3835568 3835508 3834241

II

3513473 3513472 3511963 3508324 3507098

III

3251718 3250717 3250706 3250011 3249954

I

6800041 6799386 6798513 6797668 6788846

II

6692055 6687328 6686833 6685483 6674689

III

6943852 6941624 6940396 6939192 6938992

I

10153895 10151630 10148625 10148385 10144997

II

9443199 9438254 9435896 9430618 9427940

III

9806002 9805988 9803546 9802681 9799889

2. Perhitungan % perubahan uji stabilitas larutan baku asam askorbat Pada kadar teoritis 50 µg/mL replikasi I, AUC larutan baku pada jam ke-0 = 3839183 dan AUC larutan baku pada jam ke-1 = 3836529. Konsentrasi larutan baku pada jam ke-0 dan pada jam ke-1 dihitung menggunakan persamaan kurva baku y = 70202x – 296485. Konsentrasi larutan baku pada jam ke-0



3839183 = 70202x – 296485 70202 x = 4135668 x = 58,91 µg/mL

Konsentrasi larutan baku pada jam ke-1



3836529 = 70202x – 296485 70202 x = 4133014 x = 58,87 µg/mL

% perubahan jam ke-1 = | =|

|x 100% | x 100%

= 0,068%


Kadar Teoritis Replikasi (µg/mL)

50

100

150

Persen perubahan (%) jam

Kadar terukur (µg/mL) pada jam ke-

ke-

0

1

2

3

4

1

2

3

4

I

58,91

58,87

58,86

58,86

58,840 0,068 0,087 0,089 0,119

II

54,27

54,27

54,25

54,20

54,181 0,000 0,040 0,135 0,167

III

50,54

50,53

50,53

50,52

50,517 0,028 0,029 0,048 0,050

I

101,09

101,08

101,07

101,05 100,928 0,009 0,022 0,033 0,158

II

99,55

99,48

99,48

99,46

III

103,14

103,10

103,09

103,07 103,067 0,031 0,048 0,064 0,067

I

148,86

148,83

148,79

148,78 148,735 0,022 0,50 0,053 0,085

II

138,74

138,67

138,63

138,56 138,521 0,051 0,075 0,129 0,157

III

143,91

143,91

143,87

143,86 143,819 0,000 0,024 0,033 0,061

99,302 0,068 0,075 0,094 0,248


Biografi Penulis

Penulis skripsi berjudul Validasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik untuk Penetapan Kadar Asam Askorbat dalam Sediaan Larutan Injeksi Obat Pemutih Kulit Merek “X” memiliki nama lengkap Rosalia Lestari. Penulis lahir di Sintang pada tanggal 1 Desember 1994 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara pasangan Gatot Wibowo dan Magdalena Limah. Pendidikan formal yang telah ditempuh penulis adalah TK Panca Setya Sintang (1998-2000), SD Panca Setya 1 Sintang (2000-2006), SMP Negeri 1 Sintang (2006-2009), SMA Stella Duce 1 Yogyakarta (2009-2012), kemudian tahun 2012 penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten dosen mata kuliah Mikrobiologi (2014, 2015, dan 2016), praktikum Kimia Analisis (2015), praktikum Kimia Organik (2015), dan praktikum Pharmaceutical Analysis (2015). Selain itu penulis juga pernah mengikuti kegiatan dan organisasi antara lain: Herbal Garden Team (2014-2015), makrab HGT (2014), pernah mengikuti beberapa seminar yaitu seminar Motivasi dan Inspirasi untuk Meningkatkan Leadership Competence (2014), Seminar Motivasi Bong Candra (2013), dan Seminar Menjawab Permasalahan di Indonesia dengan Kurikulum Baru (2014).

SKRIPSI. Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat. Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) Program Studi Farmasi. Diajukan oleh: Rosalia Lestari

Recommend Documents