SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

UJI IN VIVO DAN VALIDASI PROTOKOL SLUG IRRITATION TEST PADA SEDIAAN COOLING GEL EKSTRAK DAUN PETAI CINA (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) DENGAN METODE CLASSIFICATION AND REGRESSION TREE (CART)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Yoanna Kristia Nugraheni NIM: 118114041

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


UJI IN VIVO DAN VALIDASI PROTOKOL SLUG IRRITATION TEST PADA SEDIAAN COOLING GEL EKSTRAK DAUN PETAI CINA (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) DENGAN METODE CLASSIFICATION AND REGRESSION TREE (CART)

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Yoanna Kristia Nugraheni NIM: 118114041

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

Pu s h y o u r s e l f a g a i n a n d a g a i n . Do n ’t gi ve an i nch unt i l t he f i nal buz z er sounds –La r r y Bi r d Ev e r y t h i n g t h a t d r o w n s me ma k e s me wa n n a f l y -Co u n t i n g St a r -

Karya ini kupersembahkan untuk: Tuhan Yesus Kristus yang luar biasa baikNya Papa dan Mama yang mendukung, selalu mengingatkan, dan tak henti-hentinya berdoa Adek perempuan kesayangan satu-satunya yang tidak pernah lelah menyemangati Sahabat-sahabatku yang wow Dan ... Almamaterku iv


v


PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Yang Maha Kuasa atas berkat dan rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Uji In Vivo dan Validasi Protokol Slug Irritation Test pada Sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena Leucocephala (Lmk) De Wit) dengan Metode Classification And Regression Tree (CART)”. Skripsi ini disusun guna memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian “Validasi Protokol Uji Iritasi Kulit Sediaan Bahan Alam Berdasar Prinsip 3R (Reduce, Refinement & Replacement)”. Dalam pelaksanaan penelitian, penyusunan skripsi hingga penyelesaian skripsi ini, penulis mendapatkan bantuan dan dukungan dari banyak pihak, skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik, untuk itu penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat yang diberikan kepada penulis selama menyusun penelitian ini.

2.

Dr. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt., selaku dosen pembimbing dan Kepala Program Studi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, atas masukan, bimbingan, kritik, saran, dan bahan penelitian yang diberikan kepada penulis.

3.

Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji, atas saran serta dukungan yang membangun.

vi


4.

Dr. Nunung Yuniarti, M.Si., Apt., selaku dosen penguji, atas saran serta dukungan yang membangun.

5.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku kepala laboratorium, atas ijin penggunaan laboratorium selama proses skripsi.

6.

Seluruh dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah membagikan ilmu serta pengalaman selama perkuliahan.

7.

Pak Musrifin, Pak Wagiran, Mas Agung, seluruh laboran dan staf kebersihan atas segala bantuan yang telah diberikan kepada penulis.

8.

Papa Krisno Yuono Gregorius dan Mama Th. Endang Dwi, Christiana Deasy Rosalina atas doa, dukungan, dan semangat kepada penulis selama proses penelitian hingga penyusunan naskah skripsi.

9.

Dara Prabandari Sumardi atas semangat, dukungan, dan saran yang diberikan kepada penulis.

10. Dea dan Cik Ailing, anak-anak siput yang telah sabar menghadapi kerempongan dan perdebatan yang dilewati selama 1 tahun bersama peneliti. 11. Teman-teman seperjuangan lantai 3 dan lantai 1, Mpit, Lukas, Ervan, Putu, Ardha, Sheilla, Ahen, Lauren, Denyo, Vivo, Gemah, teman-teman FST A 2011, FSM A 2011 dan seluruh angkatan 2011 atas kebersamaan dan keceriaan selama ini. 12. Bebeh

Verni

dan

tim

D’bjqz

yang

mengeksplorasi pengetahuan bersama-sama. vii

selalu

berimajinasi

dan


13. Ines, Mbak Rini, Mbak Tyas, Verlita, teman-teman Kos Caritas yang selalu memberikan semangat tanpa henti lewat hiburan dan wisata kulinernya. 14. Avik, teman SMA yang jauh-jauh di Salatiga telah meluangkan waktunya untuk membantu kelancaran penulisan naskah. 15. Serta semua pihak yang telah membantu penulis dan tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Yogyakarta,

Penulis

viii


ix


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ..........................................

ii

HALAMAN PENGESAHAN .....................................................................

iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ..................................................................

iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ....................................................

v

PRAKATA ................................................…..............................................

vi

PERYATAAN KEASLIAN KARYA .........................................................

ix

DAFTAR ISI ...............................................................................................

x

DAFTAR TABEL .......................................................................................

xiv

DAFTAR GAMBAR ...................................................................................

xv

DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................

xvi

DAFTAR SINGKATAN KATA .................................................................

xvii

INTISARI ............................................................…....................................

xviii

ABSTRACT ..................................................................................................

xix

BAB I PENGANTAR .................................................................................

1

A. Latar Belakang ........................................................................................

1

1. Permasalahan ......................................................................................

3

2. Keaslian penelitian .............................................................................

3

3. Manfaat penelitian ..............................................................................

4

B. Tujuan .....................................................................................................

5

x


1. Tujuan umum .....................................................................................

5

2. Tujuan khusus ....................................................................................

5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ..........................................................

6

A. Kulit ........................................................................................................

6

B. Iritasi Kulit ..............................................................................................

7

C. Gel ...........................................................................................................

9

D. Tanaman Petai Cina ................................................................................

10

E. Bahan Uji Iritasi ......................................................................................

11

1. CMC-Na .............................................................................................

11

2. Propilen glikol ....................................................................................

12

3. Gliserin ...............................................................................................

12

4. Asam laktat .........................................................................................

13

5. Asam salisilat .....................................................................................

14

6. Arbutin ...............................................................................................

15

7. Sodium lauril sulfat ............................................................................

16

F. Slug Irritation Assay ...............................................................................

17

1. Slug mucosal irritation .......................................................................

17

2. Laeviculais alte FéR ...........................................................................

18

G. Validasi Alternatif Test ...........................................................................

19

H. Classification and Regression Tree .......................................................

20

I. Keterangan Empiris ................................................................................

21

BAB III METODE PENELITIAN ..............................................................

22

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ..............................................................

22

xi


B. Variabel Penelitian ..................................................................................

22

1. Variabel bebas ....................................................................................

22

2. Variabel tergantung ............................................................................

22

3. Variabel pengacau terkendali .............................................................

22

4. Variabel pengacau tak terkendali .......................................................

23

C. Definisi Operasional ...............................................................................

23

D. Alat dan Bahan Penelitian .......................................................................

24

1. Alat penelitian ....................................................................................

24

2. Bahan penelitian .................................................................................

24

3. Reagen ................................................................................................

24

4. Hewan uji ...........................................................................................

25

E. Tata Cara Penelitian ................................................................................

25

1. Pembuatan ekstrak daun petai cina ....................................................

25

2. Pembuatan sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina ....................

26

3. Uji sifat fisis sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina .................

27

4. Pembuatan bahan uji iritasi ................................................................

28

5. Uji iritasi menggunakan slug irritation test .......................................

29

F. Analisis Hasil ..........................................................................................

31

1. Validasi protokol slug irritation test ..................................................

31

2. Prediksi sifat iritatif sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina ......

33

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .....................................................

34

A. Ekstraksi Daun Petai Cina ......................................................................

34

B. Pembuatan dan Uji Sifat Fisis Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina ....

35

xii


C. Pembuatan Bahan Uji Iritasi ...................................................................

38

D. Slug Irritation Test ..................................................................................

41

E. Validasi Slug Irritation Test Menggunakan CART ................................

45

F. Prediksi Sifat Iritatif Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina ..................

49

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................

51

A. Kesimpulan .............................................................................................

51

B. Saran .......................................................................................................

51

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................

52

LAMPIRAN ................................................................................................

55

BIOGRAFI PENULIS..................................................................................

70

xiii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Komposisi dan konsentrasi reagen ALP ...................................

24

Tabel II.

Komposisi dan konsentrasi reagen LDH ...................................

25

Tabel III.

Komposisi dan konsentrasi reagen albumin ..............................

25

Tabel IV.

Formula acuan ...........................................................................

26

Tabel V.

Formula bahan uji ......................................................................

28

Tabel VI.

Confusion matrix .......................................................................

32

Tabel VII.

Data uji sifat fisik ......................................................................

36

Tabel VIII.

Hasil uji pendahuluan pada bahan uji .......................................

41

Tabel IX.

Data slug irritation test .............................................................

43

Tabel X.

Classification and Regression Tree .........................................

46

Tabel XI.

Confusion matrix prediksi CART .............................................

48

Tabel XII.

Hasil ALP dan persen mukus cooling gel ekstrak daun petai cina ............................................................................................

xiv

50


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur kulit manusia ..........................................................

6

Gambar 2.

Petai cina (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) ............

10

Gambar 3.

Struktur CMC-Na .................................................................

11

Gambar 4.

Struktur propilen glikol ........................................................

12

Gambar 5.

Struktur gliserin ....................................................................

13

Gambar 6.

Struktur asam laktat ..............................................................

14

Gambar 7.

Struktur asam salisilat ...........................................................

15

Gambar 8.

Struktur arbutin .....................................................................

15

Gambar 9.

Struktur sodium lauril sulfat .................................................

16

Gambar 10.

Laevicaulis alte FéR .............................................................

19

Gambar 11.

Classification and Regression Tree ....................................

46

Gambar 12.

Classification Tree ................................................................

47

xv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Determinasi petai cina .......................................................

56

Lampiran 2.

Data hasil pengukuran uji sifat fisik sediaan gel ................

57

Lampiran 3.

Foto cooling gel ekstrak daun petai cina ............................

57

Lampiran 4.

Determinasi siput ...............................................................

58

Lampiran 5.

Foto slug irritation test .......................................................

58

Lampiran 6.

Data slug irritation test ......................................................

60

Lampiran 7.

Hasil analisis data menggunakan metode classification and regression tree dengan program RStudio ..................

62

Lampiran 8.

Data penentuan spesifisitas dan sensitivitas .......................

66

Lampiran 9.

Data penentuan MCC dan rkritis

68

Lampiran 10. Dokumentasi ......................................................................

xvi

69


DAFTAR SINGKATAN KATA

SMI

Slug Mucosal Irritation

CART Classification And Regression Tree ALP

Alkaline Phosphatase

LDH

Lactate Dehydrogenase

PBS

Phosphat Buffer Saline

SLS

Sodium Lauril Sulfat

AHA

Alpha-Hydroxyacid

MCC

Matthew’s Correlation Coefficient

SEM

Standard Error Of The Mean

TP

True Positive

FP

False Positive

TN

True Negative

FN

False Negative

xvii


INTISARI Setiap produk kosmetik dan non kosmetik harus melewati uji keamanan terlebih dahulu sebelum dipasarkan. Hal tersebut dilakukan untuk menjamin keamanan produk. Penggunaan hewan untuk uji keamanan dan efikasi merupakan isu yang banyak diperbincangkan di Eropa, pengujian harus memenuhi beberapa standar ilmiah dan memperhatikan pada prinsip tiga R (three Rs) yaitu reduksi (reduction), perbaikan (refinement), dan penggantian (replacement). Penelitian mengenai Uji In Vivo dan Validasi Protokol Slug Irritation Test pada Sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) dengan Metode Classification And Regression Tree (CART) bertujuan untuk mengetahui validitas protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression tree (CART). Jenis penelitian bersifat eksperimental kuasi dan eksploratif. Uji in vivo slug irritation test bersifat eksperimental kuasi dan validasi protokol slug irritation test yang menggunakan model prediksi yang dikembangkan menggunakan metode statistika classification and regression tree bersifat eksploratif. Untuk prediksi sifat iritatif digunakan metode kelas. Hasil penelitian menunjukkan bahwa prediksi sifat iritatif bahan dengan slug irritation test menggunakan metode classification and regression tree dikatakan valid karena telah memenuhi syarat sensitifitas dan spesifisitas > 60%. Nilai sensitifitas yang didapatkan 85% dan spesifisitas yang didapat yaitu 100%. Parameter yang digunakan untuk memprediksi sifat iritatif senyawa uji adalah kadar Alkaline Phospatase (ALP) dan persen mukus yang dihasilkan. Nilai cut-off untuk tiap parameter adalah 8,25 dan 12%. Menggunakan classification and regression tree dari data validasi protokol dapat disimpulkan bahwa sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina bersifat non-iritan. Kata kunci: Slug Mucosal Irritation, validasi protokol, slug, cooling gel, Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit, cut-off, classification and regression tree

xviii


ABSTRACT Every product has to undergo the safety assessment at the first place before the marketing process to guarantee the products’ safety. The use of animals for safety and efficacy assessment is the issue being discussed in the Europe. The assessment has to fulfill several scientific standards and pays attention to three Rs – reduction, refinement, and replacement. Thus, the purpose of this research is to discover the protocol validity of slug irritation test on Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) extract cooling gel using classification and regression tree (CART) method. In this study, the in vivo test was a quasi-experimental design and the slug irritation test protocol validation which used the prediction model developed by statistic method of classification and regression test, was an explorative design. As for the prediction of irritation character, the class method was used. The result showed that the irritation character’s prediction material by slug irritation test using classification and regression tree method was valid since it had the conditions of sensitivity and specification value of > 60%. The sensitivity value was 85% and the specification value was 100%. The parameter used to predict the irritation character of testing compound was the level of ALP (Alkaline Phospatase) and the percentage mucus produced. The cut-off value of each parameter was 8,25 and 12%. Using the classification and regression tree from the protocol validation data, it can be concluded that the product of Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) extract cooling gel was non-irritant. Keywords: Slug Mucosal Irritation, protocol validation, slug, cooling gel, Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit, cut-off, classification and regression tree

xix


BAB I PENGANTAR

A. Latar belakang Kulit menutupi dan melindungi permukaan tubuh, dan bersambung dengan selaput lendir yang melapisi rongga-rongga dan lubang-lubang masuk. Kulit setiap kali tidak henti-hentinya menerima berbagai rangsangan mekanik dari luar tubuh, itulah sebabnya tidak mengherankan bila setiap hari jutaan sel rusak dan harus diperbaharui (Irianto, 2012). Iritasi adalah suatu kondisi pada kulit yang muncul akibat kontak berkepanjangan dengan zat kimia tertentu. Gejala umum terjadinya iritasi adalah panas. Hal ini disebabkan karena dilatasi pembuluh darah pada daerah yang terpapar yang ditandai dengan timbulnya kemerahan pada daerah kulit tersebut (eritema). Selain itu dapat juga menyebabkan terjadinya udema, yang dapat diamati dengan terjadinya perbesaran plasma yang membeku pada daerah yang terluka, dan dipercepat dengan adanya jaringan fibrosa yang menutupi daerah tersebut (WHO, 2005). Produk kosmetik dan non kosmetik harus melewati uji kemanan terlebih dahulu sebelum dipasarkan untuk menjamin telah memenuhi persyaratan keamanan. Proses dari uji keamanan meliputi beberapa tahapan yaitu identifikasi bahaya (hazard identification), karakterisasi resiko (risk characterisation), evaluasi resiko (risk evaluation), dan uji keamanan (safety assessment) (Leyden et al., 2002).

1


2

Identifikasi

bahaya

dicapai

dengan

tes

toksikologikal

secara

konvensional yaitu secara in vivo dan in vitro. Uji toksisitas menjadi poin akhir dan menjadi perhatian utama dalam pembuatan suatu produk. Oleh karena itu, perlu diperhatikan toksisitas akut, tingkat iritasi terhadap kulit, mata, dan membran

mukosa,

sensitisasi

dan

fotosensitisasi,

toksisitas

subkronik,

mutagenisitas, toksisitas jangka panjang dan karsinogenisitas (Leyden et al., 2002). Penggunaan hewan untuk uji keamanan dan efikasi merupakan isu yang banyak diperbincangkan di Eropa. Jika data yang dibutuhkan hanya bisa dipenuhi melalui uji menggunakan hewan, maka pengujian harus memenuhi beberapa standar ilmiah dan memperhatikan pada prinsip tiga R (three Rs) yaitu reduksi (reduction), perbaikan (refinement), dan penggantian (replacement). Reduksi berarti mengurangi jumlah hewan yang digunakan sebagai subjek uji tetapi jumlah hewan minimum sebagai standar pengujian tetap terpenuhi. Perbaikan berarti prosedur

yang

akan

dipakai

seharusnya

mengurangi

tingkat

stress,

ketidaknyamanan, atau interferensi dengan fungsi fisiologi hewan dibandingkan metode sebelumnya. Penggantian berarti mengganti uji hewan dengan metode alternatif tanpa menggunakan hewan. Penggantian ini memberi kesempatan untuk mengkaji kembali kebutuhan pengujian menggunakan hewan sebelum penelitian dimulai (Leyden et al., 2002). Adriaens (2006), telah mengembangkan Slug Mucosal Irritation (SMI) sebagai salah satu alternatif untuk menggantikan Draize test yang menggunakan kelinci sebagai hewan uji. Slug Mucosal Irritation (SMI) dikembangkan


3

menggunakan slug (Arion lusitancius) yang mempunyai permukaan mukosa yang tinggi.

Keuntungan

dari

uji

menggunakan

SMI

dapat

memprediksi

ketidaknyamanan klinik seperti gatal dan sensasi terbakar yang tidak dapat diprediksi dalam studi in vitro maupun studi laboratorium menggunakan hewan mamalia (Adriaens cit., Dhondt, 2005). Uji SMI dapat memprediksi toleransi lokal dari sediaan solid, semi-solid maupun liquid. Potensi iritasi dapat diprediksi berdasarkan jumlah total dari mukus yang diproduksi (Adriaens, 2006). Sanjaya (2013) telah memformulasikan ekstrak daun petai cina menjadi sediaan cooling gel. Namun, belum dilakukan uji iritasi terhadap sediaan yang dibuat tersebut. Maka perlu dilakukan validasi protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina sehingga dapat menjadi salah satu alternatif untuk uji iritasi tanpa menggunakan hewan vertebrata.

1. Permasalahan a. Apakah protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression trees (CART) dapat menunjukkan hasil yang valid? b. Apakah sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina bersifat iritatif atau non iritatif sebagai sediaan topikal? 2. Keaslian penelitian Sejauh yang penulis ketahui, belum ada penelitian tentang validasi protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression tree (CART).


4

Penelitian terdahulu yang terkait dengan penelitian adalah : 1. “The Slug Mucosal Irritation assay: an alternative assay for local tolerance testing” yang dilakukan oleh Els Adrians pada tahun 2006. Pada penelitian ini dilakukan uji iritasi mata, sediaan buccal, dan sediaan vaginal. 2. “Optimasi Humektan Propilen glikol dan Gelling agent CMC-Na dalam sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.): Aplikasi Desain Faktorial” yang dilakukan oleh Otniel Sanjaya pada tahun 2011. Dalam penelitian ini dilakukan optimasi pada pembuatan sediaan cooling gel dengan bahan ekstrak daun petai cina.

3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini diharapkan menambah informasi dalam bidang kefarmasian, mengenai slug irritation test pada jenis sediaan topikal cooling gel. b. Manfaat praktis Sebagai salah satu alternatif untuk uji iritasi sediaan topikal cooling gel.


5

B. Tujuan 1. Tujuan umum Mengetahui validitas protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression tree (CART). 2. Tujuan khusus Jika protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression tree (CART) menunjukkan hasil yang valid, maka protokol tersebut dapat digunakan untuk mengetahui sifat iritatif suatu sediaan topikal.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Kulit Kulit merupakan organ tubuh yang memiliki luas paling besar, yaitu kirakira 1,9 m2 pada orang dewasa dan mempunyai berat sekitar 15% dari berat badan. Ketebalan kulit sangat bervariasi di berbagai bagian tubuh, yang paling tipis ketebalannya kira-kira 0,4 mm terdapat di sekitar mata dan paling tebal kirakira 1,6 mm pada telapak tangan (Irianto, 2012). Kulit adalah membran jaringan yang terdiri dari lapisan jaringan epitelial dan penghubung. Jaringan epitelial pada lapisan luar kulit adalah epidermis, dan jaringan penghubung yang menjadi lapisan dalamnya adalah dermis. Membran bawah adalah pengikat dermis yang memisahkan kedua lapisan ini. Epidermis dan dermis berada pada lapisan pendukung berupa jaringan penghubung dan sel-sel lemak yang disebut hipodermis (Balaban and Bobick, 1998).

Gambar 1. Struktur kulit manusia (Baumann, Saghari, and Weisberg, 2009)

6


7

Lapisan paling luar dari kulit adalah epidermis yang terdiri dari lapisan epitel gepeng beserta jaringannya. Unsur utama epidermis adalah sel-sel tanduk (keratinosit), selain itu terdapat juga sel-sel melanosit, sel-sel Langerhans, dan selsel Merckel. Epidermis terdiri dari beberapa lapis sel yaitu stratum korneum, stratum

lusidum,

stratum

granulosum,

stratum

spinosum,

dan

stratum

germinativum (Irianto, 2012). Dermis bersifat ulet, lentur serta elastis yang berguna untuk melindungi bagian-bagian yang lebih dalam. Dermis terdiri dari serat-serat kolagen, serabut elastis dan serabut-serabut retikulin. Susunan serabut-serabut ini berbeda di bagian atas dan bawah sehingga pada lapisan dermis ini dibedakan atas lapis papilar dan lapis retikular (Irianto, 2012). Hipodermis atau lapis subkutis merupakan anyaman jaringan ikat jarang serta mengandung banyak sel-sel lemak (pannicuculus adiposus). Dalam lapis hipodermis terdapat anyaman pembuluh arteri, pembuluh vena, anyaman syaraf yang berjalan sejajar dengan permukaan kulit (Irianto, 2012). Kulit merupakan suatu organ yang penting bagi pertahanan tubuh. Keratinosit mempersiapkan antigen eksternal untuk dipresentasikan pada limfosit T, yang kemudian akan meningkatkan respon imun (Graham-Brown and Burns, 1999).

B. Iritasi Kulit Menurut WHO (2005), iritasi adalah suatu kondisi pada kulit yang muncul akibat kontak berkepanjangan dengan zat kimia tertentu. Setelah beberapa


8

waktu, kulit akan mengering terasa nyeri, mengalami perdarahan, dan pecahpecah. Gejala umum yang dapat terjadi jika terjadi iritasi seperti panas, disebabkan karena dilatasi pembuluh darah pada daerah yang terpapar ditandai dengan timbulnya kemerahan pada daerah kulit tersebut (eritema). Selain itu dapat juga menyebabkan terjadinya udema, yang ditandai dengan terjadinya perbesaran plasma yang membeku pada daerah yang terpapar, dan dipercepat dengan adanya jaringan fibrosa yang menutupi daerah tersebut. Secara umum, bahan kimia mempunyai dua mekanisme untuk memodulasi terjadinya iritasi. Pertama dengan cara merusak fungsi pertahanan dari stratum korneum dan yang kedua dengan efek langsung bahan iritan pada sel kulit. Kedua mekanisme dapat terjadi secara tunggal maupun kombinasi (Welss, Basketter, and Schroder, 2004). Bahan iritan yang masuk ke dalam stratum korneum akan menyebabkan delipidasi dan denaturasi protein. Delipidasi merupakan proses terganggunya keseimbangan lipid yang selanjutnya akan menyebabkan perubahan ikatan lipid sehingga stratum korneum akan kehilangan fungsi pertahanannya. Proses delipidasi ini dipicu oleh surfaktan dan bergantung pada critical micelle concentration dari komponen surfaktan. Proses kehilangan air pada membran transepidermal ini akan meningkatkan penetrasi dari bahan iritan semakin dalam ke bagian epidermal tempat keratinosit (Welss, Basketter, and Schroder, 2004). Mekanisme induksi dari iritasi kulit tidak diketahui dengan pasti tetapi terlebih dahulu bahan kimia merusak dan mengganggu fungsi sel dan memicu pelepasan

autocoid

yang

akan

meningkatkan

permeabilitas

vaskuler,


9

meningkatkan sedikit aliran darah, menarik sel darah putih ke lokasi dan menghancurkan sel secara langsung dan semuanya menghasilkan inflamasi lokal pada kulit (Benson and Watkinson, 2012).

C. Gel Menurut Dirjen POM (1995), gel merupakan suatu sistem suspensi semisolid yang terdiri dari partikel anorganik yang kecil atau molekul organik yang besar dan terpenetrasi pada suatu cairan. Gel merupakan sediaan semisolid yang transparan atau keruh dengan perbandingan pelarut yang lebih tinggi dari gelling agent. Ketika gelling agent didispersikan pada pelarut yang sesuai, maka akan terbentuk matriks tiga dimensi (Osborne and Amann, 1990). Gel dapat diklasifikasikan menjadi hidrogel dan organogel. Hidrogel meliputi komponen koloid yang larut dalam air dan juga organik hidrogel seperti gum alam dan sintesis dan juga hidrogel inorganik. Organogel meliputi hidrokarbon, lemak hewan atau nabati, dan organogel hidrofilik (Allen, 1999). Hidrogel komposisi utamanya tersusun dari 85-90% air atau campuran aqueous-alcoholi, humektan, dan gelling agent yang akan memberikan efek mendinginkan (Buchman and Stephan, 2001). Cooling gel merupakan suatu sediaan berbentuk hidrogel yang digunakan untuk mengurangi rasa panas pada permukaan kulit. Sediaan ini juga dapat mengurangi resiko kerusakan edipermal akibat adanya panas. Aktivias cooling gel ditingkatkan dengan penambahan komponen lain seperti herbal sehingga sediaan juga berguna sebagai antiinflamasi (Keller and Lacombe, 2001).


10

D. Tanaman Petai Cina Di daerah Jawa, petai cina memiliki nama lain lamtoro. Klasifikasi tanaman petai cina adalah seperti berikut : Kingdom

: Plantae (tumbuhan)

Subkingdom

: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super divisi

: Spermatophyta (Tumbuhan berbiji)

Divisi

: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas

: Magnoliopsida (Berkeping dua/dikotil)

Sub kelas

: Rosidae

Ordo

: Fabales

Famili

: Fabaceae (suku polong-polongan)

Genus

: Leucaena Benth. (leadtree)

Spesies

: Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit (white leadtree) (United States Departement of Agriculture, 2013).

Menurut Chew et al., (2011), daun petai cina mengandung flavonoid, tanin, dan saponin. Kandungan yang berfungsi sebagai antiinflamasi dalam sediaan cooling gel adalah flavonoid (Garcia-Lafuente et al., 2002).

Gambar 2. Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit) (Thomas, 1992)


11

Menurut Garcia-Lafuente et al., (2009), salah satu fungsi dari flavonoid adalah dapat digunakan sebagai agen antiinflamasi. Flavonoid dapat bersifat antioksidatif

dan

menangkap

radikal,

mengatur

aktivitas

selular

yang

berhubungan dengan inflamasi, memodulasi aktivitas dari enzim yang memetabolisme asam arakidonat (seperti fosfolipase A2, siklooksigenase, lipooksigenase, dan nitrit oksida sintase) serta memodulasi ekspresi gen proinflamasi.

E. Bahan Uji Iritasi 1. CMC-Na Carboxymethylcellulose Sodium (CMC-Na) berbentuk serbuk granul putih, tidak berbau, tidak berasa, dan bersifat higroskopis. Struktur CMC-Na dapat dilihat pada gambar 3 (Rowe et al., 2009).

Gambar 3. Struktur CMC-Na (Rowe et al., 2009)

Pada konsentrasi 3-6% dalam formula biasa digunakan sebagai basis gel. Stabil pada pH 2-10, dan dapat mengendap pada pH di bawah 2 serta mengalami penurunan viskositas pada pH di atas 10. CMC-Na dapat digunakan dalam terapi


12

pengobatan luka, dermatological patches sebagai pelindung mukosa, menyerap cairan yang keluar dari luka, menyerap keringat (Rowe et al., 2009). 2. Propilen glikol Propilen glikol (gambar 4) berbentuk cairan kental, jernih, tidak berwarna, tidak berbau. Propilen glikol dapat berfungsi sebagai pengawet, desinfektan, humektan, plasticizer, pelarut, stabilizing agent dan kosolven watermiscible. Pada formulasi sediaan topikal, propilen glikol digunakan sebagai humektan dengan konsentrasi ±15% (Rowe et al., 2009). Data klinis menunjukkan reaksi iritasi kulit dan sensitisasi propilen glikol pada subjek dengan kondisi normal dengan konsentrasi sebesar 10% dan untuk pasien dermatitis pada konsentrasi 2% (Rowe et al., 2009).

Gambar 4. Struktur Propilen glikol (Rowe et al., 2009)

3. Gliserin Gliserin merupakan cairan higroskopis yang tidak berwarna, tidak berbau, rasa manis. Struktur gliserin dapat dilihat pada gambar 5. Gliserin dapat digunakan dalam formulasi seperti oral, optalmik, topikal maupun parenteral. Fungsi gliserin dapat digunakan sebagai humektan dan emolient dalam sediaan topikal (Rowe et al., 2009). Gliserin merupakan bahan yang sudah terdaftar dalam Food and Drug Assosiation (FDA), dan aman digunakan dalam konsentrasi 0,2-65,7%


13

(Smolinske, 1992). Gliserin dalam range 20-25% digunakan untuk moisturizer pada kulit kering. Gliserin sampai dengan konsentrasi 25% aman digunakan dan dalam batas toleransi kulit (Paye, 2006). Gliserin bersifat sebagai penetration enhancer dan juga sebagai humektan yang kuat karena mempunyai kemampuan menyerap air yang hampir sama dengan natural moisturizing factor (NMF) yang merupakan pengikat alami dalam kulit. Humektan dapat membantu menjerat air dari udara yang kemudian dapat berpenetrasi ke dalam kulit bila kelembaban relatif rendah. Tetapi humektan dapat juga menarik air dari bagian epidermis dan dermis yang dapat menyebabkan kulit menjadi kering (Leyden et al., 2002).

Gambar 5. Struktur Gliserin (Rowe et al., 2009)

4. Asam laktat Asam laktat (gambar 6) merupakan golongan Alpha-hydroxyacids (AHAs) yang paling penting ikut terlibat dalam metabolisme energi tingkat seluler. Asam laktat merupakan salah satu penyusun utama dari faktor kelembaban natural pada stratum korneum. Alpha-hydroxyacids (AHAs) mempunyai beberapa aksi yang berbeda pada kulit bergantung pada pH dan konsentrasi yang digunakan. Asam laktat merupakan asam lemah dengan pKa 3,86 (Leyden et al., 2002). Menurut U.S Cosmetic Ingredient Reviewer (CIR) konsentrasi AHA di atas 10% dengan pH di bawah 3,5 aman digunakan. Konsentrasi asam laktat yang


14

digunakan pada kosmetik untuk perawatan kulit kering sekitar 5% dan mempunyai pH bervarisi antara 4-5 dan di atas 5. Perubahan pH akan menimbulkan perbedaan yang relatif besar pada availabilitas bentuk asam dan garam, sementara konsentrasi tidak berpengaruh banyak. Bentuk garam dari AHA efektif digunakan sebagai humektan moisturizer sedangkan bentuk asam dapat merangsang sensor iritasi (rasa terbakar, sakit, atau tertusuk) pada beberapa orang, tetapi pada konsentrasi yang tidak terlalu mengiritasi di mana tidak menstimulasi reaksi inflamasi. Efek iritasi bergantung pada pH dan berkurang dengan kenaikan pH. Potensi iritasi primer meningkat dengan cepat di bawah nilai pKa (pH 3,86) (Leyden et al., 2002).

Gambar 6. Struktur Asam Laktat (Rowe et al., 2009)

5. Asam salisilat Merupakan salah satu Beta-hydroxyacids yang sering digunakan pada produk anti-aging untuk wajah. Asam salisilat merupakan asam hidroksi aromatis yang digunakan sebagai agen keratolitik pada kondisi hyperkeratotic. Struktur asam salisilat dapat dilihat pada gambar 7. Asam salisilat yang terpenetrasi ke dalam stratum korneum termodifikasi dan bertindak sebagai plasticizer. Asam salisilat mempunyai pKa 2,97 (Leyden et al., 2002). Asam salisilat mempunyai potensi iritasi yang tinggi pada konsentrasi tinggi, sehingga digunakan konsentrasi


15

1,5% atau kurang pada krim kosmetik kulit. Untuk pemakaian sehari-hari dengan konsentrasi 2-3% asam salisilat tergolong aman dan jarang mengiritasi (Leyden et al., 2002).

Gambar 7. Struktur Asam Salisilat (Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products, 2002)

6. Arbutin Arbutin

(4-hydroxyphenyl-β-D-glucopyranoside,

hydroquinone-β-

glucopyranoside) merupakan derivat dari hidrokuinon. Mempunyai rumus empiris C12H16O7, struktur arbutin dapat dilihat pada gambar 8. Berbentuk serbuk berwarna putih sampai keabuan. Mempunyai kelarutan ≥ 10 g/100 g dalam air dan propilen glikol atau ≥ 10 g/100 g dalam etanol dan gliserin (Scientific Committee on Consumer Safety, 2015).

Gambar 8. Struktur Arbutin (Scientific Committee On Consumer Safety, 2015)

Digunakan sebagai agen pencerah kulit, menghambat produksi pigmen kulit melanin yang akan terbentuk melalui reaksi oksidatif yang melibatkan asam amino tirosin dan enzim tirosinase. β-Arbutin bertindak menginhibisi aktivitas melanosomal tirosinase. Hal ini dapat terjadi karena kesamaan struktur antara arbutin dengan substrat tirosin. β-arbutin digunakan sebagai agen pencerah kulit


16

di dalam krim kosmetik wajah atau lotion wajah pada konsentrasi 7%, 10% larutan β-Arbutin dapat menimbulkan sedikit potensi iritasi primer (Scientific Committee On Consumer Safety, 2015).

7. Sodium lauril sulfat Sodium lauril sulfat (gambar 9) berbentuk kristal berwarna putih sampai kuning pucat, merupakan surfaktan anionik yang digunakan dalam berbagai formulasi sediaan nonparenteral. Digunakan sebagai detergen dan wetting agent yang efektif dalam kondisi basa maupun asam (Rowe et al., 2009).

Gambar 9. Struktur sodium lauril sulfat (Rowe et al., 2009)

Sodium lauril sulfat banyak digunakan dalam kosmetik dan formulasi sediaan oral maupun topikal. Memiliki efek toksik akut meliputi iritasi kulit, mata, membran mukosa, saluran pernapasan bagian atas, dan lambung (Rowe et al., 2009). Untuk sediaan topikal digunakan pada konsentrasi 0,1-12,7% (Michael and Ash, 2004). Pada uji okular akut, 10% sodium lauril sulfat menyebabkan kerusakan korneal pada mata kelinci. Pada uji Draize suatu produk yang mengandung 5,1% sodium lauril sulfat menyebabkan iritasi ringan, dan dengan konsentrasi 21% menyebabkan iritasi hebat. Berdasarkan studi iritasi kulit akut pada hewan disimpulkan bahwa 0,5% - 10% sodium lauril sulfat menyebabkan iritasi ringan. Aplikasi 10% - 30% menyebabkan korosi kulit dan iritasi hebat.


17

Untuk kontak jangka panjang pada kulit konsentrasi sodium lauril sulfat seharusnya tidak lebih dari 1% (Robinson et al., 2010).

F. Slug Irritation Assay 1. Slug mucosal irritation Slug Mucosal Irritation (SMI) dikembangkan di University of Ghent. SMI dapat digunakan sebagai skrining awal pada tahap riset dan pengembangan formulasi sediaan baru untuk mengevaluasi toleransi lokal tanpa menggunakan hewan mamalia. Uji SMI telah divalidasi sebelumnya untuk skrining potensi iritan dari bahan-bahan kimia. Uji SMI juga direkomendasikan sebagai salah satu uji alternatif untuk menggantikan Uji Draize (Adriaens, 2006). Produksi mukus pada siput adalah mekanisme perlindungan terhadap bahan-bahan berbahaya. Mekanisme ini dapat dimanfaatkan untuk mengetahui potensi iritasi dari bahan iritan (Adriaens cit., Dhondt, 2005). Menurut Adriaens (cit., Dhondt, 2005), kerusakan jaringan dapat diprediksi dengan pelepasan protein dan enzim dari tubuh siput. Produksi protein, enzim laktat dehidrogenase (LDH) dan alkalin fosfatase (ALP) dipilih sebagai penanda yang paling relevan untuk evaluasi kerusakan jaringan yang disebabkan oleh bahan uji. Pada saat terjadi kerusakan sel, pelepasan enzim laktat dehidrogenase terjadi sebelum pelepasan enzim alkalin fosfatase karena alkalin fosfatase tidak terdapat di dalam lapisan sel epitel melainkan di jaringan penyambung bagian dasar.


18

Populasi siput yang digunakan pada pengujian akan mempengaruhi titik akhir dari slug mucosal irritation, sehingga penting untuk mengevaluasi efek penggunaan slug mucosal irritation pada spesies tertentu (Dhondt et al., 2006). 2. Laeviculais alte FéR Habitat di permukaan tanah lembab dengan tumpukan dedaunan kering, sering dijumpai di bawah batang pohon atau kayu yang telah lapuk, dataran rendah hingga hutan di dataran tinggi, daerah perkebunan, dan padang rumput tinggi lembab (Gomes and Thome, 2004). Klasifikasi siput yang digunakan sebagai berikut : Regnum

: Animalia

Filum

: Mollusca

Kelas

: Gastropoda

Ordo

: Systellommatophora

Famili

: Veronicellidae

Genus

: Laevicaulis

Spesies

: Laevicaulis alte Férussac, 1822 (Brodie and Barker, 2012).

Siput telanjang (Gambar 10), mantel menutupi seluruh bagian dorsum dan menutupi (overlap) di bagian kepala. Sepasang mata menempel pada bagian anterior dari tentakel, dan tentakel menyembul dari bagian bawah mantel pada saat aktif. Mantel seperti kulit dan bagian permukaan memiliki bintil-bintil kecil kasar. Mantel berwarna cokelat gelap hingga kehitaman dengan garis kuning pucat di bagian tengah dorsum. Sepasang tentakel terletak di bagian anterior sebelah bawah dan tidak terlihat begitu nyata. Alat respirasi dan anus di bagian


19

ventral di tubuh bagian posterior. Penis pada individu jantan pipih panjang dan terletak di bagian dalam tubuh sisi anterior dekat mulut (Ramakrishna, Jayashankar, Alexander, Thanuja, and Deepak, 2014).

Gambar 10. Laevicaulis alte FéR

G. Validasi Alternatif Tes Validasi dari sebuah metode alternatif dapat didefinisikan sebagai proses di mana reliabilitas dan relevansi dari sebuah metode alternatif terjamin untuk tujuan penelitian tersebut (Balls, 1990). Sebuah metode untuk penggantian dari uji menggunakan hewan meliputi uji sistem dan model prediksi (Archer, 1997). Model prediksi dikembangkan dengan pengalaman dan metode statistika. Klasifikasi model prediksi dilakukan dengan membuat prediksi pada skala kategori, sedangkan model matematik dilakukan dengan membuat prediksi pada skala yang berulang (Balls, 1990). Menurut Fentem et al., (cit., Dhondt, 2005), relevansi dari metode dievaluasi menggunakan beberapa metode statistikal. Indeks, sensitifitas, dan spesifisitas dihitung untuk menentukan validitas protokol uji. Indeks merupakan jumlah bahan yang diklasifikasikan secara benar melalui uji alternatif, dibagi dengan total bahan yang diuji. Sensitifitas (evaluasi jumlah negatif palsu) adalah jumlah total bahan iritan yang diklasifikasikan secara benar dengan uji alternatif,


20

dibagi dengan jumlah total bahan iritan yang diuji. Spesifisitas (evaluasi jumlah positif palsu) adalah jumlah total bahan non-iritan yang diklasifikasikan secara benar dengan uji alternatif, dibagi dengan jumlah total bahan non-iritan yang diuji. Sebuah metode dikatakan valid jika memiliki nilai sensitifitas dan spesifisitas > 60%.

H. Classification and Regression Tree (CART) CART adalah suatu metode statistik nonparametrik yang dapat menggambarkan hubungan antara variabel respon (dependent variable) dengan satu atau lebih variabel prediktor (independent variable). Apabila variabel respon berbentuk kontinu maka metode yang digunakan adalah metode pohon regresi (regression tree), sedangkan apabila variabel respon memiliki skala kategorik maka metode yang digunakan adalah metode pohon klasifikasi (classification tree). Pembentukan pohon klasifikasi terdiri atas 3 tahap yang memerlukan learning sample. Tahap pertama adalah pemilihan pemilah. Setiap pemilahan hanya bergantung pada nilai yang berasal dari satu variabel prediktor. Tahap kedua adalah penentuan simpul terminal. Simpul t dapat dijadikan simpul terminal jika tidak terdapat penurunan keheterogenan yang berarti pada pemilahan, hanya terdapat satu pengamatan (n=1) pada tiap simpul anak atau adanya batasan minimum n serta adanya batasan jumlah level atau tingkat kedalaman pohon maksimal. Tahap ketiga adalah penandaan label tiap simpul terminal berdasar aturan jumlah anggota kelas terbanyak. Proses pembentukan pohon klasifikasi berhenti saat terdapat hanya satu pengamatan dalam tiap simpul anak atau adanya


21

batasan minimum n, semua pengamatan dalam tiap simpul anak identik, dan adanya batasan jumlah level/kedalaman pohon maksimal (Hartati, 2012).

I. Keterangan Empiris Produk kosmetik dan non kosmetik harus melewati uji kemanan terlebih dahulu sebelum dipasarkan. Penggunaan hewan untuk uji keamanan dan efikasi harus memenuhi beberapa standar ilmiah dan memperhatian pada prinsip tiga R (three Rs). Produksi mukus pada siput adalah mekanisme perlindungan terhadap bahan-bahan berbahaya. Mekanisme ini dapat dimanfaatkan untuk mengetahui potensi iritasi dari bahan iritan. Jenis penelitian bersifat eksperimental semu (quasi-experimental) dan eksploratif. Uji in vivo slug irritation test bersifat eksperimental kuasi dan validasi protokol slug irritation test yang menggunakan model prediksi yang dikembangkan menggunakan metode statistika classification and regression tree bersifat eksploratif. Dari penelitian ini diharapkan protokol yang valid pada Slug Irritation Test sebagai salah satu alternatif uji iritasi menggunakan hewan non-vertebrata.


BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Jenis penelitian berjudul “Uji In Vivo dan Validasi Protokol Slug Irritation Test pada Sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena Leucocephala (Lmk) De Wit) dengan Metode Classification And Regression Tree (CART)” adalah eksperimental kuasi (quasi-experimental) dan eksploratif. Uji in vivo slug irritation test bersifat eksperimental kuasi dan validasi protokol slug irritation test

yang menggunakan model prediksi

yang dikembangkan

menggunakan metode statistika classification and regression tree (CART) bersifat eksploratif.

B. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah bahan uji iritasi dengan formula yang berbeda. 2. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah sifat iritatif yang ditinjau dari produksi mukus, albumin, LDH, dan ALP. 3. Variabel pengacau terkendali Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah berat badan siput. 22


23

4. Variabel pengacau tak terkendali Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah umur siput dan kondisi patologis hewan uji.

C. Definisi Operasional 1. Iritasi adalah keadaan di mana siput mengeluarkan jumlah mukus yang lebih banyak dari normal. 2. Mukus adalah lendir yang dikeluarkan oleh siput dan berada di luar tubuh siput. 3. Siput atau slug adalah siput telanjang dari spesies Laevicaulis alte (FéR), memiliki mantel berwarna hitam, dan memiliki berat 3-4 g. 4. Cooling gel ekstrak daun petai cina adalah sediaan semipadat yang dibuat dari ekstrak daun petai cina dengan menggunakan gelling agent CMC-Na dan humektan propilen glikol dengan formula yang telah ditentukan pada penelitian ini. 5. Simplisia daun petai cina adalah daun petai cina yang telah dikeringkan selama beberapa hari dan kemudian dihaluskan menjadi serbuk. 6. Ekstrak daun petai cina adalah hasil dari ekstraksi simplisia daun petai cina menggunakan 500 mL pelarut etanol 96% : air (1:1) selama 3 hari dalam suhu ruangan, dan remaserasi menggunakan 500 mL etanol selama 24 jam.


24

D. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware (PyrexGermany), blender (Philips® tipe HR 2815/A), timbangan analitik Mettler Toledo®, alat maserasi (Innova 2100 platform shaker), Vacum Rotary Evaporator (Rotavapor R-3 Buchi®), waterbath, mixer, indikator pH universal, viskometer (Rion VT-04), tabung microtube, Spektrofotometer UV-VIS (Shimadzu® tipe UV mini-1240), micropipet. 2. Bahan penelitian Bahan uji yang digunakan adalah daun petai cina yang diperoleh dari Ungaran, etanol 96% (teknis), akuades, CMC-Na, propilen glikol, metil paraben, gliserin, arbutin, asam laktat, asam salisilat, sodium lauril sulfat, natrium klorida, PBS. 3. Reagen a. Reagen ALP Reagen ALP yang digunakan adalah reagen ALP ReiGed Diagnostics. Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALP dapat dilihat pada Tabel I. Tabel I. Komposisi dan konsentrasi reagen ALP Komposisi Konsentrasi (mM) Diethanolamine 1,0 Reagen 1 Magnesium chloride 0,5 p- Nitrophenylphosphatase Reagen 2 10,0 pH 10,4 ± 0,2


25

b. Reagen LDH Reagen LDH yang digunakan adalah reagen LDH DiaSys. Komposisi dan konsentrasi dari reagen LDH dapat dilihat pada Tabel II. Tabel II. Komposisi dan konsentrasi reagen LDH Komposisi pH Konsentrasi (mmol/ L) Phosphate buffer 7,5 64 Reagen 1 Pyruvate 0,80 Reagen 2 Good’s buffer 9,6 NADH 1,0

c. Reagen albumin Reagen albumin yang digunakan adalah reagen albumin ReiGed Diagnostics. Komposisi dan konsentrasi dari reagen albumin dapat dilihat pada Tabel III. Tabel III. Komposisi dan konsentrasi reagen albumin Komposisi Konsentrasi (mM) Bromcresol green 0,25 Succinat Buffer 85 Surfactant pH 4,20 ± 0,1

4. Hewan uji Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah siput telanjang dari spesies Laevicaulis alte (FéR) dengan berat badan 3-4 g yang diperoleh dari daerah Ungaran, Jawa Tengah.

E. Tata Cara Penelitian 1. Pembuatan ekstrak daun petai cina a. Pembuatan serbuk daun petai cina Daun petai cina diperoleh dari Ungaran dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada daun. Daun yang telah


26

dicuci dikering-anginkan selama 3 hari, dikeringkan sampai benar-benar kering, ditandai dengan hancur bila diremas. Daun yang sudah kering kemudian dihaluskan hingga menjadi serbuk dengan alat penghalus. b. Pembuatan ekstrak cair daun petai cina Sebanyak 25 g serbuk daun petai cina diekstrak dengan 500 mL campuran etanol 96% : akuades (1:1) terus menerus selama 3 hari pada suhu ruangan. Ekstrak disaring dengan bantuan pompa vakum dan filtratnya diekstrak lagi menggunakan 500 mL etanol 96% selama 1 hari pada suhu ruangan dan disaring. Kedua ekstrak tersebut dicampur dan dievaporasi hingga menjadi ekstrak cair. 2. Pembuatan sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina a. Formula gel Formula yang digunakan dalam percobaan ini mengacu pada formula Optimasi Humektan Propilen glikol dan Gelling agent CMC-Na (Sanjaya, 2013). Tabel IV. Formula acuan (Sanjaya, 2013) Bahan F1 F2 F3 CMC-Na 5g 5g 8g Propilen glikol 16 g 20 g 16 g Metil paraben 0,2 g 0,2 g 0,2 g Ekstrak daun petai cina 12 g 12 g 12 g Akuades ad 200 g ad 200 g ad 200 g

F4 8g 20 g 0,2 g 12 g ad 200 g

Keterangan: F1 = formula cooling gel dengan level gelling agent dan humektan rendah; F2 = formula cooling gel dengan level gelling agent rendah dan humektan tinggi; F3 = formula cooling gel dengan level gelling agent tinggi dan humektan rendah; F4 = formula cooling gel dengan level gelling agent dan humektan tinggi


27

b. Pembuatan gel CMC-Na dikembangkan dalam 100 mL akuades dengan cara menaburkan CMC-Na di atas akuades, pengembangan dilakukan selama 24 jam, suspensi ini disebut campuran 1. Metil paraben dilarutkan menggunakan propilen glikol, disebut campuran 2. Campuran 1 dicampur dengan campuran 2 dan ditambahan dengan ekstrak daun petai cina, lalu dilakukan proses mixing menggunakan mixer, proses mixing ini dilakukan selama 5 menit dengan kecepatan mixer skala 2. 3. Uji sifat fisis sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina a. Uji daya sebar Uji daya sebar dilakukan 48 jam setelah pembuatan dengan cara gel ditimbang seberat 1 g dan diletakkan di tengah kaca bulat berskala, kemudian ditutup dengn kaca bulat lain, di atas gel diberi beban dengan berat total 125 g kemudian didiamkan selama 1 menit dan diukur penyebarannya. b. Uji pH Uji pH dilakukan beberapa saat setelah pembuatan gel dengan menggunakan indikator pH universal. c. Uji viskositas Uji viskositas dilakukan 48 jam setelah pembuatan gel dengan menggunakan alat viskometer.


28

4. Pembuatan bahan uji iritasi a. Formula bahan uji Tabel V. Formula bahan uji F1 4g

F2 -

CMC-Na Propilen 8g glikol Metil paraben Ekstrak daun petai cina Gliserin Asam salisilat Sodium lauril sulfat Asam laktat Arbutin ad 100 g ad 100 g Akuades

F3 -

F4 8g

F5 8g

F6 8g

F7 8g

F8 8g

-

16 g

16 g

16 g

16 g

16 g

-

0,2 g

0,2 g

0,2 g

0,2 g

0,2 g

-

-

-

-

12 g

-

100 g -

1g

-

-

-

-

-

-

2g

-

-

-

-

1g 10 g ad 200 g ad 200 g ad 200 g ad 200 g ad 200 g bahan non iritan non iritan iritan non iritan iritan non iritan non iritan Kontrol uji Keterangan: F1 = CMC-Na; F2 = Propilen glikol; F3 = Gliserin; F4 = Asam salisilat; F5 = SLS; F6 = Asam Laktat, F7 = Cooling gel ekstrak daun petai cina; F8 = Arbutin

b. Pembuatan bahan uji CMC-Na CMC-Na sebanyak 4 g dikembangkan dalam 100 mL akuades. Konsentrasi CMC-Na disesuaikan dengan konsentrasi CMC-Na sebagai gelling agent pada sediaan. c. Pembuatan bahan uji propilen glikol Sebanyak 8 g propilen glikol dilarutkan dengan sedikit air kemudian ad sampai tanda batas dalam labu ukur 100 mL. d. Pembuatan bahan uji asam salisilat, asam laktat, sodium lauril sulfat, dan arbutin Sebanyak 8 g CMC-Na dikembangkan dalam 100 mL akuades dengan cara menaburkan CMC-Na di atas akuades, pengembangan dilakukan selama 24 jam, suspensi ini disebut campuran 1. Metil paraben dilarutkan


29

menggunakan propilen glikol, disebut campuran 2. Campuran 1 dicampur dengan campuran 2 dan ditambahan dengan bahan uji yang telah dilarutkan dalam akuades, lalu dilakukan proses mixing menggunakan mixer. Proses mixing ini dilakukan selama 5 menit dengan kecepatan mixer skala 2. 5. Uji iritasi menggunakan slug irritation test a. Pengumpulan dan determinasi siput Siput diperoleh dari wilayah Perumda, Ungaran-Kabupaten Semarang. Determinasi dilakukan dengan mencocokan karakteristik siput dengan literatur. Untuk klasifikasi spesies siput, dilakukan pembedahan untuk mengetahui bentuk alat kelamin siput sebagai pembeda yang khas. Siput yang digunakan untuk prosedur uji adalah siput dari spesies Laevicaulis alte (FéR) yang memiliki berat antara 3-4 g. b. Slug irritation test Uji iritasi menggunakan slug irritation test diadaptasi dari prosedur uji Slug Mucosal Test (Adriaens cit., Dhondt, 2005). Uji iritasi dilakukan dengan menempatkan siput pada bahan uji dalam periode waktu 60 menit dan diukur jumlah lendir yang diproduksi. Masing-masing siput dan cawan petri ditimbang. Sebanyak 1 g bahan uji dimasukkan ke dalam cawan petri, kemudian siput diletakkan di atas bahan uji dan ditunggu selama 60 menit. Siput dipindah ke cawan petri baru, ditambahkan 1 mL PBS di dekat bagian bawah tubuh siput dan didiamkan selama 60 menit. Setelah 60 menit, cairan PBS yang telah kontak dengan tubuh siput ditampung dalam tabung microtube.


30

c. Pengukuran kadar albumin Sebanyak 8 μL PBS hasil uji diambil dan ditambahkan dengan 800 μL reagen albumin (Tabel III), ditambahkan 3200 μL akuades, dan absorbansi senyawa dibaca pada panjang gelombang 630 nm. d. Pengukuran LDH Dalam labu ukur 5 mL dimasukkan 20 μL PBS hasil uji, ditambahkan dengan 800 μL reagen 1 LDH (Tabel II) dan 200 μL reagen 2 LDH (Tabel II), ad sampai tanda batas 5 mL menggunakan NaCl 0,9%, didiamkan selama 1 menit, kemudian diukur absorbansinya. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 2, 3, dan 4 menit, absorbansi senyawa dibaca pada panjang gelombang 340 nm. e. Pengukuran ALP Dalam labu ukur 5 mL dimasukkan 20 μL PBS hasil uji, ditambahkan dengan 800 μL reagen 1 ALP (Tabel I) dan 200 μL reagen 2 ALP (Tabel I), ad sampai tanda batas 5 mL menggunakan akuades, didiamkan selama 3 menit, kemudian diukur absorbansinya. Pengukuran absorbansi dilakukan kembali pada waktu 4, 5, dan 6 menit, absorbansi senyawa dibaca pada panjang gelombang 405 nm.


31

F. Analisis Hasil 1. Validasi protokol slug irritation test a. Perhitungan persen mukus % mukus =

bobot mukus yang dikeluarkan x 100% bobot siput

b. Perhitungan ALP ALP [U/L] = Δabsorbansi/menit x faktor koresponding (3300) c. Perhitungan albumin Albumin

g

Absorbansi sampel g dL = absorbansi standar x konsentrasi standar ( dL)

d. Perhitungan aktivitas LDH Aktivitas LDH [U/L] = Δabsorbansi/menit x faktor koresponding (10.080) e. Penentuan nilai cut off Dicari nilai cut off dari faktor yang digunakan untuk prediksi respon iritasi berdasarkan variabel persen mukus, kadar ALP, kadar albumin, dan kadar LDH menggunakan classification and regression tree pada program RStudio. Dibuat plot CART untuk prediksi. f. Penentuan jumlah data true positive, false positive, true negative, false negative Data slug irritation test diprediksi sebagai iritan maupun non-iritan sesuai nilai cut off dari faktor yang digunakan. Dikatakan positif benar (true positive) jika pada literatur bahan dikatakan iritan dan prediksi CART bahan dikatakan iritan. Data dikatakan negatif benar (true negative) jika pada literatur bahan dikatakan non-iritan dan pada prediksi CART dikatakan noniritan. Data dikatakan positif palsu (false positive) jika pada literatur bahan


32

dikatakan non-iritan dan pada prediksi CART bahan dikatakan iritan. Data dikatakan negatif palsu (false negative) jika pada literatur bahan dikatakan iritan dan prediksi CART bahan dikatakan non-iritan. Pembuatan confusion matrix dapat dilihat pada Tabel VI. Tabel VI. Confusion Matrix

Literatur

Prediksi CART Iritan

Non-iritan

Iritan

true positive

false negative

Non-iritan

false positive

true negative

g. Perhitungan nilai spesifisitas, sensitifitas, tkritis dan MCC 1) Perhitungan spesifisitas TN

Spesifisitas = TN +FP

2) Perhitungan sensitifitas Sensitifitas =

TP TP + FN

3) Perhitungan MCC (Matthew’s correlation coefficient) MCC =

TP x TN − (FP x FN) TP + FP TP + FN TN + FP (TN + FN)

Keterangan: TP = True Positive; TN = True Negative; FP = False Positive; FN = False Negative

4) Perhitungan rkritis df = n - 2 rkritis =

(t tabel 2 ) (df + (t tabel 2 ))

Keterangan: ttabel = 1,995 (dilihat dari tabel distribusi t); df (degree of freedom); n = jumlah data


33

2. Prediksi sifat iritatif cooling gel ekstrak daun petai cina Jika nilai sensitifitas dan spesifisitas metode CART > 60% dapat dilakukan prediksi sifat iritatif dari sediaan. Prediksi dilakukan sesuai dengan faktor klasifikasi dan nilai cut-off yang didapatkan dari metode CART.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Ekstraksi Daun Petai Cina Penelitian ini menggunakan tumbuhan petai cina yang diambil dari wilayah Perumda, Ungaran. Daun diambil dari satu pohon saja untuk meminimalkan faktor pengacau yang mungkin bisa mengganggu penelitian. Daun petai cina yang digunakan telah melalui proses determinasi (lampiran 1). Dipilih tumbuhan petai cina dengan tinggi 5-6 m yang memiliki banyak daun pada satu pohon. Daun petai cina diambil pada bulan September 2014 dan dalam keadaan berbuah. Tumbuhan petai cina memiliki daun yang kecil dan berwarna hijau. Daun yang telah diambil, dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran kemudian daun petai cina diangin-anginkan hingga tidak basah lagi. Setelah dikeringkan daun dipetik dari batangnya menjadi satuan kecil. Daun yang sudah dipetik tersebut dikeringkan dengan cara dianginanginkan kembali selama 3 hari hingga mengering. Indikasi bahwa daun sudah benar-benar kering adalah ketika daun diremas akan menjadi serpihan kecil. Daun petai cina yang kering ini disebut juga simplisia daun petai cina. Untuk mempermudah saat ekstraksi, simplisa daun petai cina dihaluskan menggunakan alat penyerbuk yang berada di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma. Hasil maserasi akan lebih optimal karena serbuk yang dimaserasi tidak terlalu halus dan tidak terlalu kasar sehingga saat maserasi serbuk tidak mengendap dengan rapat. 34


35

Pada penelitian dilakukan 3 kali ekstraksi. Untuk masing-masing proses ekstraksi, sebanyak 25 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 1000 mL dan ditambahkan 250 mL etanol 96% serta 250 mL akuades dan dimaserasi selama 3 hari. Setelah 3 hari, campuran tersebut disaring menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Filtrat diremaserasi menggunakan 500 mL etanol 96% selama 24 jam. Setelah 24 jam remaserasi, campuran disaring kembali dengan bantuan pompa vakum. Hasil maserasi dan remasererasi dicampur menjadi satu dan dilakukan evaporasi. Evaporasi menggunakan rotari evaporator selama 2 jam dan dilanjutkan menggunakan waterbath selama 5 jam hingga penyusutan bobot ekstrak tidak lebih dari 10%. Tanin dan saponin merupakan senyawa yang larut dalam air dan pelarut organik seperti alkohol. Sedangkan flavonoid tidak larut dalam air, tetapi larut dalam sebagian pelarut organik. Oleh karena itulah penggunaan pelarut etanol 96% : akuades digunakan saat proses ekstraksi.

B. Pembuatan dan Uji Sifat Fisis Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina Pada pembuatan cooling gel ekstrak daun petai cina ini digunakan CMCNa sebagai gelling agent, propilen glikol sebagai humektan, akuades sebagai pelarut, dan ekstrak petai cina sebagai zat aktif. Sanjaya (2013) telah melakukan optimasi propilen glikol sebagai humektan dan CMC-Na sebagai gelling agent dalam sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. Jumlah CMC-Na yang digunakan dalam formula adalah 5 g (level rendah) dan 8 g (level tinggi), sedangkan untuk jumlah propilen glikol adalah 16 g


36

(level rendah) dan 20 g (level tinggi), sehingga tidak dilakukan lagi optimasi jumlah humektan maupun gelling agent dalam penelitian ini. Uji sifat fisis sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dilakukan untuk mengetahui sediaan gel yang dihasilkan telah memiliki sifat fisis yang baik yaitu dapat diterima oleh masyarakat (acceptable). Sifat fisis yang diamati daam penelitian adalah daya sebar, viskositas, dan pH. Uji sifat fisis sediaan, khususnya daya sebar dan viskositas dilakukan 48 jam setelah pembuatan gel. Waktu 48 jam dianggap sudah tidak ada lagi pengaruh gaya atau energi yang diberikan dalam proses pembuatan sediaan yang dapat mempengaruhi hasil pengujian. Hasil uji sifat fisis sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dapat dilihat pada Tabel VII. Tabel VII. Data uji sifat fisik

Formula pH Daya Sebar (cm) ± SEM Viskositas (d.Pas) ± SEM 1

6

6,742±0,361

80±0

2

6

6,492±0,060

140±37,859

3

6

5,525±0,104

275±14,434

4

6

5,175±0,278

333,33±16,667

Keterangan: Formula 1 = formula cooling gel dengan level gelling agent dan humektan rendah; Formula 2 = formula cooling gel dengan level gelling agent rendah dan humektan tinggi; Formula 3 = formula cooling gel dengan level gelling agent tinggi dan humektan rendah; Formula 4 = formula cooling gel dengan level gelling agent dan humektan tinggi

Uji pH dilakukan untuk mengetahui pH tiap formula yang dibuat, sesaat setelah pembuatan geldengan menggunakan pH universal. Hasil uji pH menurut Tabel VII, didapatkan bahwa semua sediaan mempunyai pH 6 yang masuk ke dalam range pH yang diinginkan yaitu nilai range pH kulit yang menurut Heather et al., (2012) kulit memiliki rentang pH antara 5-6,5. Sediaan cooling gel yang


37

dibuat sesuai dengan syarat pH untuk sediaan topikal sehingga diharapkan tidak mengiritasi kulit. Pengujian daya sebar bertujuan untuk mengetahui kemampuan sediaan semisolid untuk menyebar dengan cara melihat diameter penyebaran sediaan semisolid pada tempat aplikasi. Daya sebar merupakan kemampuan suatu sediaan semisolid untuk menyebar di area yang akan diaplikasikan. Daya sebar berbanding terbalik dengan viskositas, semakin kecil viskositas suatu sediaan semisolid maka kemampuan menyebarnya pada permukaan kulit akan semakin besar, begitu juga sebaliknya. Menurut Garg et al. (2002) daya sebar yang optimum untuk sediaan yang bersifat semisolid berada pada kisaran 3-6 cm. Pengujian viskositas dilakukan untuk mengetahui tingkat kekentalan gel. Viskositas berbanding terbalik dengan kemampuan alir di mana semakin besar viskositas maka kemampuan untuk mengalir akan semakin kecil, begitu pula sebaliknya. Viskositas sediaan semisolid menurut Garg et al. (2002) adalah 200300 d.Pa.s. Pada Tabel VII, dapat dilihat bahwa daya sebar yang dihasilkan pada formula 1 dan 2 belum memenuhi teori. Hal ini dapat disebabkan karena penggunaan gelling agent yang kecil sedangkan untuk formula 3 dan 4 sudah memenuhi teori sehingga dapat dikatakan sediaan yang dihasilkan dalam penelitian merupakan kategori sediaan semisolid. Bila dilihat dari viskositasnya, yang memenuhi syarat viskositas sediaan semisolid hanyalah formula 3. Dari Tabel VII juga dapat dilihat bahwa daya sebar berbanding terbalik dengan viskositas, semakin tinggi daya sebar semakin rendah pula viskositasnya. Namun,


38

hasil yang diperoleh tidak sesuai dengan teori yang seharusnya semakin besar konsentrasi propilen glikol yang ditambahkan akan menyebabkan penurunan viskositas karena propilen glikol mempunyai banyak gugus hidroksi yang akan menarik air melalui pembentukan ikatan hidrogen.

C. Pembuatan Bahan Uji Iritasi Bahan uji iritasi digunakan sebagai pembanding dalam uji iritasi, bahan uji merupakan bahan-bahan yang digunakan pada kosmetik. Berdasarkan hasil uji sifat fisis sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina yang telah diformulasikan, dipilih formula 3 untuk pengujian iritasi. Formula 3 dipilih karena hanya formula 3 yang memenuhi persyaratan uji sifat fisis sediaan semisolid gel. Untuk mengetahui potensi iritasi dari sediaan cooling gel, dilakukan pula uji iritasi pada komponen penyusun gel yaitu gelling agent dan humektannya agar dapat diketahui pengaruh penggunaan gelling agent dan humektan yang dipilih terhadap potensi iritasi dari sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. CMC-Na digunakan sebagai salah satu bahan uji karena CMC-Na merupakan gelling agent pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. Propilen glikol digunakan sebagai salah satu bahan uji iritasi untuk mengetahui potensi iritasi dari humektan yang digunakan. Pada uji pendahuluan digunakan propilen glikol dengan konsentrasi 100% (tanpa pengenceran), tetapi hasil pengujian menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 100% siput mati sebelum 60 menit batas waktu pemaparan selesai. Menurut Rowe et al., (2009), propilen glikol dengan konsentrasi 10% dapat menimbulkan reaksi iritasi dan sensitisasi


39

kulit. Penggunaan propilen glikol dalam sediaan semisolid dibatasi dengan konsentrasi ±15% sehingga konsentrasi propilen glikol yang dipilih sesuai dengan konsentrasi propilen glikol yang digunakan dalam formulasi sediaan untuk mengetahui potensi iritasinya dalam sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. Propilen glikol diencerkan menggunakan akuades sebagai bahan uji non-iritan. Gliserin digunakan sebagai salah satu bahan uji karena gliserin dapat digunakan sebagai humektan pada sediaan gel. Gliserin dalam range 20-25% digunakan untuk moisturizer pada kulit kering. Gliserin sampai dengan konsentrasi 25% aman digunakan dan dalam batas toleransi kulit (Paye, 2006). Gliserin dengan konsentrasi 100% digunakan sebagai kontrol iritan pada slug irritation test. Penggunaan asam salisilat dibatasi dengan konsentrasi 1,5% untuk sediaan kosmetik dan untuk pemakaian sehari-hari dengan konsentrasi 2-3% asam salisilat tergolong aman dan jarang mengiritasi (Leyden et al., 2002). Pada uji pendahuluan, dilakukan uji pada siput menggunakan asam salisilat dengan konsentrasi 2%, 1%, dan 0,5%. Namun, hasil pengujian menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 2% dan 1% siput mati sebelum 60 menit batas waktu pemaparan selesai sedangkan untuk konsentrasi 0,5% siput tetap hidup. Asam salisilat untuk uji iritasi dibuat dengan konsentrasi 0,5% karena mampu mengiritasi siput tetapi tidak membuat siput mati. Asam salisilat dibuat dengan konsentrasi 0,5% dalam gel, digunakan sebagai bahan uji non-iritan. Asam laktat merupakan salah satu senyawa Alpha-hydroxyacids (AHAs) yang efektif digunakan sebagai humektan moisturizer (Leyden et al., 2002). Pada


40

uji pendahulan, dilakukan uji pada siput menggunakan asam laktat dengan konsentrasi 2,5%, 1%, dan 0,5%. Namun, hasil pengujian menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 2,5% dan 1% siput mati sebelum 60 menit batas waktu pemaparan selesai sedangkan untuk konsentrasi 0,5% siput tetap hidup. Asam laktat untuk uji iritasi dibuat dengan konsentrasi 0,5% karena mampu mengiritasi siput tetapi tidak membuat siput mati. Asam laktat dibuat dengan konsentrasi 0,5% dalam gel, digunakan sebagai bahan uji non-iritan. Menurut U.S Cosmetic Ingredient Reviewer (CIR) konsentrasi AHA di atas 10% dengan pH di bawah 3,5 aman digunakan, konsentrasi asam laktat yang digunakan pada kosmetik untuk perawatan kulit kering sekitar 5% (Leyden et al., 2002). Berdasarkan studi iritasi kulit akut pada hewan disimpulkan bahwa 0,5%10% sodium lauril sulfat menyebabkan iritasi ringan. Untuk kontak jangka panjang pada kulit konsentrasi sodium lauril sulfat seharusnya tidak lebih dari 1%. Sodium lauril sulfat banyak digunakan dalam kosmetik dan formulasi sediaan oral maupun topikal. Sodium lauril sulfat juga kerap digunakan sebagai kontrol positif pada uji iritasi karena bersifat iritatif (Robinson et al., 1983). Pada uji pendahulan, dilakukan uji pada siput menggunakan sodium lauril sufat dengan konsentrasi 2% dan 1%. Namun, hasil pengujian menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 2% siput mati sebelum 60 menit batas waktu pemaparan selesai sedangkan untuk konsentrasi 1% siput tetap hidup. Digunakan konsentrasi 1% karena bersifat iritatif ringan sehingga siput tidak mati. Sodium lauril sulfat dibuat dengan konsentrasi 1% dalam gel, digunakan sebagai bahan uji iritan.


41

Arbutin merupakan turunan hidrokuinon yang sering digunakan sebagai agen pencerah kulit. β-arbutin digunakan sebagai agen pencerah kulit didalam krim kosmetik wajah atau lotion wajah pada konsentrasi 7%, 10% larutan βArbutin dapat menimbulkan sedikit potensi iritasi primer (Scientific Committee on Consumer Safety, 2015). Pada uji pendahulan, dilakukan uji pada siput menggunakan arbutin dengan konsentrasi 5%. Didapatkan hasil bahwa siput tidak mati dan tetap memproduksi mukus. Arbutin dibuat dengan konsentrasi 5% dalam gel, digunakan sebagai bahan uji non iritan. Hasil uji pendahuluan untuk masingmasing bahan dapat dilihat pada Tabel VIII. Tabel VIII. Hasil uji pendahuluan pada bahan uji Kontrol Bahan Konsentrasi Jenis Bahan Uji (%) CMC-Na 4% Non iritan Propilen glikol 8% Non Iritan Gliserin 100% Iritan Asam salisilat 0,5% Non iritan Asam laktat 0,5% Non iritan Sodium lauril 1% Iritan sulfat Arbutin 5% Non Iritan

D. Slug Irritation Test Salah satu kriteria yang diperlukan agar suatu sediaan dapat diterima dan digunakan oleh masyarakat adalah terkait keamanan. Sediaan topikal tidak boleh bersifat iritatif terhadap kulit karena dapat mengganggu acceptance dari sediaan tersebut, sehingga perlu dilakukan uji iritasi pada bahan. Uji iritasi pada penelitian ini menggunakan uji iritasi pada siput yang diadaptasi dari uji iritasi untuk mukosa.


42

Siput yang digunakan adalah siput telanjang (rerespo) yang diperoleh dari daerah Ungaran, Jawa Tengah. Dilakukan determinasi pada siput untuk mengetahui spesies siput yang digunakan. Siput yang digunakan pada penelitian adalah siput dari spesies Laevicaulis alte FéR (Lampiran 4). Jenis siput yang digunakan untuk pengujian iritasi akan mempengaruhi hasil akhir dari uji iritasi. Dhondt et al., (2006) menemukan bahwa “however, because this study demonstrates that the use of other slug species can influence the test end points and eye irritation classification, it is important to evaluate the effects of the selected species”. Masing-masing siput dan cawan petri ditimbang. Bahan uji dimasukkan ke dalam cawan petri, siput diletakkan di atas 1 g bahan uji dalam periode waktu 60 menit dan diukur jumlah lendir diproduksi. Mukus yang dihasilkan digunakan sebagai parameter sifat iritatif bahan. Menurut Cock et al., (2011), dalam keadaan normal siput telanjang memproduksi mukus dalam jumlah terbatas untuk menghindari dehidrasi. Ketika siput dipaparkan dengan komponen iritan, siput akan mensekresi mukus sebagai mekanisme untuk perlindungan dinding tubuh siput. Semakin tinggi jumlah mukus yang diproduksi, semakin iritan bahan untuk tubuh siput. Warna dari mukus yang diproduksi juga dapat mengindikasikan tingkat iritasi. Normalnya mukus yang diproduksi oleh siput tidak berwarna tetapi kontak dengan bahan iritan menyebabkan sekresi mukus yang berwarna sedikit kuning. Siput kemudian dipindahkan ke cawan petri baru, kemudian ditambahkan 1 mL Phosphat Buffer Saline (PBS) di dekat bagian bawah tubuh siput dan


43

didiamkan selama 60 menit. Setelah 60 menit kontak dengan bahan uji, siput akan melepaskan ALP, LDH, dan albumin. Menurut McComb, Bowers, and Posen (1979), secara umum alkaline phosphatase (ALP) terdapat pada 3 daerah pada tubuh moluska yaitu saluran pencernaan, organ excretory, dan pada bagian mantel. Aktivitas ALP akan meningkat jika terjadi kerusakan sel maupun infeksi pada snails dan slugs. Lactate dehydrogenase (LDH) merupakan enzim sitolik dan akan dilepaskan pertama kali saat terjadi kerusakan jaringan. Setelah 60 menit, cairan Phosphat Buffer Saline (PBS) yang telah kontak dengan tubuh siput ditampung dalam tabung microtube. PBS digunakan sebagai pelarut dari biomarker kerusakan jaringan yang dilepaskan oleh siput. Hasil slug irritation test yang didapatkan dalam penelitian ini disajikan pada Tabel IX. Tabel IX. Data slug irritation test Bahan Uji

CMC-Na 4% (Non Iritan)

Propilen glikol 8% (Non iritan)

Pengukuran 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Persen mukus (%) -12,426 -12,197 -70,925 -20,290 -14,817 -17,714 -15,626 -16,109 -13,578 -11,296 -11,427 -16,657 -19,594 -19,414 -8,134 -11,804 -4,835 -13,511 -8,852 -8,621

LDH (U/L) -3,360 0,000 6,720 0,000 -3,360 -3,360 0,000 6,720 10,080 0,000 -6,720 -3,360 -20,160 0,000 3,360 -6,720 3,360 0,000 -3,360 3,360

ALP (U/L) 1,100 2,200 4,400 2,200 4,400 2,200 3,300 5,500 5,500 3,300 0,000 5,500 5,500 6,600 3,300 5,500 5,500 5,500 15,400 8,800

Albumin (μg/mL) 36,697 0,000 12,232 489,297 67,797 257,627 122,699 -24,540 -53,691 40,268 48,930 48,930 48,930 134,557 67,797 216,949 171,779 -24,540 26,846 53,691


44

Tabel IX (lanjutan) Persen mukus LDH ALP Albumin (%) (U/L) (U/L) (μg/mL) 1 51,412 -6,720 9,900 97,859 2 51,497 0,000 39,600 12,232 3 50,606 3,360 24,200 12,232 4 42,041 -10,080 53,900 146,789 5 37,937 -3,360 45,100 122,034 Gliserin 100% (Iritan) 6 38,145 -3,360 85,800 230,508 7 44,106 3,360 36,300 196,319 8 40,437 -3,360 50,600 24,540 9 41,166 3,360 23,100 80,537 10 43,009 3,360 35,200 93,960 1 2,778 -6,720 2,200 48,930 2 15,296 -3,360 2,200 61,162 3 12,021 -3,360 3,300 61,162 4 5,358 -3,360 13,200 85,627 5 7,148 23,520 5,500 67,797 Salisilat 0,5% (Non iritan) 6 6,844 -3,360 4,400 244,068 7 12,450 0,000 5,500 171,779 8 6,819 3,360 6,600 36,810 9 7,141 13,440 6,600 26,846 10 13,863 -6,720 7,700 67,114 1 27,180 -3,360 8,800 36,697 2 25,319 0,000 13,200 48,930 3 5,956 -3,360 16,500 61,162 4 -8,224 -3,360 19,800 146,789 5 18,357 -23,520 12,100 122,034 SLS 1% (Iritan) 6 14,098 0,000 17,600 244,068 7 9,646 0,000 11,000 245,399 8 17,775 3,360 11,000 85,890 9 22,586 6,720 15,400 40,268 10 16,606 -6,710 23,100 40,268 1 9,534 3,360 3,300 48,930 2 4,479 -6,720 3,300 0,000 3 1,970 -3,360 4,400 110,092 4 -3,959 3,360 4,400 -122,324 5 6,331 0,000 4,400 40,678 Laktat 0,5% (Non iritan) 6 7,727 0,000 4,400 284,746 7 1,777 0,000 4,400 -12,270 8 -1,620 3,360 4,400 12,270 9 2,719 -3,360 3,300 26,846 10 10,541 0,000 0,000 53,691 1 -10,704 -6,720 6,600 -146,789 2 11,755 0,000 2,200 48,930 3 0,210 3,360 3,300 110,092 4 1,515 3,360 3,300 73,394 5 9,924 0,000 3,300 135,593 Arbutin 5% (Non Iritan) 6 9,753 -6,720 5,500 284,746 7 7,509 -3,360 3,300 -12,270 8 2,686 0,000 6,600 12,270 9 8,246 13,440 4,400 -26,846 10 0,064 10,080 12,100 67,114 Keterangan: Persen mukus adalah perbandingan jumlah total mukus yang dihasilkan oleh siput setelah 60 menit pemaparan bahan uji dengan bobot siput; Nilai ALP (Alkaline phosphatase) adalah selisih aktivitas enzim ALP tiap menit; Nilai LDH (Lactate dehydrogenase) adalah selisih aktivitas enzim LDH tiap menit; Nilai albumin adalah nilai konsentrasi albumin dalam sampel. Bahan Uji

Pengukuran


45

Penentuan nilai ALP, LDH, dan albumin menggunakan sampel PBS yang direaksikan dengan reagen yang terdapat pada masing-masing kit ALP, LDH, dan albumin, pengukuran dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis. ALP bertindak sebagai katalis pada hidrolisis p-nitrofenilfosfat menjadi p-nitrofenol dan fosfat, p-nitofenol mempunyai absorbansi pada panjang gelombang 405 nm. Jumlah p-nitrofenol yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi katalitik dari ALP yang ada pada sampel. Semakin tinggi kadar ALP pada sampel maka semakin banyak p-nitrofenol yang terbentuk. p-nitrofenilfosfat + H2O

ALP

fosfat + p-nitrofenol (1)

LDH merupakan suatu enzim yang mengandung 5 isoenzim yang berbeda yang mengkatalisis perubahan piruvat menjadi l-laktat. Jumlah laktat yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi katalitik dari LDH yang ada pada sampel. Prinsip pengukurannya semakin banyak jumlah LDH dalam sampel maka semakin tinggi laktat yang terbentuk. Piruvat + NADH + H+

LDH

Laktat + NAD+

(2)

Albumin akan membentuk kompleks warna dengan bromkresol hijau (BCG), intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan kandungan albumin dalam sampel. Semakin tinggi kandungan albumin pada sampel albumin maka intensitas warna hijau yang ditimbulkan akan semakin tinggi. BCG + albumin

pH terkontrol

kompleks BCG-Albumin

(3)

E. Validasi Slug Irritation Test Menggunakan CART Validasi protokol slug irritation test menggunakan model prediksi yang dikembangkan menggunakan metode statistika classification and regression tree.


46

Analisis classification and regression tree merupakan bagian dari decision tree yang dilakukan menggunakan program RStudio versi 0.98.1028. Prediksi respon iritasi menggunakan data dari keempat faktor yaitu persen mukus, ALP, LDH, dan albumin. Untuk prediksi menggunakan classification and regression tree digunakan dua metode yaitu metode kelas dan metode anova. Dari uji menggunakan metode CART didapatkan hasil seperti pada Tabel X. Tabel X. Classification and Regression Tree Anova Method Class Method Variabel yang digunakan ALP Persen mukus ALP Cut-off 8,25 0,12 8,25

Persen mukus 0,12

Dari Tabel X dapat dilihat variabel yang digunakan dan dipilih setelah pengolahan secara statistik dari keempat faktor. Didapatkan juga nilai cut off dari masing-masing variabel yang digunakan, nilai cut off ini yang nantinya akan digunakan untuk syarat klasifikasi dan prediksi senyawa iritan atau non iritan. Cut off dari ALP yaitu 8,25 dan cut off dari persen mukus yaitu 12%. Classification Tree Regression Tree

(a) (b) Gambar 11. Classification (a) and Regression (b) Tree

Dari Gambar 11 dapat dilihat perbedaan hasil plot antara metode kelas (classification tree) dengan hasil plot dari metode anova (regression tree). Untuk prediksi sifat iritatif bahan digunakan metode kelas yang mempunyai nilai akhir angka 0 dan 1, nilai akhir ini merupakan variabel respon yang berupa skala


47

kategorik. Angka 0 akan menunjukkan bahan non iritan sedangkan angka 1 akan menunjukkan bahwa bahan iritan. Tidak digunakan metode anova karena variabel respon yang diinginkan tidak berbentuk kontinu. Hasil analisis menggunakan metode anova (Gambar 11.b.) menunjukkan adanya 46 bahan uji yang bersifat tidak mengiritasi, 17 bahan yang bersifat mengiritasi, dan 7 bahan yang termasuk dalam subgrup baru antara mengiritasi dan tidak mengiritasi. Nilai 0,4286 menunjukkan nilai rata-rata dari respon iritasi dari ketujuh bahan tetapi jika digunakan metode kelas, maka 7 bahan termasuk dalam kelas non iritan. Pada metode anova dapat dilihat jumlah bahan beserta respon iritasinya. Dari kedua metode yang digunakan menghasilkan nilai cut off yang sama. Namun, untuk prediksi sifat iritatif bahan lebih cocok digunakan metode kelas karena memberikan hasil akhir yang diinginkan yaitu penggolongan bahan. Jika nilai ALP yang terukur kurang dari 8,25 masuk ke kategori 0, jika lebih dari 8,25 maka dilihat lagi persen mukus yang dihasilkan apakah kurang dari 12% atau lebih. Jika persen mukus yang dihasilkan kurang dari 12% masuk kategori 0 dan jika lebih dari 12% masuk ke kategori 1. Classification Tree

Gambar 12. Classification Tree Keterangan: Berdasarkan hasil classification tree, ALP dan persen mukus merupakan variabel yang digunakan untuk menentukan penggolongan sifat iritatif bahan. nilai ALP < 8,25 dikelompokkan menjadi non-iritan. Nilai ALP > 8,25 dan persen mukus < 12% dikelompokkan menjadi non-iritan, nilai ALP > 8,25 dan persen mukus > 12% dikelompokkan menjadi iritan.


48

Dari Gambar 12 kemudian ditinjau kembali data slug irritation test untuk mencari spesifisitas dan selektivitas sebagai syarat validasi uji alternatif. Untuk mencari spesifisitas dan selektivitas terlebih dahulu dicari nilai true positive, false positive (positif palsu), true negative, dan false negative (negatif palsu). Dikatakan positif benar (true positive) jika pada literatur bahan dikatakan iritan dan prediksi CART bahan dikatakan iritan. Data dikatakan negatif benar (true negative) jika pada literatur bahan dikatakan non-iritan dan pada prediksi CART dikatakan non-iritan. Data dikatakan positif palsu (false positive) jika pada literatur bahan dikatakan non-iritan dan pada prediksi CART bahan dikatakan iritan. Data dikatakan negatif palsu (false negative) jika pada literatur bahan dikatakan iritan dan prediksi CART bahan dikatakan non-iritan. Tabel XI. Confusion matrix prediksi CART

Literatur

Prediksi CART Iritan

Non-iritan

Iritan

17

3

Non-iritan

0

50

Dari Tabel XI diketahui dari total 70 bahan uji iritasi didapatkan nilai true positive sebanyak 17 artinya dari 17 senyawa iritan menurut literatur diprediksi dengan tepat sebagai iritan menggunakan prediksi CART. Tidak didapatkan adanya nilai positif palsu, artinya tidak ada bahan non-iritan yang diprediksi sebagai iritan. Nilai true negative sebanyak 50, 50 senyawa non-iritan menurut literatur juga diprediksi non-iritan menggunakan CART. Ada 3 bahan


49

iritan yang diprediksi sebagai non-iritan lewat prediksi CART, dapat dilihat dari nilai negatif palsu yaitu 3. Nilai sensitifitas yang didapat yaitu 85% dan nilai spesifisitas yang didapat yaitu 100%. Dari nilai spesifisitas 100% dapat dinyatakan bahan non iritan benar-benar digolongkan sebagai non iritan menggunakan prediksi CART, terbukti dengan tidak ditemukannya nilai false positive. Prediksi sifat iritatif bahan dengan slug irritation test menggunakan metode classification and regression tree dikatakan valid karena telah memenuhi syarat sensitifitas dan spesifisitas > 60%. Menurut Liu, Cheng, Yan, Wu, and Chen (2015), nilai MCC digunakan untuk mengukur kualitas klasifikasi (biner). Diperoleh nilai MCC untuk metode CART sebesar 0,895481. Untuk penentuan rkritis terlebih dahulu dicari nilai titik kritis distribusi t (ttabel) berdasarkan nilai df yang diketahui. Nilai df dari 70 data adalah 68. Menggunakan tabel distribusi t (lampiran 9) dicari nilai titik kritis distribusi untuk df 68 dengan tingkat kepercayaan (α) 0,025. Diperoleh nilai titik kritis distribusi t sebesar 1,995. Menggunakan nilai titik kritis distribusi t tersebut diperoleh hasil rkritis sebesar 0,235146. Karena nilai MCC lebih besar dari nilai rkritis dapat dikatakan bahwa klasifikasi menggunakan CART pada cooling gel ekstrak daun petai cina dapat diterima.

F. Prediksi Sifat Iritatif Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina Pohon klasifikasi yang didapatkan dari analisis CART digunakan untuk menentukan sifat iritatif sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. Jika nilai


50

ALP terukur kurang dari dari 8,25 masuk ke kategori 0, jika lebih dari 8,25 maka dilihat lagi persen mukus yang dihasilkan apakah kurang dari 12% atau lebih. Jika persen mukus yang dihasilkan kurang dari 12% masuk kategori 0 dan jika lebih dari 12% masuk ke kategori 1. Tabel XII. Hasil ALP dan persen mukus cooling gel ekstrak daun petai cina ALP cut off Persen mukus cut off Pengukuran Kategori (U/L) ALP (%) persen mukus 1 3,3 1,128 non iritan 2 2,2 2,401 non iritan 3 1,1 -1,069 non iritan 4 3,3 -5,360 non iritan 5 -5,5 1,545 non iritan 8,25 12 6 3,3 4,237 non iritan 7 3,3 0,991 non iritan 8 3,3 0,289 non iritan 9 4,4 -0,447 non iritan 10 4,4 1,195 non iritan

Berdasarkan Tabel XII dapat dilihat nilai ALP dan persen mukus yang dihasilkan oleh siput dari pengujian sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina. Dari 10 kali pengukuran didapatkan nilai ALP kurang dari nilai cut off sehingga dapat disimpulkan bahwa sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina bersifat non iritan.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Protokol slug irritation test pada sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina dengan metode classification and regression tree (CART) menunjukkan hasil yang valid. 2. Sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina non iritan sebagai sediaan topikal.

B. Saran 1. Perlu ditambahkan jenis dan jumlah kontrol bahan uji pada slug irritation test. 2. Perlu dikaji proporsi kontrol bahan uji. 3. Perlu dilakukan optimasi waktu pengukuran kadar ALP, LDH, dan albumin menggunakan spektrofotometer.

51


Daftar Pustaka Adriaens, E., 2006, The Slug Mucosal Irritation Assay : An Alternative Assay for Local Tolerance Testing, National Centre for The Replacement, Refinement and Reduction of Animals In Research, 1-9. Allen, L.V., 1999, The Basic of Compounding, International Journal of Pharmaceutical Compounding, 385-389. Archer, G., 1997, The Validation of Toxicological Prediction Models, Plenum Press, New York, pp. 141-146. Balaban, N.E., and Bobick, J.E., 1998, The Handy Anatomy Answer Book, diterjemahkan oleh Tanuwidjaja, B.S., hal. 48, PT. Indeks, Jakarta. Balls, 1990, The Three Rs: The Way Forward: The Report and Recommendations of ECVAM Workshop, Utrecht University, The Netherlands. Baumann, L., Saghari, S., and Weisberg, E., 2009, Cosmetic Dermatology Principles and Practice, 2nd edition, The McGraw-Hill Companies, Inc., New York, p. 15. Benson, H.A.E., and Watkinson, C., 2012, Topical and Transdermal Drug Delivery Principles and Practice, John Wiley & Sons, Inc., New jersey, pp. 328. Brodie, G., and Barker, G.M., 2012, Laevicaulis alte (Férussac, 1822), Family Veronicellidae. USP Introduced Land Snailsof The Fiji Islands Fact Sheet, 3. Buchman and Stephan, 2001, Handbook of Cosmetic Science and Technology, Marcel Dekker Inc., New York, pp. 150-166. Chew, Y.K., Chan, E., W., L., Tan, P., L., Lim, Y., Y., Stanlas, and J., Goh, J., K., 2011, Assesment of phytochemical content,polyphenolic composition, antioxidant and antibacterial activities of Leguminosae medicinal plants in Peninsular Malaysia, BMC Complementary and Alternative Medicine, 12, 6. Cock, L., Lenoir, J., De Koker, S., Vermeersch, V., Skirtach, A., Dubruel, P., et al., 2011, Mucosal Irritation Potential of Polyelectrolyte Multilayer Capsules, Biomaterials, 32, 1967-1977. Dhont, M., 2005, Optimisation and Validation of An Alternative Mucosal Irritation Test, Dissertation, Ghent University, Belgium, 2,14, 36. Dhondt, M., Adriaens, E., Pinceel, J., Jordaens, K., Backeljau, T., and Remon, J.P., 2006, Slug Species-And Population-Specific Effects on The End 52


53

Points of The Slug Mucosal Irritation Test, Toxicology In Vitro, 20, 448457. Dirjen POM, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, hal.7. Garcia-Lafuente, A., Guillamon, E., Villares, A., Rostagno, M. A., Martinez, J. A., 2009, Flavonoid as Anti-Inflammatory Agent: Implications in Cancer and Cardiovascular Disease, Journal of Inflammation Research., 58:537552. Garg, A., Aggarwal, D., Garg, S., and Singla, A.K., 2002, Spreading of Semisolid Formulation: An Update, Pharmaceutical Technology, diakses tanggal 1 Mei. Gomes, S.R., and Thome, J.W., 2004, Diversity & Distribution of The Veronicellidae In The Oriental & Australian Biogeographical Regions, Memoirs of The Queensland Museum, 49 (2), 131-137. Graham-Brown, R., and Burns, T., 1999, Lecture Notes on Dermatology, diterjemahkan oleh Zakaria, M.A., hal. 9, Erlangga, Jakarta. Hartati, A., Zain, Ismaini, Ulama, and Brodjol Sutijo S., 2012, Analisis CART (Classification And Regression Trees) pada Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kepala Rumah Tangga di Jawa Timur Melakukan Urbanisasi, Jurnal Sains Dan Seni ITS, 1 (1), 100. Heather, A.E., and Adam, C.W., 2012, Transdermal and Topical Drug Delivery: Principles and Practice, A.John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, p. 265. Irianto, K., 2012, Anatomi Dan Fisiologi, Alfabeta, Bandung, hal. 320-321, 431433 Keller, G.S. and Lacombe, V. G., 2001, Lasers in Aesthetic Surgery, Thieme, New York, p. 226. Leyden, J.J., and Rawling, A.V., (Eds.), 2002, Skin Moisturization, Cosmetic Science and Technology Series, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 324328, 331, 354-356, 613-614, 625. Liu, Y., Cheng, J., Yan, C., Wu, Xiao., and Chen, F., 2015, Research on the Matthews Correlation Coefficients Metrics of Personalized Recommendation Algorithm Evaluation, International Journal of Hybrid Information Technology, 8 (1), 163-172. McComb, R., Bowers, G., and Posen S., 1979, Alkaline Phospatase, Plenum Press, New York, pp. 44-46.


54

Michael and Ash, 2004, Handbook of Preservatives, Synapes Information Resources Inc., USA, p. 535. Osborne, D.W., and Amann, A.H., 1990, Topical Drug Delivery Formulations, Marcel Dekker Inc., New York, pp. 381-383. Paye, M., 2006, Handbook of Cosmetic and Science and Technology, 2nd Edition, CRC Press, pp. 268-269. Ramakrishna, S., Jayashankar, M., Alexander, R., Thanuja, B.G., and Deepak,P., 2014, Morphometric Studies of The Tropical Leatherleaf Slug Laevicaulis Alte (Férussac, 1822), International Global Journal for Research Analysis, 3 (3), 190-201. Robinson, V.C., Bergfeld W.F., Belsito D.V., Hill R.A., Klaassen C.D., Marks J.G., et al., 1983, Final Report on the Safety Assessment of Sodium Lauryl Sulfate, International Journal of Toxicology, 29(4), 127-181. Rowe, R.C., Sheskey, P.J., and Quinn, M.E., 2009, Handbook of Pharmaceutical Excipients, edisi 6, Pharmaceutical press, London, pp. 118-121, 283, 301, 562, 698. Thomas, 1992, Tanaman Obat Tradisional 2, Kanisius, Yogyakarta, hal. 91. Sanjaya, O., 2013, Optimasi Humektan Propilenglikol dan Gelling Agent CMCNa Dalam Sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.) : Aplikasi Desain Faktorial, Skripsi, 18-20, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Scientific Committee on Cosmetic Products and Non-Food Products, 2002, Salicylic Acid, European Commission, pp. 6-16. Scientific Committee on Consumer Safety, 2015, Opinion on β-arbutin, European Commission, pp. 6-16. Smolinske, 1992, Handbook of Food, Drug, and Cosmetics Excipients, CRC Press, USDA, pp. 199-200. United States Departement of Agriculture, 2013, Leucaena leucocephala (Lmk) De Wit, White leadtree, http://plants.usda.gov/java/profile?symbol=LELE10, diakses tanggal 1 Mei 2014. World Health Organization, 2005, Bahaya Bahan Kimia pada Kesehatan Manusia dan Lingkungan. EGC, Jakarta. Welss, T., Basketter, D.A., and Schroder, K.R., 2004, In Vitro Skin Irritation : Facts and Future. State of The Art Review of Mechanisms and Models, Toxicology in Vitro, 18 (1), 231-243.


LAMPIRAN

55


56

Lampiran 1. Determinasi petai cina


57

Lampiran 2. Data hasil pengukuran uji sifat fisik sediaan gel 1. Uji pH Formula 1 2 3 4

Replikasi 1 2 3 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

2. Uji Daya Sebar dan Viskositas Formula 1 2 3 4

R1 6,125 6,375 5,725 5,375

Daya sebar R2 R3 6,725 7,375 6,525 6,575 5,375 5,475 4,625 5,525

Viskositas Rata-rata R1 R2 R3 Rata-rata 6,742 80 80 80 80 6,492 70 150 200 140 5,525 250 300 275 275 5,175 350 350 300 333,333

Lampiran 3. Foto cooling gel ekstrak daun petai cina Formula 1

Formula 2

Formula 3

Formula 4


58

Lampiran 4. Determinasi siput

Lampiran 5. Foto slug irritation test 1. Foto perlakuan penempatan bahan uji diatas siput selama 60 menit

Perlakuan CMC-Na

Perlakuan propilenglikol

Perlakuan gliserin


59

Perlakuan asam salisilat

Perlakuan SLS

Perlakuan asam laktat

Perlakuan arbutin

Perlakuan sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina

2. Mukus hasil uji

Perlakuan CMC-Na

Perlakuan asam salisilat

Perlakuan propilenglikol

Perlakuan SLS

Perlakuan sediaan cooling gel ekstrak daun petai cina

Perlakuan gliserin

Perlakuan asam laktat

Perlakuan arbutin


60

Lampiran 6. Data slug irritation test Data penimbangan siput dan mukus Berat Petri (g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

48,791 43,372 45,667 34,475 43,365 46,447 43,372 46,452 43,371 46,453 41,809 35,146 35,797 47,762 51,015 39,09 51,02 39,096 51,019 39,096 35,626 35,795 48,327 46,514 37,808 48,784 37,914 48,792 37,912 48,792

Gliserin

Propilenglikol

CMC-Na

Bobot Bahan Replikasi Siput (g) 3,195 3,304 3,632 3,036 3,28 3,263 3,635 3,228 3,41 3,178 3,238 3,620 3,649 3,379 3,098 3,448 3,785 3,042 3,163 3,039 3,293 3,274 3,875 3,675 3,374 3,526 3,877 3,618 3,979 3,755

Berat Berat Petri + Berat Petri + Petri + Sediaan Sediaan + Cotton Sediaan + Cotton Bud + Mukus (g) (g) Bud (g) 49,799 49,966 49,569 44,387 44,552 44,149 46,668 48,830 46,254 35,475 35,622 35,006 44,384 44,542 44,056 47,458 47,618 47,04 44,378 44,552 43,984 47,461 47,626 47,106 44,373 44,541 44,078 47,455 47,62 47,261 42,826 42,980 42,610 36,148 36,315 35,712 36,789 36,959 36,244 48,768 48,946 48,290 52,017 52,184 51,932 40,099 40,268 39,861 52,042 52,225 52,042 40,132 40,281 39,87 52,019 52,168 51,888 40,107 40,27 40,008 36,672 36,830 38,523 36,832 36,993 38,679 49,329 49,479 51,440 47,524 47,692 49,237 38,911 39,079 40,359 49,8 49,974 51,319 38,927 39,108 40,818 49,799 49,982 51,445 38,929 39,083 40,721 49,81 49,983 51,598

Bobot Cotton Mukus Bud (g) (g) 0,167 0,165 2,162 0,147 0,158 0,16 0,174 0,165 0,168 0,165 0,154 0,167 0,17 0,178 0,167 0,169 0,183 0,149 0,149 0,163 0,158 0,161 0,150 0,168 0,168 0,174 0,181 0,183 0,154 0,173

-0,397 -0,403 -2,576 -0,616 -0,486 -0,578 -0,568 -0,52 -0,463 -0,359 -0,370 -0,603 -0,715 -0,656 -0,252 -0,407 -0,183 -0,411 -0,280 -0,262 1,693 1,686 1,961 1,545 1,280 1,345 1,710 1,463 1,638 1,615


61

Berat Petri (g)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

34,481 45,662 51,008 38,312 34,475 35,79 34,479 35,795 34,478 35,794 46,513 46,827 41,809 37,914 47,754 45,31 47,76 45,32 47,757 45,316 47,757 45,838 46,904 43,372 40,626 46,908 40,632 46,915 40,631 46,915 48,327 37,914 46,318 40,632 41,804 46,82 41,868 46,826 41,808 48,826

Arbutin

Laktat

SLS

Salisilat

Bobot Bahan Replikasi Siput (g) 3,352 3,393 3,702 3,453 4,029 3,726 3,984 3,461 3,697 3,044 3,337 4,076 4,080 3,271 3,421 3,965 3,95 3,308 3,148 3,017 3,923 3,505 3,808 3,814 3,301 3,559 3,376 3,209 3,531 3,159 3,083 3,828 3,811 3,564 3,416 3,322 3,196 3,314 3,056 3,101

Berat Berat Petri + Berat Petri + Petri + Sediaan Sediaan + Cotton Sediaan + Cotton Bud + Mukus (g) (g) Bud (g) 35,482 35,629 35,544 46,745 46,902 47,421 52,009 52,188 52,633 39,313 39,458 39,643 35,484 35,643 35,931 36,792 36,955 37,21 35,485 35,629 36,125 36,797 36,959 37,195 35,48 35,648 35,912 36,801 36,964 37,386 47,539 47,703 48,610 47,896 48,074 49,106 42,808 42,971 43,214 38,916 39,089 38,820 48,796 48,931 49,559 46,33 46,483 47,042 48,766 48,943 49,324 46,344 46,506 47,094 48,766 48,936 49,647 46,318 46,476 46,977 48,783 48,954 49,328 46,849 47,021 47,178 47,924 48,095 48,170 44,370 44,532 44,381 41,688 41,814 42,023 47,923 48,079 48,354 41,634 41,813 41,873 47,948 48,104 48,052 41,637 41,795 41,891 47,93 48,092 48,425 49,336 49,491 49,161 38,989 39,161 39,611 47,388 47,541 47,549 41,675 41,849 41,903 42,833 42,993 43,332 47,863 48,024 48,348 42,897 43,061 43,301 47,837 48,008 48 42,814 42,994 43,246 47,873 48,024 48,026

Bobot Cotton Mukus Bud (g) (g) 0,147 0,157 0,179 0,145 0,159 0,163 0,144 0,162 0,168 0,163 0,164 0,178 0,163 0,173 0,135 0,153 0,177 0,162 0,17 0,158 0,171 0,172 0,171 0,162 0,126 0,156 0,179 0,156 0,158 0,162 0,155 0,172 0,153 0,174 0,16 0,161 0,164 0,171 0,18 0,151

-0,085 0,519 0,445 0,185 0,288 0,255 0,496 0,236 0,264 0,422 0,907 1,032 0,243 -0,269 0,628 0,559 0,381 0,588 0,711 0,501 0,374 0,157 0,075 -0,151 0,209 0,275 0,06 -0,052 0,096 0,333 -0,33 0,45 0,008 0,054 0,339 0,324 0,24 0,089 0,252 0,002


62

Lampiran 7. Hasil analisis data menggunakan metode classification and regression trees dengan program RStudio 1. Pembuatan pohon klasifikasi

2. Metode kelas


63

Dari analisis data menggunakan metode kelas, variabel yang digunakan untuk klasifikasi senyawa adalah kadar ALP dan persen mukus. 3. Penentuan cut-off dari variabel dengan metode kelas

Keterangan : Klasifikasi pertama berdasarkan nilai cut-off dari kadar alp yaitu 8,25. Klasifikasi kedua berdasarkan nilai cut-off dari jumlah persen mukus yang dihasilkan yaitu 0,12. 4. Plot menggunakan metode kelas

Keterangan : Predicted class=0  tidak iritasi, predicted class=1  iritasi 5. Metode anava


64

Dari analisis data menggunakan metode anava, variabel yang digunakan untuk klasifikasi senyawa adalah kadar ALP dan persen mukus. 6. Penentuan cut-off dari variabel dengan metode anava

Keterangan : Klasifikasi pertama berdasarkan nilai cut-off dari kadar alp yaitu 8,25. Klasifikasi kedua berdasarkan nilai cut-off dari jumlah persen mukus yang dihasilkan yaitu 0,12.


65

4. Plot menggunakan metode anava


66

Lampiran 8. Data penentuan spesifisitas dan sensitivitas 1. Data penentuan True Positive, False Positive, True Negative, False Negative

Asam salisilat

Gliserin

Propilenglikol

CMC-Na

Bahan

Iritasi atau Tidak iritasi* 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ALP (U/L)

Persen Mukus (%)

1,100 2,200 4,400 2,200 4,400 2,200 3,300 5,500 5,500 3,300 0,000 5,500 5,500 6,600 3,300 5,500 5,500 5,500 15,400 8,800 9,900 39,600 24,200 53,900 45,100 85,800 36,300 50,600 23,100 35,200 2,200 2,200 3,300 13,200 5,500 4,400 5,500 6,600 6,600 7,700

-0,12 -0,12 -0,71 -0,20 -0,15 -0,18 -0,16 -0,16 -0,14 -0,11 -0,11 -0,17 -0,20 -0,19 -0,08 -0,12 -0,05 -0,14 -0,09 -0,09 0,51 0,51 0,51 0,42 0,38 0,38 0,44 0,40 0,41 0,43 0,03 0,15 0,12 0,05 0,07 0,07 0,12 0,07 0,07 0,14

Prediksi True False True False CART* Positive Positive Negative Negative 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Keterangan : * 0  tidak mengiritasi, 1  iritan

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0


67

Arbutin

Asam laktat

SLS

Iritasi Persen atau ALP Prediksi True False True False Bahan Mukus Tidak (U/L) CART* Positive Positive Negative Negative (%) iritasi* 1 8,800 0,27 1 1 0 0 0 1 13,200 0,25 1 1 0 0 0 1 16,500 0,06 0 0 0 0 1 1 19,800 -0,08 0 0 0 0 1 1 12,100 0,18 1 1 0 0 0 1 17,600 0,14 1 1 0 0 0 1 11,000 0,10 0 0 0 0 1 1 11,000 0,18 1 1 0 0 0 1 15,400 0,23 1 1 0 0 0 1 23,100 0,17 1 1 0 0 0 0 3,300 0,10 0 0 0 1 0 0 3,300 0,04 0 0 0 1 0 0 4,400 0,02 0 0 0 1 0 0 4,400 -0,04 0 0 0 1 0 0 4,400 0,06 0 0 0 1 0 0 4,400 0,08 0 0 0 1 0 0 4,400 0,02 0 0 0 1 0 0 4,400 -0,02 0 0 0 1 0 0 3,300 0,03 0 0 0 1 0 0 0,000 0,11 0 0 0 1 0 0 6,600 -0,11 0 0 0 1 0 0 2,200 0,12 0 0 0 1 0 0 3,300 0,00 0 0 0 1 0 0 3,300 0,02 0 0 0 1 0 0 3,300 0,10 0 0 0 1 0 0 5,500 0,10 0 0 0 1 0 0 3,300 0,08 0 0 0 1 0 0 6,600 0,03 0 0 0 1 0 0 4,400 0,08 0 0 0 1 0 0 12,100 0,00 0 0 0 1 0 Keterangan : * 0  tidak mengiritasi, 1  iritan

2. Spesifisitas TN

Spesifisitas = TN +FP =

50 50+0

=1

3. Selektifitas Sensitivitas =

TP 17 = = 0,85 TP + FN 17 + 3


68

Lampiran 9. Penentuan MCC dan rkritis 1. Tabel distribusi t

2. Perhitungan MCC

MCC =

17 x 50 −(0 x 3) 17+0 17+3 50+0 (50+3)

= 0,895481

3. Perhitungan tkritis df = 70 – 2 = 68 rkritis = (1,9952 ) (68 + (1,9952 )) rkritis = 0,235146


69

Lampiran 10. Dokumentasi

Daun petai cina yang sudah dikeringkan

Ekstrak daun petai cina

Serbuk daun petai cina


BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi yang berjudul “Validasi Protokol Slug Irritation Test Pada Sediaan Cooling Gel Ekstrak Daun Petai Cina (Leucaena Leucocephala (Lam.) De Wit. Dengan Metode Classification And Regression Trees (Cart)” bernama lengkap Yoanna Kristia Nugraheni, lahir di Surakarta pada tanggal 12 Desember 1992, merupakan anak pertama dari dua bersaudara pasangan Bapak Krisno Yuono dan Ibu Th. Endang Dwi, memiliki seorang adik yang bernama Christiana Deasy Rosalina. Penulis menempuh pendidikan formal di TK Santa Theresia Ungaran pada tahun 1996-1999, SD Mardi Rahayu II Ungaran pada tahun 1999-2005, SMP NEGERI 1 Ungaran pada tahun 2005-2008, dan SMA NEGERI 1 Salatiga pada tahun 2008-2011. Pada tahun 2011 penulis melanjutkan studinya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan menyelesaikan sampai tahun 2015. Selama kuliah penulis pernah menjadi asisten Praktikum Farmasi Fisika (2014 dan 2015), Praktikum Kimia Organik (2014), Praktikum Biokimia (2014), dan Praktikum Biofarmasetika (2015). Selain itu penulis juga aktif dalam berbagai kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan antara lain devisi keamanan pada acara Tiga Hari Temu Akrab Farmasi (2012 dan 2013), devisi keamanan pada kegiatan Temu Alumni Akbar Fakultas Farmasi (2012), peserta pada LKTMF ISMAFARSI (2012), devisi humas pada acara Aksi Hari Kesehatan dan Lingkungan Hidup di SD Pangudi Luhur Yogyakarta (2012), koordinator devisi kampanye pada panitia Komisi Pemilihan Umum Gubernur BEMF dan Ketua DPMF Farmasi (2014), dan lolos Program Kreativitas Mahasiswa yang dibiayai DIKTI (2013).

70

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Recommend Documents