SeminarNasional Peternakan dan Vetenner 199?
PRODUKSI MONOCLONAL ANTIBODI C12 DAN M96 UNTUK MENDETEKSI SERPULINA PILOSICOLI, SPIROCHAETA PATOGEN PADA HEWAN DAN MANUSIA I WAYAN MASA TENAYA
Balai Penyidikan Penyakit Hewan wilatult 11 Denlxisar Bali
RINGKASAN Telah diproduksi dua jenis monoclonal antibodi (MoAb), C12 dan M96 untuk mendiagnosa infeksi bakteri S. pilosicoli, penyebab diare lendir berdarah pada beberapa spesies hewan dan manusia . Kedua MoAb ini termasuk klas IgGl isotype, tetapi memberikan basil yang berbeda dalam beberapa uji serologi. Pada uji Western blot, C12 mendeteksi satu garis protein pads 72 kDa, suatu protein dari genus Serpulina (genus specific) yang bersifat "inununodominant" dan tergolong protein yang patogen berdasarkan uji "immimogold staining" pada penieriksaan mikroskop elektron. C12 tidak- digunakan untuk tujuan diagnosa tetapi dapat digunakan untuk mernilih "DNA libraries" dalam pembuatan vaksin rekayasa DNA terhadap genus ini . Sedangkan M96 bereaksi dengan satu garis protein pada 80 kDa yang lianya dimiliki oleh S. pilosicoli . Pada uji FAT dan Immunodot-blot, M96 juga secara spesifrk hanya mendeteksi strain S. pilosicoli asal hewan maupun manusia dan tidak mendeteksi sejumlah spesies-spesies spirochaeta lainnya seperti S. hyodysenteriae, S. innocens, S. murdochii, S. intermedia dan B. aalborgi . Monoclonal antibodi M96 selanjutnya dapat digunakan untuk mendeteksi S. pilosicoli pada hewan dan manusia dari beberapa negara asal Amerika, Asia, Eropa dan Australia . Kata kunci : Antibodi, S. pilosicoli, patogen PENDAHULUAN Serpulina pilosicoli merupakan salah satu spirochacia yang relatif bans diketaluu bersifat patogen, bakteri saluran pencernaan ini menyebabkan diarc Icndir-berdarah pada beberapa spesies hewan dan manusia. Pada babi, kuman yang bersifat weakly beta-haemolvtic anaerobic ini adalah agen penyebab porcine intestinal spirochaetosis (PIS) (TROTT et al., 1996) . Kejadian PIS telah dilaporlr 9i Amerika Utara, Eropah dan Australia (HAMPSON dan TROTT, 1995; DUHAMEL, 1996, , FELTSet al_, 1996). Walaupun angka kematian babi karena PIS tidak terlalu besar, di negaranegar, aaju penyakit ini tetap dicatat sebagai salah satu penyakit penting yang merugikan secara ekonomi (TAYLOR et al., 1980; ANDREWS dan HOFF MAN, 1982) . PIS mempunyai gambaran histopatologi yang khas berupa penancapan salah satu bakteri S. pilosicoli pada epithel usus besar (colon) menyerupai bulu-bulu sikat (TAYLOR 1980; ANDREws dan HOFFMAN, 1982; JACQUES et al., 1989; GRAD et al., 1995; TROTT et al., Gambaran pathogomonic ini tidak ditemukan pada penyakit bakteri lainnya, khususnya dysentery (SD), suatu penyakit diare berdarah oleh bakteri yang berbeda genus tetapi masih satu spesies, Serpulina hyodysenteriae .
ujung et al., 1996) . swine dalam
Penancapan sel-sel spirochaeta juga dideteksi pada usus besar induk semang lain penderita S. pilosicoli jugs penderita diare seperti manusia (HARLAND dan LEE, 1967, LEE et al., 1971), anjing (LEE dan HAMPSON, 1994, DUHAMEL et al., 1995) dan ayam (TRAMPEL et al., 1994; TROT et al., 995
SeminarNasional Peternakan don Veteriner 1997
1995) . Pada pasien manusia dengan komplikasi AIDS/HIV, selain dari colon kuman ini juga dapat diisolasi dari darah dan hati (LAMBERT dan GoURSOT, 1982) . Hasil penelitian TROTT et al. (1995) membuktikan bahwa strain-strain .S. pilosicoli yang diisolasi dari manusia penderita diare mampu menimbulkan diare pads ayam dan babi percobaan dengan gambaran histopatologi yang sama seperti yang selama ini dideteksi pada manusia . Peneliti tersebut juga mendapatkan hal serupa bila isolat asal babi diinokulasikan pada ayam percobaan . Berdasarkan test polymerase chain reaction (PCR), S. pilosicoli dapat dideteksi dari faeces manusia dan sejumlah spesies hewan yang disertai diare seperti anjing, babi, ayam, kelinci, itik, possum, tikus besar dan tikus putih (PARK et al., 1995; ATYEO et al., 1996). Ini membuktikan bahwa S. pilosicoli adalah patogen dan menyerang banyak host, oleh karena itu patut dicurigai sebagai salah satu penyebab penyakit zoonosis . Selain dengan PCP, S. pilosicoli juga dapat dibedakan dari sejumlah intestinal spirochaeta lainnya dengan uji multilocus enzyme electrophoresis (MEE) profile (LEE dan HAMPSON, 1994) . Kedua uji tersebut sangat sensilif dan spesifik, tetapi hanya dapat dilarukan pada laboratorium dengan peralatan canggih dan dengan sumber daya manusia yang memadai . Dalam penelitian ini telah berhasil diproduksi monoclonal antibodi yang tidak hanya dapat digunakan dengan mudah pads beberapa test serologi konvensional seperti FAT. Western blot. slide agglutination test dan Immunodot-blot . tetapi juga mainpu mendeteksi suatu microorganisme pada tingkat genetik, menyamai spesifisitas uji MEE dan PCR . Antibodi yang spesifik ini digunakan untuk mendeteksi beberapa isolat dari beberapa spesies hewan dan manusia yang dikirim dari beberapa negara asal Amerika, Eropa, Asia, dan Australia . MATERI DAN METODA Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium mikrobiologi pada Department Genetic Studies, School of Veterinary Studies, Murdoch University, Western Australia, dilaksanakan selama 2 tahun, Februari 1995 - Februari 1997. Bakteri dan pemupukannya Sebanyak 29 jenis strain standar dari anaerobic intestinal spirochaetes yang diperoleh dari laboratorium pusat penelitian spirochaete, Murdoch University (label 1) digunakan dalam penelitian ini . Ke-29 jenis bakteri ini meliputi 20 strain S. pilosicoli yang diisolasi dari babi (n=8), manusia (n=8), anjing (n=2) dan ayam (n=2) yang disertai diare. Semua microorganisme ini telah diuji dengan MEE dan PCR (LEE dan HAMPSON, 1994; PARK et al., 1995; ATYEO et al., 1996). Strain-strain dari bakteri lainnya adalah S. innocens (n=2), S. intermedia (n=2), S. murdochii (n=2) yang semua tergolong spirochaeta babi tidak patogen dan S. hvodysenteriae (n=2) salah satu spirochaeta babi yang patogen dan B. aalborgi (n=1) suatu spirochaeta tidak patogen asal manusia (LEE dan HAMPSON, 1994). Semua jenis bakteri tersebut dipupuk selama 3-5 hari pads suhu 37°C dengan suatu reciprocal shaker dalam media Kunkle benipa Trypticase Soy Broth (BBL) dilengkapi 2%,foetal bovine serum dan l% ethanolic cholesterol dart dipanen pada mid-log phase (kira-kira 108 sel/ml). Persiapan antigen (outer membrane proteins) Outer membrane proteins (OMPJ) diekstraksi dari bakteri dengan deterjen Triton X-114, sesuai metode dari LEE dan HAMPSON (1995). Bakteri di dalam 300ml BBL mula-mula disentrifuge 2800 g selanta 15 menit pada 40°C, diencerkan dan dicuci 3 kali dengan 0,05 M Tris buffered saline (TBS) mengandung 1M NaCl, 1M Tris (pH 8,0) dan terakhir dilarutkan dengan 30 ml larutan ekstrasi mengandung 0,1%(v/v) Triton X-1 14, 10 mM Tris dan 5mM EDTA (pH 7,5). 996
Seminar Nosional Peternakan dan I itertner 199-
Larutan ini kemudian dicampur hati-hati memakai circular mixer pada 4 °C selama 18 jam, selanjutnya disentrifuge 1000 g selama 10 menit pada 4°C. Supernatan larutan ini dipresipitasikan dengan 10 kali aceton absolut (Analar) pada -20°C selama 18 jam kemudian diendapkan dengan sentifuge 1000 g selama 10 menit pada 4° C. Endapan protein ini dilarutkan dengan PBS (pH 7,2), konsentrasi proteinnya diestimasikan dengan kit test protein (Bio-Rad laboratories, USA) dan disimpan pada -20°C sebelum dipakai. Pembuatan bakterin Untuk memproduksi hyperimmune serum terhadap bakteri, mutlak diperlukan sumber antigen berupa bakterin . Pembuatannya dengan mensentrifugasikan sel bakteri dari medium, dicuci 3 kali dengan PBS dan dilarutkan dengan 10 ml PBS (kira-kira 10 9 sel/ml) mengandung 0,3% formaldehyde . Larutan ini diinaktifkan dengan alat circular mixer 18 jam pada 4°C dan disimpan (aliquots) pada -20°C sebelum dipakai. Produksi hyperimmune serum pada babi Antiserum terhadap S pilosicoli (strain 1648) diproduksi pada seekor anak babi umur 4 minggu . Setelah serum normal diambil, babi disuntik dengan 3ml inrmunogen mengandung 1,5 ml bakterin dan 1,5 ml Freund's Complete Adjuvant pada 2 tempat di otot lelier. Babi terus disuntik setiap minggu (4 kali lagi) dengan immunogen, memakai Freund's Incomplete Adjuvant . Satu minggu sebelum darah diambil, babi disuntik (lewat vena jugularis) hanya dengan 1 .5 ml bakterin . Serum dipanen dan disimpan (aligouts) pada -20°C sebelum diuji. SDS-PAGE dan Western blot Untuk melihat perbedaan profil protein dan reaksi imununogenesitas dari beberapa spirochaeta, dilakukan dengan membandingkan OW yang telah dibuat memakai uji SDS-PAGE dan Western blot . Mula-mula OW dipanaskan selama 5 merit di dalam sample-reducing buffer yang mengandung 0,125 M Tris-HCL (pH 6,8), 4% SDS (w/v), 10% 2-betamercaptoethanol (v/v), 20% glycerol (v/v) dan 0,001% bromophenol blue (w/v), dan dimasukkan ke dalam SDS-PAGE lewat 4% "stacking dan 12,5% resolving gels" (mini-protean system). Pemisahan dijalankan selama 2 jam pada 100 V, 4°C. Sketsa protein dapat dilihat dengan mewarnainya dengan Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad) . Sedangkan untuk reaksi imrnunologinya dilakukan dengan mentransfer protein tadi secara elektrik ke kenos nitrocellulose (Hybong-C extra, berukuran 0,45 pm), mereaksikannya dengan hyperimmune serum, dan dilanjutkan dengan goat antiporcine antiserum yang dikonjugasi horseradish peroxidase (HRP) (Bio-Rad). Kertas nitrocellulose lalu diwarnai dengan 4-Chloro-1-naplithol . Produksi dan penggunaan monoclonal antibodi (MoAb) Berdasarkan hasil SDS-PAGE dan Western blot, didapatkan suatu protein yang dominan dan hanya spesifik dari S. pilosicoli pads posisi 72 kDa. Selain itu pada pemeriksaan mikroskop elektron dengan uji Imr»unogold staining (data tidak dipublikasi), protein ini ternyata menipakan komponen "outer membrane protein" yang diduga berperan dalam mekanisme kekebalan . Karena itu protein ini diisolasi dari SDS-PAGE dengan alat elektroeluter (Bio-Rad), guns memproduksi MoAb . Monoclonal antibodi diproduksi sesuai metode LEE dan HAMPSON (1995) dengan sedikit modifikasi . Mula-mula tikus putih betina (BALB/C mice) berumur 2 minggu diimunisasi lewat intraperitoneal dengan protein murni 72 kDa (kira-kira 50 gg/ml) yang diemulsikan dengan Freund's Complete Adjuvant . Immunisasi dilanjutkan dengan 997
Seminar Nasiona! Peternakan don Vetertner 199'
Incomplete Freund's Adjuvant sebanyak 4 kah, dilakukan 2 minggu sekah . Dua minggu sebelum melakukan fusi, tikus diinokulasi lagi melalui vena ekor dengan 0,2 ml protein yang lama tanpa adjuvant. Sel-sel limpa diekstraksi secara aseptis dan difusikan dengan sel myeloma (NS-1) memakai 40% polyethylene glycol (PEG; MW 1,3000-1,6000 ; Sigma) . Sel yang telah difusikan dilarutkan dalam 50 ml media DMEM-HAT (DMEM; 20% foetal bovine serum; 100 JIM hypoxanthine; 0,4 gM aminopterin ; 16 NM thymidine ; 0,58 mg/ml glutamine ; 0,22 mg/ml sodium pyruvate; 200 IU/ml penicillin; 200 4g/ml streptomycine; 0,05 mg/mi gentamycine ; 0,0025 mg/ml amphotericin B) mengandung 106 SCI limpa normal . Larutan ini disebarkan pada tissue culture plate sebelum diinkubasikan pada 37°C dengan CO2 7%. Sepuluh hari kemudian, supernatannya diuji dengan ELISA memakai protein murni 72 kDa (kira-kira 5~Lg/ml) yang di"coating" tiap-tiap lubang. Absorbennya dibaca dengan titertek ELISA reader OD 450 nm. Untuk mendapat cloneclone tunggal (mono), sel-sel hybridoma positif ELISA diclone ulang dengan pengenceran bertahap (limiting dilution) . Supernatannya diuji ELISA lagi untuk mengecek kontinuitas produksi antibodi, lalu dilanjutkan dengan Western blot guna menentukan spesifisitasnya . Untuk mendapatkan kualitas dan kuantitas MoAb yang cukup, sel-sel hybridoma yang speifk (memproduksi species-specific MoAb), dibiakkan secara in vitro memakai slat "miniPERM Bioreactor" (Heraus) . Setelah isotype dari MoAb yang didapat ditentukan dengan "ELISA-based mouse monoclonal isotype kit" (Bio-Rad). antibodi ini kemudian digunakan untuk mendeteksi S. pilosicoli dengan beberapa test serologi . HASIL PENELITIAN Dihasilkan dua jenis MoAb, (C12) dan (M96) yang keduanya termasuk 1gGl isotype. Pada Western blot C12 bereaksi dengan satu protein pada 72 kDa yang bersifat genus spesifik, sehingga tidak digunakan dalam diagnosa. tetapi akan digunakan lebih lanjut dalam produksi vaksin rekayasa DNA . Sedangkan M96 bereaksi dengan protein pada 80 kDa yang merupakan suatu protein. spesifik untuk S. pilosicoli (Gambar 1) . Hasil reaksi M96 ini terhadap S. pilosicoli dan beberapa "intestinal spirochaeta" lainnya, dirangkum dalam Tabel 1 .
Gambar 1. Hasil uji Western blot OIvP dart spirochaeta dengan M96. 1 . Berat molekul standard (kDa) . 2-5, S. pilosicoli asal babi (2,3) manusia (4,5). 6, .S. innocens; 7, "S. intermedia ",, 8, "S. murdochii "; 9, S. hvo ; 10, B. aalborgi 998
SeminarNasional Peternakan don Vetertner 1997
Tabel 1. Hasil deteksi M96 terhadap beberapa jenis intestinal spirochaeles Spesies* S. pilosicoli (isolat babi)
(isolat manusia)
(isolat anjing) (isolat ayam) S. hyodysenteriae S. innocens
"S. intermedia" "S. murdochii" B. allborgi ' Nama gpesies menurut
Strain 1648 3295 Gut A Gut B MIA 883769 891069 T4527 11A N26 Gap 183 Gap 401 HRMIA HRM2B Naomi Disley 1624294 MeyersK912 42167 Q94035406 B78 B204 B256 4171 889 PWSA 15521 Growden TACC43994
Asal' NSW WA USA USA U.K Can Can Tas Oman Oman Sydney Sydney Italy Italy WA WA USA USA USA USA USA USA USA U.K NSW U.K WA WA Denmark
WB2 + + + + + + + + +
IFAT3 +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ ++
ID" + + + + + + + + +
+ + + + + , + + + + + -
+++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ + -
+ + + + + - + + + + + -
+ ,;
++
+
LEE and HAMPSON (1994)
1 WA, Western Australia; NSW, New South Wales ; Can, Canada ; Tas, Tasmania
2 WB, Western blot dari OMP, -, test negatil ; +, test positif
3 IFAT, Immunofluorescence test dari set spirochaeta; - . reaksi negatif, +, reaksi positif lemah, ++, reaksi positif kual, +++, reaksi positif sangat kuat. 4 ID, Immuno-dot blot dari OMP; -, reaksi negalit + . reaksi positif
KESIMPULAN Hasil penelitian membuktikan bahwa S. pilosicoli yang dfsolasi dari beberapa host yang menderita diare dapat dideteksi secara spesifik dengan monoclonal antibodi M96. Deteksi kuman ini dengan M96 pada beberapa uji serologi konvensional Inemberikan hasil yang sama dengan uji PCR clan MEE .
Semnar Nasional Peternokan don Veteriner 1997
Keadaan ini membuktikan bahwa M96 adalah suatu reagen yang andal dan praktis untuk diagnosis. Selain itu, telah pula dihasilkan MoAb yang lain (Cl2), yaitu MoAb yang mampu mendeteksi semua genus Serpulina yang diuji, yang dapat digunakan selain untuk screening isolate dari bakteri lain juga dapat digunakan untuk menseleksi "DNA libraries" dalam usaha pembuatast vaksin rekayasa DNA. Kedua monoclonal antibodi yang telah diproduksi ini (M96 dan C12), adalah reagen yang sangat bermanfaat untuk penyidikan atau studi lebih lanjut terhadap Intestinal spirochaetes baik dari genus .Serpulina secara umum . maupun terhadap Serpulina pilosicoli secara khusus . UCAPAN TERIMA KASIH Penulis berterima kasih kepada Australian International Development Assitence Bureau Government (AIDAS) atas dana yang diberikan sehingga penelitian terselesaikan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak kepala BPPH VI untuk memberikan ijin meninggalkan kantor selama penelitian di Australia. DAFTAR PUSTAKA ATYEO, R.F ., TROTT, D.J . and HAIvTSON, D.J . 1996 . Use of polymerise chain reaction for the detection of swine dysentery and intestinal spirochaetosis from faecal sample . Proceedings of the 24th Congress of International Pig Veterinary Socciety, Bologna, Italy, p.291 . ANDREWS, J.J. and HOFFMAN, L.J . 1982 . A porcine colitis caused by a weakly betahemolytic treponema (Treponema innocens). p.395-402 . In Proceedings of Annual Convention of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Nashville, Tennessee, USA. DUHAIvfEL, G.E . 1996 . Porcine colonic spirochaetosis caused by Serpulina pilosicoli . PIGS-MISSET 12, May supplement : Enteric diseases p. 10- 12 . DUHA~,ML, G.E ., MUNIAPPA, M.R ., MATHIESON, J.L ., JOHNSON, J ., ToTH, R .O ., ELDER and DGSTER, A.R . 1995 . Certain canine weakly beta-hemolytic intestinal spirochaetes are phenotypically related to spirochetes associated with human and porcine intestinal spiroclletosis . .I . Clin . Microbiol. 33 : 2212-2215 .
FELISTROM, C., PETTERSON, B., JOHANSON, K.E ., LURDEHEIN, N. and GUNARSSON, A. 1996 . Prevalence of Serpulina species in relation to diarrhea and feed medication in pig-rearing herds in Sweden . AIn . J. Vet. Res. 57 : 807-81 .1 . GmARD, C., LEMARCHAND, T. and HIGGms, R. 1995 . Porcine colonic spiroclnetosis : a restropective study of eleven cases. Can. Vet. J. 36 : 291-294. HAMPSON, D.J . and TROTT, D.J . 1995 . Intestinal spirochaeta infection of pigs: an overview and an Australian perspective . in D.P . Hennessy and P.D . Cranwell (ed.), Manipulating Pig Production V Australasian Pig Science Association, Werribee, Victoria, Australia, p. 136-169. HARIAND, W.A . and LEE, F.D . 1967 . Intestinal spirochaetosis . Br . Med. J . 3: 718719 .
JACQUES, M., GIRARD, C ., HIGGINS, R. and GOYETTE, G. 1989 . Extensive colonization of the porcine colonic epithelium by a spirochete similar to Treponema innocens . J. Clin . Microbiol. 27 : 1139-114 1 .
LAMBERT, T., and GOURSOT, G. 1982 . Diarrhea aigue avec Inemocultures et coprocultures positive a Treponema. Med. et Malad. Inf. 12 : 276-278. LEE, B.J . and HAMPSON, D.J . 1995 . A monocional antibody reacting with the cell envelope of spirochaetes isolated from cases of intestinal spirochaetosis in pigs and humans FEMS Microbiol Lett . 136: 179184. 1000
Seminar Nas+onal Perernakan dan Neteriner 1997
LEE, F.D., KRASZWESKI, A., GORDON, J., HowlE, G.R ., MCSEVENEY, D. and HARta,ND, W.A . 1971 . Intestinal spirochaetosis . Gut 12 : 126-133.
LEE, J .L. and HAMPSON, D.J . 1994 . Genetic characterisation of intestinal spirohaetes and their association with disease. J. Med. Microbiol. 40 :365-371 . PARK, N.Y ., CHUNG, C .Y ., McLAREN, A.J ., ATYEO, R. and HAMPSON, D.J .X . 1995 . Polymerase chain reaction
for detection of human and porcine spirochaetosis recovered from cases of intestinal spirochaetosis .
FEMS Microbiol. Lett . 125: 225-230.
TAYIOR, D.J ., SImmoNS, J .R ., and LAIRD, H.M . 1980. Production of diarrhoea and dysentery in pigs by feeding pure cultures of spirochaete differing from
Treponema hyodysenteriae .
Vet. Rec. 106: 326-332.
TRAWEL, D.W ., JENSEN, N.S . and HOFFMAN, L.J . 1994 . Cecal spirochaetosis in commercial laying hens . Avian Diseases 38 : 885-898 .
TROTT, D.J ., MCLAREN, A.J . and HAn-u>sON, D.J . 1995 . Pathogcnecity of human and porcine intestinal spirochetes in day-old specific pathogen tree chicks : an animal model of intestinal spirochaetosis . Infect . Immun. 63 : 3705-3710. TROTT, J.D ., STANTON, T.B ., JENSEN, N.S., DuHAMEL, G.E ., JOHNSON, J.L . and HAMPSON, J.D .L. 1996 . .
Serpulina pilosicoli 206-215 .
sp . nov. : the agent of porcine intestinal spirochetosis' . Lit. J. System Bacteriol. 46 :
