Sejtbiológia – gyakorlati szempontból
Alapfogalmak, tematika
A sejttenyésztés jelentősége
Kutatás: az állati és humán sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások vizsgálata Rekombináns fehérjék előállítása Monoklonális ellenanyag termeltetése (hibridóma sejtekkel) Állati vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából Sérült szövetek rekonstrukciója, nem funkcionáló szövetek helyettesítése a saját szövetek tenyésztésével (pl. bőrszövet, porcszövet) Állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése, gyógyszerfejlesztés
Sejttípusok
Primer sejtek Eredeti szervből vagy szövetből származnak Normál, nem transzformált és nem immortalizált sejtek Genetikailag és funkcionálisan is jobban hasonlítanak az in vivo sejtekre, mint az immortalizált sejtvonalak Véges élettartamúak, nem tenyészthetők korlátlan ideig A fenntarthatóság korlátja: a kromoszómavégek (telomerek) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) mechanizmusok
Primer sejtek beszerzési forrásai
Saját izolálás Viszonylag olcsó A megfelelő donor beszerzése problémás lehet Etikai aspektusok Az izoláló protokol kidolgozása hosszadalmas lehet A minőség reprodukálhatósága nehézkes lehet
Kereskedelemben kapható sejtek beszerzése Megbízható minőség, minőségi bizonylattal Részletes donorinformáció Kidolgozott sejttenyésztési protokol Az adott sejttípushoz kifejleszett optimális médium
A Lonza cég primer sejt kínálata
A legnagyobb primer sejt választékkal rendelkező cég Több, mint 200 féle sejttípus rendelhető Biztonságos folyékony nitrogénben történő szállítás Garancia www.lonza.com www.biocenter.hu/cellist.pdf
Sejttípusok
Sejtvonal Genetikailag viszonylag homogén Korlátlan ideig fenntartható sejtkultúra Normál sejtek in vitro transzformációjával, vagy tumor sejtek felhasználásával nyerik Előnye: könnyen és viszonylag olcsón fenntartható Hátránya: biológiailag nem feltétlen releváns eredményeket kapunk
HeLa sejtek
Sejtvonalak beszerzési forrásai A laborban van évek óta Genetikailag már módosulhatott a sok passzálás során Mycoplasma kontamináció? Más labortól kaptuk Az eredete nem biztos, hogy ismert Mycoplasma kontamináció? Biztonságos beszerzési források, sejtbankok: European Human Cell Bank (Salisbury, UK) European Collection of Animal Cell Cultures (Salisbury, UK) American Type Culture Collection (USA) ATCC Tumor Bank, Deutsche Krebs Forschungszentrum, (Heidelberg, Germany) Collection of Cancer Cell Lines (Japan)
Kondicionálisan immortalizált sejtek
A primer sejtek és a sejtvonalak előnyei egy sejttípusban
Kondicionális immortalizáció: az onkogének expressziójának kikapcsolása bizonyos körülmények között
Lonza: az SV40 Large T antigen tsA58 hőmérséklet szenzitív variánsának (tsSV40T) és a humán telomeráz katalitikus alegységének együttes alkalmazása: 33°C-on: immortalizált fenotípus 37°C-on: primer sejt fenotípus
33°C-on: – immortalizált fenotípus 37°C-on: – primer sejt fenotípus
A sejtkultúrák fenntartása
Az in vitro sejttenyésztés módjai: Adherens módon, monolayer kultúra – a sejtek a tenyésztő edény aljára kitapadnak (mátrix fehérjék, Ca2+ ionok) Szuszpenzióban – csak bizonyos sejtek képesek erre, pl. CHO, BHK, VeRo, HeLa
A sejtkultúrák fenntartása - passzálás
A sejtek növekedése a telítési szakaszban leáll - passzálás Szuszpenzióban – a sejtek friss médiummal való higítása Letapadó sejtek – a konfluens kultúra elérésekor a sejteket először szuszpenzióba visszük (fizikai mód, proteázok, kelátképzők), majd ezután tesszük friss médiumba
A sejtkultúrák fenntartása - tápfolyadékok A tápfolyadék (médium) feladata, hogy a sejtek számára biztosítsa a növekedéshez szükséges tápanyagokat, növekedési faktorokat, a megfelelő fizikai és kémiai környezetet Sóoldat: anorgainikus ionok (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, foszfát, hidrogénkarbonát) Glükóz: energiaforrás Esszenciális aminosavak: ezeket az aminosavakat a gerincesekből származó sejtek nem tudják előállítani Vitaminok: pl. kolin, folsav, nikotinamid, inozitol, pantoténsav, piridoxin, riboflavin, tiamin, biotin, B12 Pufferrendszer: oldott CO2/bikarbonát, vagy 20 mM HEPES Fenolvörös: pH indikátor Szérum: 5-20% (pl. Fetal Bovine Serum, Human Serum) A sejtek proliferációjához elengedhetetlen komponenseket tartalmaz. Alternatíva: szérummentes médium Antibiotikumok: penicillin, streptomycin, gentamycin – bakteriális fertőzések ellen véd
A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények
Letapadó sejtekhez: sejttenyésztéshez alkalmas felület (bevonattal vagy anélkül)
Flaskák (normál, vagy szűrős kupakos) Petri csészék 6, 12, 24, 48, 96-lyukú platek Roller bottle
A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények
Speciális tenyésztőedény – UpCell Cells harvested by trypsinization 37°C
20-25°C
Cells harvested from UpCell Surface by temperature reduction
A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények
3D szövetmodell – UpCell segítségével
20-25°C
37°C
A sejtkultúrák fenntartása – tenyésztő edények
Szuszpenziós sejtekhez
.
Kíméletes kevertetés Spinner flask (műanyag vagy üveg) Reaktorok
A sejtkultúrák fenntartása – berendezések
Steril fülke Szűrt levegőt áramoltatnak a munkafelület fölött 0,3 mm-nél nagyobb részecskéket szűr ki UV (germicid) lámpa segít fenntartani a sterilitást
CO2 inkubátor Egyenletes 37°C hőmérséklet 5% CO2 koncentráció Megfelelő páratartalom biztostása Fontos a felületek jól tisztántarthatósága (élek, csavarok, stb. nélkül)
A sejtkultúrák fenntartása – berendezések
Centrifuga A sejtek kíméletes lecentrifugálásához Ha lehet, kilendülőfejes rotor 15, 50 ml-es Falcon cső rotor
Mikroszkóp Inverz mikroszkóp Fluoreszcens mikroszkóp Konfokális mikroszkóp
Miről lesz még szó?
Primer sejtek kezelése, passzálása -film Sejtek transzfektálása – módszertani áttekintés, truobleshooting Amaxa Nuclofector System Sejt viabilitás, citotoxicitás Luminométeres meghatározás Vialight, Toxilight kitekkel Mycoplasma és detektálása MycoAlert mérés (mintát lehet hozni)
