S2-Kimia Institut Pertanian Bogor BIOESAI MELIBATKAN ENZIM

2014/12/5

OH OH

HO

O OH

OH

S2-Kimia Institut Pertanian Bogor

BIOESAI MELIBATKAN ENZIM

Company

LOGO

Agenda

 Pendahuluan  Yang perlu diperhatian untuk esai dengan enzim  Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh

1

2014/12/5

Company

LOGO

Pendahuluan

 Enzim tertentu adalah molekul target untuk penemuan obat dan banyak obat ditemukan dengan melibatkan enzim target dalam penapisannya.  Biasanya esai ini memanfaatkan enzim yang dimurnikan sebagian atau murni dari manusia dan melibatkan pengukuran pembentukan produk menggunakan beberapa metode seperti radiometri, kolorimetri dan fluorometri

Company

LOGO

         

Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim

Sumber enzim Konsentrasi enzim yang digunakan Menentukan substrat dan konsentrasi esai akhir Perlunya kofaktor dan konsentrasi esai akhir Penentuan batas akhir analisis pH analisis Suhu analisis Profil inhibitor Kompatibiliti DMSO Kompatibiliti ekstrak

2

2014/12/5

Company

LOGO

Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim

 Sebelum mengembangkan metode esai enzim, perlu dipelajari mekanisme reaksi enzim yang mungkin.  Apakah reaksi enzim melibatkan satu jenis substrat atau multisubstrat, mekanisme katalisis, apa kofaktor yang diperlukan faktor yang meregulasi aktivitas enzim

Company

LOGO            

Yang perlu diperhatikan dalam pengembangan esai dengan enzim

Memilih sumber enzim Memilih konsentrasi enzim Memilih substrat dan konsentrasi substrat Memilih konsentrasi kofaktor Memilih pH analisis Memilih suhu analisis Kompatibilitas DMSO Kompatibilitas ekstrak Profil inhibitor Inhibisi kompetitif Inhibisi unkompetitif Inhibisi nonkompetitif

3

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih sumber enzim

 Sebaiknya yang berasal dari manusia untuk tujuan pengobatan  Sebagian besar enzim yang diisolasi dari spesies yang berbeda mungkin sangat homolog tapi mungkin tidak sama sifatnya dengan enzim manusia  Umumnya sulit mengisolasi enzim langsung dari manusia  Sel manusia atau cell lines secara praktis merupakan sumber enzim  Setelah sumber enzim ditentukan  murnikan enzim hingga jumlah yang cukup untuk penapisan  Pemurnian enzim memberikan bobot yang kecil karena kehilangan selama pemurnian atau rusak saat dimurnikan

Company

LOGO

Memilih sumber enzim

 Metode yang paling mudah untuk memproduksi enzim untuk esai penapisan ialah melakukan clone dan ekspresi enzim manusia pada sistem yang sesuai  Beberapa suplayer telah menyediakan enzim dengan beberapa tingkat kemurnian  Makin murni biasanya makin tinggi keaktifannya tapi biayanya lebih mahal

4

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih konsentrasi enzim

 Jumlah enzim yang digunakan dalam esai sebaiknya diminimalkan tetapi tetap harus memenuhi syarat S/N yang baik  Dicoba esai menggunakan enzim dengan beberapa konsentrasi lalu diputuskan berapa konsentrasi enzim terrendah yang baik digunakan untuk esai tsb  Stabilitas enzim sering berkurang karena penyimpanan  perlu dicek sebelum melakukan esai

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

A. esai enzim reversible dengan 1 substrat Substrat tipe ini biasanya tinggi afinitasnya untuk berinteraksi dengan enzim cukup dengan jumlah substrat yang sedikit dapat memberikan esai yang sensitif untuk identifikasi inhibitor yang berkompetisi dengan substrat pada sisi aktif Secara fisiologis substrat yang digunakan biasanya memiliki nilai Km yang kecil, tetapi beberapa esai menggunakan peptida sintesis atau turunan peptida. Km enzim untuk substrat tertentu ditentukan secara percobaan dengan menentukan hubungan konsentrasi substrat pada laju reaksi awal

5

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

A. esai enzim reversible dengan 1 substrat Pada konsentrasi rendah, laju reaksi awal setara dengan konsentrasi substrat dan reaksi mengikuti laju reaksi orde pertama terhadap substrat. Jika konsentrasi enzim meningkat laju reaksi tidak bergantung pada konsentrasi substrat atau laju mengikuti reaksi orde ke-nol. Berdasarkan persamaan MichaelisMenten untuk substrat tunggal:

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

A. esai enzim reversible dengan 1 substrat Secara umum, direkomendasikan bahwa nilai Km dari substrat dimasukkan dalam esai enzim dengan satu substrat. Di bawah nilai Km, S/N akan terlalu rendah Penggunaan enzim di atas nilai Km akan meningkatkan nilai S/N tetapi makin tidak sensitif dalam mendeteksi inhibitor kompetitif karena sangat banyak substratnya

6

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

B. esai enzim reversible dengan 2 substrat Penentuan Km untuk 2 substrat mirip dengan metode 1 substrat Konsentrasi B tetap pada tingkat jenuh dan konsentrasi A bervariasi untuk ditentukan efeknya pada laju reaksi dan nilai Km untuk A yang ditulis sebagai KmA Secara umum 3 konsentrasi B yang tetap digunakan Kebalikannya KmB ditentukan pada konsentrasi A jenuh yang tetap dan konsentrasi B bervariasi Reaksi enzim - 2 substrat umumnya berada pada 2 kelas umum yaitu single- dan double- displacement enzyme reaction

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

B. esai enzim reversible dengan 2 substrat Reaksi enzim single-displacement: kedua substrat A dan B akan berikatan dengan enzim untuk membentuk kompleks ternary. Substrat A dan B akan berasosiasi dengan enzim dalam keadaan acak atau beraturan Reaksi enzim double-displacement, satu substrat harus berikatan pada enzim dan satu produk dilepaskan sebelum substrat kedua berikatan dan berdisosiasi dari enzim

7

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih substrat dan konsentrasi substrat

B. esai enzim reversible dengan 2 substrat  Dalam reaksi 2 substrat dapat ditentukan esai digunakan untuk inhibitor substrat A atau B yang berinteraksi dengan enzim  Contoh: reaksi protein kinase 







Substrat: ATP dan peptida yang akan difosforilasi Biasanya digunakan inhibitor uantuk peptida fosfat dan bukan inhibitor untuk ATP Esai melibatkan jumlah ATP yang jenis dan nilai Km untuk peptida Akan dihasilkan esai yang sensitif untuk mendapatkan inhibitor kompetitif

Company

LOGO

Memilih konsentrasi kofaktor

 Banyak enzim memerlukan kofaktor untuk aktivitas maksimal  Setelah kofaktor ditentukan, perlu ditentukan konsentrasi kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas enzim yang optimal  Secara umum, konsentrasi jenuh harus digunakan dalam esai penapisan  Contoh esai enzim NO sintase harus mengandung jumlah kofaktor NADPH, tetrahidrobiofterin, kalsium dan kalmodulin dalam konsentrasi jenuh

8

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih titik akhir esai

 3 tipe esai yang umum digunakan: 





Radiometrik  sangat sensitif dan bisa untuk automatis, perlu substrat dan produk yang terlabel, tidak baik untuk volume yang besar karena biaya yang mahal dan limbahnya Kolorimetrik kurang sensitif tetapi banyak untuk high troughput screening. Perhatikan warna sampel yang mungkin muncul yang mengganggu nilai titik akhir Fluorometrik sangat sensitif dan digunakan HTS. Natural produk dapat mengganggu nilai titik akhir. Yang paling banyak digunakan karena S/Nnya memungkinkan dia untuk diminiaturisasi

Company

LOGO

Memilih pH esai

 Kebanyakan enzim memiliki nilai pH optimum untuk aktivitas maksimal  Hubungan aktivitas enzim dan pH untuk enzim merupakan fungsi lonceng  Perlu menentukan pH optimum dengan pengukuran sederhana pada nilai pH yang berbeda untuk konsentrasi substrat jenuhnya  Nilai Km juga bergantung pH yang digunakan

9

2014/12/5

Company

LOGO

Memilih suhu esai

 Suhu esai juga penting untuk ditentukan  Umumnya reaksi enzim meningkat dengan meningkatnya suhu (laju meningkat 2 kali tiap kenaikan 10oC)  Tetapi peningkatan suhu dapat mendenaturasi enzim atau terjadi proteolisis  pembatas suhu inkubasi  Untuk tujuan praktis esai biasanya dilakukan pada suhu ruang sehingga tidak memerlukan inkubator

Company

LOGO

Kompatibitas DMSO

 Ekstrak kering natural produk biasanya dilarutkan dalam DMSO sebelum digunakan untuk uji  Semakin tinggi konsentrasi DMSO dalam esai, semakin tinggi kemungkinan metabolit sekunder ada di dalam larutan  Perlu diperhatikan apakah esai enzim tolerance terhadap konsentrasi DMSO berbeda yang digunakan

10

2014/12/5

Company

LOGO

Kompatibitas Ekstrak

 Senyawa kimmia berbeda dalam ekstrak dari berbagai organisme memberikan tipe metabolit sekunder yang berbeda  Perlu dievaluasi dan ditentukan konsentrasi optimalnya termasuk dalam skrining  Secara umum yang digunakan antara 0.1% - 1%

Company

LOGO

Profil Inhibitor

 Perlu mengetahui tipe inhibitor  Nilai Ki dan mekanisme inhibisi dapat ditentukan dibandingkan dengan informasi dari literatur  Aktivator enzim juga merupakan info yang menarik untuk diketahui  3 tipe inhibitor enzim  cek dari Vmax dan nilai Km ditentukan Ki-nya   

Kompetitif Unkompetitif nonkompetitif

11

2014/12/5

Company

LOGO

Profil Inhibitor

 Inhibisi Kompetitif 





Inhibitor yang berkompetisi dengan substrat pada sisi aktif enzim Inhibisi kompetitif dapat berkurang dengan meningkatkan konsentrasi substrat Km meningkat, tidak mengubah Vmax

Company

LOGO

Profil Inhibitor

 Inhibisi Unkompetitif 



Inhibitor yang tidak berinteraksi dengan enzim bebas tetapi berinteraksi dengan kompleks enzimsubstrat sehingga menghambat pembentukan produk Km dan Vmax turun saat ada inhibitor

12

2014/12/5

Company

LOGO

Profil Inhibitor

 Inhibisi Nonkompetitif 







Inhibitor yang berinteraksi dengan enzim bebas atau dengan kompleks enzim-substrat Biasanya berikatan dengan enzim bukan pada sisi aktif dan mengubah konformasi enzim sehingga enzim tidak berfungsi sehingga tidak terbentuk kompleks substrat-enzim atau dekomposisi menghasilkan satu produk dengan laju tipikal Jarang ditemukan, kadang disebut mixed inhibition Km tetap dan Vmax turun saat ada inhibitor

Company

LOGO

Profil Inhibitor

 Dari poin pencarian obat, inhibitor nonkompetitif tidak terlalu diutamakan dibandingkan inhibitor kompetitif dan diperkirakan lebih nonselektif dan dapat menghambat berbagai enzim  Untuk enzim 2 substrat, pengaruh peningkatan konsentrasi inhibitor dievaluasi pengaruhnya dihubungkan dengan substrat A dan substrat B pada nilai Km dan Vmax ditentukan dari hubungan Lineweaver-Burk

13

2014/12/5

Company

LOGO

Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh

 Farnesiltransferase: 

 

 

enzim yang mengatalisis penambahan C15 farnesil isoprenoid ke substrat protein pada asam amino C terminal Ras: substrat fisiologis Beberapa kanker manusia resisten untuk obat antikanker konvensional seperti kanker kolon dan pankreas, kadar Ras protein yang termutasi ditemukan tinggi Inhibitor Ras farnesilasi merupakan agen antikanker Enzim yang mengandung Zn protein sitosolik heterodimer mengandung subunit  dan  yang memerlukan ion Zn dan Mg untuk aktivitas

Company

LOGO

Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh

 Farnesiltransferase: 

 

 

subunit  berikatan dengan farnesilpirofosfat dan dibagi ke enzim isoprenilasi yang berhubungan seperti geranilgeraniltransferase. Sub unit  berikatan dengan substrat. Perlu dicek tipe inhibitor apa yang ditentukan Inhibitor kompetitif ikatan farnesilpirofosfat tidak diharapkan karena akan juga menjadi inhibitor untuk geranilgeranil transferase  selektivitasnya berkurang dan menyebabkan efek kebalikan. Yang dicari inhibitor pada subunit  karena lebih selektif Perlu mencari sumber enzim farnesiltransferase yang cocok, otak tikus tidak cocok (50 otak tikus hanya untuk 100 assay plates)

14

2014/12/5

Company

LOGO

Pengembangan metode esai cepat enzim untuk penapisan bahan alam: Contoh

 Farnesiltransferase: 

Metode radiometrik

Company

LOGO

Tirosinase Feomelanogenesis

Eumelanogenesis

COOH

TYR

NH2

HO

O

O

tirosin

TYR

HO

COOH

HO

glutation atau sistein

NH 2 dopakuinon

COOH NH 2

HO S

COOH H2N NH2

HO

COOH

sisteinildopa

dopa

HO

HO

DHI

N H

O

HO

-CO2

COOH

-

O dopakrom

IQ

N H

HO DHICA

eumelanin

COOH NH 2

N

leukodopakrom

S

HBTA COOH

N H

N H

HO

HO

O

HO

COOH

TRP-2

TYR O

N H+

O COOH

TRP-1

f eomelanin

N H

O ICAQ

campuran melanin

15

2014/12/5

Company

LOGO

Metode L-tirosin

•Tirosinase mushroom •Sampel atau pelarut

L-DOPA (substrat) 30 min

5 min Kontrol positif: •Asam kojat

Company

LOGO

Absorbans pada 490 nm

IC50

Jerawat 



Acne is the most common skin disease characterized by pimples on the face, chest, and back. It occurs when the pores of the skin clogged with oil, dead skin cells, and bacteria (Propionibacterium acnes).

bacteria antibacterial lipase

bacteria grow

antioxidant

free fatty Inflammation acids Lipase inhibitor

triglycerides

ROS acne is formed 32

16

2014/12/5

Company

LOGO

Lipase inhibitory assay

•DTNB •PMSF BALB •Crude lipase (substrate) •Sample or solvent 30oC

30oC

5 min

30 min

DTNB: 5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) PMSF: phenylmethylsulphonyl fluoride BALB: dimercaptopropanol tributyrate

Stopping reagent Absorbance at 414 nm

Positive controls: •Tetracycline •Chloramphenicol •IPMP

IC50: concentration that can inhibit 50% lipase reaction 33

17