QualiCont - Tapasztalatok Dr. Krenács Tibor Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Budapest
Magyar-Osztrák Patológus Kongresszus 2009. octóber 1-3
ALAPÍTVA:1996
5 diagnosztikus szakma • EQALM-tag
(European Committee for External Quality Assurance Programmes in Laboratory Medicine)
• EN 14 136:2004 European Standard • ISO Guide 43-1:1997 Hisztotechnológia 40-58 Labor Immunhisztokémia 30-48 Labor 2009-ben:
46 Labor HT 36 Labor IHC
2009: 72-féle program
2009 szeptember: 48. Forduló
Patológiai Program
Továbbképzés - értékelés
• Szeged: Diagnosztikus patológia - Minőségbiztosítás
2000
2001
2002
• Szombathely: Hisztotechnológia – Minőségbiztosítás 3x • Marosvásárhely: 2007. április 12-15. Pávai Zoltán prof. Diagnosztikus patológiai továbbképzés − Minőségbiztosítási fórum UK NEQAS, dán, norvég, lengyel, magyar, román előadók
Romániai pathológusok – első kísérleti QC forduló
Patológiai Program
Szövetpatológia eszközei: morfológia/hisztokémia
• A normális és megváltozott morfológia ill. molekula-expresszió ANALITIKAI TESZT
in situ analízise
• Az analit - kémiailag rögzített, beágyazott, festett - szöveti metszet hátrány: - fiziko-kémiai változások
előny: - konzisztens minta - nem bomlik/fertőz
Pre-analitika Szövetelőkészítés
- RÖGZÍTÉS - Víztelenítés - Beágyazás - Metszés
Formaldehid keresztkötések - sztérikus gátlás - konformáció módosulás
Nehezen standardizálható !
www.ukneqasicc.ac.uk ~700 laboratórium - 7 modul évente 4 forduló – 4 metszet/forduló
Az akkreditáció (CPA) feltétele 3x 10/20 – figyelmeztető levél 4x 10/20 – gyenge teljesítmény NQAAP értesítése
www.nordiqc.com ~ 150 labor Általános modul: 3 forduló/6 antigén/év Emlő modul: 2 forduló/4 metszet/év
optimális - jó - határérték - rossz
Patológiai Program
Gynecocytologia
Hisztotechnológia
QualiCont metszet 2 féle
Saját metszet 2 féle Értékelés • festett metszetek • 4 értékelő 1-5-ig • kommentárok
LabQuality - virtuális
Immunhisztokémia
Patológiai Program
Farmakodiagnosztikumok - terápia
Immunhisztokémia Mintaválasztás •Her2 •ER •Melanoma •Hám-Carcinoma •LCA •Izom •Endotel •Proliferáció •…
ER
Her2
+ 0
2+/FISH-
+ 3+/FISH+
Lép
45. Ford
A leggyakoribb hibalehetőségek
Resons for failure
NORDIQC (Skandináv országok) Fals negatív:
2559 (Slides) metszetből 740 ( 29 %)
Túlhígított primer antitest Elégtelen HIER
Overdiluted primary antibody
Insuffiecient HIER
247 ( 33 %) 243 ( 33 %)
Nem megfelelő primer antitest
107 ( 14 %)
Nem értelmezhető ok
41 ( 6 %)
Fals pozitív: Túl tömény primer antitest
102 ( 4%) Concentrated primary antibody
51 ( 50 %)
Nem megfelelő minőségű primer antitest
16 (16 %)
Túlzott antiténfeltárás
13 (13 %)
A detektáló rendszer nemspecifikus reakciója
19 (19 %)
Nem értelmezhető ok
3 ( 2 %)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Pokilonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Pokilonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Pokilonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Pokilonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Poliklonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU)
Patológiai Program
PROBLÉMÁK
• Saját speciális festést nem értékelünk • Túlrögzült szövet – igen, meg kell oldani • Multiblokk esetén nem jelezzük előre, hogy melyiket mire várjuk • Pokilonális Her2 nem szerencsés – kivéve Herceptest! • Túlhígított primer antitest (RTU) • Javaslat: Antigénfeltárás (metszetadhézió)
10 mM Tris-1 mM EDTA, pH 9.0 (10x) Tris bázis 12,1 g Na2 EDTA 3,72g Deszt.víz ad 1000 ml pH 9-re állítás: kb. 4,5 ml 1N HCl (+ 0.1% Tween 20)
CD20
B-sejt marker - QC
CD79a
IHC
HIER - Műtermékek
-Technológiai
HIER
CD3 CD79a
c-erbB2, saját
3+
Endogén biotin
Alul/elkésett rögzítés
Adatbázis-kezelő program
Dr. Ocsovszki Imre
• Technika és az eredményesség összevetése • Teljesítmény megoszlása fordulónként festésenként • Grafikus ábrázolás • Egyedi szöveges értékelés
Új fejlesztés Paraméteres összesítés adott festés akár összes körére Várható fejlesztések • Technikai adatbevitel - közvetlenül interneten • Értékelés laptop-okkal közvetlen adatbevitellel
Eredményösszesítés
Paraméteres összesítés
Antigénfeltárás
Paraméteres összesítés
Antigénfeltárás
Paraméteres összesítés
Primer antitest
Módszer
Paraméteres összesítés
Inkubáció
Paraméteres összesítés
Automatizálás
Patológiai Program
Digitális mikroszkópia
Hematológiai program Dr. Horváth Katalin
www.pathonet .org QualiCont EQA Run42 ER
+
+ Kiváló proliferációs marker (Ki67) immunhisztokémiai reakció. Erős nukleáris festődés a tonzilla csíracentrumai B-lymphocytáinak nagyrészében (és a tonzilla hám bazális és suprabazális sejtjeiben, valamint elszórtan a perifollikuláris régióban.
Köszönet • Lábdy Mária, Sarró Anikó, Dudás Ágnes Danyiné Szekeres Katalin • Dr. Sárkány Erika, Dr. Horváth Katalin, Dr. Juhász Péter • Dr. Ocsovszki Imre • QualiCont Iroda munkatársai
4% formaldehyde
2-48 h, 24-sample miroarray
Antigen retrieval 0,01 M Citrate pH 6 120oC 1 min 120oC 2.5 min
02h
28h
48h
28h
48h
04h
14h
48h
14h
28h
44h
04h
CD79a – IHC EnVision+
0,01 M TRIS-EDTA, pH 9 120oC 1 min
120oC 2,5 min
04h
Analitikai fázis
Felelősségi körök Pre-analitika
Szakasszisztens (asszisztens)
Rögzítés módja időtartama
Antigénfeltárás hatékonysága
Reagensek minősége/ affinitása Jelző-/előhívórendszer
Immunhisztokémia eredményessége Kontrollok
Patológus
A reakció értékelése értelmezése
Post-analitika
Inkubációs idő hőmérséklet
Reagensek hígítása
Szövetpatológia Külső minőségértékelés - EQA 1996 1984
1993
Gerry Reynolds London Histology Discussion Group
†
EAP Kongreszus Innsbruck
1992
Első próba itthon
Keith Miller, UCL Tony Rhodes
ICC
AFACAP - francia holland, spanyol ...
2009 2000
7 modul ~700 laboratórium
Patológiai Program
1995 Továbbképzés M.-on Keith Miller-rel
ICC
46 Hisztotechnológia 36 Immunhisztokémia (17gynec. cytol. LabQuality)
EU TEMPUS: 1996-2001
Brit értékelők, továbbképzések
KT: Részvétel a UK NEQAS ICC értékeléseiben évente 2x 1996-tól
Her-2 IHC teszt Gyakori technikai hibalehetőségek • Rögzítés - Elégtelen/késleltetett • Beágyazás - Elégtelen víztelenítés • Antigénfeltárás - Elégtelen/túlzott • Reagensek - Tárolási hiba, hígítás • Előhívás - túl hosszú (>10’), csapadékos • Felülfestés - túlzott (cytoplazma, mag)
IHC
Detektáló rendszer
Hatékony HIER (Tris-EDTA; EDTA stb…) • Metabolikusan erősen aktív sejtekben:
Endogén biotin ! máj, vese, mellékvese, emlő gasztointesztinális hám
FALS POZITIVITÁS ! Anti-biotin IgG - vesehám sejtek
Vese
Her2
Hollinshead et al. JHC 48:1053-1057, 1997
Erős expresszió 80-100%
ER
Mérsékelt expresszió >40%
HIER Antigen retrieval
nincs
Ki67
bcl2
CD35 citrate Tris EDTA
0.01M citrát, pH6
0,1 M Tris0,01MEDTA pH9
trypsin
TRS (Dako) pH6 TRS
Szövet multiblokk - „tissue microarray” Mintaszelekció - TMA készítés - in situ teszt - adat és „kép” értékelés/feldolgozás
Hatékony módszer: („high throughput”)
- nagyszámú minta - gyors „sreen”-elés - takarékos - standard
• Tumorok klinikopatológiai tulajdonságai - molekuláris változások • Új próbák széleskörű tesztelése (IHC, ISH) • Alapkutatás (cDNS chip)
-
diagnosztikai/klinikai validálás
• In situ diagnosztikus módszerek technikai validálása
CD79a – IHC EnVision+
(for 16h) 4% formaldehyde fixation Delayed by 2, 4, or 6h after surgery
0,01 M Citrate, pH 6 120oC 1 min
120oC 2,5 min
2h után
6h után
2h után
6h után
2h után
6h után
0,01 M TRIS-EDTA, pH 9 120oC 1 min
120oC 2,5 min 2h után
6h után
Fixation length (4% formaldehydeAntigen retrieval 120oC, 1 min 0.01M citrate, pH6
04h
48h
120oC, 1 min 0,01 M Tris-EDTA, pH9 04h
48h
Delayed fixation (in 4% formaldehyde)
- Antigenicity (morphology)
1 min 0.01M citrate, pH6
2h delay
6h delay
1 min 0,01 M Tris-EDTA, pH9 2h delay
6h delay
EU 7th FRAME PROGRAM (2007 – 2013) Work Programs (€ 50.5 billion)
Health (€ 6.05 billion) Food, Agriculture and Biotechnology
Cooperation (€ 32 billion)
Information and Communication Technologies High –throughput research Nanosciences, Nanotechnologies
Ideas Biotechnology, Detection, diagnosis and monitoring generic tools and Energi People medical Prediction of suitability, safety and efficacy of Environment technologies therapies (incl climate change for human health Capacities Transport (incl Aeronautics) Innovative therapeutic approaches and intervention Socio-economic science and Humanities Nuclear research and Security training
HEALTH-2007-1.2-5: QUALITY STAIN
Standardisation and improvement of pre-analytical Joint Research Space Centre procedures for in vitro tissue diagnostics EU FP7 - HEALTH: QUALITY STAIN
HEALTH-2007-1.2-5: QUALITY STAIN Standardisation and improvement of pre-analytical procedures for in vitro tissue diagnostics.
EU FP7
DK
NEM TÁMOGATTÁK!
UK ICC
Pl
D CZ
SK F
HU I
P E
R
NORVÉG ALAP Pályázat „Régiós/országos tele-diagnosztikai hálózatok technológiájának kidolgozása, komplett rendszerek kifejlesztése, telepítése, tesztelése” Dr Orosz Zsolt – elnök Dr Kulka Janina - főtitkár
www.pathonet.com
Internet
Intranet
Általános patológus
Specialista
1996-ban: 5 diagnosztikus szakma
1. Forduló: 1996
43. Forduló: 2008 május Hisztotechnológia 40-58 Labor
30-48 Labor
2007-ben: 46 Labor
Visszaesés okai:
Immunhisztokémia
36 Labor
Egészségügyi reform - „takarékosság” - intézmény összevonások
Patológiai QualiCont Program Minőségi kontroll
-
metszetértékelés eredménye/kritika
Minőségbiztosítás
információáramlás - egységes standardok közvetítése (protokollok, tapasztalatok terjesztése/kontrollja) - tudományos alapon a függetlenség fenntartásával
Adatáziskezelő program Adatbevitel
a tesztek technikai részletei számszerűsített értékelés/kritika
Automatizálás
- módszer paraméter-eredményesség (grafikus ábrázolás) - értékelő lapok, visszajelzés - átjárhatóság - QualiCont központi adatbank
Proficiency Testing for Histopathology Kredit pont alapú - nem rendszeres Technikai programok •169-190 programok IHC, ISH/FISH, molekuláris (PCR) •178. HistoQIP (2/év): 2 H-E, 2 speciális, 1 IHC •179. Immunhisztokémia (2/év): 8-10-core Her2, EGFR, ER, CD20, CD117 Interpretatív programok: (hasonló a hazai TOTO metszetekhez) •PIP, Performance improvement program (10 ismeretlen eset) Listából kiválasztott diagnózis (40 kredit pont) •Digitális metszet program (5 eset alkalmanként) •Digitális „Online program in dermatology”
uali Patológiai Program ont
H-E
Hisztotechnológia Speciális festés
Rugalmas rost Amyloid Reticulin PAS
Digital/Virtual microscopy
Scanning camera NEW Hitachi camera 3-chip for each pixel
1 pixel = 0,23 µm
20x
NA=0,63
UK NEQAS ICC Her2 teszt A HER-2 értékelés: megfelelőség 36 ország UK és külföldi laborok
B HER-2 értékelés: megfelelőség Csak UK laborok
- Hatékony visszajelzés és ellenőrzés az UK laborokban - UK laborok működési feltétele a NEQAS megfelelés (CPA)
Immunhisztokémia Rögzítés
Antigénfeltárás nincs
CD79a
5’/T-E
10’/T-E
Immunhisztokémia:
Standardizálás - Automatizálás
• Pre-analitika (?) • Analitika • Poszt-analitika (-)
