Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
ROLE MAKROFÁGŮ V OBRANNÉM SYSTÉMU MLÉČNÉ ŽLÁZY SKOTU Bakalářská práce
Vedoucí práce:
Vypracovala: Kristýna Hartmannová
prof. MVDr. Zbyšek Sládek, Ph.D.
Brno 2014
ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem práci: Role makrofágů v obranném systému mléčné žlázy skotu vypracoval/a samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom/a, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Brně dne:
……………………………………………….. podpis
PODĚKOVÁNÍ Děkuji panu prof. MVDr. Zbyšku Sládkovi, Ph.D. za jeho pevné nervy, cenné rady a připomínky při vedení mé bakalářské práce.
Abstrakt Tato práce pojednává o přirozené imunitě mléčné žlázy a to prostřednictvým makrofágů v ní působících. V práci je nejprve popsán proces, při kterém se makrofágy vyvíjejí z hemopoetické buňky přes krevní monocyt až po zralý makrofág a jejich aktivace. Ve stručnosti jsou popsány různé typy makrofágů a jejich cesta do tkání. Další část práce už pojednává o samotných makrofázích mléčné žlázy. Nejprve je popsaná jejich struktura, ultrastrukturu a smrt a dále je rozepsána jejich vlastní role v mléčné žláze. Mezi významné role makrofágů mléčné žlázy skotu patří fagocytóza, rezoluce zánětu a produkce cytokinů. Klíčová slova: mléčná žláza, makrofág, struktura, fagocytóza, eferocytóza
Abstract This bachelor's thesis discusses natural immunity of the mammary glands and the macrophages acting within. The dissertation first describes the process, which macrophages evolve from haematopoietic cell through blood monocyt to mature macrophage and their activation. Briefly describes different types of macrophages and their paths to tissues. Next part of the bachelor's thesis discusses macrophages of the mammary gland themselves. First is described their structure, ultrastructure and death, then their own role in the mammary gland. Important roles of the macrophages of the mammary gland of cattle are phagocytosis, resolution of inflammation and the production of cytokines. Keywords: bovine mammary gland, macrophage, structure, phagocytosis, efferocytosis
Obsah 1 Úvod ................................................................................................................................. 1 2 Literární přehled ............................................................................................................... 2 2.1 Vývoj makrofágů – monocytů ...................................................................................... 2 2.2 Krevní monocyty........................................................................................................... 2 2.3 Klasicky aktivované makrofágy .................................................................................... 3 2.4 Alternativně aktivované makrofágy .............................................................................. 4 2.5 Typy makrofágů ............................................................................................................ 5 2.5.1 Kupfferovy buňky ...................................................................................................... 6 2.5.2 Alveolární makrofágy ................................................................................................ 6 2.5.3 Histiocyty ................................................................................................................... 7 2.5.4 Osteoklasty ................................................................................................................. 8 2.5.5 Synoviální buňky A ................................................................................................... 8 2.5.6 Mikroglie.................................................................................................................... 9 2.5.7 Mezangiální buňky ..................................................................................................... 9 2.5.8 Makrofágy marginální zóny červené pulpy sleziny ................................................. 10 2.5.9 Peritoneální a pleurální makrofágy .......................................................................... 10 2.6 Makrofágy mléčné žlázy skotu ................................................................................... 11 2.6.1 Struktura makrofágů................................................................................................. 12 2.6.2 Ultrastruktura makrofágů ......................................................................................... 13 2.6.3 Nekróza a apoptóza makrofágů ................................................................................ 14 2.6.4 Role makrofágů mléčné žlázy .................................................................................. 15 2.6.4.1 Fagocytóza ............................................................................................................ 15 2.6.4.1.1.Chemotaxe ......................................................................................................... 15 2.6.4.1.2 Opsonizace a rozpoznání.................................................................................... 16 2.6.4.1.3 Pohlcení.............................................................................................................. 17 2.6.4.1.4 Trávení a zabíjení ............................................................................................... 18 2.6.4.2 Prezentace antigenu makrofágy ............................................................................ 18 2.6.4.3 Role makrofágů v rezoluci akutního zánětu mléčné žlázy .................................... 19 2.6.4.3.1 Definice akutního zánětu mléčné žlázy .............................................................. 19 2.6.4.3.3 Indukce apoptózy neutrofilů .............................................................................. 19 2.6.4.3.4 Přepnutí makrofágů z klasicky aktivované buňky na alternativně aktivovanou .. 20
2.6.4.3.5 Efferocytóza - pohlcení apoptotických neutrofilů makrofágy ........................... 20 2.7 Metody studia makrofágů mléčné žlázy skotu ............................................................ 21 3 Závěr .............................................................................................................................. 23 4 Literatura ........................................................................................................................ 24 5 Seznam obrázků ............................................................................................................. 30
1. ÚVOD
Mastitida, nebo-li zánět mléčné žlázy, je jedním velmi významným a ekonomicky velice závažným produkčním onemocněním nejen krav, ale i koz a ovcí. Je to nejrozšířenější a nejnákladnější onemocnění v chovu dojeného skotu. Jsou způsobeny infekcemi, které vznikly působením bakterií buď z nedostatečné hygieny dojení a to bakteriemi Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Mycoplasma bovis a Corynebacterium bovis a nebo bakteriemi z vnějšího prostředí Escherichia coli a Streptococcus uberis. Mastitida způsobuje značné ekonomické ztráty, protože snižuje produkci mléka a kvalitu mléka, zvyšuje brakování v chovech dojnic a jsou nutné náklady na léčiva a desinfekční prostředky. Mléčná žláza skotu je vybavena obrannými mechanismy, které mají za cíl zabránit průniku patogenů do mléčné žlázy a způsobit mastitidu. Jedním z významných obranných mechanismů jsou buňky nespecifického imunitního systému: neutrofilní granulocyty a makrofágy. Základní funkcí makrofágu je fagocytóza, při které dochází k pohlcení cizorodého materiálu a tím k jeho eliminaci. Dlouhou dobu se předpokládalo, že makrofágy hrají roli v mléčné žláze skotu právě ve spojitosti s fagocytózou. A to jak fagocytózou mikrobiálních patogenů, tak s fagocytózou tukových globulí a kaseinových micel. Dnes je zřejmé, že tyto buňky zastávají významné funkce nejen v souvislosti s fagocytózou. Jedná se zejména o regulační roli v souvislosti s akutní zánětlivou reakcí mléčné žlázy. Iniciace tohoto procesu, jeho průběh a rezoluce jsou přímo ovlivňovány makrofágy. To je velmi významné, neboť perspektiva akutního zánětu mléčné žlázy závisí na procesech vedoucích k jeho ukončení a tím zabránění přechodu do chronického stavu - tedy vedoucí k prodlužování onemocnění mléčné žlázy. Tato práce pojednává o makrofázích mléčné žlázy skotu. Zejména o jejich vývoji, struktuře a hlavně funkci, kterou zaujímají v obranných reakcích mléčné žlázy.
1
2. LITERÁRNÍ PŘEHLED
Většina buněk, které se účastní nespecifických imunitních mechanismů zajišťujících obranu mléčné žlázy skotu, patří do myeloidní vývojové řady. Z myeloidního prekurzoru vznikají monocyty, které cirkulují v krvi a ve tkáních se diferencují na makrofágy. Monocyty/makrofágy tak patří do imunitního systému organismu. Přičemž platí, že makrofágy společně s neutrofilními granulocyty představují první buněčnou bariéru mléčné žlázy skotu v boji proti patogenům (Paape et al., 2003).
2.1 Vývoj makrofágů - monocytů Makrofágy se vyvíjí z kmenové hemopoetické buňky kostní dřeně přes CFU-GEMM (prekurzor nelymfatických buněk), CFU-GM ( společný prekurzor makrofágů a granulocytů) a CFU-M pod vlivem cytokinů IL-3, GM-CSF a M-CSF. Dále proliferují a diferencují se v monoblasty a promonocyty (Toman et al., 2009) Předurčená předchůdcovská buňka kostní dřeně CFU-GM se během přibližně 6 dnů pod vlivem lokálně tvořených specifických stimulačních faktorů (CSF, colony stimulating factor) diferencuje na monoblast. Ten přechází v promonocyt, který je po určité době vyplaven do krevního oběhu jako monocyt. Do různých tkání migrují monocyty zřejmě náhodně, tedy bez nutného vlivu lokálního zánětu. Tkáňové makrofágy jsou buď bývalé monocyty imigrované z krve, nebo vznikají lokální proliferací předchůdcovských buněk. Makrofágy se od monocytů liší enzymatickými aktivitami, fagocytární kapacitou a povrchovými znaky. Plazmatická membrána makrofágu nese více FcR a receptorů pro komplement než plazmatická membrána monocytu. Během diferenciace monocytu v makrofág se azurofilní cytoplazmatická granula obsahující myeloperoxidázu ztrácejí a převládnou lysozomy obsahující hydrolytické enzymy (Broide, 1987).
2.2 Krevní monocyty Do krevního oběhu vstupují budoucí makrofágy jako monocyty, velké neproliferující buňky s ledvinovitým jádrem. Krevní monocyty jsou tvořeny vícero populacemi buněk, které se liší intenzitou exprese některých povrchových molekul (např. CD16, CD43, CD163, Ly6C, receptory pro chemokiny). V krvi postupem času maturují, zvyšují nebo snižují intenzitu exprese povrchových molekul a mění se na „rezidentní“ monocyty. Tyto monocyty postupně vycestovávají do různých tkání a zde se vlivem lokálního tkáňového mikroprostředí mění na tkáňově „rezidentní“ makrofágy (a možná také dendrické buňky) (Toman et al., 2009).
2
Obr. 1 Krevní nátěr - Krevní monocyt (Mo). Panoptické barvení, zvětšení 1000x. (Physiology of Leukocytes, 2014)
Monocyty jsou schopny vycestovat do tkáně, ve které probíhá zánět, a diferencovat se zde v „zánětlivé“ makrofágy. Během zrání monocytů v makrofágy se zvětšuje počet lysozomů, receptorů pro Fc fragment IgG a receptorů pro C3 složku komplementu a zvyšuje se schopnost fagocytózy a opsonizace. Makrofágy migrují do ohnisek zánětu po 6-12 hodinách, vydrží tam déle než granulocyty a řídí jeho průběh. Jsou aktivovány především bakteriálním lipopolysacharidem (LPS) a interferonem-γ (IFN-γ). Proto se v organizmu makrofágy nacházejí v různých aktivačních stádiích označovaných jako normální (klidové) a jako zánětlivé (aktivované). Klidové makrofágy se usazují v pojivové tkáni (histiocyty), játrech (Kupfferovy buňky), plicích (alveolární makrofágy), lymfatických uzlinách, slezině, kostní dřeni, serózních kapalinách (pleurální a peritoneální makrofágy), kostech (osteoklasty), centrálním nervovém systému, kůži (histiocyty, Langerhansovy buňky) a jiných orgánech (Ferenčík, 1989). Aktivované makrofágy se diferencují z makrofágů klidových a vyskytují se v různých zánětlivých místech, kde zastávají významné efektorové i regulační funkce. Aktivované makrofágy nejsou homogenní skupinou buněk, byly charakterizovány jednak klasicky aktivované makrofágy a alternativně aktivované makrofágy (Stein et al., 1992).
2.3 Klasicky aktivované makrofágy Diferenciace klasicky aktivovaných makrofágů vyžaduje spouštěcí signál ve formě IFNgamma pomocí IFN – gama Receptoru. Klasicky aktivovaným se makrofág stane v případě, že makrofág "narazí" na odpovídající stimul, jako jsou bakteriální lipopolysacharid (LPS). Nejprve je LPS vázán na rozpustný lipopolysacharid - vázající protein (LBP - lipopolysaccharide3
binding protein) a poté je buď rozpuštěný a nebo v membráně vázaný na receptor CD14. CD14 poskytuje LPS rozpoznávací komplex pro LPS, který se skládá z Toll-like rceptoru (TLR-4) a MD – 2. Pomocí těchto nástrojů jsou tyto komponenty patogenů rozpoznávány a pak jsou patogeny následně fagocytovány. Klasicky aktivovaný makrofág uvolňuje proteolytické enzymy, jako jsou MMP – 1, 2, 7, 9 a 12, které degradují kolagen, elastin, fibronektin a další komponenty extracelulární matrix (ECM). Uvolnění těchto molekul je důležité pro obranu hostitele. Podle intenzity vyvolané infiltrace leukocytů je tkáň "nasycena" mediátory zánětu, pro – apoptotickými faktory a faktory degradujícími matrix protézami. Klasicky aktivované makrofágy jsou tak schopny histotoxicky poškodit tkáň a do určité míry tak způsobit vážná zranění. Například poškození tkáně chronickým zánětem bylo spojeno s vývojem nádorů, autoimunitních onemocnění typu 1, a glomerulonefritidy u jiných patologických stavů. Některé antigeny jsou zpracovány a spojovány s molekulami MHC třídy II a tyto MHC II komplexy jsou pak prezentovány T-buňkám, proto lze tento typ makrofágu označit jako antigen prezentující buňku (APC) (Hořejší a Bartůňková, 2013). Klasicky aktivované makrofágy uvolňují významné chemokininy: IL – 8/CXCL8, IP – 10/CXC10, MIP – 1 alfa/CCL3, MIP – 1 beta/CCL4 a RANTES/CCL5. Prozánětlivé cytokiny, jako jsou IL – beta/IL – 1F2, IL – 6 a TNF – alfa. Konečně k proapoptotické aktivitě makrofágu přispívá uvolňovaný TNF – alfa (Pollard, 2009; Akira et al., 2013).
2.4 Alternativně aktivované makrofágy Alternativně aktivované makrofágy se vyznačují protizánětlivou činností, regulací fibrotické proliferace a pro- angiogenetickou aktivitou. Jejich protizánětlivá činnost spočívá v iniciaci rezoluce zánětu. Na rozdíl od klasicky aktivovaných makrofágů jsou tyto buňky zodpovědné za tvorbu a vylučování proti-zánětlivých cytokinů: IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β (Hořejší a Bartůňková, 2013). Například IL - 10 blokuje zánětlivou odpověď v klasicky aktivovaných makrofázích (M1), stimuluje přeměnu M1 makrofágů na alternativně aktivované makrofágy (M2) a zvyšuje eferocytózu. IL - 4 indukuje transkripční faktor PPARy, který potlačuje zánět. Kromě toho, lipidové ligandy aktivátory (PPARy) jsou syntetizovány působením 12,15 - lipoxygenázy, což také vede k syntéze lipidů, včetně lipoxinu, resolvinu a protectinu. Tyto lipidové mediátory potlačují zánětlivou produkci cytokinů a stimulují eferocytózu (fagocytózu apoptotických buněk). Aktivace jiné skupiny transkripčních faktorů, jaterních X receptorů (LXR), spojují dvě klíčové vlastnosti při rozlišení zánětu. První je potlačení zánětlivých cytokinů a druhá je zvýšení eferocytózy. Úspěšná eferocytóza vede k produkci transformujícího růstového faktoru - β (TGFβ), který stimuluje tvorbu jizev při hojení ran. TGF - β nepřímo podporuje funkci ECM tím, že "přiměje" fibroblasty ve vazivu k produkci ECM komponentů - vláknité a amorfní hmoty. Fibroblasty vytváření komponenty 4
ECM a dále vylučují fibronektin a tzv. matrix-associated protein (βIG-H3), ECM a enzym trans - glutaminázu a osteopontin, který se podílí na buněčné adhezi na ECM a na rekonstrukci poškozené ECM - fibrogenezi. Vedle toho alternativně aktivované makrofágy mají zvýšenou sekreci enzymu Arginázy I, který se podílí na biosyntéze polyaminů, prolinu, čímž podporuje konstrukci ECM. Polyaminy jsou zapojeny zejména do proliferace. Další faktory, vylučované alternativně aktivovanými makrofágy, které podporují buněčnou proliferaci jsou PDGF , IGF. Tyto faktory , spolu se základním FGF, TGF - alfa VEGF, se také podílí na angiogenezi. Angiogeneze (syn. neokapilarizace) je proces novotvorby krevních kapilár. Jde o fyziologickou vlastnost všech vyšších organismů, při které se remodeluje či nově vytváří síť krevních kapilár v poškozeném či změněném ložisku tkáně (Akira et al., 2013). Angiogeneze je nezbytnou součástí při procesech hojení ran a veškeré traumatizované, či nekrózou postižené tkáně (např. srdeční infarkt), při zánětlivých procesech a také při vzniku a vývoji nádorů (Wikipedia).
Obr. 2 Schéma aktivace makrofágů (Tabas, 2010).
2.5 Typy makrofágů Makrofágy putují migrací z krve de facto kdekoliv. Na rozdíl od polymorfonukleárních leukocytů - neutrofilních granulocytů žijí makrofágy déle, mohou se diferencovat in situ, odpovídají poměrně pomalu na vnější stimuly a jsou převládajícím druhem buněk v ložiscích zánětu po uplynutí prvních 8 až 12 hodin. Zúčastňují se ničení bakterií a virů žijících uvnitř buňky. Makrofágy se dále liší škálou enzymů svých cytoplazmatických granulí, v recyklaci, 5
obnově membrán fagolysozomů, v sekreci nelysozomálních proteinů a ve větší šíři antimikrobiálního spektra (Pollard, 2013).
Výše bylo uvedeno, že se makrofágy nacházejí prakticky ve všech tkáních organizmu, kde zastávají významné funkce v souvislosti s imunitním systémem. Níže tedy následuje stručná charakteristika významných typů makrofágů organizmu.
2.5.1 Kupfferovy buňky Kupfferovy buňky se nacházejí v jaterních sinusoidách. Hrají významnou úlohu v imunitní reakci organismu. Přicházejí do styku s portální krví, která kromě vstřebaných živin ze střeva obsahuje také řadu škodlivých látek (mikroorganismy, endotoxin, atd.). Úlohou Kupfferových buněk je fagocytovat tyto látky a zabránit tak tomu, aby se dostaly do systémové cirkulace. Fagocytují také imunokomplexy, staré erytrocyty či zbytky rozpadlých buněk. Kromě fagocytární funkce produkují také signální molekuly sloužící k intercelulární komunikaci. Cytotoxické působení Kupfferových buněk je zajištěno produkcí superoxidu a látek s protinádorovým působením (Lata, 2005).
Obr. 3 Kupfferovy buňky v játrech (označené jako von Kupffer cells) (Dartmouth, 2014).
2.5.2 Alveolární makrofágy Alveolární makrofágy (AM) jsou zástupci mononukleárního fagocytického systému v plicích. Za normálních podmínek tvoří více než 90 % buněk uvnitř alveolárních prostor a jsou lokalizovány na rozhraní vzduchu a tkáně, takže jsou regulérně exponovány inhalovanými antigeny. Kromě rozhodující úlohy v obraně proti nim mají regulační funkci v plicním imunitním systému, fagocytují odumřelé buňky a hrají roli v reparaci a remodelaci plicní tkáně. Většinou se rekrutují z cirkulujících monocytů (menšina se replikuje plicích) a diferencují se ve 6
zralé AM pod vlivem metabolitů vitamínu D, čímž se mění v dlouho žijící fagocyty přežívající měsíce až roky. Za normálních okolností jsou to mobilní čističi, kteří jsou přitahováni do infikovaných nebo zanícených ložisek chemokiny, endotoxinem, imunokomplexy, fragmenty kolagenu a produkty komplementu. Zde fagocytují cizí antigeny, bakterie, houby a viry, jsou schopny inaktivovat živé virulentní opouzdřené a gram-negativní mikroorganismy. Tyto procesy mohou probíhat, aniž by nutně muselo dojít k rozvoji zánětlivé odpovědi, která by mohla vést k poškození alveolokapilární membrány (Anton a Vašáková, 2007) .
Obr. 4. Alveolární makrofágy (šipky) v plicích (Caceci, 2014).
2.5.3 Histiocyty Histiocyty, tzv. makrofágy vaziva, mají vřetenovitý nebo hvězdovitý tvar a jsou schopny tvořit panožky. Mají fagocytární funkci a pohlcují zejména různé cizorodé struktury (např. bakterie) a předávají je T-lymfocytům ke "kontrole". Dále jsou schopné vylučovat různé kolagenázy a tím trávit mezibuněčnou hmotu. Lysozomy mají poměrně vysoký obsah fosfatázy a hydrolázy (Shimizu, 2007).
7
2.5.4 Osteoklasty Osteoklast je velká kostní buňka, která má různě tvarovaný povrch a bohaté buněčné organely, jako je endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát a lysozomy. Je to buňka schopná pohybu. Bývá mnohojaderná, obsahuje až 50 jader. Výzkumy ukazují, že se vyvíjí z monocytů, konkrétně zřejmě fúzí několika těchto buněk. Hlavní funkcí osteoklastů je odbourávat kostní tkáň. Mají opačnou funkci než osteoblasty, protože rozrušují kostní matrix. Vylučují různé kolagenázy, enzymy a dále produkují vodíkové kationty, čímž rozpouští vápenaté krystaly. Roli hrají i různé cytokiny a hormony, jako je parathormon a kalcitonin, které regulují aktivitu osteoklastů. (Jelínek et al., 2014)
Obr. 5. Mnohojaderný osteoklast (wikipedia, 2014) .
2.5.5 Synoviální buňky A Synoviální buňky mají ovoidní tvar s početnými mikroklky na povrchu, které mají roli při transportu látek mezi kloubní dutinou a okolní tkání. Mezi synoviálními buňkami jsou četné mezery, kterými "prosvítají" hlouběji uložené buňky a kolagenní vlákna hlubších (povrchnějších) vrstev kloubního pouzdra. Synoviální buňky spolu s vrstvou kolagenních vláken tvoří synoviální membránu na nitrokloubním povrchu. Podle stavby a funkčních projevů se rozlišují dva hlavní typy synoviálních buněk a to typ A a B, ale pouze typ A má imunitní funkci. Synoviální buňky A - typu mají výraznou fagocytární aktivitu, a plní funkci obraného systému kloubu. Fagocytující synoviální buňky jsou schopné reagovat s antigenem (HLA-DRA) jednoho typu bílých krvinek. Na bílé krvinky mají výrazně stimulující vliv, který se výrazně zvyšuje při revmatickém onemocnění kloubu. Právě u artitídy kolenního kloubu byla poprvé popsána apoptóza neutrofilních granulocytů a jejich efferocytóza (Savill et al., 1989).
8
Obr. 6. Osteoartitída - synoviální makrofágy (Synovial cytology, 2014).
2.5.7 Mikroglie Mikroglie mají protáhlý tvar a nepravidelné výběžky. I jejich jádro má protáhlý tvar. Mikroglie je částí buněčných struktur v mozku. Představuje s mozkovými buňkami komplex vzájemně se chránících a spolupracujících struktur. Tvoří krevní mozkovou bariéru, což je ochranný val zabraňující pronikání škodlivin do centra mozku. Buňky glie se chovají jako imunitní buňky-makrofágy s prokazatelnou ochrannou imunitní funkcí (Dluholucký, 2011).
Obr. 7. Mikroglie v mozku (Osel, 2014).
2.5.7 Mezangiální buňky Mesangiální buňky jsou buňky myoepiteliálního charakteru, které mají nebo za určitých okolností mohou získávat schopnost kontraktility, stejně jako svalové buňky. Cytoplasmatické výběžky mesangiálních buněk pronikají mezi endotelem až do lumen kapilár a komunikují zde s protékající krví. V ledvinách, nesouvislou vrstvou endotelu, která odděluje lumen kapiláry od mesangia, proudí trvale složky plasmy mezi mesangiálními buňkami ke glomerulárnímu hilu a mohou tak ovlivňovat jejich sekreční, produktivní a fagocytární aktivitu. Na povrchu
9
mesangiálních buněk jsou receptory pro angiotensin II. Bazální membrána a mesangiální buňky spolu tvoří biomechanickou jednotku, která mění filtrační plochu a ultrafiltrační vlastnosti bazální membrány. Kontrakce vyvolané mezangiálními buňkami regulují průtok krve kapilárami (Engliš, 2014).
2.5.8 Makrofágy marginální zóny červené pulpy sleziny Meranginální zóna obsahuje krevní sinusy a lymfatickou tkáň. Lymfocyty jsou v této zóně méně početné, převažují makrofágy a dendritické buňky. Červená pulpa je tvořena provazci retikulární tkáně, které jsou uloženy v okolí sinusů. Tyto tzv. provazce Billrothovy jsou tvořeny retikulárním vazivem a volnými buňkami. Z volných buněk jsou zastoupeny makrofágy, lymfocyty, granulocyty, ale především velké množství erytrocytů, které podmiňují charakteristické zbarvení této složky sleziny. Kromě běžných erytrocytů se zde nacházejí rovněž různě poškozené a funkčně méněcenné červené krvinky, které jsou fagocytovány, odbourávány a odstraňovány z krve. V četných fagocytech lze nalézt buď jejich zbytky nebo granula hemosiderinu (Hořejší a Bartůňková, 2013).
2.5.9 Peritoneální a pleurální makrofágy Tyto buňky se nacházejí v břišní dutině a představují významný nástroj v boji proti cizorodým strukturám. Jejich funkcí je fagocytóza, řízení zánětlivých procesů a rovněž rezoluce akutní zánětlivé odpovědi (peritonitis) (Yamamoto et al., 1993). Peritoneální makrofágy zvyšují biologickou dostupnost erytropoetinu a jsou hlavním lokálním zdrojem cytokinů (Schück, 2006) Pleurální makrofágy představují dominantní buněčnou populaci v pleurální dutině zvířat. Vykazují podobnou funkci během zánětlivé odpovědi jako peritoneálních makrofágy a měly by být považovány za významného činitele v místní zánětlivé odpovědi v oblasti hrudníku (pleuritis).
10
Obr.8. Plurální makrofágy koně (Warner, 1999).
2.6 Makrofágy mléčné žlázy skotu Vedle výše uvedených populací makrofágů představují makrofágy rovněž významnou složku obranného systému mléčné žlázy skotu. Zde jsou charakteristickou složkou mléka, kolostra či sekretu involující mléčné žlázy. Tvoří buněčnou populaci, která se v mléce označuje jako somatické buňky, termín zavedený Paape et al. v roce 1963. Jejich početní zastoupení a diferenciální podíl se mění v souvislosti s funkčním obdobím mléčné žlázy (viz. tab. 1 - dle Sládek a Ryšánek, 1998).
Tab.1
Absolutní a diferenciální počet somatických buněk ve funkčních obdobích mléčné žlázy
Období
Laktace Kolostrální Aktivní involuce
Absolutní počet
Makrofágy
Neutrofily
Lymfocyty
[. 103 . ml-1]
[% ]
[% ]
[%]
200
60
12
28
1000/280
50 /37
25/37
25/26
1800
43
19
38
11
Makrofágy byly v mléčné žláze skotu popsány již Donné (1838) jako charakteristická buněčná složka mléka. Jedná se o poměrně strukturálně heterogenní skupinu buněk, přičemž strukturální vlastnosti úzce souvisí s výkonem jejich funkce (Sládek a Ryšánek, 1998).
2.6.1 Struktura makrofágů Makrofágy představují největší buňky v mléčné žláze skotu. Dosahují velikosti 30 - 40 µm (Lee et al., 1969), 10 - 45µm (Mayer a Klein, 1961; Jensen a Eberhart, 1975) 15 - 35µm (McDonald a Anderson, 1981) či 35 µm (Desiderio a Campbell, 1980). Chromatin v jádře makrofágu má krajkovitou, nebo šňůrovitou strukturu a je často jemně dispergovaný. Struktura nevakuolizovaného typu odpovídá krevním monocytům. Kulovité nebo oválné jádro je naplněno tmavě modrofialovým homogenním chromatinem. Cytoplazma je světle fialová nebo modro fialová a má větší objem než jádro. Vakuolizované makrofágy představují různé stupně degenerace projevující se především v jádru a cytoplazmě. Jádro je relativně velké, oválné, ledvinovitého tvaru, excentrické a protáhlé, nebo je hluboce sevřeno a často vyplňuje celou cytoplasmu. Chromatin v jádře makrofágu má krajkovitou, nebo šňůrovitou strukturu a je často jemně dispergovaný. Více či méně vakuolizovaná (pěnivá) cytoplasma obsahující malá bílo šedavá granula, je typická pro tento typ makrofágů. Velikost buňky se pohybuje v rozpětí od 18 do 38 mikrometrů. U některých buněk zaujímá cytoplasma větší než jádro a u jiných zase méně prostoru než jádro. V cytoplazmě se nacházejí intracelulární vakuoly v kruhovém obrazci kolem jádra nebo i na buněčné periferii (Sládek a Ryšánek, 1999) .
Obr. 9. Nevakuolizované makrofágy mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999).
12
Obr. 10. Vakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999).
2.6.2 Ultrastruktura makrofágů Byly zaznamenány dva typy makrofágů dle obsahu lipidových inkluzí: Makrofágy bez lipidových inkluzí: jádro je nepravidelně stočené s chromatinem, který je rozmístěn difúzně. V základní cytoplazmě jsou mitochondrie, středně velký Golgiho aparát s malými, hustými a oválnými vezikulami a také cisterny granulárního endoplazmatického retikula. Velikost tohoto typu buněk je kolem 8 až 18 mikrometrů. Tento typ makrofágů je u krav v období zprahlosti dominantní. Makrofágy s lipidovými inkluzemi: představují dva typy. První obsahuje v cytoplazmě globule mléčného tuku s charakteristickým složením membrány, která je obklopena kontinuální membránovou jednotkou fagocytární vakuoly. U druhého typu, který je větší, jsou lipidové kapičky bez membrány, obdobně jako tuk tukových depot (Lee et al., 1980; Lintner a Eberhart, 1990a,b; Sládek a Ryšánek, 1999).
Obr. 11. Nevakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999). 13
Obr. 12. Vakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999).
2.6.3 Nekróza a apoptóza makrofágů V literatuře existují práce, které popisují rovněž strukturálně změněné makrofágy při studiu vlivu antibiotik (ATB) na fagocyty mléčné žlázy skotu (Lintner a Eberehart, 1990) či projevy nekrózy a apoptózy těchto buněk (Sládek a Ryšánek, 1999; Sládek a Ryšánek, 2010). V případě účinku ATB byly zaznamenány makrofágy s typickým kulatým jádrem obsahující elektronově prozařující chromatin v transmisním elektronovém mikroskopu. Lze u těchto buněk zaznamenat přítomnost až několika cytoplazmatických vakuol, z nichž některé mají vzhled prázdných objektů. Dochází k úplné ztrátě pseudopodií. Proces degenerace pokračuje karyolýzou a končí totální lýzou těchto buněk (Lintner a Eberhart, 1990). Podobné změny zaznamenali Sládek a Ryšánek (1999) u makrofágů mléčné žlázy jalovic. Navíc popsali proces apoptózy (programované buněčné smrti). Apoptotické makrofágy jsou charakteristické karyopyknotickým jádrem se zahuštěným chromatinem, cytoplazmatickou vakuolizací a absencí pseudopodií (Sládek a Ryšánek, 2010). Jako spouštěč apoptózy makrofágů je znám oxid dusnatý. Apoptóza makrofágů byla také pozorována u patologických procesů a indukce apoptózy makrofágů s následnou sekundární nekrózou je způsobena bakteriálním exotoxinem s histotoxickým účinkem. Dále bylo zjištěno, že makrofágy také mohou podstoupit apoptózu lokálně. Apoptóza byla pozorována v alveolárních, peritoneální a pleurální makrofágů v reakci na patogenní a nepatogenní podněty a řada mechanismů, jsou považovány za tento proces hnací (Akira et al., 2013).
14
2.6.4 Role makrofágů mléčné žlázy Je to velmi překvapivé, ale v literatuře neexistuje mnoho prací, které pojednávají o roli makrofágů v obranném systému mléčné žlázy skotu. Drtivá většina prací je věnována zejména polymorfonukleárním leukocytům. Role makrofágů, jako složky obranného systému mléčné žlázy, lze vidět ve třech oblastech: fagocytóza, prezentování antigenu a řízení zánětlivé reakce a její rezoluce.
2.6.4.1 Fagocytóza Vědec Pasteurova ústavu v Paříži Ilja Mečnikov (1845 až 1916) pozoroval na počátku osmdesátých let devatenáctého století v italské Messině mořské živočichy. V jejich tělech našel pohyblivé buňky, které měly schopnost pohlcovat cizorodé částice a mikroorganismy. Pojmenoval je fagocyty, což jsou vlastně "žravé" buňky a popsal, jak je materiál, který byl pohlcen, uzavírán do vakuol. Zde byl tráven pomocí enzymů, jež nazval cytázy. Později našel fagocyty i mezi lidskými bílými krvinkami, a nazval je makrofágy a mikrofágy. Mikrofágy byly později přejmenovány na neutrofily, zatím co makrofágy nesou svůj název dodnes. V Messině tak byla objevena fagocytární teorie. Jak později Mečnikov zaznamenal: „ V malé zahrádce našeho domu jsem ulomil několik trnů růže a vpravil je pod kůži několika nádherných larev mořských hvězdic průhledných jako voda. Trny velmi brzy obklopily pohyblivé buňky. Rázem mne napadlo, že podobné buňky ochraňují organismus před škodlivými vetřelci. Můj jednoduchý pokus se stal základem fagocytární teorie, jíž jsem zasvětil příštích dvacet pět let života“ (Lokaj a John, 2008). Fagocytóza je komplexní proces, při kterém se fagocyty (neutrofily, makrofágy) přesunou do tkáně (chemotaxe), rozpoznají cizí materiál, pohltí ho a zlikvidují. Je to vlastně hlavní mechanismus hostitele pro odstranění cizího materiálu.
2.6.4.1.1 Chemotaxe Všechny leukocyty jsou mobilní. Buněčná migrace je řízena podle koncentračního gradientu
a
chemoatraktantu.
Migrace
je
vždy
směřována
k nejvyšší
koncentraci.
Chemoatraktanty se váží na receptory na membráně makrofágů, vyvolají změny ve cytoskeletu makrofágů
a
následuje
přímý
pohyb
makrofágů
podél
koncentračního
gradientu
chemoatraktantu do žlázy. Vstup je usnadněn propustností kapilár. Chemotaxe je tak primárně zodpovědná za uvedení makrofágů do styku s bakteriemi. Mezi nejdůležitější chemoatraktans pro neutrofilní granulocyty patří například: komplementové komponenty (C5a, C3a a C567), bakteriální produkty (endotoxiny), enzymy kininového systému, produkty rozpadu kolagenu a fibrinu a sekreční produkty leukocytů (PAF – krevní destičky aktivační faktor) (Bartůňková et al., 2005).
15
2.6.4.1.2 Opsonizace a rozpoznání Opsonizace představuje takzvané povlečení cizího materiálu substancemi, zvyšujícími intenzitu fagocytózy. Tyto substance se nazývají opsoniny a mezi nejdůležitější z nich patří (Paape et al., 1991): - komplement komponentu C3 - imunoglobuliny - nespecifické polypeptidy (lysozym, fibronektin) Opsonizace částic náleží do oblasti specifické odolnosti a je zprostředkovaná specifickými protilátkami IgG1 a IgG2 nebo aktivací komplementového systému. K přilnutí na nespecifická místa cytoplazmatické membrány dochází při nespecifické odolnosti. Na povrchu cytoplasmatické membrány makrofágů jsou umístěny Fc receptory pro IgG a IgM a rovněž receptory pro komplement (jeho aktivované fragmenty C3 a C5) (GREWAL et al., 1978; HOWARD et al., 1980). Bakterie, která je opsonizovaná některou imunoglobulinovou molekulou, nebo některým komponentem komplementu, má receptory, které jsou umístěné na povrchu buněk a dochází k adherenci (Concha, 1986). Antifagocytární obal některých patogenních bakterií znemožňuje jejich fagocytózu, tudíž bez opsonizace je proces fagocytózy nemožný (Tagorowsky, 1982).
Jestliže fagocyty specificky rozpoznají látku jako cizí, může být pohlcování usnadněno. Rozpoznávání je uskutečněno opsonizací. V procesu opsonizace jde o navázání imunoglobulinu na antigen, nebo cizí těleso. Druhý konec imunoglobulinu se pak může vázat na specifické receptory Fc na povrchu fagocytů. Makrofágy mají dva specifické receptory. Receptor CD14 váže a odstraňuje toxický bakteriální LPS navázaný na sérový protein vázající LPS, tzv. LBP. Je významný při specifických infekcích patogenními enterobakteriemi. "Setkání" CD14 s bakteriemi vede k produkci interleukinu IL-12 a prozánětlivých cytokinů TNF-α, interleukinů IL1 a IL6 (Toman et al., 2009). CD14 je hlavní receptor pro LPS a je exprimován převážně na povrchu bovinních monocytů a makrofágů. (Sládek a Ryšánek, 2002). Imunitní odpověď na infekci mléčné žlázy se vyznačuje zvýšením celkových počtů zejména CD14 + neutrofilů a CD14 + makrofágů. Rovněž samotná rezoluce akutní zánětlivé odpovědi mléčné žlázy je doprovázena zvýšením relativního počtu CD14 + neutrofilů , CD14 + vakuolizovaných makrofágů a apoptotických neutrofilů (Sladek a Ryšánek, 2002, Sládek et al., 2006). Bylo zjištěno, že zánětlivá reakce mléčné žlázy na intramammárně aplikovaný LPS byla doprovázena zvýšenou expresí na povrchu receptoru CD14. LPS se váže k LBP, který usnadňuje přenos na LPS s membránou asociovaný CD14. Prostřednictvím TLR-4 tato vazba iniciuje signální transdukci, a to vede k tomu, že makrofágy začnou uvolňovat pro-zánětlivé cytokiny, jako je TNF-α a interleukiny IL-1b, IL-6, IL-8. Taková aktivace poskytuje nespecifický obranný systém proti Gram-negativním bakteriím. Další studie prokázaly, že i infekce, která byla 16
způsobena Gram-pozitivními bakteriemi Staphylococcus aureus a Streptococcus uberis, byla doprovázena rovněž zvýšením počtu CD14 + neutrofilů a makrofágů (Sládek et al., 2006).
Druhý významný receptor u makrofágů mléčné žlázy skotu je receptor CD44. CD44 je receptor pro molekuly extracelulární matrix a je široce exprimován v celé řadě tkání a buněk, včetně bílých krvinek. CD44 je transmembránová adhezní molekula zahrnující vazby na metabolismus hyaluoranu (Vivers et al., 2002). CD44 může být exprimován v důsledku signálů generovaných po navázání LPS s LBP, a následné vazby LPS-LBP komplexu s CD14-TLR-4 komplexu (Mishra et al., 2005). Podobně jako CD14, CD44 má další funkce v zánětlivých a imunitních reakcí, což přispívá k odstranění částic a apoptotických buněk (Vivers et al, 2002; Vachon et al., 2006). CD44 je příslušný fagocytární receptor, který účinně zprostředkovává internalizaci velkých částic (Vachon et al., 2006) a je rozhodující roli při rezoluci zánětu plic (Teder et al., 2002) a neinfekčním poškození plic (Liang et al., 2007).
2.6.4.1.3 Pohlcení K ingesci, pohlcení, dá podnět adherence partikulárního antigenu. Při této fázi jsou pohlcovány pouze částice větší než 0,1 µm. Pseudopodie, nacházející se na povrchu makrofágů, se formují kolem fagocytované částice. Spojením pseudopodií dochází k vytvoření fagocytární vakuoly, nebo-li fagozomu. Lysosomy se poté přesouvají k fagozomu, kde splynou s membránami, obklopujícími fagocytovanou partikuli a vytvoří tzv. fagolysozom. Potom dojde k uvolnění obsahu lysosomů do fagozomu, a tím dochází k natrávení bakterií, nebož lysosomy obsahují účinný arzenál destruktivních enzymů, které mohou působit jak uvnitř, tak i vně těchto buněk navozením vysoce toxického mikroprostředí (Paape et al., 2003).
17
Obr. 13. Makrofág mléčné žlázy jalovice s fagocytovanými bakteriemi Staphylococcus aureus v transmisním elektronovém mikroskopu Zvětšení 5000 x (Sládek, 2014).
2.6.4.1.4 Trávení a zabíjení Existují dva základní systémy pro trávení a zabíjení pohlceného cizího materiálu. Jsou to systémy závislé nebo nezávislé na kyslíku. Závislé systémy na kyslíku: Charakteristické je oxidativní vzplanutí metabolismu, které je uskutečňováno zároveň s pohlcením. Při něm je zaznamenána zvýšená spotřeba kyslíku, zvýšená produkce peroxidu vodíku, superoxidového aniontu a zvýšená oxidace glukózy přes hexózamonofosfát. To má za následek produkci několika mikrobicidních oxidačních činidel ve fagolysozomu, včetně superoxidového aniontu, hydroxylového radikálu, singletového kyslíku a peroxidu vodíku. Ty budou oxidovat tuky, jako je například v bakteriálních membránách, které způsobují lýzu bakterií. Primární enzym zapojený do katalyzující oxidace cizích materiálů fagocytů je myeloperoxidáza , který je obsažen v lysosomech (Bartůňková a Hořejší, 2009).
Nezávislé systémy na kyslíku – Oxid dusnatý (NO) je účinný mikrobicidní prostředek, který ničí především intracelulární parazity makrofágů. Oxid dusnatý je tvořen NO-syntázou, která je pomocí cytosinu interferonu a tumor nekrotizujícího faktoru aktivována v makrofázích. Když reaguje oxid dusnatý se superoxidovým aniontem, který je tvořený při respiračním vzplanutí, vznikají toxické reaktivní dusíkové metabolity, zabíjející patogenní mikroby. K uvolňování baktericidních látek do okolních tkání a k jejich degradaci dochází při některých zvláště chronických onemocněních (Bartůňková a Hořejší, 2009).
2.6.4.2 Prezentace antigenu makrofágy Často jsou makrofágy v literatuře popisovány jako zodpovědné buňky v prezentaci antigenu (Hume, 2012). Antigen, který je pohlcen makrofágy, může být využit pro potřeby specifické-adaptativní imunity. Antigen je naštěpen na přiměřeně velké peptidy, vážící se s molekulami MHC I, MHC II nebo CD 1 a potom jsou prezentovány T lymfocytům (Tomanet al., 2009). Většina tkáňových makrofágů exprimuje třídy II MHC na svém povrchu (Hume, 2012). Makrofágy mohou být při prezentaci antigenu aktivovány a podílejí se na spuštění zánětlivé reakce (Srivastava, 2002): První fáze - rozpoznávací - Th1 buňky rozpoznávají antigen na APC. Druhá fáze - aktivační - sekrece a vyloučení prozánětlivých cytokinů buňkami Th1 a samotnými makrofágy Třetí fáze - efektorová - indukce zánětlivé reakce a aktivace makrofágů.
18
2.6.4.3 Role makrofágů v rezoluci akutního zánětu mléčné žlázy Makrofágy hrají významnou roli v regulaci zánětu mléčné žlázy skotu. "Stojí" nejen u jeho indukce, ale rovněž u jeho rozpuštění, tzv. rezoluce.
2.6.4.3.1 Definice akutního zánětu mléčné žlázy Akutní zánět je pro organismus fyziologický a je základním nástrojem vrozené imunity. Za normálních okolností se poraněná tkáň kompletně zhojí a zánět odezní bez následků. Zánětlivé reakce se účastní mnoho složek nebuněčných a buněčných: krevní plazma, krevní cévy, všechny cirkulující krevní buňky, a buněčné a mezibuněčné složky pojivové tkáně. Tato reakce probíhá ve vaskularizované pojivové tkáni mléčné žlázy (Halouzka et al., 1996). V iniciální fázi zánětlivé reakci mléčné žlázy dochází k influxu leukocytů z krevního řečiště do kavitárních systémů mléčné žlázy. V této fázi, která trvá 1-2 dny jsou dominantními buňkami neutrofilní granulocyty. Poté dochází k nárůstu podílu makrofágů a lymfocytů. Fáze rezoluce je charakterizována snížením celkového počtu buněk. Změny v celkovém počtu buněk v průběhu zahájení rezoluce zánětlivé reakce jsou patrné společně se změnou v diferenciálním poměru jednotlivých buněčných typů. Diferenciální podíl makrofágů a lymfocytů je totiž v opačném poměru k diferenciálnímu podílu neutrofilů (Sládek a Ryšánek, 2005).
2.6.4.3.2 Definice rezoluce akutního zánětu - co to je? Rezoluce je vlastně hojení, tedy reparace poškozené tkáně. Aby mohla proběhnout, je nutná funkční a fyzická eliminace neutrofilů z místa zánětu (Maskrey et al., 2011). Neutrofily obsahují účinný arzenál enzymů ve svých granulích, které působí histotoxicky. Na druhé straně mají krátkou životnost a proto zanikají ve tkáni, nemají schopnost se vracet do krevního řečiště. Jejich funkční eliminace je provedena apoptózou - programovanou buněčnou smrtí a fyzická pak pohlcením makrofágy (Savill et al., 1999). Úkolem rezoluce je tedy zabránit přechodu akutního zánětu do chronicity.
2.6.4.3.3 Indukce apoptózy neutrofilů Neutrofily fagocytují bakteriální patogeny v dutinovém systému mléčné žlázy a v tuboalveolech. U těchto buněk dochází v procesu fagocytózy ke spotřebě energie. Neutrofily "neumějí" metabolizovat v mléce obsaženou laktózu a proto mají omezenou životnost. U těchto buněk je tedy indukována apoptóza v době, kdy mají zbytek energie dostačující k provedení apoptotických změn. Proces apoptózy je zahájen induktivním signálem. Indukci vyvolává vazba membránového proteinu Fas na svůj ligand nebo vazba cytokinu TNF-α na membránový receptor TNFR1. Vazba vede k aktivaci enzymů caspáz. Apoptózu vyvolává i poškozená DNA
19
ionizujícím zářením, při kterém dochází k tvorbě proteinu p53 a indukci caspáz (Toman et al., 2009). Apoptózu neutrofilů mléčné žlázy poprvé popsali Sládek a Ryšánek (2000) u virginní jalovice. Mezi základní morfologické charakteristiky patří karyopyknotické jádro, zeióza a přítomnost apoptotických tělísek (Obr. 14). Podle uvedených autorů představuje apoptóza rychlý a bezpečný mechanismus odstraňování neutrofilů, směřující k omezení poškození zanícené tkáně a podporuje rezoluci akutního zánětu mléčné žlázy skotu. V případě oddálení apoptózy neutrofilů přechází akutní zánět mléčné žlázy do chronicity (Boutet et al., 2004).
2.6.4.3.4 Přepnutí makrofágů z klasicky aktivované buňky na alternativně aktivovanou Klasicky aktivované makrofágy jsou vysoce pozitivní pro třídu II-MHC a jsou schopny zabíjet mikroorganismy a nádorové buňky a zároveň vystavit současný antigen T-lymfocytům jako antigen prezentující buňky. Iniciální fáze zánětu je charakteristická právě dominancí klasicky aktivovaných makrofágů. Tyto makrofágy uvolňují protizánětlivé cytokiny, jak bylo zaznamenáno při zánětlivé reakci bovinní mléčné žlázy iniciované různými činiteli. Interferon – γ byl ve vyšší hladině zaznamenán u E. coli, M. bovis, S. aureus, P. aeruginosa, S. marcescens a S. uberis mastitídy. Interleukin - 1β, IL – 8, IL – 10, TNF – α a fragment C5a pak u E. coli, M. bovis, S. aureus, S. uberis, K. pneumoniae, S. marcescens a P. aeruginosa. Interleukin – 6 pak u E. coli a S. aureus. Interleukin – 12 byl zaznamenán u E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. marcescens a S. uberis. TGF – α a TGF – β1 u E.coli, M. bovis, S. aureus a P. aeruginosa (Bannerman, 2008). Je logické, že tyto cytokiny působí prozánětlivě a proto je nutné zastavit jejich produkci a uvolňování. Proto dojde k tzv. přepnutí klasicky aktivovaného makrofágu na alternativně aktivovanou buňku. Tento "switch off" umožní Th2 cytokiny IL-4 a IL-13. Alternativně aktivované makrofágy pak neprodukují prozánětlivé, ale protizánětlivé činitele (TGF - 1β, aj. viz výše kap. 2.4) (Hume, 2012).
2.6.4.3.5 Efferocytóza - pohlcení apoptotických neutrofilů makrofágy Jak již bylo uvedeno výše, apoptóza neutrofilů je pouze jeden ze dvou kroků nutných pro zahájení rezoluce akutního zánětu (Savill, 1997). Tím druhým je fyzická eliminace apoptotických buněk, která je zprostředkovaná fagocytózou lokálními makrofágy (Maszaros et al., 1999). Rozpoznání apoptotických neutrofilů makrofágy vyžaduje na jedné straně existenci signálních molekul na povrchu apoptotických neutrofilů (tzv. "Eat me" signálů) a na druhé straně existenci specifických receptorů na povrchu makrofágů (Savill, 1997). Signálem pro odstranění apoptotických buněk fagocytózoum, je přesun molekuly fosfatidylserinu do vnější části buněčné membrány a spolu s vitronektinem a neobvyklými cukry (Toman et al., 2009).
20
Obr. 14. Makrofág s fagocytovanými apoptotickými neutrofily v cytoplazmě (*). Vlevo apoptotický neutrofil (šipka). Transmisní elektronový mikroskop (zvětšení 5000x) (Sládek et al., 2006).
Efferocytóza byla zaznamenána např. během rezoluce akutního zánětu mléčné žlázy virginních jalovic po aplikaci prozánětlivých činitelů (Sládek a Ryšánek, 2000) a u experimentální infekce S. uberis (Sládek et al., 2006).
2.7 Metody studia makrofágů mléčné žlázy skotu. Studium makrofágů vyžaduje jejich předešlé získání - izolaci z dutinového systému mléčné žlázy. V literatuře existuje celá řada prací, kde byla použita indukce zánětlivé odpovědi a následné výplachy dutinového systému mléčné žlázy. K tomuto účelu byly použity mléčné žlázy v různém funkčním období. Jednalo se o mléčnou žlázu nelaktující - jalovice (Wardley et al., 1975), laktující mléčnou žlázu dojnice (Derbyshire a Berman, 1968) a konečně mléčnou žlázu v involuci (Desiderio a Campbell, 1980). Stručný postup je takový, že do dutinového systému mléčné žlázy jsou vpraveny činitelé indukující zánětlivou reakci. Může se jednat o relativně inertní destilovanou vodu, fyziologický roztok či mléko (Derbyshire a Berman, 1968) nebo imunologicky významný LPS (Wardley et al., 1975). V každém případě dojde k zánětlivé reakci mléčné žlázy, která je ve své iniciální fázi charakteristická influxem neutrofilních granulocytů a monocytárních forem makrofágů. Čtyři až pět dní po indukci lze zaznamenat 65 až 70% populaci makrofágů. Kultivací těchto buněk po dobu 2-3 dnů lze získat téměř čistou populaci adherovaných makrofágů. Výsledky studií tak prokazují, že makrofágy tvoří morfologicky různorodé populace buněk, z nichž dva typy byly již popsány výše. První typ představuje makrofág podobný monocytu. Tyto buňky jsou 21
v průměru velké od 10 do 25 mikrometrů a mají oválné jádro, které je obklopeno bohatou, slabě bazofilní cytoplazmu. Druhý typ, už představuje plně diferencovaný makrofág. Velikost těchto buněk je v průměru 18 až 40 mikrometrů, jádro tvaru ledvin nebo nepravidelně tvarované. Jsou bohaté na cytoplazmu, která obsahuje mnoho vakuol a granulí (Wardley et al., 1975, Desiderio a Campbell, 1980). Takto získané makrofágy lze pak použít ke studiu za použití světelné a elektronové mikroskopie, průtokové cytometrie, ELISA, aj.
22
3. ZÁVĚR Makrofágy mléčné žlázy skotu, stejně tak jako jiné makrofágy působící v kterékoliv jiné tělní tkáni, se aktivně podílejí na imunitní reakci a tím znesnadňují proniknutí mikrobiálním patogenům, jehož léčení je dlouhodobé a velmi nákladné. Do různých tkání, jako jsou plíce, játra, ledviny, mikroglie v mozku, mléčná žláza atd., se dostávají z krve v podobě monocytů a při cestě se dokončuje jejich vývoj. Avšak než mohou vykonávat svoji práci, musí být aktivovány. Aktivace se děje dvojím způsobem a to klasickou cestou, která je uskutečněna nejčastěji prozánětlivými interleukiny a nebo alternativní cestou, na které se podílí celá řada protizánětlivých cytokinů. Dále je v práci popsaná struktura a ultrastruktura. Strukturálně jsou buď vakuolizované, které představují různé stupně degenerace projevující se především v jádru a cytoplazmě. Méně vakuolizovaná (pěnivá) cytoplasma obsahuje malá bílo šedavá granula a je typická pro tento typ makrofágů. Nebo nevakuolizované, které odpovídají krevním monocytům. Po ultrastrukturní stránce rozeznáváme makrofágy bez lipidových inkluzí, které jsou u krav v období zprahlosti dominantní, nebo s lipidovými inkluzemi. Umírají buď nekrózou, což představuje úplnou lýzu buněk a nebo apoptózou, jejíž spouštěčem je oxid dusnatý. Apoptóza makrofágů byla také pozorována u patologických procesů a indukce apoptózy makrofágů s následnou sekundární nekrózou je způsobena bakteriálním exotoxinem s histotoxickým účinkem. Jejich funkce v zánětlivé reakci je fagocytóza, která představuje komplexní proces, při kterém se fagocyty (neutrofily, makrofágy) přesunou do tkáně (chemotaxe), rozpoznají cizí materiál, čemuž napomáhá opsonizace, poté ho pohltí a zlikvidují. Je to vlastně hlavní mechanismus hostitele pro odstranění cizího materiálu. Další mechanismus v zánětlivé reakci je rezoluce zánětu, což je vlastně hojení, tedy reparace poškozené tkáně. Aby mohla proběhnout, je nutná funkční a fyzická eliminace neutrofilů z místa zánětu, tedy eferocytóza, což znamená pohlcení apoptotických neutrofilů. Apoptóza neutrofilů je jeden ze dvou kroků, které jsou třeba pro zahájení rezoluce akutního zánětu. Jako druhým krokem je fyzická eliminace apoptotických buněk, která je zprostředkovaná fagocytózou lokálními makrofágy. K tomu je potřeba signální molekuly na povrchu apoptotických neutrofilů a specifických receptorů na povrchu makrofágů. Další funkce je pak produkce cytosinů, které „nařizují“ neutrofilům zemřít apoptózou. Všemi těmito funkcemi pak tlumí nebo úplně ruší účinky zánětu.
23
4. LITERATURA AKIRA S, MISAWA T, SATOH T, SAITOH T. Macrophages control innate inflammation. Diabetes Obes Metab. 2013 Sep;15 Suppl 3:10-8. ANTON, J. a M. VAŠÁKOVÁ. Imunitní odpověď organismu u tuberkulózní infekce. Kazuistiky v alergologii, pneumologii a ORL. 2007, roč. 4, č. 2. Angiogeneze. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2014-04-28]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Angiogeneze BANNERMAN, D. D. Pathogen - dependent inductin of cytokines and other soluble inflammatory mediators during intramammary infection of dairy cows. Journal of animal science. 2009, č. 87. Bartunkova Horejsi 2009 - http://knihy.abz.cz/prodej/zaklady-imunologie-2 BARTŮŇKOVÁ JIŘINA, PAULÍK MILAN, a kol.Vyšetřovací metody v imunologii. Grada, s. 184, 2005 ISBN: 80-247-0691-1 BROIDE, D. H. Buňky zánětu. Základní a klinická imunologie. 1987, č. DOPLNÍM
BOUTET P, BOULANGER D, GILLET L, VANDERPLASSCHEN A, CLOSSET R, BUREAU F, LEKEUX P.: Delayed neutrophil apoptosis in bovine subclinical mastitis. J Dairy Sci. 2004 Dec;87(12):4104-14.
CONCHA, C. (1986): Cells types and their immunological functions in bovine mammary tissues and secretions. Nord Vet. Med., 38: 257-272.
DERBYSHIRE JB, BERMAN DT.: Leukocytic responses of the bovine udder to infusion of certain irritants. Am J Vet Res. 1968 Oct;29(10):1971-7. DESIDERIO, J.V. – CAMPBELL, S.G. (1980): Bovine mammary gland macrophages: isolation, morphologic features, and cytophilic immunoglobulins. Am. J. Vet. Res., 41: 1595-1599. DLUHOLUCKÝ, S. K článku Dr. Russella L. Blaylocka "Vakcíny, vývoj nervového systému a poruchy
autistického
spektra"
-
3x
DOPLNENÉ
Viac
tu:
http://www.slobodavockovani.sk/news/prof-mudr-svetozar-dluholucky-csc-k-clanku-dr-russellal-blaylocka-vakciny-vyvoj-nervoveho-systemu-a-poruchy-autistickeho-spektra/ [online]. 2011 [cit. 2014-04-5]. Dostupné z: http://www.slobodavockovani.sk/news/prof-mudr-svetozardluholucky-csc-k-clanku-dr-russella-l-blaylocka-vakciny-vyvoj-nervoveho-systemu-a-poruchyautistickeho-spektra/
24
ENGLIŠ,
MIROSLAV.
Glomerulus
[online].
2014
[cit.
2014-04-5].
Dostupné
z:
http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/AJCLB.htm
Ferenčík: http://books.google.cz/books?vid=ISBN80-05-00043-X&redir_esc=y GREWAL, A.S. ; ROUSE, B.T. ; BABIUK, L.A. (1978): Characterization of surface receptors on bovine leukocytes.Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 56:289-300.
HALOUZKA, Roman a František JELÍNEK. Obecná veterinární patologie. Vyd. 1. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita, 1996, 161 s.
HOŘEJŠÍ, V. a BARTŮŇKOVÁ, J. Základy imunologie. Triton. 2013, č. 5.
HOWARD, C.J. ; TAYLOR, G. ; BROWNLIE, J. (1980): Surface receptors for immunoglobulin on bovine polymorphonuclear neutrophils and macrophages. Res. Vet. Sci., 29: 128-133.
HUME, David A. Macophage Biology Review [online]. 2012 [cit. 2014-04-29]. Dostupné z: http://www.macrophages.com/macrophage-review
JEFFREY W. POLLARD Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. Author manuscript; available in PMC 2013 May 9. Published in final edited form as: Nat Rev Immunol. 2009 April; 9(4): 259–270
JELÍNEK, Richard. A KOL. Osteoklasty [online]. 2014, 2014 [cit. 2014-04-5]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Osteoklast JENSEN, D.L. – EBERHART, R.J. (1975): Macrophages in bovine milk. Am. J. Vet. Res., 36: 619-624. LATA, Jan a Tomáš VAŇÁSEK. Kritické stavy v hepatologii [online]. 2005 [cit. 2014-04-5]. http://books.google.cz/books?id=gIkFDostupné z: pjPE14C&pg=PA126&lpg=PA126&dq=kritick%C3%A9+stavy+v+hepatologii&source=bl&ots =GbREqUAdJb&sig=e4AEdTa__NP6AoA3OM8N__AXecQ&hl=cs&sa=X&ei=BrtgUX4CsbEOYfegcAL&ved=0CEUQ6AEwAw#v=onepage&q=kritick%C3%A9%20stavy%20v% 20hepatologii&f=false
LEE, C.S. - McDOWELL, G.H. - LASCELLES, A.K. (1969): The importance of macrophages in the removal of fat from the involuting mammary gland. Res. Vet. Sci., 10: 34-38
25
LEE, C.S. – WOODING, F.B.P. – KEMP, P. (1980): Identification, properties, and differencial counts of cell populations using electron microscopy of dry cows secretions, colostrum and milk from normal cows. J. Dairy Res., 47: 39-50. LIANG, J., JIANG, D., GRIFFITH, J., YU, S., FAN, J., ZHAO, X., BUCALA, R., NOBLE, P.W., 2007. CD44 is a negative regulator of acute pulmonary inflammation and lipopolysaccharide-TLR signaling in mouse macrophages. Journal of Immunology 178, 2469– 2475. LINTNER, S. – EBERHART, R.J. (1990): Effect of antibiotics on phagocyte recruitment, function, and morphology in the bovine mammary gland during the early nonlacting period. Am. J. Vet. Res., 51: 533-542. LOKAJ J.., JOHN C.:Ilja Iljič Mečnikov a Paul Ehrlich: Laureáti Nobelovy ceny v r. 1908 za práce o imunitě. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 57, 2008, č. 4, s. 119–124 MASKREY B.H., MEGSON, I.L., WHITFIELD P.D.,ROSSI A.G., Mechanisms of Resolution of Inflammation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2011; 31: 1001-1006
McDONALD, J.S. – ANDERSON, A.J. (1981): Total and differential somatic cell counts in secretions from noninfected bovine mammary glands: the peripartum period. Am. J. Vet. Res., 42: 1366-1368. MESZAROS, A.J. – REICHNER, J.S. – ALBINA, J.E. (1999): Macrophage phagocytosis of wound neutrophils. Journal of Leukocyte Biology, 65: 35-42. MEYER,G.,and Klein, M. (1961). In „Milk: The Mammary Gland and Its Secretion“ (S. K. Kon and A. T. Cowie. Eds.), Vol. 1, pp. 47-126. Academic Press, New 126. Academic Press, New York. MISHRA, J.P., MISHRA, S., GEE, K., KUMAR, A., 2005. Differential involvement of calmodulin-dependent protein kinase II-activated AP-1 and c-Jun N-terminal kinase-activated EGR-1 signaling pathways in tumor necrosis factor-alpha and lipopolysaccharide-induced CD44 expression in human monocytic cells. Journal of Biology and Chemistry 22, 26825– 26837. Osteoklast. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, 2001- [cit. 2014-04-29]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Osteoklast
PAAPE, Max J., Douglas D. BANNERMAN, Xin ZHAO a Jai-Wei LEE. The bovine neutrophil: Structure and function in blood and milk. Veterinary Research. 2003, roč. 34, číslo 5, s. 597-627. PAAPE, M.J. - GUINDRY, A.J. - JAIN, N.C. - MILLER, R.H. (1991): Leukocytic defense mechanismus in the udder. Flem. Vet. J., 62: 95 - 109. PAAPE, M.J. – HAFS, H.D. - SNYDER, W.W. (1963): Variation of estimated numbers of milk somatic cells stained with Wright´s stain or pyronin γ - methyl green stain. 26
J. Dairy Sci., 46: 1211-1216. PAAPE MJ, SHAFER-WEAVER K, CAPUCO AV, VAN OOSTVELDT K, BURVENICH C.: Immune surveillance of mammary tissue by phagocytic cells. Adv Exp Med Biol. 2000;480:259-77. Review. POLLARD, Jeffrey w. Trophic macrophages in development and disease. Nat Rev Immunol. 2009, č. 9. SAVILL, J.S. (1997): Apoptosis Journal of Leukocyte Biology, 61: 375-380
in
resolution
of
inflammation.
SAVILL, J. s. Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflammation. Programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages. Journal of Clinical Investigation. 1989, č. 83. Dostupné z: http://biomech.ftvs.cuni.cz/pbpk/kompendium/anatomie/kloub_spojeni_articulatio.php Savill, J. S. Recognition and phagocytosis of cell undergoing apoptosis. British Medical Bulletin, 1997. 53: 491-508. SAVILL, J.S. – WILLIE, A.H. – HENSON, J.E. – WALPORT, M.J. – HENSON, P.M. – HASLETT, C. (1989): Macrophage phagocytosis of aging neutrophils in inflammation. Programmed cell death in the neutrophil leads to its recognition by macrophages. Journal of Clinical Investigation, 83: 865-867. SHIMIZU, Hiroshi. Shimizu'sTextbookof Dermatology [online]. 2007 [cit. 2014-04-1]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Histiocyt SCHÜCK, Otto, Vladimír TESAŘ a kol. Klinická nefrologie. Praha: Grada, 2006. ISBN 80247-0503-6. SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. Apoptosis of resident and inflammatory macrophages before and during the inflammatory response of the virgin bovine mammary gland. Acta Veterinaria Scandinavica. 2010, č. 52. SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. Expression of macrophage CD44 receptor in the course of experimental inflammatory response of bovine Maďary gland induced by lipopolysaccharide and muramyl dipepide. Veterinary Science. 2009, č. 86. SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. , Macrophages of the bovine heifers mammary gland: Morphological features during initiation and resolution of the inflammatory response. Anat. Histol. Embryol. 2006, č. 35. SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. Morphological characteristic of somatic cells from mammary glands of unbred heifers. Vet. med.- Czech. 1999, č. 44.
27
SLÁDEK, Z.-RYŠÁNEK, D. (2000): Morphology of apoptosis of polymorphonuclear leukocytes isolated from juvenile bovine mammary glands. Veterinary Medicine Czech, 45: 7181. SLÁDEK, Z.-RYŠÁNEK, D.: Morfologická a funkční charakteristika somatických buněk mléka skotu. Veterinary Medicine Czech, 1998, roč. 43, č. 8, s. 255 – 264. SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. The role of CD14 during resolution of experimentally induced Staphylococcus
aureus
and
Streptococcus
uberis
mastitis.
Comparative
Imunology,
Mycrobiology and Infectious Diseases. 2006, č. 29.
SLÁDEK, Z. a D. RYŠÁNEK. Ultrastructure of Phagocytes from mammary glands of nonpregnant heifers. Anat. Histol. Embryol. 1999, č. 28.
SLÁDEK, Z., RYŠÁNEK, D., Faldyna, M. Activation of phagocytes during initiation and resolution of mammary gland injury induced by lipopolysacharide in heifers. Vet. Res. 2002. 33: 191-204. SLÁDEK, Z., D. RYŠÁNEK, M. FALDYNA a H. RÝZNAROVÁ. Neutrophils apoptosis during experimentally induced Streptococcus uberis mastitis. Veterinary Medicine Czech. 2006, č. 51.
SLÁDEK, Z. a T. LANGROVÁ. EXPRESSION OF „EAT ME SIGNALS“ ON NEUTROPHILS DURING RESOLUTION OF INFLAMMATORY RESPONSE INDUCED BACTERIALS TOXINS
[online].
2006
[cit.
2014-04-5].
Dostupné
z:
http://mnet.mendelu.cz/mendelnet2006/articles/bioziv/langrova.pdf SRIVASTAVA P. Roles of heat-shock proteins in innate and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology 2, 185-194, 2002. STEIN, M, S KESHAV, N HARRIS a S GORDON. Interleukin-4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity - a marker of alternative immunological macrophage activation. Journal of Experimental Medicine. 1992, č. 176
TABAS, Ira. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nature Reviews Immunology. 2010, č. 10.
TARGOWSKI, S.P. (1982): Role of immune factors in protection of mammary gland. J. Dairy Sci., 66: 1781-1789.
28
TEDER, P., VANDIVIER, R.W., JIANG, D., LIANG, J., COHN, L., PURE, E., HENSON, P.M., NOBLE, P.W., 2002. Resolution of lung inflammation by CD44. Science 296, 155–158. TOMAN, Miroslav. A KOLEKTIV. Veterinární imunologie. Praha: Grada Publishing, 2009. ISBN 80-7169-727-3. VACHON, E., MARTIN, R., PLUMB, J., KWOK, V., VANDIVIER, R.W., GLOGAUER, M., KAPUS, A., WANG, X., CHOW, C.W., GRINSTEIN, S., DOWNEY, G.P., 2006. CD44 is a phagocytic receptor. Blood 107, 4149–4158. VIVERS, S., DRANSFIELD, I., HART, S.P., 2002. Role of macrophage CD44 in the disposal of inflammatory cell corpses. Clinical Science (London) 103, 441–449. WARDLEY, R. c., B. t. ROUSE a L. a. BABIUK. The mammary gland of the ox: A convenient source for the repeated collection of neutrophils and macrophages. Journal of the reticuloendothelial society. 1975, č. 19
YAMAMOTO, Ch., S. I. YOSHIDA, M. H. QIN, H. MAYMOTO a Y. MIZUGUCHI. Lipopolysaccharide and granulocyte colony-stimulating factor delay neutrophil apoptosis and ingestion by guinea pig macrophages. Infection and Immunology. 1993, č. 61.
29
5 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Krevní nátěr - Krevní monocyt (Mo). Panoptické barvení, zvětšení 1000x (Physiology of Leukocytes, 2014). Obr. 2 Schéma aktivace makrofágů (Tabas, 2010). Obr. 3 Kupfferovy buňky v játrech (označené jako von Kupffer cells) (Dartmouth, 2014). Obr. 4. Alveolární makrofágy (šipky) v plicích (Caceci, 2014) Obr. 5. Mnohojaderný osteoklast (wikipedia, 2014) . Obr. 6. Osteoartitída - synoviální makrofágy (Synovial cytology, 2014). Obr. 7. Mikroglie v mozku (Osel, 2014). Obr. 8. Plurální makrofágy koně (Warner, 1999). Obr. 9. Nevakuolizované makrofágy mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999). Obr. 10. Vakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999). Obr. 11. Nevakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999). Obr. 12. Vakuolizovaný makrofág mléčné žlázy skotu (Sládek a Ryšánek, 1999). Obr. 13. Makrofág mléčné žlázy jalovice s fagocytovanými bakteriemi Staphylococcus aureus v transmisním elektronovém mikroskopu Zvětšení 5000 x (Sládek, 2014). Obr. 14. Makrofág s fagocytovanými apoptotickými neutrofily v cytoplazmě (*). Vlevo apoptotický neutrofil (šipka). Transmisní elektronový mikroskop (zvětšení 5000x) (Sládek et al., 2006).
30
