Skripsi AAM AMELIA NIM : Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)

Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 Skripsi Diajukan untuk memenuhi syarat gelar sarjana farmasi (S.Far)

AAM AMELIA NIM : 108102000061

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 1433 H/ 2012

1

LEMBAR PERNYATAAN

DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI BENAR BENAR KARYA SENDIRI DAN BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU PADA LEMBAGA MANAPUN.

Jakarta, 25 November 2012

Aam Amelia

2

KATA PENGANTAR Puji syukur kepada Allah Azza wa Jalla, yang oleh karena pertolongan dan kasih sayang-Nya penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Makalah skripsi yang berjudul ―Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2” dibuat untuk memenuhi tugas mata kuliah Skripsi, salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Pada penulisan ini, penulis juga ingin mengucapkan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: (1) Ofa Suzanti Betha Msi, Apt dan Dr. Siswa Setyahadi, M.Sc selaku dosen pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan pikiran dalam menuntun penulis dalam penyusunan skripsi ini. (2) Zilhadia M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik selama pendidikan. (3) Drs. Umar Mansur M.Sc selaku kaprodi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. (4) Para dosen Farmasi UIN yang telah memberikan ilmu, pengalaman dan wawasannya. (5) Kak Ruby, Kak Wina, seluruh karyawan dan staf LAPTIAB BPPT PUSPIPTEK Serpong yang telah memberikan bantuan, ilmu, dan pengalaman selama penelitian kepada penulis. Juga teman satu leb Bioseparasi Oki dan Sarah. (6) Kementrian Agama dan CSS Mora yang telah memberikan dukungan moril dan materil selama pendidikan. Ucapan beribu terimakasih, semoga ilmu yang saya terima dapat bermanfaat. (7) Orangtua, Uu, Aa, Atatan, Aenyang, Aujang, Ababang, Dede, Abi, tetehteteh, dan keluarga besar yang selalu memberi dukungan, semangat dan doa . Love you all. (8) Rekan penelitian Siti Mardiyanti Said yang telah bersama dalam suka dan duka. Sahabat-sahabat Emak, Memyu, Zikri, Endah, yang telah memberikan

3

dukungan dan keceriaan sehingga saya bersemangat dan bisa menyelesaikan tugas akhir ini. (9) Teman-teman Matriks 2008 khususnya teman farmasi

Imam, Roni, Pei,

Doni, Labib, Jidin, Ukon, Fafa, Fani, Eva, dan Teguh. Asiknya rame rame. (10) Teman-teman seangkatan Farmasi 2008 yang telah menempuh pendidikan bersama selama empat tahun, Semoga semangat dan kesuksesan bersamasama dengan kita semua. (11) Semua pihak yang tak bisa disebutkan satu persatu yang telah membantu kelancaran pembuatan skripsi, Saya ucapkan terimakasih.

Saya menyadari bahwa dalam makalah skripsi ini masih terdapat banyak kekurangan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang membangun sehingga dapat menyempurnakan skripsi ini dan melaksanakan perbaikan di masa yang akan datang. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat bagi para pembaca dan bagi dunia pendidikan dan ilmu pengetahuan.

Ciputat, 10 Oktober 2012

Aam Amelia

4

DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL LEMBAR PERSETUJUAN LEMBAR PENGESAHAN LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................... i KATA PENGANTAR ........................................................................................................ ii DAFTAR ISI ........................................................................................................................ iv DAFTAR GAMBAR ........................................................................................................... vi DAFTAR TABEL ............................................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................................... ix ABSTRAK .......................................................................................................................... x ABSTRACT ........................................................................................................................ xi BAB I PENDAHULUAN .................................................................................................. 1 1.1 Latar Belakang .................................................................................................... 1 1.2 Pembatasan Masalah ........................................................................................... 3 1.3 Perumusan Masalah ........................................................................................... 3 1.4 Hipotesa .............................................................................................................. 4 1.5 Tujuan Penelitian ................................................................................................ 4 1.6 Manfaat Penelitian .............................................................................................. 4 BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................................... 5 2.1 Selulosa ............................................................................................................... 5 2.2 Enzim Selulase .................................................................................................... 7 2.3 Bacillus sp ........................................................................................................... 10 2.4 Fermentasi ........................................................................................................... 11 2.5 Glukosa ............................................................................................................... 13 2.6 Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas.................................................................... 15 2.6.1 Kromatografi Lapis Tipis ................................................................................. 15 BAB III KERANGKA KONSEP ....................................................................................... 16 BAB IV METODOLOGI PENELITIAN ......................................................................... 17 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................................. 17 4.2 Bahan .................................................................................................................. 17 4.3 Alat ...................................................................................................................... 17 4.4 Metoda ................................................................................................................ 18

5

4.4.1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 .............................. 18 4.4.2 Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas ............................................... 18 4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan Waktu Inkubasi ....................................................................................... 18 4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Konsentrasi Enzim .................................................................................................... 19 4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Konsentrasi Substrat ................................................................................................. 19 4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding......................................................................... 20 4.4.2.5 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi ............................................................... 20 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN .............................................................................. 21 BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan ......................................................................................................... 30 6.2 Saran ................................................................................................................... 30 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................................... 31 LAMPIRAN ......................................................................................................................... 37 GAMBAR ........................................................................................................................... 58

6

DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Struktur Selulosa ................................................................................................ 5 Gambar 2. Jalur Reaksi Selulosa Menjadi Glukosa .............................................................. 8 Gambar 3. Bacillus sp .......................................................................................................... 10 Gambar 4. Struktur Glukosa ................................................................................................. 13 Gambar 5. Reaksi antara Gula Reduksi dengan Reagen DNS .............................................. 14 Gambar 6. Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat terhadap persen sakarifikasi .................................................................................................. 22 Gambar 7. Kurva hubungan konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi ............................................................................................................................ 24 Gambar 8. Kurva hubungan antara konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi ............................................................................................................................ 24 Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT ................................................. 28 Gambar 10. Autoklaf ............................................................................................................. 59 Gambar 11. Refrigerated Sentrifuge ..................................................................................... 59 Gambar 12. Termomixer ....................................................................................................... 59 Gambar 13. pHmeter ............................................................................................................. 59 Gambar 14. Timbangan Analitik .......................................................................................... 59 Gambar 15. Spektrofotometer UV VIS ................................................................................. 59 Gambar 16. Substrat limbah pengolahan kertas awal ........................................................... 60 Gambar 17. Perendaman Substrat dengan NaOH ................................................................. 60 Gambar 18. Substrat limbah pengolahan kertas hasil pretreatment ...................................... 60 Gambar 19. Enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 ....................................................... 60

7

Gambar 20. Analit berwarna kecoklatan hasil uji aktivitas selulase dengan larutan DNS ........................................................................................................................... 61 Gambar 21. Analit berwarna biru hasil analisa kadar protein ............................................... 61 Gambar 22. Substrat limbah pengolahan kertas+enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 ...................................................................................................................... 61 Gambar 23. Pengembangan sampel dan pembanding pada kromatografi lapis tipis.............61

8

DAFTAR TABEL Tabel

1.

Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai

lignoselulosa.......................................................................................................................... 7 Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat .......................................................................................................................... 22 Tabel

3.

Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi

keseluruhan ........................................................................................................................... 26

9

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Cara pembuatan reagen .................................................................................... 40 Lampiran 2. Pembuatan medium .......................................................................................... 41 Lampiran 3. Pembuatan kurva standar glukosa dan kurva standar BSA .............................. 43 Lampiran 4. Kurva standar Glukosa ..................................................................................... 44 Lampiran 5. Kurva standar BSA ........................................................................................... 45 Lampiran 6. Metoda pengujian aktivitas enzim selulase dan kadar protein ......................... 46 Lampiran 7. Perhitungan uji aktivitas selulase ..................................................................... 48 Lampiran 8. Perhitungan kadar protein ................................................................................. 49 Lampiran 9. Aktivitas enzim selulase yang digunakan ......................................................... 50 Lampiran 10. Penentuan persen sakarifikasi limbah pengolahan kertas............................... 51 Lampiran 11. Metoda perlakuan awal substrat limbah pengolahan kertas ........................... 52 Lampiran 12. Hasil uji pendahuluan perlakuan awal substrat .............................................. 53 Lampiran 13. Perhitungan uji variasi konsentrasi substrat ................................................... 55 Lampiran 14. Perhitungan uji variasi konsentrasi enzim ...................................................... 57 Lampiran 15. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis tipis ........................................................................................................................................ 58 Lampiran 16. Data pembanding ............................................................................................ 59

10

ABSTRAK Judul : Pengaruh Variasi Konsentrasi Enzim dan Substrat Terhadap Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Menggunakan Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK

Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan di alam dan dapat dilakukan proses sakarifikasi dengan cara enzimatis. Penelitian ini bertujuan untuk melihat pengaruh konsentrasi enzim dan substrat terhadap sakarifikasi limbah pengolahan kertas menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2. Nilai aktivitas spesifik enzim selulase adalah 15,04 U/mg. Proses sakarifikasi substrat limbah pengolahan kertas dilakukan dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit serta dilakukan variasi konsentrasi substrat 25,50,100, 150 dan 200 mg. Hasil terbaik didapat dari konsentrasi enzim dengan aktivitas 12 unit dengan nilai persen (%) sakarifikasi sebanyak 1,80% dan substrat 100 mg dengan persen (%) sakarifikasi sebanyak 1,01%. Analisa produk akhir sakarifikasi diidentifikasi dengan kromatografi lapis tipis. Kromatogram dan nilai Rf menunjukkan produk akhir sakarifikasi adalah Maltosa.

Kata kunci: Sakarifikasi, Selulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, KLT

11

ABSTRACT Title : Effect of Concentration Enzymes and Substrates Variation for Paper Sludge Saccharification Using Cellulase Enzyme From Bacillus sp. BPPT CC RK2

Cellulose is the most abundant polymer in nature and can be converted into sugar molecules with enzymatic reaction. The aim of this study is to know about effect of variation concentration of enzymes and substrates on saccharification of paper sludge uses cellulase enzymes from Bacillus sp BPPT CC RK2. The result of spesific enzyme activity is 15,04 U/mg. Yhe process of paper sludge saccharification is done by variation of the concentration of the enzyme with activity unit 6,12,18 unit and variation of the concentration of substrate 25,50,100,150 and 200 mg. The best results were obtained from the concentration of the enzyme activity 12 unit with 1.80% saccharification and substrate as 100 mg with 1.01% saccharification. Analysis of the final product saccharification identified by thin layer chromatography. Rf value indicates the end product of sacharification is Maltose.

Keyword: Saccharification, Cellulase, Bacillus sp. BPPT CC RK2, TLC

12

BAB I. PENDAHULUAN 1.1

LATAR BELAKANG Produksi biomassa lignoselulosa dari tanaman di dunia mencapai jumlah

sekitar 200 x 109 ton per tahun. Sebanyak 8-20 x 109 ton dari biomassa tersebut berpotensi untuk diolah lebih lanjut (Lin dan Tanaka, 2006). Indonesia merupakan negara penghasil biomassa yang cukup melimpah, baik yang berasal dari bahan kayu, jerami, rumput-rumputan, limbah pertanian, hutan, limbah industri (kayu, kertas) dan bahan berserat lainnya, sehingga sangat memungkinkan untuk pemanfaatan biomassa lignoselulosa yang sampai saat ini belum dikembangkan secara optimal (Octavia et al, 2011). Limbah kertas dilaporkan memiliki kandungan selulosa sebanyak 6070%, hemiselulosa 10-20 %, dan lignin 5-10% (Sun dan Cheng 2002). Dalam penelitian ini material lignoselulosa yang digunakan adalah limbah kertas yang merupakan residu pengolahan pabrik kertas. Lignoselulosa adalah komponen organik di alam yang berlimpah dan terdiri dari tiga tipe polimer, yaitu selulosa, hemiselulosa dan lignin. Komponen ini merupakan sumber penting untuk menghasilkan produk bermanfaat seperti glukosa dari proses fermentasi, bahan kimia dan bahan bakar cair (Anindyawati, 2009). Selulosa merupakan polimer yang paling banyak ditemukan pada tumbuhan dan merupakan target utama biokonversi ( D.J Mukesh Kumar et al, 2012). Proses biokonversi polisakarida menjadi komponen gula dinamakan

13

Sakarifikasi (Karmakar dan Ray, 2011). Glukosa merupakan produk utama dari proses pemecahan selulosa (Kristensen, 2009). Pada penelitian ini yang menjadi fokus perhatian adalah sakarifikasi selulosa menjadi glukosa. Proses sakarifikasi dapat dilakukan dengan cara fisika, kimia dan biologi (Laser et al, 1996 dalam Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metoda fisika dilakukan dengan penggilingan dan radiasi untuk menurunkan ukuran partikel, luas permukaan dan derajat polimerasi. Metoda kimia melibatkan reagen asam, basa, amoniak, tekanan uap, dan hipoklorit untuk memisahkan lignin. Namun, kedua metoda diatas menghasilkan kualitas produk yang rendah karena terjadi degradasi molekul glukosa. Metoda biologi atau secara enzimatik memiliki keuntungan yaitu menghasilkan produk dengan kualitas yang baik karena reaksi spesifik dari enzim-substrat. Struktur kristal dan porositas selulosa pun tidak mengalami degradasi sehingga produk biokonversi yang dihasilkan berkualitas lebih baik (Thakur dan Nakagoshi, 2011). Metode yang digunakan untuk menghidrolisis selulosa adalah dengan menggunakan enzim, contohnya selulase(Galbe dan Zacchi, 2002). Enzim selulase dapat dihasilkan oleh jamur, bakteri dan actinomycetes. Bakteri Bacillus sp. diketahui merupakan salah satu mikroorganisme yang dapat menghasilkan enzim selulase. Meskipun produksi enzim selulase oleh bakteri ini tidak sebanyak produksi enzim selulase oleh jamur (con. Trichoderma reesei), namun produksi enzim selulase menggunakan bakteri mendatangkan beberapa keuntungan, antara lain yaitu bakteri memiliki laju pertumbuhan yang lebih tinggi dibandingkan jamur dan lebih mudah beradaptasi pada lingkungan yang ekstrim (Maki, 2009), bakteri lebih mudah direkayasa genetika, enzim selulase yang

14

dihasilkan merupakan katalis yang lebih efektif dan kurang terinhibisi oleh material yang telah terhidrolisis (Ariffin et al, 2006). Pada penelitian ini bakteri yang digunakan adalah Bacillus sp. BPPT CC RK2 yang merupakan koleksi BPPT. Enzim selulase yang dihasilkan oleh Bacillus sp. BPPT CC RK2 mencapai kondisi optimum pada pH 7,0 dan temperatur 37° C dengan menggunakan media produksi dedak padi 40 % dan air kelapa 20 % (Bakti, 2011; Marssada, 2011). Menurut Thakur dan Nakagoshi (2011), terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi hasil dan laju hidrolisis enzim yaitu konsentrasi substrat, aktivitas selulase, dan kondisi reaksi seperti pH dan temperatur. Pada penelitian ini akan dilakukan pengamatan terhadap kemampuan enzim selulase yang dihasilkan dari fermentasi Bacillus sp. BPPT CC RK2 dalam mengkonversi selulosa dari limbah pengolahan kertas menjadi glukosa. Selanjutnya juga akan diamati pengaruh jumlah enzim dan substrat terhadap konsentrasi glukosa yang dihasilkan.

1.2

PEMBATASAN MASALAH Penelitian ini dibatasi pada analisa produksi glukosa dari limbah

pengolahan kertas secara enzimatis menggunakan enzim selulase yang dihasilkan Bacillus sp. BPPT CC RK2 dengan variasi konsentrasi enzim dan substrat.

1.3

PERUMUSAN MASALAH

1. Apakah limbah pengolahan kertas dapat dikonversi menjadi glukosa melalui proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang dihasilkan bakteri Bacillus sp. BPPT CC ?

15

2. Bagaimana pengaruh variasi konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap proses sakarifikasi?

1.4

HIPOTESA Limbah pengolahan kertas merupakan limbah akhir pabrik kertas yang

mengandung selulosa. Enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 dapat menghidrolisis selulosa dan menghasilkan glukosa. Konsentrasi glukosa yang dihasilkan akan mencapai optimum pada jumlah enzim dan substrat tertentu.

1.5

TUJUAN PENELITIAN.

1. Mengetahui potensi limbah pengolahan kertas untuk menghasilkan molekul glukosa melalui proses sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 2. Mengetahui pengaruh konsentrasi enzim selulase dan substrat terhadap proses sakarifikasi.

1.6

MANFAAT PENELITIAN

1. Memanfaatkan limbah pengolahan kertas untuk dapat menghasilkan molekul glukosa. 2. Menjaga kelestarian lingkungan dengan memanfaatkan limbah pengolahan kertas.

16

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1

Selulosa Selulosa merupakan molekul sederhana dengan unit selubiosa yang

berulang yang tersusun atas unit-unit glukosa-1,4 anhidrat yang dihubungkan oleh ikatan β 1,4-glikosidik. Ikatan rantai saling berinteraksi melalui ikatan hidrogen intramolekul dan intermolekul; dan ikatan van der walls (O'Sullivan, 1997 dikutip dari Saxena dan Brown, 2007).

Gambar 1. Struktur Selulosa (P. Singh nee’ Nigam et al, 2009) Selulosa merupakan polimorfisme, dan perbedaan bentuk biasanya terdefinisi oleh bentuk kristal dan amorf. Bentuk kristal merupakan bentuk selulosa terbanyak, sedangkan bentuk amorf memiliki persentase yang sedikit (Kondo, 2004 dikutip dari Saxena dan Brown, 2007). Selulosa berasal dari biopolimer yang disintesis oleh tumbuhan, alga, beberapa jenis bakteri termasuk golongan sianobakteri, dan jamur ( Brown, 1996). Selulosa merupakan bagian dari lignoselulosa. Lignoselulosa terdiri dari tiga komponen utama yaitu: Selulosa, Hemiselulosa dan Lignin. Ketiganya membentuk suatu ikatan kimia kompleks yang menjadi bahan dasar dinding sel tumbuhan.

Selulosa

lignoselulosa.

berjumlah

sekitar

30-60%

dari

total

keseluruhan

17

Hemiselulosa merupakan istilah umum bagi polisakarida yang larut dalam alkali.

Hemiselulosa

berjumlah

sekitar

20-40%

dari

total

keseluruhan

lignoselulosa. Hemiselulosa sangat dekat asosiasinya dengan selulosa dalam dinding sel tanaman (Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010). Lima gula netral, yaitu glukosa, mannosa, dan galaktosa (heksosan) serta xilosa dan arabinosa (pentosan) merupakan konstituen utama hemiselulosa (Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010). Berbeda dari selulosa yang merupakan homopolisakarida dengan monomer glukosa dan derajat polimerisasi yang tinggi (10.000– 14.000 unit), rantai utama hemiselulosa dapat terdiri atas hanya satu jenis monomer (homopolimer), seperti xilan, atau terdiri atas dua jenis atau lebih monomer (heteropolimer), seperti glukomannan. Rantai molekul hemiselulosa pun lebih pendek daripada selulosa. Lignin mempunyai struktur molekul yang sangat berbeda dengan polisakarida karena terdiri atas sistem aromatik yang tersusun atas unit-unit fenil propana. Lignin berjumlah sekitar 15-25% dari total keseluruhan lignoselulosa (Fengel dan Wegener, 1984 dalam Hermiati et al, 2010). Peran ketiga komponen kimia ini dalam dinding sel dapat dianalogkan seperti bahan konstruksi yang terbuat dari reinforced concrete, di mana selulosa, hemiselulosa,dan lignin berperan sebagai rangka besi, semen, dan bahan penguat yang memperbaiki ikatan di antara mereka.

18

Tabel 1. Kandungan selulosa, hemiselulosa, lignin dalam berbagai lignoselulosa ( Kumar et al, 2009) Material Lignoselulosa Batang Kayu ( keras) Batang Kayu ( lunak) Kulit Kacang Tongkol Jagung Rumput Kertas Jerami Gandum Sampah (sortiran) Daun Kapas Koran Limbah Kertas (Residu Pabrik) Limbah air (padatan) Pupuk Hasil Ternak Kotoran Babi

Selulosa (%) 40 – 55 45 – 50 25 – 30 45 25 – 40 85 – 99 30 60 15 – 20 80 – 95 40 – 55 60 – 70 8 – 15 1,6 – 4,7 6,0

Hemiselulosa (%) 24 – 40 25 – 35 25 – 30 35 35 – 50 0 50 20 80 – 85 5 – 20 25 – 40 10 – 20 Tdk diketahui 1,4 – 3,3 28

Lignin (%) 18 – 25 25 – 35 30 – 40 15 10 – 30 0 – 15 15 20 0 0 18 – 30 5 – 10 Tdk diketahui 2,7 -5,7 Tdk diketahui

Kandungan utama limbah kertas adalah selulosa yang merupakan homopolisakarida terdiri dari β –D- glukosa. Limbah kertas dapat digunakan untuk produksi glukosa setelah hidrolisis selulosa dengan enzim selulase (Vynios et al, 2009). Adapun karakteristik limbah pengolahan kertas yang dipakai dalam penelitian ini adalah limbah akhir sisa pembuangan pabrik kertas yang didapatkan dari sebuah pabrik pembuatan kertas di wilayah Tangerang.

2.2

Enzim Selulase Enzim merupakan suatu protein yang bersifat sebagai katalis, yang

meningkatkan kecepatan reaksi perubahan substrat menjadi produk sementara enzim itu sendiri tidak mengalami perubahan (Adhiyanto, 2006). Enzim selulase merupakan enzim yang mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan menghasilkan glukosa, selobiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al, 2005).

19

Untuk dapat menghidrolisis selulosa menjadi glukosa , enzim selulase dibagi menjadi tiga tipe, yaitu exoglucanase, endoglucanase, dan β-glucosidase. Endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) bersifat lebih aktif memecah daerah dengan sifat kekristalan yang rendah dan menciptakan ujung rantai yang bebas. Exoglucanase (1,4-β-D-glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91) biasanya aktif pada bentuk kristal selulosa dan memecah bagian selulosa yang tidak tereduksi menjadi unit selobiosa. β-Glucosidase (EC 3.2.1.21) memecah selobiosa menjadi glukosa (Mussatto dan Teixeira, 2010).

Gambar 2. Jalur reaksi selulosa menjadi glukosa (Demers, 2009). Produksi enzim selulase dilaporkan berasal dari berbagai jenis bakteri dan jamur. Enzim selulase yang dihasilkan oleh jamur seperti Aspergillus dan Trichoderma spp lebih banyak digunakan karena menghasilkan produk enzim selulase yang lebih tinggi dibandingkan jenis bakteri dan yeast (Mrudula dan Murugamal, 2011). Pada saat ini, enzim selulase yang berasal dari bakteri mulai dikembangkan karena laju pertumbuhan bakteri yang lebih cepat dibandingkan jamur, bakteri lebih mudah direkayasa genetika , kurang terinhibisi oleh material

20

yang telah terhidrolisis dan dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim (Ariffin et al, 2006; Maki et al, 2009 ). Enzim selulase memiliki aplikasi yang luas di bidang pangan, detergen, tekstil, bahan bakar, kimia, dan pengolahan limbah. Terlepas dari aplikasi umum selulase tersebut, kini mulai dikembangkan aplikasi enzim selulase dalam pengembangan protoplast, antibakteri chitooligosakarida, immunomodulator, dan agen antitumor (Begum et al, 2012). Penentuan konsentrasi enzim adalah dengan cara menentukan aktivitas katalitiknya. Pada tahun 1961, komisi enzim menetapkan Unit Enzim (U), yang dikenal dengan International Unit (IU), sebagai jumlah enzim yang digunakan untuk mengubah 1mol substrat permenit dibawah kondisi ideal (Adhiyanto et al, 2006). Pengujian aktivitas selulase dilakukan dengan dua pendekatan, yaitu mengukur selulase individu (endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukosidase) dan aktivitas total selulase (Zhang et al, 2006). Aktivitas endoglukanase atau CMCase dapat diukur berdasarkan reduksi viskositas substrat dan peningkatan ujung akhir rantai yang direduksi berdasarkan pengujian gula reduksi. Aktivitas eksoglukanase diukur menggunakan substrat Avicel, dan aktivitas β-glukosidase diukur menggunakan selobiosa yang tidak dihidrolisis oleh endoglukanase dan eksoglukanase dan menggunakan siklodekstrin rantai panjang yang dihidrolisis oleh endoglukanase dan eksoglukanase (Ghose, 1987). Aktivitas total selulase terdiri dari endoglukanase, eksoglukanase, dan βglukosidase yang keseluruhannya bekerja secara sinergis menghidrolisis kristal selulosa. Pada umumnya, pengujian aktivitas total selulase dilakukan dengan

21

menggunakan filter paper assay (FPA) menggunakan kertas saring whatman no.1 sebagai substrat sebagaimana dipublikasikan oleh IUPAC (The International Union of Pure and Applied Chemistry) ( Ghose, 1987).

2.3

Bacillus sp

Gambar 3. Bakteri Bacillus sp (Sumber : www. Invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm) Klasifikasi bakteri Bacillus sp adalah sebagai berikut: (cohn, dikutip dari wikipedia.com) Kingdom

: Bacteria

Phylum

: Firmicutes

Kelas

: Bacilli

Ordo

: Bacillales

Famili

: Bacilaceae

Genus

: Bacillus

Species

: Bacillus sp.

Golongan Bacillus merupakan bakteri Gram positif, berbentuk batang, bersifat aerob dan merupakan bakteri endospora. Pada umumnya, golongan Bacillus bersifat mesofil yang dapat hidup pada temperatur 30-45˚ C (Oppenheimer dan Zobell, 1952 dalam Kalimutho et al, 2011). Namun dilaporkan beberapa spesies memiliki kemampuan bertahan di lingkungan yang ekstrim, seperti padang pasir, kedalaman bawah laut dan mata air panas Arctic. Bakteri ini

22

termasuk golongan thermofilik, asidofilik, alkalifilik, halotoleran, dan halofilik yang memiliki kemampuan tumbuh pada temperatur, pH dan konsentrasi garam yang ekstrim (Turnbull,1996). Bacillus banyak ditemukan di alam seperti pada tanah, air, debu, beberapa spesies bahkan ditemukan

sebagai flora normal pada usus manusia. Ketika

ditumbuhkan pada media agar darah, Bacillus membentuk pola yang besar, tersebar, berwarna putih keabu-abuan dengan tepi yang tidak beraturan. Karakteristik unik dari bakteri ini adalah kemampuannya untuk membentuk endospora pada kondisi lingkungan yang ekstrim ( El safey, 2006). Bacillus banyak digunakan dalam mikrobiologi industri karena laju pertumbuhannya yang cepat pada proses fermentasi, kemampuan mengsekresikan protein ke medium ekstraselular dan status keamanannya yang GRAS ( generally regarded as safe), seperti B. subtilis dan B. licheniformis (Schallmey et al, 2004). Pada umumnya, Bacillus alkalifilik mampu memproduksi berbagai enzim yaitu protease, amilase, xilanase, pullulase dan selulase (Schallmey et al, 2004). Beberapa Bacillus yang telah diteliti menghasilkan enzim selulase adalah Bacillus subtilis (Yin et al, 2010), Bacillus pumilus (Ariffin et al, 2006), Bacillus licheniformis (Aygan et al, 2011), Bacillus sp (Aygan dan Arikan, 2008). Pada penelitian ini, diamati kemampuan Bacillus sp BPPT CC RK 2 dalam menghasilkan enzim selulase untuk selanjutnya diamati kemampuan sakarifikasi limbah kertas.

2.4

Fermentasi Istilah fermentasi berasal dari bahasa latin yaitu fervere yang berarti

mendidih. Istilah ini pertama kali digunakan untuk menerangkan terjadinya

23

penggelembungan atau pendidihan pada ekstrak buah karena adanya gas CO2 saat ditumbuhi mikroba atau yeast. Dalam mikrobiologi, fermentasi mengarah pada segala

proses

yang

melibatkan

produksi

biomassa/bioproduk

dengan

menggunakan mikroba (Tewari, 2007). Dalam mikrobiologi industri, fermentasi dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim beberapa bakteri, khamir, dan kapang. Beberapa contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon dioksida, dan oksidasi senyawa nitrogen organik (Hidayat dan Suhartini, 2010). Fermentasi dalam arti luas adalah proses perubahan kimia dari senyawa-senyawa organik (karbohidrat, protein, lemak dan bahan organik lain) melalui kerja enzim yang dihasilkan mikroba (Gandjar, 1977 dikutip Abun 2006). Mikroorganisme yang umum digunakan dalam fermentasi adalah bakteri, jamur dan khamir (Yeast). Kelompok bakteri yaitu Acetobacter, Streptococcus, Lactococcus,Leuconostoc,

Pediococcus,

Lactobacillus,

Propionibacterium,

Brevibacterium, Bacillus, Micrococcus, dan Staphylococcus. Kelompok yeast yaitu Saccharomyces, Candida, Torulopsis, dan Hansenula. Kelompok jamur yaitu Aspergillus, Penicillum, Rhizopus, Mucor, Monascus, dan Actinomucor (Chojnacka, 2004). Menurut jenis mediumnya, proses fermentasi dibagi menjadi dua yaitu fermentasi substrat padat dan fermentasi substrat cair. Pada fermentasi substrat padat, mikrooorganisme tumbuh pada media substrat yang sedikit atau sama sekali bebas kandungan air , walaupun kapiler air tetap masih ada. Keuntungan fermentasi substrat padat antara lain prosesnya sangat sederhana, tidak diperlukan

24

alat yang rumit, berkurangnya persoalan kontaminasi oleh mikroorganisme lain (Chisti, 1999). Fermentasi substrat cair adalah proses fermentasi yang substratnya larut atau tersuspensi dalam fase cair. Keuntungannya antara lain jumlah inokulum yang digunakan lebih sedikit, penanganan suhu dan kelembaban selama fermentasi lebih mudah untuk dikontrol (Chisti, 1999). Proses fermentasi

dipengaruhi beberapa faktor, yaitu temperatur, pH,

lingkungan dan komposisi medium,kandungan O2 dan CO2 , dan kondisi operasional fermentor (Chisti, 1999).

2.5

Glukosa

Gambar 4. Struktur Glukosa ( Sumber: Handbook of Pharmaceutical Exipients) Glukosa atau dikenal dengan dekstrosa (karena mempunyai sifat dapat memutar

cahaya

terpolarisasi

kearah

kanan),

merupakan

molekul

pentahidroksihexana dan termasuk golongan aldoheksosa (Vollhard dan Schore, 2009). Pemerian glukosa yaitu tak berbau, rasanya manis, berbentuk kristal atau serbuk putih halus (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th). Glukosa memiliki banyak manfaat dalam bidang farmasi, pangan, industri permen dan bahan kimia. Dalam bidang farmasi, glukosa digunakan sebagai pemanis, pengisi tablet dan kapsul, agen tonisitas, dan nutrisi dalam sediaan parenteral (Handbook of Pharmaceutical Exipients ed 5th).

25

Analisa glukosa dari enzim selulase dapat dilakukan dengan menghitung kadar gula reduksi menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan Nelson Somogyi dikarenakan kemampuan metoda diatas yang tinggi dalam mendeteksi kadar gula yang tidak memerlukan pengenceran sampel dan interfensi yang rendah dari selulase karena tidak memerlukan adanya pemindahan protein (Zhang et al, 2006). Metoda DNS sepuluh kali lebih sensitif dibanding metode Nelson Somogyi (Gusakov et al, 2011). Metoda DNS digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri (Dashtban et al, 2010). Analisis ini dilakukan dengan menggunakan asam 3,5-dinitrosalisilat atau 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) yang merupakan senyawa aromatik yang bereaksi dengan cara mengurangi kadar glukosa membentuk asam 3-amino-5-nitrosalisilat, yang menyerap gelombang cahaya 540 nm (Miller, 1959)

(Toledo et al, 2012) Gambar 5. Reaksi antara gula reduksi dengan reagen DNS

26

2.6

Analisa Sakarifikasi Limbah Kertas

2.6.1

Kromatografi Lapis Tipis ( KLT) Kromatografi lapis tipis adalah metoda pemisahan fisikokimia, dimana

lapisan pemisah yaitu fase diam ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisahkan berupa larutan ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah pelat atau lapisan ditaruh didalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan. Fase diam yang biasa digunakan yaitu silika gel, alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan turunannya, poliamida dan lain-lain. Fase gerak adalah medium pembawa dan terdiri dari satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak dalam fasa diam dengan adanya gaya kapiler. Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf, yaitu : Rf =

Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awal

Deteksi senyawa yang dipisahkan dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu deteksi dengan lampu UV; deteksi dengan pelarut semprot; dan deteksi biologi (Stahl, 1985).

27

BAB III KERANGKA KONSEP

Bacillus sp BPPT CC RK 2

Pembuatan media

Pembuatan stok kultur

Variasi Perlakuan Awal Limbah Pengolahan Kertas Pembuatan Starter Bakteri Pretreatment Limbah Pengolahan Kertas

Untreatment Limbah Pengolahan Kertas Produksi enzim selulase

Analisa kadar enzim selulase

Analisa kadar protein

Sakarifikasi

Sakarifikasi Enzim selulase + Limbah Pengolahan Kertas Variasi Konsentrasi Enzim

Pembanding

Variasi Konsentrasi Substrat

Enzim Komersil Primafast 200

Analisa Produk Sakarifikasi

Analisa kandungan glukosa secara kualitatif dengan Kromatografi Lapis Tipis ( KLT )

Analisa Persen (%) Sakarifikasi dengan Spektrofotometer UV Visible

Limbah Pengolahan Kertas+ Buffer

28

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN 4.1

TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Teknologi Bioindustri,

LAPTIAB – BPPT PUSPIPTEK, Serpong, Tangerang, Banten dengan waktu penelitian selama lima bulan dari Mei- September 2012. 4.2

BAHAN Limbah pengolahan kertas, Bacillus sp. BPPT CC RK2. Bahan kimia yang

digunakan antara lain : medium Luria Bertani (LB), dedak padi, air kelapa, ekstrak khamir (Scharlau), pepton (Pronadisa), NaCl (Merck), pereaksi Dinitrosalisilat acid (DNS), Bouvine Serum Albumin (Sigma-Aldrich), pereaksi Bradford, agar Bacto, CMC (Pronadisa), Na2HPO4.2H2O (Merck), NaHPO4 (Merck), NaOH (Merck), H2SO4 , metanol, butanol, asam asetat, glukosa (Sigma), maltosa (Sigma), sukrosa (Sigma), galaktosa (Sigma), arabinosa (Sigma), ddH2O (Milipore), akuades, enzim selulase komersil Primafast 200 (Genencor).

4.3

ALAT Spektrofotometer UV Vis (Genesis), Lempeng KLT, Shaker Inkubator

(Kuhner), Shaker Inkubator GLF,

Static Incubator (Memmert), Laminar Air

Flow (Babcock BF), Refrigerated Centrifuge (Gyrozen), Sentrifuge (Sigma), pHmeter (Inolab), Waterbath, Termomixer (Eppendorf), Timbangan analitik (Radwag), Autoklaf (Hitachi) , Hot plate magnetic stirrer (Heindolph) , Oven,

29

Pipet mikro (Thermo), Mikrotube (Eppendorf), cawan petri, dan alat-alat gelas (Pyrex).

4.4

METODA

4.4 .1 Produksi Enzim Selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 ke dalam media LB steril (10% media produksi), kemudian diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 6 jam. Produksi enzim dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC , agitasi 150 rpm selama 24 jam. Setelah 24 jam, enzim dipanen dengan cara sentrifugasi dengan agitasi 6000 rpm menggunakan Refrigerated Centrifuge (Zyrogen) selama 15 menit pada suhu 4oC, kemudian supernatannya diambil sebagai fraksi enzim kasar, kemudian enzim kasar tersebut dianalisis aktivitas enzim dan kadar protein. 4.4.2. Proses Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas 4.4.2.1 Variasi Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan Waktu Inkubasi a.

Pretreatment substrat Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml

NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan semalaman dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi

30

enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan 120 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011). b.

Perlakuan substrat tanpa pretreatment Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12

jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 24,48,72,96, dan 120 jam pada suhu 50˚ C. Dihitung kadar gula reduksi dengan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011). 4.4.2.2 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Konsentrasi Enzim Sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 5,5 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 Unit kemudian diinkubasi selama 96 jam pada suhu 37˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011). 4.4.2.3 Uji Sakarifikasi Limbah pengolahan Kertas dengan Variasi Substrat Seperti prosedur 4.4.2.1 diatas dengan variasi substrat sebanyak 25 ,50, 100, 150, 200 mg ditambah enzim selulase kasar sebanyak 12 unit.

31

4.4.2.4 Uji Sakarifikasi Pembanding a. Sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan Enzim Selulase Komersial Enzim komersil yang digunakan yaitu enzim Primafast 200, dengan kondisi optimum sakarifikasi pada pH 5,5 dengan temperatur inkubasi 60° C. Sakarifikasi dilakukan selama 96 jam, dan setiap 24 jam supernatan diambil untuk dihitung kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi. b. Blangko Blangko yaitu sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment 24 jam ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi pada suhu 37°C. Kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi diukur setiap 24 jam. Sebagai kontrol yaitu larutan buffer sitrat pH 5,5 diinkubasi pada suhu 37°C. 4.4.2.4 Analisa Produk Akhir Sakarifikasi a) Analisa Produk Dengan Menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Analisa glukosa dilakukan secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis dengan larutan pengembang butanol: asam asetat:air ( 3:3:1). Sampel ditotolkan dalam pelat silika gel, dan dibiarkan hingga pelarut bergerak menuju keatas dari pelat. Visualisasi kromatogram dilakukan dengan penampak bercak H2SO4 10 % dalam metanol kemudian dikeringkan dalam oven suhu 110 ˚C selama 5 menit (Karmakar dan Ray, 2011). Sebagai pembanding digunakan berbagai standar gula, yaitu glukosa, xylosa, arabinosa, galaktosa, sukrosa dan maltosa dengan konsentrasi 5 mg/ml.

32

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh variasi konsentrasi enzim dan substrat limbah pengolahan kertas untuk mencapai hasil sakarifikasi optimum dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp. BPPT CC RK2. Media produksi enzim yang digunakan adalah media Luria Bertani ditambah dengan dedak beras 40 % sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber nitrogen. Enzim selulase yang dihasilkan memiliki aktivitas spesifik 15,04 unit/mg dengan data terlampir. Konsentrasi enzim dan substrat berpengaruh terhadap produk yang dihasilkan dari proses sakarifikasi. Analisa produk ditinjau dari besarnya persen (%) sakarifikasi dan jenis gula yang dihasilkan. Untuk mengetahui nilai persen sakarifikasi, terlebih dahulu harus diketahui kadar gula reduksi sampel. Pengukuran kadar gula reduksi dilakukan dengan metoda DNS (Miller, 1959). 3,5- asam dinitrosalisilat (DNS) merupakan senyawa aromatik yang bereaksi dengan gula reduksi sampel yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas membentuk kompleks warna 3-amino-5 dinitro asam salisilat yang dapat dideteksi dengan spektrometer UV vis pada panjang gelombang 540 nm (Toledo et al, 2012). Pada uji variasi perlakuan awal substrat dilakukan perbandingan antara substrat yang diberi perlakuan (pretreatment) dan substrat tanpa perlakuan (untreatment). Proses pretreatment dilakukan untuk mengkondisikan bahan-bahan lignoselulosa baik dari segi struktur dan ukuran dengan memecah dan menghilangkan kandungan lignin dan hemisellulosa, merusak struktur kristal dari

33

selulosa serta meningkatkan porositas bahan (Sun dan Cheng, 2002). Rusaknya struktur kristal selulosa akan mempermudah terurainya selulosa menjadi glukosa. Selain itu, hemiselulosa akan turut terurai menjadi senyawa gula sederhana: glukosa, galaktosa, manosa, heksosa, pentosa, xilosa dan arabinosa (Mosier et al, 2005). Proses pretreatment dilakukan dengan cara basa menggunakan NaOH. Tabel 2. Persen (%) sakarifikasi berbagai waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat

WaktuInkubasi

24 jam

48 jam

72 jam

Sample

96 jam

120 jam

% Sakarifikasi

Untreatment Pretreatment 6 jam Pretreatment 12 jam Pretreatment 24 jam Pretreatment 36 jam

0 0,358 0,6265 1,1485 1,0292

0,8154 0,4325 0,7458 1,2678 1,1783

0,6762 0,5817 0,8353 1,417 1,2976

0,2138 1,1783 1,1932 1,76 1,6258

0 1,1783 0,9546 1,3722 1,3126

% Sakarifikasi

Persen Sakarifikasi Pada Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas dan Waktu Inkubasi 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Untreatment Pre treatment 6 jam Pre treatment 12 jam Pre treatment 24 jam Pre treatment 36 jam 24

48

72

96

120

Waktu Inkubasi (jam)

Gambar 6 . Kurva hubungan waktu inkubasi dan perlakuan awal substrat terhadap persen sakarifikasi

Dari hasil dapat terihat nilai persen (%) sakarifikasi lebih tinggi pada substrat dengan pretreatment dibandingkan substrat tanpa proses pretreatment.

34

Hal ini dikarenakan penggunaan reagen basa seperti NaOH dapat menyebabkan pemutusan ikatan ester dan glikosidik dan pemecahan lignin dan meningkatkan daya tembus enzim masuk ke selulosa dan hemiselulosa (Brodeur et al, 2011). Sehingga mempermudah reaksi antara enzim dan substrat yang mengakibatkan persen sakarifikasi yang dihasilkan lebih besar. Persentase sakarifikasi terbesar didapatkan pada sampel yang dilakukan pretreatment selama 24 jam yaitu sebanyak 1,79 % dengan waktu inkubasi 96 jam. Dari kurva diatas terlihat penambahan waktu inkubasi mengakibatkan penurunan nilai persen sakarifikasi, hal ini disebabkan karena kemungkinan gula yang dihasilkan bisa berubah menjadi produk lain dikarenakan enzim selulase yang digunakan dalam proses sakarifikasi belum murni, sehingga dapat terjadi reaksi lain yang tidak diketahui. Salah satu produk lanjutan yang bisa terbentuk adalah etanol (Prasetyo et al, 2010). Pada tahap penelitian dilakukan proses sakarifikasi dengan variasi konsentrasi substrat sebesar 25, 50, 100, 150, dan 200 mg dan variasi konsentrasi enzim dengan volume 2,4, dan 6 ml dengan inkubasi pada kondisi optimum yang telah didapat dari tahapan uji pendahuluan yaitu menggunakan substrat hasil pretreatment 24 jam, waktu inkubasi 96 jam dan suhu 37˚ C, pH 5,5. Pada uji pengaruh variasi konsentrasi substrat didapatkan hasil persen sakarifikasi tertinggi sebesar 1,01 %. Dari hasil dapat terlihat bahwa persen sakarifikasi meningkat mulai dari konsentrasi substrat terendah 25 mg dan mencapai nilai tertinggi pada konsentrasi 100 mg. Setelah titik optimum, nilai persen sakarifikasi mengalami penurunan. Hal ini karena jika konsentrasi substrat divariasikan, reaksi pada awal meningkat hingga mencapai maksimum dan

35

akhirnya mengalami penurunan (Haldane, 1930). Dengan semakin bertambahnya konsentrasi substrat dapat terlihat penurunan pada grafik sakarifikasi, hal ini karena jumlah enzim yang semakin terbatas (Ghose dan Ray, 2010).

Hubungan konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi

Sakarifikasi (%)

1,2000 1,0143

1,0000 0,8000 0,6000

0,5701

0,4000 0,2000

0,2660

0,2486

0,1392

0,0000 25

50

75

100

125

150

175

200

Substrat (mg)

Gambar 7. Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi Pada uji pengaruh variasi konsentrasi enzim, didapatkan hasil persen sakarifikasi tertinggi sebesar 1,80 % pada aktivitas enzim12 Unit.

Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi

sakarifikasi (%)

2,0000

1,8097

1,5000

1,5104

1,0000 0,7637 0,5000 0,0000 6

12

18

enzim (U)

Gambar 8. Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi

36

Enzim merupakan katalisator yang dapat mempercepat laju reaksi tanpa ikut serta dalam reaksi tersebut. Laju reaksi enzim dipengaruh berbagai faktor seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, temperatur, dan inhibitor. Konsentrasi substrat mempengaruhi laju reaksi, karena semakin banyak substrat yang ada maka semakin banyak pula ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat (Chen dan Ramos, 2010). Produk yang dihasilkan dari reaksi antara substrat dan enzim dipengaruhi oleh kondisi dari konsentrasi enzim maupun substrat. Pada keadaan konsentrasi enzim meningkat sedangkan konsentrasi substrat tetap, konsentrasi atau jumlah molekul enzim lebih rendah dibandingkan jumlah molekul substrat yang akan dikatalisis, maka produk yang dihasilkan akan sebanding dengan jumlah substrat yang diubah oleh enzim menjadi produk. Bila jumlah enzim ditingkatkan makin banyak substrat yang ada akan diubah menjadi produk hingga suatu ketika jumlah enzim berlebih namun substrat habis. Akibatnya penambahan jumlah enzim tidak akan mengubah grafik kecepatan reaksi vs konsentrasi enzim (Adhiyanto et al, 2006). Hubungan antara konsentrasi enzim dan produk yang dihasilkan dapat menghasilkan kurva yang tidak linear, hal ini dikarenakan bisa jadi enzim tidak dalam keadaan murni sehingga masih terdapat senyawa-senyawa penghambat reaksi dalam jumlah yang sangat kecil (Sadikin, 2002). Proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas juga menggunakan enzim komersial Primafast 200 dan blangko ( substrat limbah pengolahan kertas tanpa penambahan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2).

37

Enzim komersil Primafast 200 memiliki kondisi optimum pada pH 4,5 hingga 5,5, dan temperatur 55 hingga 60° C. Proses sakarifikasi mengikuti kondisi optimum dari enzim tersebut, yaitu pH 5,5 dan suhu 60° C. Substrat yang digunakan adalah sebanyak 100 mg limbah hasil pretreatment dengan NaOH selama 24 jam, dan konsentrasi enzim yang digunakan sebanyak 15,04 Unit/mg. Pada proses sakarifikasi blangko, sebanyak 100 mg substrat hasil pretreatment dengan NaOH selama 24 jam ditambah buffer sitrat pH 5,5 kemudian diinkubasi pada suhu 37° C. Dari hasil terlihat bahwa kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi tertinggi didapatkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas menggunakan enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2 . Hal ini menunjukan bahwa nilai persen sakarifikasi dengan menggunakan enzim selulase yang diproduksi dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 jauh lebih tinggi dibandingkan enzim komersil dan blangko. Kadar Gula Reduksi (mg/ml)

Sakarifikasi (%)

0,4022

1,80

Enzim Komersil Primafast 200

0,0033

0,0033

Blangko

0

0

Enzim selulase Bacillus sp BPPT CC RK2

Tabel 3. Perbandingan kadar gula reduksi dan persen sakarifikasi keseluruhan

Nilai persen sakarifikasi nol pada blangko menunjukkan bahwa tanpa ada bantuan hidrolisis dari enzim selulase maka proses sakarifikasi tidak terjadi.

38

Setelah mengetahui nilai persen sakarifikasi, selanjutnya dilakukan identifikasi jenis gula menggunakan kromatografi lapis tipis dengan standar gula pembanding menggunakan Glukosa, Xylosa, Arabinosa, Galaktosa, Maltosa, dan Sukrosa dengan konsentrasi 5 mg/ml. Karena jenis gula dari proses sakarifikasi awalnya tidak diketahui, maka ditotolkan berbagai standar gula pembanding untuk mengidentifikasi jenis gula yang dihasilkan dari proses sakarifikasi. Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang tidak berwarna. Pada penelitian ini, untuk menampakkan bercak maka lempeng KLT disemprot dengan reagen campuran asam sulfat dan metanol lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang nampak sebagai bercak hitam atau kecoklatan (Gandjar dan Rohman, 2007). KLT dapat digunakan untuk uji identifikasi senyawa baku. Parameter pada KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah Rf. Dua senyawa dikatakan identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Penotolan nomor satu sampai enam pada lempeng kromatografi lapis tipis menunjukkan jenis gula standar sebagai baku pembanding. Penotolan nomor tujuh menunjukkan sampel produk sakarifikasi limbah pengolahan kertas menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2. Penotolan nomor delapan menunjukkan blangko, yaitu substrat limbah pengolahan kertas ditambah buffer sitrat pH 5,5 tanpa penambahan enzim selulase. Dari perbandingan nilai Rf antara sampel dan baku pembanding gula yang ditotolkan terlihat bahwa nilai Rf sampel adalah 0,32 cm, mendekati nilai Rf

39

maltosa yaitu 0,33 cm, sehingga berdasarkan analisa kromatografi lapis tipis, produk akhir sakarifikasi diperkirakan mengandung Maltosa.

Rf Xilosa 3,5/8 = 0,56 cm

Jarak rambat pelarut 8 cm

Rf Arabinosa 3,9/8 = 0,48 cm

Rf Glukosa 3,5/8 = 0,43 cm

Rf Sukrosa 3,1/8 = 0,38 cm

Rf Sampel 2,6/8 = 0,32 cm

Rf Galaktosa 3,5/8 = 0,43cm

Rf Maltosa 2,7/8 = 0,33 cm

1

2

3

4 5 6

7 8

( Ket: 1= Sukrosa; 2= Arabinosa; 3= Galaktosa; 4= Xilosa; 5= Maltosa; 6=Glukosa; 7= Sampel; 8= Blangko {limbah pengolahan kertas + buffer, tanpa enzim selulase} ) Gambar 9. Analisa produk akhir sakarifikasi dengan KLT Namun, berdasarkan literatur, seharusnya jenis gula terbanyak yang dihasilkan dari proses sakarifikasi selulosa adalah glukosa (Sukumaran et al, 2005). Maltosa (C12H22O11) merupakan gabungan 2 unit glukosa yang terhubung dengan ikatan 1,4 glikosidik. Hal ini menunjukkan bahwa proses sakarifikasi yang terjadi belum sempurna, sehingga masih diperlukan hidrolisis kembali untuk memecah maltosa menjadi glukosa.Ini dapat disebabkan karena aktivitas enzim yang dihasilkan sangatlah kecil, sehingga hidrolisis selulosa menjadi glukosa belum sempurna.

40

Pada penotolan blangko dapat terlihat tidak ditemukan bercak, hal ini menunjukkan bahwa pada limbah pengolahan kertas tanpa penambahan enzim selulase tidak terjadi proses sakarifikasi menjadi molekul gula dikarenakan tidak adanya interaksi antara enzim dan substrat untuk menghasilkan produk.

41

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN 6.1

Kesimpulan 1. Enzim selulase yang dihasillkan Bacillus sp. BPPT CC RK2 dapat melakukan sakarifikasi limbah pengolahan kertas. Konsentrasi enzim dan substrat

mempengaruhi persen sakarifikasi. Persen sakarifikasi tidak

berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi enzim dan substrat. 2.

Berdasarkan analisa dengan kromatografi lapis tipis, jenis gula yang dihasilkan dari proses sakarifikasi limbah pengolahan kertas dengan menggunakan enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 diperkirakan adalah maltosa.

6.2

Saran 1. Perlu dilakukan optimasi konsentrasi enzim dan substrat untuk menghasilkan persen sakarifikasi yang maksimum. 2. Perlu dilakukan optimasi waktu sakarifikasi untuk menghasilkan persen sakarifikasi yang maksimum. 3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengkarakterisasi produk yang dihasilkan.

42

DAFTAR PUSTAKA

Abun. 2006. Bioproses Limbah Udang Windu Melalui Tahapan Deproteinasi Dan Demineralisasi Terhadap Protein Dan Mineral Terlarut. Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran: Bandung Adhiyanto,C. 2006. Pemanfaatan Tentang Enzim dan Manfaatnya dalam Bidang Biomedik. UIN Jakarta Press : Jakarta hal 1, hal 115-120. Anindyawati, Trisanti. 2010. Potensi selulase dalam Mendegradasi Lignoselulosa Limbah Pertanian untuk Pupuk Organik. Berita Selulosa, Vol. 45, No. 2, Desember : 70 – 77 Ariffin, H., Abdullah, N., Kalsom, M.S., Shirai,Y and Hassan, M.A. 2006. Production and Characterisation of Cellulase by Bacillus Pumilus Eb3. International Journal of Engineering, 3(1), pp.47-53. Bakti, C. P. 2011. Optimasi Produksi Enzim Selulase Dari Bacillus sp. BPPT CC RK2 dengan Variasi pH dan Suhu Menggunakan Response Surface Methodology. Universitas Indonesia: Depok Begum S.F., Savitha, C., Jaison, J.P. 2012. Utilization of Banana Waste for Effective Production of Cellulase by Rhizopus Sp. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. Volume 3 issue 1.p 674683 Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry (72), p 248-254 Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K.B and Ramakhrisnan, S. 2011. Chemical and Physicochemical Pretreatment of Lignocellulosic Biomass: A Review. SAGE - Hindawi Access to Research Enzyme Research. p 1-17 Brown, R.M. Jr. 1996. The biosynthesis of cellulose. J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem. A33. P 1345-1373. In Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier Chen, T and Ramos, J. 2010. Enzyme Kinetics [application of uv-vis spectrometry]. Cheng, C. Sung, C. Hsieh, P.H. 2010. On-line desalting and carbohydrate analysis for immobilized enzyme hydrolysis of waste cellulosic biomass by

43

column-switching high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1217 (2010) P. 2104–2110 Chisti, Y. 1999. Fermentation (Industrial) Basic Consideration.p 663-674 dalam Encyclopedia of Food Microbiology, Robinson, R, Batt dan Patal, P. Academic Press: London Chojnacka, K. 2006. Fermentation Product. Chemical Engineering and Chemical Process Technology Vol V dalam Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS). Dashtban, M., Maki, M., Leung, Kam Tin., Mao, C., Qin, W.2010. Cellulase Activities in Biomass Convertion: Measurement Methods and Comparison. Critical Reviews in Biotechnology.Informa Health Care. P 1-8 Demers, A., Doane, R., Guzman, S., Pagano, R. 2009. Enzymatic Hydrolysis of Cellulosic Biomass for the Production of Second Generation Biofuels.Worcester Polytechnic Institute. P 1-29 Bai, S. Kumar, M.R. Kumar, D.J. Mukesh. Balashanmugam, P. Balakumaran, M.D. Kalaichelvan, P.T. 2012. Cellulase Production by Bacillus subtilis isolated from Cow Dung. Archives of Applied Science Research, 2012, 4 (1):269-279 El-Safey. M. 2006. Introduction to Bacterial taxonomy. Fengel, D. and G. Wegener. 1984. Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. Walter de Gruyter & Co., Berlin dalam Hermiati, E. 2010. Pemanfaatan biomassa lignoselulosa ampas tebu untuk produksi bioetanol. Jurnal Litbang Pertanian, 29(4), Hal 121-130 Galbe, M and Zacchi, G. 2002. A Review of the Production of Ethanol from Softwood. Appl Microbiol Biotechnol (2002) 59:618–628 Ghose, T.K. 1987. Measurement of Cellulase Activities. Pure & Appl. Chem., Vol. 59, No. 2, P. 257—268 Ghosh, B and Ray, R.R. 2010. Saccharification of Raw Native Starches by Extracellular Isoamylase of Rhyzopus Oryzae. Biotechnology:9 (2) P 224228. Gusakov, A.V., Kondratyeva, E.G., Sinitsyn, A.P. 2011. Comparison of Two Methods for Assaying Reducing Sugars in the Determination of Carbohydrase Activities. Hindawi Publishing Corporation International Journal of Analytical Chemistry. Volume 2011 Haldane, J.B.S. 1930. Enzymes. University College: London

44

Handbook of Pharmaceutical Excipients.–5th ed. 2006. edited by Raymond C. Rowe, Paul J. Sheskey, Siaˆn C. Owen. Pharmaceutical Press. American Pharmacists Association. P 744 Hidayat, N dan Suhartini S. 2010. Mikrobiologi Industri. Jurusan Teknologi Industri Pertanian. Universitas Brawijaya Malang Gandjar, I.G dan Rohman, A . 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Hal 378-388 Karmakar, M and Ray, R.R. 2011. Saccharification of agro wastes by the Endoglucanase of Rhizopus oryzae. Annals of Biological Research, 2011, 2 (1) : P 201-208 Kondo T., Kasai, W., and Brown, R. M. Jr. 2004. Formation of Nematic Ordered Cellulose and Chitin. Cellulose (11), P 463- 474 in Saxena, I.M and Brown, R.M.Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier Kristensen, JB. 2009. Enzymatic hydrolysis of lignocellulose Substrate interactions and high solids loadings. Forest and Landscape Research Kumar, P., Barret, D.M., Delwiche, M.J and Stroeve,P. 2009. Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Ind. Eng. Chem. Res., Vol. xxx, No. xx, XXXX Laser, M., Schulman, D., Allen, S., Lichwa, J., Antal, M., and Lynd, L. 2002. A Comparison of Liquid Hot Water and Steam Pretreatment of Sugarcane Bagasse for Bioconversion to Ethanol. Bioresource Technology, 81. 33-44. In Thakur, I,S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon Society. Journal of International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12 Lin,Y and Tanaka, S. 2006. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology. 69(6):627-642 in Abdel-Rahman, M.A. Tashiro, Y. Sonomoto, K. 2011. Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits. Journal of Biotechnology 156 (2011) pp 286– 301 Lo, Yun-Chung., Saratale, G.D., Chen, Wen-Ming., Bai, Ming-Der., Chang, JoShu. 2009. Isolation of cellulose-hydrolytic bacteria and applications of the cellulolytic enzymes for cellulosic biohydrogen production. Enzyme and Microbial Technology 44 (2009) 417–425

45

Maki,M., Leung K,T., Qin, W. 2009. The prospects of cellulase-producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. International Journal of Biological Sciences 2009; 5(5):500-516 Marssada, Agung. 2011. Optimasi Produksi Selulase Dari Bacillus sp. Bppt CC RK 2 Menggunakan Metode Respon Permukaan dengan Variasi Rasio C/N Dan Waktu Fermentasi. Universitas Indonesia. Miller, G.L., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Analytical Chemistry, 31(3), pp.426-428. Mosier, N., Wyman, C., Dale, B., Elander, R., Lee, Y.Y., Holtzapple and Ladisch, M. 2005. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 96 (2005) P 673–686 Mrudula, S and Murugammal, R. 2011. Production of cellulase by Aspergillus niger under submerged and solid state fermentation using coir waste as a substrate. Brazilian Journal of Microbiology.2011. 42. P 1119-1127 Mussatto, S.I. and Teixeira, J.A., 2010. Lignocellulose as raw material in fermentation processes. Applied Microbiology and Microbial Biotechnology, P.897-907. Nigam,P.S., Gupta, N., Anthwal, A. 2009. Pre-treatment of Agro-Industrial Residues in Biotechnology for Agro-Industrial Residues Utilisation. Springer. P.16 Octavia, S. Soerawidjaja, T.H., Purwadi, R., Putrawan, I.D.G Arsa. 2011. Pengolahan Awal Lignoselulosa Menggunakan Amoniak untuk Meningkatkan Perolehan Gula Fermentasi. Prosiding Seminar Nasional Teknik Kimia, “Pengembangan Teknologi Kimia untuk Pengolahan Sumber Daya Alam Indonesia”. Yogyakarta. ISSN 1693-4393 O'Sullivan, A. C. 1997. Cellulose: The Structure Slowly Unravels. Cellulose ,4. 173-207. In Saxena, I.M and Brown, R.M. Jr. 2008. Biochemistry and Molecular Biology of Cellulose Biosynthesis in Plants: Prospects for Genetic Engineering. Advances in Plant Biochemistry and molecular Biology, Volume 1. Elsevier Prasetyo, J., Kato, T., and Park Enoch.Y. 2010 Efficient Cellulase-Catalyzed Saccharification of Untreated Paper Sludge Targeting for Biorefinery. Biomass and Bioenergy 34 (2010). P 1906-1913 Ramanathan, T., Ahmad, A., Ahmad, A.S., Kalimutho, M. 2011. Taxonomical Identity and Polysaccharide Produced by Bacillus Species Isolated From Old Aged Medicinal Decoctions. Journal of Sustainability Science and Management Volume 6 Number 1, June 2011: P 2-9

46

Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Widya Medika: Jakarta Schallmey, M., Singh, A., Ward.O,P. 2004. Development in the Use of Bacillus spesies for Industrial Production. Can. J. Microbiol. Vol 50 p 1-17 Scopes, Robert. 2002. Enzyme Activity and Assays. Encyclopedia of Life Sciences Stahl, Egon. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopis. Terjemahan dari :Drug Analysis by Chromatography and Microscopy : a Practical Supplement to Pharmacopoias. Kosasih Padmawinata dan Iwang Sudiro. Penerbit ITB Bandung Sukumaran, R.K., Singhania, R.R. and Pandey, A. 2005. Microbial Cellulases Production, Applications and Challenges. Journal Scientific & Industrial Research, 64 (November), pp.832-844. Sun,Ye and Cheng, Jiayang. 2002. Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for Ethanol Production : a Review. Bioresource Technology (83) p 1-11 Tewari, Rupinder. 2007. Food and Industrial Microbiology. Department of Biotechnology Panjab University Thakur, I.S. and Nakagoshi, N. 2011. Production of Biofuels from Lignocellulosic Biomass in Pulp and Paper Mill Effluent for Low Carbon Society. Journal of International Development and Cooperation, Vol 18,No. I.P 1-12 Toledo,V.D.A.A.D., Takasusuki, M.C.C.R., Oliveira, A.J.B.D., Chambo, E.D and Lopes, S.M.S. 2012. Spectrophotometry as a Tool for Dosage Sugars in Nectar of Crops Pollinated by Honeybees. Dalam Macro To Nano Spectroscopy Edited by Dr. Jamal Uddin. Intech. p 269-290 Vollhardt, P and Schore, N. 2009. Organic chemistry : structure and function ,6th ed. W. H. Freeman and Company: USA. P 1117 Vynios, D.H., Papaioannon, D.A., Filos,G., Karigiannis, G., Tziala, T., Lagios, G. 2009. Enzymatic Production of Glucose From Waste Paper. Bioresources 4 (2) p 509-521 Yin, L.-J. et al., 2010. Purification and Characterization of a Cellulase from Bacillus subtilis YJ1. Journal of Marine Science and Technology, Vol. 18, No. 3, pp. 466-471 (2010) Zhang , P.Y.H., Himmel M.E., and Mielenz J.R. 2006. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnology Advances 24 (2006) 452–481 http:// invivo.flocruz.br/cell/oficina.htm . Gambar bakteri Bacillus sp. Diunduh pada tanggal 15 September 2012

47

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7699/bacillus. Turnbull, Peter CB. 1996. Medical Microbiology. 4th edition. Editor Baron S, Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston diunduh pada tanggal 15 September 2012

48

LAMPIRAN

49

Lampiran 1 Cara pembuatan reagen No. Nama Reagen dan buffer 1. Natrium Hidroksida 1 N 2.

Natrium Hidroksida 5 N

3.

Buffer Phosfat 0,1 M pH 7

4.

5. 6.

7. 8. 9.

Cara pembuatan Sebanyak 4 gram natrium hidroksida dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL Sebanyak 20 gram natrium hidroksida dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL. Larutan A= Sebanyak 2,78 gram NaHPO4 dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL. Larutan B = Sebanyak 3,56 gram Na2HPO4.2H2O dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL.

19,5 ml Larutan A dicampurkan dengan 30,5 ml larutan B dilarutkan dalam aquades hingga tepat 100 mL. pH 7 Buffer Phosfat 0,05 M pH Sebanyak 50 ml Buffer Phosfat 0,1 M dipipet 7 kemudian ditambahkan aquadest hingga tepat 100 ml CMC 1% dalam Buffer Sebanyak 1 gram CMC dilarutkan dalam 10 Phosfat 0,05 M pH 7 ml Buffer Phosfat 0,05 M pH 7 Pereaksi DNS Larutan A = Sebanyak 10 gram dinitrosalisilat acid ditambah 10 gram natrium hidroksida dan 2 gram fenol kemudian dilarutkan dalam MiliQ hingga tepat 250 mL. Larutan B= Sebanyak 200 g Natrium Kalium Tartrat ditambahkan 0,5 gram natrium sulfit kemudian dilarutkan dalam MiliQ hingga tepat 250 mL. Larutan A dicampurkan dengan larutan B kemudian ditambahkan miliQ hingga tepat 1000 ml Asam sulfat 0,005 N Sebanyak 0,140 mL asam sulfat dicampurkan dalam aquades hingga tepat 1000 mL. Asam sulfat 10% dalam Sebanyak 2 ml asam sulfat ditambahkan 18 ml metanol metanol hingga tepat 20 ml Pereaksi Bradford Sebanyak 100 mg Coomassie Blue G-250 dilarutkan dalam 50 ml ethanol 95%. Larutan ini kemudian dicampurkan dengan 100 ml asam fosfat 85% dan diencerkan sampai volume 1 L dengan aquadest. Konsentrasi akhir reagent ini 0.01% Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7% ethanol, dan 8.5% asam fosfat

50

Lampiran 2. Pembuatan medium No. 1.

2.

3.

Nama medium Medium Luria Bertani

Cara Pembuatan Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5 yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan dalam volume tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0, lalu dicukupkan hingga tepat 100 mL. Medium Luria Bertani Sebanyak 0,5 gram natrium klorida, 0,5 agar yeast extract dan 1 gram pepton dilarutkan dalam volume tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0,ditambahkan 2 gram agar, diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan hingga tepat 100 mL. Medium Luria Sebanyak 2,5 gram natrium klorida, 100 ml Bertani+Dedak Padi 40 % air kelapa, 5 gram pepton, dan 200 gram + Air kelapa 20 % dedak padi dilarutkan dalam volume tertentu aquades, diatur pH sampai 7,0, diaduk hingga homogen, lalu dicukupkan hingga tepat 500 mL

Pembuatan Media Pembuatan Media Kultivasi Bakteri Media kultivasi yang digunakan adalah Luria Bertani (LB) cair dengan komposisi per liter yaitu, 10g pepton, 5g ekstrak khamir, dan 5g NaCl. LB ditambahkan dengan 1% Selulosa. Media dilarutkan dengan akuades. Kemudian media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1,2 atm selama 15 menit. Proses Penyiapan Stok Kultur Isolat Bacillus sp. BPPT CC RK2 diinokulasikan sebanyak 1-2 ose ke dalam media LB agar dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Isolat ini digunakan sebagai stok kultur penelitian.

51

Pembuatan Media Produksi Enzim Media produksi dibuat sebanyak 500 ml. Media produksi mengandung 40% dedak beras sebagai sumber karbon dan air kelapa 20 % sebagai sumber nitrogen. Media dilarutkan dengan volum tertentu akuades, diatur pH sampai 7,0. Ditambahkan hingga volume akuades tepat 500 mL. Kemudian media disterilisasi dalam autoklaf

pada suhu 121°C dan

tekanan 1,2 atm selama 15 menit

(Marsadda, 2011). Pembuatan Starter Media starter dibuat dengan menginokulasikan sebanyak 1-2 ose isolat Bacillus sp.ke dalam media LB standar (10% media produksi), kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 6 jam dengan agitasi 150 rpm. Produksi Enzim Selulase Produksi enzim selulase dilakukan dengan menginokulasikan media starter ke dalam media produksi, dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam dengan agitasi 150 rpm. Setelah 24 jam, enzim disentrifugasi pada agitasi 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4oC. Kemudian diambil supernatannya sebagai fraksi enzim selulase kasar. Enzim selulase kasar tersebut kemudian dianalisis kadar protein dan aktivitas enzimnya

52

Lampiran 3 Pembuatan Kurva Standar Glukosa dan Kurva Standar BSA Pembuatan Kurva Standar Glukosa Pembuatan kurva standar

glukosa dilakukan dengan membuat variasi

konsentrasi standar glukosa sebagai berikut: 0; 0,04; 0,08; 0,12; 0,16; 0,20; 0,20; 0,24; 0,28; 0,32 mg/ml Glukosa tersebut dilarutkan dalam larutan buffer fosfat 0,05 M, pH 7.0. Kandungan glukosa dalam larutan tersebut diuji dengan metode DNS (Miller,1959). Kurva standar glukosa adalah grafik hubungan konsentrasi glukosa dengan nilai absorbansi pada panjang gelombang 540 nm. Pembuatan Kurva Standar BSA Pembuatan kurva standar BSA dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi standar BSA sebagai berikut : 0; 0,03; 0,06; 0,09; 0,12; 0,15; 0,18; 0,21; 0,24 mg/ml. BSA dilarutkan dalam mili-Q-water (ddH2O). Kandungan protein pada larutan yang dibuat diuji dengan metode Bradford. .Konsentrasi analit berfungsi sebagai sumbu X pada grafik dan absorbansi sebagai sumbu Y, sehingga akan diperoleh suatu garis linear dengan gradien tertentu. Bouvine Serum Albumin (BSA) mengandung 1mg/mL protein dalam buffer phosfat 0,05 M pH 7.0.

53

Lampiran 4 Kurva Standar Glukosa

C(mg/ml) 0 0,04 0,08 0,12

Absorbansi 0 0,1465 0,297 0,4475

0,16 0,2 0,24 0,28 0,32

0,4965 0,6455 0,6775 0,808 0,951

Kurva Standar Glukosa 1,2 y = 3,0178x R² = 0,9782

absorbansi

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

0,05

0,1

0,15

0,2

konsentrasi (mg/ml)

0,25

0,3

54

Lampiran 5 Kurva Standar BSA

C(mg/ml) 0 0,03 0,06

Absorbansi 0 0,156 0,3185

0,09 0,12 0,15 0,18 0,21

0,37 0,5415 0,6505 0,728 0,8865

0,24

0,965

Kurva Standar BSA 1,2

y = 4,1855x R² = 0,9886

Absorbansi

1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0

0,05

0,1

0,15

Kadar protein (mg/ml)

0,2

55

Lampiran 6 Metoda Pengujian Aktivitas Enzim Selulase dan Kadar Protein a. Pengujian Aktivitas Selulase Pengujian aktivitas selulase yang dilakukan pada percobaan ini adalah melakukan pengujian terhadap endo β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) atau yang biasa disebut sebagai CMCase. Aktivitas CMCase diukur dengan menggunakan metode yang dilakukan oleh Yin et al (2010), yaitu dengan mereaksikan sampel dalam larutan 1 mL CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) di mana volume sampel enzim 100 μl, dan volume pelarut 900 μl. Reaksi berlangsung selama 30 menit dan diinkubasi pada suhu 500C. Gula turunan yang dihasilkan dari reaksi tersebut ditentukan dengan metode DNS (Miller, 1959) yaitu dilakukan penambahan larutan DNS sebanyak 3 mL pada tabung reaksi. Tabung reaksi berisi larutan dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit agar terjadi reaksi antara glukosa dengan DNS. Tabung reaksi didinginkan kemudian dikocok agar bercampur. Sebagai kontrol yaitu 900 μl CMC 1%, buffer fosfat 0,05 M (pH 7.0) diinkubasi pada suhu 500C selama 30 menit baru kemudian ditambahkan 100 μl enzim lalu ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit . Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan dalam waktu yang bersamaan. Absorbansi

diukur

pada

panjang

gelombang

540

nm

menggunakan

spektrofotometer UV Visible. Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva standar glukosa.

56

Aktivitas selulase dihitung menurut persamaan

Aktivitas ( U ml)=

mg glukosa ×1000 Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml

b. Penentuan Kadar Protein Kadar protein diukur menggunakan metode yang dilakukan oleh Y.C Lo et al 2009 dengan metoda Bradford. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan modifikasi, yaitu sebanyak 30 µl sample dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1,5 ml pereaksi Bradford. Kemudian larutan diaduk dengan vortex perlahan untuk mencegah terbentuknya busa, analit diinkubasi selama 20 menit pada suhu ruang. Blangko menggunakan ddH2O sebanyak 30µl. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 595 nm menggunakan spektrofotometer UV Visible.

57

Lampiran 7 a. Perhitungan Uji Aktivitas Selulase

Nama zat

Absorbansi

Rata-rata absorbansi

Sampel

0,674

0,691

0,690

0,685

Kontrol

0,129

0,179

0,099

0,136

Faktor pengenceran (Fp) = 10 Kadar gula reduksi sample => y

=

3,017 x

0,685

=

3,017 x

x

=

0,2270 mg

Kadar gula reduksi kontrol => y

=

3,017 x

0,136 =

2,9576 x

x

0,0450 mg

=

Konsentrasi gula reduksi = 0,2270 – 0,0450 = 0,1821 mg

Aktivitas ( U ml) =

=

0,1821 ×1000 180 ×30 menit ×0.1 ml

= 3,37 U/ml

mg glukosa ×1000 Mr glukosa ×30 menit ×0.1 ml

x 10 = 0,337 x 10

x Fp

58

Lampiran 8 Perhitungan Uji Kadar Protein

Nama zat

Absorbansi

Rata-rata absorbansi

Sampel

0,934

1,284

1,038

1,161

Kontrol

0,221

0,220

0,219

0,220

Y = 4,185 x ( 1,161 – 0,220 )

= 4,185 x

0,941

= 4,185 x X

= 0,2248 mg/ml

59

Lampiran 9 Aktivitas Enzim Selulase yang Digunakan: Aktivitas Enzim (U/ml)

Volume

Aktivitas Total

Enzim (ml)

(aktivitas enzim x volume )

2

6 Unit (pembulatan)

4

12 Unit (pembulatan)

6

18 Unit (pembulatan)

3,37 U/ml

Aktivitas Spesifik Aktivitas spesifik (U/mg)

=

Aktivitas Selulase Kadar Protein

=

3,37/0,224

=

15,04 U/mg

60

Lampiran 10 Penentuan Persen Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas Untuk menentukan persen sakarifikasi , harus terlebih dahulu diketahui kadar gula reduksi (dari kurva standar). Pengukuran kadar gula reduksi ditentukan berdasarkan metode DNS, yaitu dengan mengambil 1 ml sampel (dari total volume 5 ml) dari campuran 100 mg limbah pengolahan kertas ,12 U enzim selulase (4 ml) dan 1 ml buffer sitrat 5,5 yang kemudian ditambahkan ke dalam 3 ml DNS, selanjutnya dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit. Setelah itu didinginkan pada suhu ruangan, Sebagai kontrol yaitu buffer sitrat pH 5,5 ditambah 12 U enzim selulase ( 4 ml) lalu ditambahkan 3ml DNS dan dipanaskan didalam waterbath selama 5 menit . Perlakuan sampel dan kontrol dilakukan dalam waktu yang bersamaan. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 540 nm menggunakan spektrofotometer UV Visible (Miller, 1959). Harga absorbansi yang diperoleh dari sampel dan kontrol, diplotkan pada kurva standar glukosa untuk mengetahui konsentrasi gula reduksi. Konsentrasi gula reduksi diperoleh dari selisih plot absorbansi (sampel- kontrol) pada kurva standar glukosa. Untuk menentukan persen sakarifikasi dapat dihitung dengan rumus (Begum& Alimon, 2011) : Sakarifikasi (%) =

Jumlah gula reduksi (mg/ml) x 0,9 Substrat (mg/ml)

x 100

61

Lampiran 11 Metoda Perlakuan Awal Substrat Limbah Pengolahan Kertas a.

Pretreatment substrat Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas ditambah 100 ml

NaOH 1N dalam erlenmeyer dibiarkan selama 6, 12, dan 24 jam. Kemudian larutan disaring menggunakan kain nilon dan dicuci dengan air yang mengalir hingga pH netral, setelah itu substrat hasil pretreatment dikeringkan selama 12 jam dalam oven suhu 80˚ C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah pengolahan kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan menggunakan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011). b.

Perlakuan substrat tanpa pretreatment Sebanyak 5 gram substrat limbah pengolahan kertas basah dikeringkan 12

jam dalam oven suhu 80˚C. Dari hasil perlakuan, diambil sebanyak 100 mg substrat limbah kertas kemudian dicampur dengan 1 ml larutan buffer phosfat 0,05 M pH 7 lalu ditambahkan enzim selulase kasar dengan variasi konsentrasi enzim dengan aktivitas 6,12,18 unit kemudian diinkubasi selama 96 jam pada suhu 50˚ C. Kadar gula reduksi dihitung dengan metoda DNS (Miller, 1959) dan persen (%) sakarifikasi (Begum dan Alimon 2011).

62

Lampiran 12 

Hasil uji pendahuluan perlakuan awal subtrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 7 suhu 50˚ C): ∑ Abs

∑ Abs

Konsentrasi

Konsentrasi

Kadar gula reduksi

sampel

kontrol

sampel

kontrol

(sampel –kontrol)

A B

0,685 0,671

0,670 0,592

0,2269 0,2224

0,2222 0,1962

0,0475 0,2618

C D

0,712 0,79

0,632 0,672

0,2360 0,2618

0,2095 0,2227

0,2652 0,3911

E

0,801

0,692

0,2655

0,2294

0,3613

Substrat

Ket : A= Untreatment (tanpa penambahan NaOH); B= Pretreatment 6 jam dengan NaOH; C= Pretreatment 12 jam dengan NaOH; D= Pretreatment 24 jam dengan NaOH; E= Pretreatment 36 jam dengan NaOH

Perlakuan Substrat

Persen Sakarifikasi (%)

Untreatment (tanpa penambahan NaOH)

0,2138

Pretreatment 6 jam dengan NaOH

1,1783

Pretreatment 12 jam dengan NaOH

1,1932

Pretreatment 24 jam dengan NaOH

1,76

Pretreatment 36 jam dengan NaOH

1,6258

63

Lampiran 13 Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Substrat 

Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi substrat (waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C dengan jumlah 4 ml enzim ditambah 1 ml buffer (Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ):

Substrat (mg)

25 50 100 150 200

Substrat

∑ Abs

∑ Abs

Konsentrasi

Konsentrasi

Kadar gula reduksi

sampel

kontrol

Sampel

Kontrol

(sampel –kontrol)

0,682 0,687 0,726 0,717 0,696

0,680 0,678 0,658 0,659 0,660

0,2262 0,2276 0,2406 0,2375 0,2306

0,2254 0,2248 0,2181 0,2185 0,2188

0,0077 0,0276 0,2254 0,1900 0,1182

Kadar Gula Reduksi

% Sakarifikasi

25

0,0077

0,1392

50

0,0276

0,2486

100

0,2254

1,0143

150

0,1900

0,5701

200

0,1182

0,2660

(mg)

64

Hubungan Konsentrasi substrat terhadap % Sakarifikasi 1,2000 1,0143

% Sakarifikasi

1,0000 0,8000 0,6000

0,5701

0,4000 0,2660

0,2486

0,2000

0,1392

0,0000 25

50

75

100

125

150

175

200

Substrat (mg)

Gambar .Kurva hubungan antara variasi konsentrasi substrat terhadap persen sakarifikasi

65

Lampiran 14 Perhitungan Uji Variasi Konsentrasi Enzim Tabel kadar gula reduksi dan persen (%) sakarifikasi pada uji variasi konsentrasi enzim dengan waktu inkubasi 96 jam, pH 5,5 suhu 37˚ C, substrat 100 mg (Begum dan Alimon, 2011 dengan modifikasi ): Enzim (ml)

2 4 6

Enzim (ml)

∑ Abs

∑ Abs

Konsentrasi

Konsentrasi

Kadar gula reduksi

sampel

kontrol

Sampel

kontrol

(sampel –kontrol)

0,746 0,795 0,700

0,661 0,673 0,627

0,2474 0,2634 0,2319

0,2191 0,2232 0,2079

0,2828 0,4022 0,2398

Kadar Gula

% Sakarifikasi

Reduksi 2

0,2828

0,7637

4

0,4022

1,8097

6

0,2398

1,5104

Hubungan variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi 2,0000 sakarifikasi (%)



1,8097

1,5000

1,5104

1,0000 0,7637 0,5000 0,0000 6

12

18

enzim (U)

Gambar. Kurva hubungan antara variasi konsentrasi enzim terhadap persen sakarifikasi

66

Lampiran 15 Analisa produk akhir sakarifikasi dengan kromatografi lapis tipis Perhitungan : Rf =

Jarak titik pusat bercak dari titik awal Jarak garis depan dari titik awal

Hasil : 

Rf Galaktosa = 3,5/8 = 0,43



Rf Sukrosa

= 3,1/8 = 0,38



Rf Arabinosa = 3,9/8 = 0,48



Rf Xilosa

= 3,5/8 = 0,56



Rf Glukosa

= 3,7/8 = 0,46



Rf Maltosa

= 2,7/8 = 0,33



Rf Sampel

= 2,6/8 = 0,32

67

Lampiran 16 Data Pembanding 1. Sakarifikasi Limbah Pengolahan Kertas dengan Enzim Komersial 

Nama

: Primafast 200



Aktivitas enzim

: 6200 U/ml



Kondisi optimum

: pH 4,5-5,5

Temperatur 55-60° C

Waktu

∑ Abs

∑ Abs

Konsentrasi

Konsentrasi

Kadar gula reduksi

(jam)

sampel

kontrol

sampel

kontrol

(sampel –kontrol)

0 jam 24 jam 48 jam 72 jam 96 jam

0,730 0,706 0,732 0,704 0,705

0,7 0,643 0,704 0,684 0,704

0,242 0,234 0,243 0,233 0,234

0,232 0,213 0,233 0,227 0,233

0,0983 0,2088 0,0934 0,0679 0,0033

Waktu

Kadar Gula Reduksi (mg/ml)

% Sakarifikasi

0

0,0983

0,0973

24

0,2088

0,2067

48

0,0934

0,0924

72

0,0679

0,0673

96

0,0033

0,0033

(jam)

68

% Sakarifikasi Enzim Komersil Primafast 200 % Sakarifikasi

0,3 0,207

0,2 0,2 0,1

0,097

0,092

0,067

0,1

0,003

0,0 0

24

48

72

96

Waktu (Jam)

2. Blangko (Substrat + Buffer sitrat pH 5,5) Waktu (jam)

Kadar Gula Reduksi (mg/ml)

% Sakarifikasi

0

0

0

24

0

0

69

GAMBAR

70

Gambar 10. Autoklaf

Gambar 12. Termomixer

Gambar 14. Timbangan Analitik

Gambar 11. Refrigerated Centrifuge

Gambar 13. pHmeter

Gambar 15. Spektrofotometer UV Vis

71

Gambar 16. Substrat limbah pengolahan kertas awal

Gambar 17. perendaman substrat dengan NaOH

Gambar 18.

Gambar 19.

Substrat limbah pengolahan kertas hasil

Enzim selulase Bacillus sp.BPPT CC

pretreatment

RK2

72

Gambar 20.

Gambar 21.

Analit berwarna kecoklatan hasil uji

Analit berwarna biru hasil analisa

aktivitas selulase dengan larutan DNS

kadar protein

Gambar 22.

Gambar 23.

Substrat limbah pengolahan kertas+Enzim

Pengembangan sampel dan

selulase Bacillus sp.BPPT

pembanding pada kromatografi lapis tipis