RESPON METABOLIT ANTI PATOGEN PADA AKAR TUSAM AKIBAT PENGIMBASAN INTERAKSI SIMBIOTIK MIKORISA
Fakultas Kehutanan Universitas Gadjah Mada
LATAR BELAKANG
• Masa sukulen panjang • Peka terhadap patogen • Tergantung pada mikorisa
Sehat
?
Pinus merkusii Jungh. et de Vriese
Mikorisa Ekto
MEKANISME ?
Landasan Teoritis
T r i c h o d e r m a
Patogenesis Antagonisme • • •
Kompetisi Antibiosis Parasitisme
• Inokulasi
Kompetisi/ antibiosis
• Inkubasi
Kompetisi/ antibiosis
• Infeksi Sintesis hormon
Blocking • Kimiawi • Fisik
M i k o r i z a
Tujuan 1. Isolasi fitoaleksin enzim β-1,3-glukanase dan kitinase sebagai respon infeksi jamur pembentuk mikorisa pada tusam. • Aktifitas fitoaleksin enzim β-1,3-glukanase dan kitinase terhadap jamur penyebab rebah semai secara in vitro. • Pengaruh inokulan mikorisa terhadap perkembangan Fusarium sp ; Rhizoctonia sp. dan pertumbuhan semai tusam. • Pengaruh T. reesei sebagai biokontrol terhadap pembentukan mikorisa • Pengaruh waktu inokulasi terhadap interaksi antagonistik antara T. reesei dengan jamur rebah semai (Fusarium sp. dan R. solani)
METODE
• fitoaleksin • kitinase • β-1, 3-glukanase
Induksi Tanaman
Jamur mikorisa
Trichoderma Interaksi
Pembentukan mikorisa
In vitro In vivo
Patogen
Tahun I T-14
T0
Trc
Trc Mi
T+14
Trc
Tahun 2 Interaksi
mikorisa Ekto
Pembentukan mikorisa
Induksi Tanaman
Metabolit sekunder * fitoaleksin * Pathogenesis – Related Protein
ß- 1,3-glukanase
Tahun 3 Interaksi
mikorisa Ekto
Pembentukan mikorisa Trichoderma Patogen damping off
Induksi tanaman Waktu Metabolit sekunder * Pathogenesis – Related Protein
kitinase
Metode Khusus fitoaleksin Ekstraksi menurut Keen et al. cit. Nonaka dan Matsuzaki (1976) Akar (10 gr) + etanol 70% (50ml), rendam 24 jam Saring Evaporasi (40o) sampai ¼ volum semula Ekstraksi dengan petrolium ether Evaporasi (40oC) Materi kering + etanol
Larutan fitoaleksin kasar dlm etanol
Metode Khusus 1- 3 β glukanase Ekstraksi Pathogenesis-Related Protein •
Ekstraksi menggunakan metode Vannini et al. (1999). • Dialisis menggunakan metode Colligan et al.(1996). Isolasi β-1,3-Glukanase
Kromatografi gel filtrasi mengacu pada metode Colligan et al. (1996) dan Harjono (2000) dengan modifikasi Karakterisasi β-1,3-Glukanase • •
SDS-PAGE mengacu pada metode Laemli (1970)
Karakterisasi pH optimal aktifitas enzim mengacu pada metode Aono et al. (1995) dan Fontaine et al. (1997) dengan modifikasi. •
Karakterisasi suhu optimal aktifitas enzim.
Metode khusus kitinase Inokulasi mikorisa pd tusam
Panen, 4,6,8, minggu
Aktivitas kitinase. Deteksi isoform kitinase
Akar dipotong, dimsukkan dlm –80 C Ekstraksi crude protein Pengendapan am. sulfat Dialisis, pemekatan PEG
Karakterisasi, BM, pH, suhu optimum, aktifitas antifungal kitinase pada R. solani & Fusarium sp.
Kromatografi gel filtrasi sephacril S-300 HR
Uji in vivo antara jamur patogen, agen biokontrol dan jamur pembentuk mikorisa a. Inokulasi R.solani dan Fusarium sp. 15 hari sebelum semai ditanam b. Perlakuan : Faktor A - Tanah tidak bermikorisa (M0) - Tanah bermikorisa (M1) Faktor B - Tanpa patogen (P0) - Dengan inokulasi R. solani (P1) - Dengan inokulasi Fusarium sp. (P2) Faktor C - Tanpa T. reesei (T0) - T. reesei bersama waktu penanaman semai (T1) - 7 hari setelah penanaman semai - 14 hari setelah penanaman semai c. Pengamatan - Persen kematian semai
60
60
50
50
Jumlah ujung akar
Jumlah ujung akar
Hasil tahun pertama 40 30 20 10 0
40 30 20 10 0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
10
20
Waktu (hari)
W-14
Kontrol
T1
40
50
60
70
80
Waktu (hari)
T13
W0
T27
60 Jumlah ujung akar
30
Kontrol
T1
T13
T27
Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media tanpa inokulasi jamur mikorisa ekto
50 40 30 20 10
W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah steril.
0 0
10
20
30
40
50
60
70
Waktu (hari)
W+14
Kontrol
T1
T13
T27
80
W0
: Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril.
W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril.
120
100
100
Jumlah ujung akar
Jumlah ujung akar
120
80 60 40 20
80 60 40 20
0 0
10
20
30
40
50
60
70
0
80
0
Waktu (hari)
W-14
Kontrol
T1
20
30
40
50
60
70
80
Waktu (hari)
T13
W0
T27
Kontrol
T1
T13
T27
Perkembangan jumlah ujung akar semai tusam pada media yang diinokulasi jamur mikorisa ekto
120 Jumlah ujung akar
10
100 80 60 40 20
W-14 : Introduksi Trichoderma 14 hari sebelum penambahan tanah
0 0
10
20
30
40
50
60
70
Waktu (hari)
W+14
Kontrol
T1
T13
T27
80
steril.
W0
: Introduksi Trichoderma bersama-sama dengan penambahan tanah steril.
W+14 : Introduksi Trichoderma 14 hari setelah penambahan tanah steril.
Aktifitas fitoaleksin thd persentase perkecambahan spora Fusarium sp Tusam
Konsentrasi (%)
Akar tidak bermikorisa
Akar bermikorisa
Pohon
0
63,67
71,00
2
49,00
46,70
10
32,33
26,67
40
2,67
17,33
80
0,67
1,00
100
2,67
0,00
0
85,00
84,67
2
58,00
56,00
10
51,33
66,33
40
66,67
5,33
80
0,00
0,67
100
0,00
0,00
0
77,33
86,67
2
48,00
46,67
10
50,00
56,33
40
47,66
26,33
80
2,00
1,00
100
0,00
0,00
0
88,33
94,00
2
74,33
71,33
10
72,67
93,66
40
66,33
56,33
80
52,66
43,33
100
0,00
0,00
4 minggu
6 minggu
8 minggu
Keterangan : a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 300 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol
Aktifitas fitoaleksin thd panjang buluh kecambah Fusarium sp. Tusam
Konsentrasi (%)
Akar tidak bermikorisa
Akar bermikorisa
Pohon
0
3,38
3,12
2
1,55
1,75
10
0,95
0,90
40
0,34
0,48
80
0,30
0,34
100
0,00
0,00
0
3,47
3,71
2
1,79
1,71
10
2,04
2,79
40
1,96
0,35
80
0,00
0,34
100
0,00
0,00
0
3,42
3,62
2
1,77
1,66
10
2,09
1,60
40
0,71
0,99
80
0,61
0,39
100
0,00
0,00
0
3,51
3,73
2
1,65
1,63
10
0,5
4,49
40
2,80
1,65
80
1,91
1,50
100
0,00
0,00
4 minggu
6 minggu
8 minggu
Keterangan : a) tiap perlakuan sumber ekstrak dan konsentrasi diukur 20 spora b) konsentrasi 2 % hanya dari etanol
Aktivitas β-1,3-glukanase dari crude protein No.
Sampel
Kadar Protein (µg/µ l)
Aktivitas Enzim (µU)
Aktivitas spesifik (µU/µg)
1
TM
0.2764
259,4202
55,3645
2
M4M
0,1856
333,8082
93,6874
3
M6M
0,3563
1349,7078
378,8122
4
M8M
0,3948
675,0547
170,9865
5
EP
0,3398
1831,6029
539,0238
Keterangan : TM : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam tanpa mikorisa ; M4M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 4 minggu; M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; M8M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 8 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa bermikorisa.
Isolasi β-1,3-glukanase 0.10
14
0.09
12
0.08 10
0.07 0.06
8
0.05 6
0.04 0.03
4
0.02 2
0.01 0.00
0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 OD 280 nm fraksi
Aktivitas enzim pada tiap fraksi
Aktivitas β-1,3-glukanase dari hasil kromatografi 30,3789
35 30 25 Aktivitas Enzim (µ U)
20
17,5283 9,4968
15 10 5 0
GFCA I
GFCA II
GFCA III
Hasil Kromatografi Aktivitas b-1,3-glukanase
Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.
Aktivitas β-1,3-glukanase dari hasil kromatografi
31,8119
0,1818 0,20
35,00 0,1542
0,18 0,16
25,00
0,14
16,7101
Aktivitas 20,00 spesifik (µ g/µ U) 15,00
0,12
Kadar Protein 0,10 (µ g/µ l) 0,08
30,00
0,0551
0,06
10,00
0,04
5,00
6,1587
0,02
0,00
0,00 GFCA I
GFCA II
GFCA III
GFCA I
GFCA II
GFCA III
Keterangan : GFCA I = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak pertama aktivitas enzim; GFCA II = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak kedua aktivitas enzim; GFCA III = penggabungan fraksi-fraksi yang membentuk puncak ketiga aktivitas enzim.
Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi
10
log Berat molekul protein standart
5,50
5,00
Marker
4,50
GFC Results peak 2 Linear (Marker)
y = -0,0274x + 5,132
4,00
2
R = 0,9418
3,50 0
10
20
30
40
50
Mobilitas Relatif (mm)
Hasil interpolasi kurva berat molekul protein standart menunjukkan bahwa β-1,3glukanase hasil isolasi memiliki berat molekul 15 kD. GFCA II hasil isolasi kemudian disebut sebagai GLUC15
Karakterisasi β-1,3-glukanasehasil isolasi 80 70 Temperature
Enzyme Activity ( µ U)
60
Poly. (Temperature)
50 40 30 20 10 0 10 -10
20
30
40
50
60
o
Temperature ( C )
Hasil karakterisasi pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β-1,3glukanase hasil isolasi memiliki kisaran suhu yang sempit untuk aktivitasnya. Suhu optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 40o C .
Karakterisasi β-1,3-glukanasehasil isolasi 16 14
Enzyme Activity (µ U)
12 10 pH Poly. (pH)
8 6 4 2 0 2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH Hasil karakterisasi pengaruh pH terhadap aktivitas enzim menunjukkan bahwa β-1,3glukanase hasil isolasi memiliki aktivitas optimal pada pH cenderung asam. pH optimal untuk aktivitas enzim tersebut adalah 6 .
Karakterisasi β-1,3-glukanase hasil isolasi No.
Sampel
Persentaseperkecambahan Fusariumsp.
1
Kontrol
68%
2
GLUC15
14,54%
3
M6M
17,32%
4
EP
12,86%
Persentase perkecambahan konidia Fusarium sp. yang diinkubasikan dalam protein dari akar semai tusam (P. merkusii) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. GLUC15 = β-1,3glukanase hasil isolasi dari akar semai tusam (P. merkusii); M6M : crude protein hasil ekstraksi dari akar semai tusam bermikorisa 6 minggu; EP : crude protein hasil ekstraksi dari akar tusam dewasa bermikorisa. Penghitungan persentase dilakukan dengan menjumlah konidia yang berkecambah dan tidak berkecambah dari tiga bidang pandang mikroskop dan dilakukan dengan dua kali perulangan.
Rerata persentase infeksi jamur mikorisa semai tusam (P. merkusii) umur 8 minggu setelah diinokulasi jamur mikorisa dan patogen Sumber variasi Tanah tidak bermikorisa
Tanah bermikorisa
Ulangan
Rerata
1
2
3
P0
6,67
4,76
0,00
3,81
P1
4,70
9,09
0,00
4,60
P2
9,09
0,00
7,14
5,41
P0
50,00
21,74
11,11
27,62
P1
33,33
31,25
9,52
24,70
P2
18,18
23,53
17,86
19,86
Keterangan : P0 : tanpa patogen P1 : patogen Fusarium sp. P2 : patogen Rhizoctonia sp.
Hasil tahun ketiga Aktivitas spesifik kitinase 1
Aktivitas spesifik (unit/mg)
0,8 0,6
mikorisa tidak bermikorisa
0,4 0,2
4 M : 4 minggu 6 M : 6 minggu 8 M : 8 minggu
0 4M
6M
8M
Sampel
Aktivitas spesifik kitinase dari crude protein semai tusam bermikorisa dan tidak bermikorisa umur 4, 6 dan 8 minggu. Aktivitas kitinase diukur dengan menginkubasikan substrat–enzim selama 30 menit, reaksi dihentikan dengan penambahan DNS dan direbus selama 15 menit. Aktivitas kitinase diukur pada absorbansi 540, visibel.
Aktivits spesifik kitinase (Unit/mg)
Persentasi tingkat kejenuhan Ammonium Sulfat 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 30
50
70
Tingkat kejenuhan ammonium sulfat (%)
Perbandingan aktivitas spesifik kitinase dengan tingkat kejenuhan 30, 50, 70 %.
Rekapitulasi pemisahan kitinase dari 50 g akar semai tusam Protein total (µ g)
Aktivitas kitinase (unit)
Aktivitas spesifik (unit.mg-1)
Tingkat pemurnian
Recovery (%)
1,293
0,00106
0,819
1
100
Pengendapan amonium sulfat dan dialisis
0,777
0,000906
1,166
1,422
85,47
Sephacril S-300 HR
0, 155
0,000553
3,568
4,350
52,158
Langkah pemurnian
Crude protein
Suhu optimal
0,1 0,09 0,08
(Unit)
Aktivitas spesifik kitinase
Suhu Optimal
0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 10
20
30
40
50
Suhu C
Nilai suhu optimal dicapai pada suhu 300 C. Konsentrasi protein yang digunakan untuk masing – masing pengamatan adalah 0,156 µg ml-1. Data merupakan hasil rata – rata dua ulangan percobaan
pH optimal
Ak ltivitas s pe s ifik k itinas e (Unit)
pH Optimum 0 ,0 9
0 ,0 8
0 ,0 7
0 ,0 6
0 ,0 5
0 ,0 4
0 ,0 3 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Nilai pH optimal dicapai pada pH 5. Konsentrasi protein yang digunakan untuk masing–masing pengamatan adalah 0,156 µg ml-1. Data merupakan hasil rata – rata dua ulangan percobaan.
Ringkasan hasil • Akar tusam mengeluarkan senyawa fitoaleksin, β-1,3glukanase dan kitinase dengan aktivitas yang lebih tinggi pada akar bermikorisa dibandingkan dengan akar tidak bermikorisa. • Isolat enzim β-1,3-glukanase memiliki berat molekul 15 kD, kurang tahan terhadap pemanasan dan bekerja optimal pada pH cenderung asam. Sedangkan enzim kitinase memiliki berat molekul 52 kDa, aktivitas optimum kitinase pada pH 5 dan suhu 300C. • Senyawa fitoaleksin, β-1,3-glukanase dan kitinase yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto memiliki aktivitas antifungal. • Inokulasi jamur mikorisa dan introduksi T.reesei kedalam perakaran semai tusam dapat menghambat perkembangan patogen penyebab rebah semai (R. solani dan Fusarium sp.). Perlakuan ini tidak menimbulkan hambatan pembentukan dan perkembangan mikorisa apabila waktu aplikasi Trichoderma tepat. • Pengendalian patogen penyebab penyakit rebah semai diperoleh dari inokulasi T.reesei pra tanam dan selanjutnya dapat meningkatkan perkembangan mikorisa.
Kesimpulan Inokulasi jamur pembentuk mikorisa ekto sangat berpotensi untuk meningkatkan ekspresi enzim yang berperan pada ketahanan semai tusam terhadap patogen.
Publikasi Naemah, D., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 2004. Pengaruh waktu aplikasi Trichoderma terhadap perkembangan mikoriza pada akar Pinus merkusii Jungh. et de Vriese. Agrosains BPPS. 16(2):173-178. Tektonia, R., S. M. Widyastuti dan Sumardi. 2004. Pengaruh inokulasi mikoriza terhadap perkembangan penyakit rebah semai (Fusarium sp.) pada semai Pinus merkusii Jung. et de Vriese. Jurnal Fitopatologi.(accepted) Anggoro, M.D., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 2005. Isolasi dan karakterisasi β-1,3-glukanase akar semai tusam (Pinus merkusii jungh. et de vriese) yang berasosiasi dengan jamur pembentuk mikorisa ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted) Handayani, A., S.M. Widyastuti dan S. Margino. 2005. Isolasi dan karakterisasi kitinase akar tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) yang bersimbiosis dengan jamur mikoriza-ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(accepted) Suryantini, R., SM. Widyastuti dan Sumardi. 2005. Pengaruh Waktu Inokulasi Trichoderma reesei terhadap Patogenisitas Jamur Lanas (damping-off) dan Perkembangan Mikorisa pada Semai Tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vries).Buletin Kehutanan.(accepted)
Publikasi ... Widyaningsih, S., S.M. Widyastuti dan Sumardi. 2005. Produksi fitoaleksin pada tusam (pinus merkusii jungh. et de vriese) sebagai respon infeksi jamur mikoriza. BIOTA. (submitted) Widyastuti, S.M., A. Handayani, Harjono dan Sumardi. 2005. Aktivitas Anti Jamur Kitinase dan β-1,3-glukanase Akar Semai Tusam (Pinus merkusii Jungh. et de Vriese) yang Berasosiasi dengan Jamur Pembentuk Mikorisa Ekto. Jurnal Perlindungan Tanaman. (submitted) Widyastuti, S. M., Sumardi, Harjono dan D. Naemah. 2005. Uji aktivitas biokontrol Trichoderma formulasi hasil reisolasi dari media semai tusam setelah 5 bulan aplikasi secara in vitro. Agr UMY.
(submitted)
Widyastuti, S. M., Sumardi dan R. Tektonia. 2005. Uji awal aktivitas senyawa metabolit anti patogen akar tusam (Pinus merkusii Jung. et de Vriese.) akibat pengimbasan interaksi mikoriza ekto terhadap Fusarium sp. Jurnal Perlindungan Tanaman Indonesia.(submitted)
