Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012 KORELASI AKTIVITAS KURKUMIN SEBAGAI ANTIOKSIDAN DENGAN HASIL UJI PENAMBATAN MOLEKUL PLANTS IN SILICO Maulana Tegar1, Hari Purnomo2 Laboratorium Sintesis Organik Fakultas Farmasi UGM Jl. Sekip Utara Yogyakarta-55281, email:
[email protected] 2 Laboratorium Farmakokimia Fakultas Farmasi UGM 1
ABSTRAK Kurkumin merupakan suatu senyawa dari bahan alam yang terdapat dalam Curcuma Longa L yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Aktivitas kurkumin sebagai antioksidan adalah dengan penangkapan radikal bebas.Tujuan penelitian ini adalah mengkorelasi aktivitas kurkumin sebagai antioksidan dengan hasil uji penambatan molekul PLANTS in silico. Protein Data Bank (1HD2) divalidasi untuk memastikan harga RMSD (Root Mean Standard Deviation) < 2. Penambatan molekul dilakukan dengan PLANTS. Preparasi ligand menggunakan MarvinSketch, dengan menggambar senyawa kurkumin kemudian mengoptimasi. Preparasi protein dilakukan dengan program YASARA. Preparasi dilakukan dengan menghilangkan protocol docking (termasuk air jika esensial) yang tidak diperlukan. Setelah semua preparasi selesai, dilakukan docking PLANTS. Penurunan skor menunjukkan kestabilan ikatan ligand dengan protein. Hal yang sama dilakukan terhadap vitamin C. Berdasarkan penambatan molekul PLANTS kurkumin memiliki skor (menggambarkan total energi ikatan) yang lebih stabil (-67.2105) dibandingkan skor vitamin C (-59.6986) untuk berikatan dengan 1HD2. Hal ini sesuai dengan data uji antioksidan yang menyatakan IC50 kurkumin 0.0013 µg/ml lebih kecil dibanding IC50 vitamin C = 1.96 µg/ml ,sehingga dapat disimpulkan bahwa ada korelasi aktivitas kurkumin sebagai antioksidan dengan hasil uji penambatan molekul PLANTS in silico
Kata kunci : antioksidan, radikal, 1HD2, kurkumin, PLANTS.
C - 56
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012 melanin berlebihan dalam kulit, yang tidak hanya membuat kulit lebih gelap, melainkan juga berbintik hitam. Sinar UVA merusak kulit dengan menembus lapisan basal yang menimbulkan kerutan (Fuchs J et al, 1989).
PENDAHULUAN Saat ini ditemukan bahwa ternyata radikal bebas berperan dalam terjadinya berbagai penyakit. Hal ini dikarenakan radikal bebas adalah spesi kimia yang memiliki pasangan elektron bebas di kulit terluar sehingga sangat reaktif dan mampu bereaksi dengan protein, lipid, karbohidrat, atau DNA. Reaksi antara radikal bebas dan molekul itu berujung pada timbulnya suatu penyakit (Sánchez FG et al, 1997). Penjelasan mengenai sumber radikal bebas endogenus ini sangat bervariasi. Sumber endogenus dapat melewati autoksidasi, oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transpor elektron di mitokondria, oksidasi ion-ion logam transisi, atau melalui ischemic. Autoksidasi adalah senyawa yang mengandung ikatan rangkap, hidrogen alilik, benzilik atau tersier yang rentan terhadap oksidasi oleh udara. Contohnya lemak yang memproduksi asam butanoat, berbau tengik setelah bereaksi dengan udara. Oksidasi enzimatik menghasilkan oksidan asam hipoklorit. Di mana sekitar 70-90 % konsumsi O2 oleh sel fagosit diubah menjadi superoksida dan bersama dengan `OH serta HOCl membentuk H2O2 dengan bantuan bakteri. Oksigen dalam sistem transpor elektron menerima 1 elektron membentuk superoksida. Ion logam transisi, yaitu Co dan Fe memfasilitasi produksi singlet oksigen dan pembentukan radikal `OH melalui reaksi Haber-Weiss: H2 O2 + Fe2+ ---> `OH + OH- + Fe3 + (Yasaei PM et al, 1996) .
Gambar 1. Mekanisme Pembentukan radikal bebas Antioksidan sebenarnya didefinisikan sebagai inhibitor yang bekerja menghambat oksidasi dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif yang relatif stabil (S. A. B. E. van Acker et al, 1996). Tetapi mengenai radikal bebas yang berkaitan dengan penyakit, akan lebih sesuai jika antioksidan didefinisikan sebagai senyawa-senyawa yang melindungi sel dari efek berbahaya radikal bebas oksigen reaktif. Salah satu contoh senyawa bahan alam yang memiliki aktivitas antioksidan adalah curcumin.
Secara singkat, xantin oksida selama ischemic menghasilkan superoksida dan xantin. Xantin yang mengalami produksi lebih lanjut menyebabkan asam urat. Sedangkan sumber eksogenus radikal bebas yakni berasal dari luar sistem tubuh, diantaranya sinar UV. Sinar UVB merangsang melanosit memproduksi
Kurkumin merupakan suatu senyawa dari bahan alam yang diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan (Yoshikawa et al, 2000) . Kurkumin merupakan salah satu senyawa yang terdapat dalam Curcuma Longa L. Kurkumin telah dilaporkan berkhasiat sebagai inhibitor angiogenesis baik in C - 57
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012
vitro maupun in vivo (Robinson dkk., 2003). Aktivitas curcumin sebagai
kimia komputasi dengan spesifikasi (Laptop ASPIRE intel® GMA 4500MHD, intel® CoreTM Duo Processor T6500 (2,1 Hz, 800 MHz FSB), 802. 11a/b/g/Draft-N, 320 GB HDD), Perangkat Lunak : PLANTS untuk Docking; MarvinSketch (program ChemAxon 5.2) dan YASARA untuk preparasi ligand dan protein; Paket Program VMD ; Bahan Penelitian : Enzim yang didownload dari situs http/www.pdb.org ; database senyawa digambar sendiri dengan ChemDraw.
antioksidan dapat dianalogkan dengan vit C yang merupakan senyawa antioksidan yang sudah banyak dikenal. Telah diketahui bahwa aktivitas Curcumin sebagai antioksidan dengan penghambatan penghambatan enzim phosporilase. Enzim ini dapat mendegradasi dinding sel sehingga terbentuk suatu radikal bebas. Seperti halnya vitamin C, curcumin dapat digunakan sebagai inhibitor selektif enzim phosporilsae sehingga dapat menghambat beraktivitas sebagai antioksidan.
PROSEDUR a. Preparasi ligan Senyawa yang digunakan dalam penelitian yaitu curcumin. Senyawa ini digambarkan struktur dua dimensinya secara manual menggunakan MarvinSketch (program ChemAxon 5.2). Kemudian struktur yang terbentuk dilakukan optimasi protonation dengan metode Major Microspecies untuk mendapatkan struktur yang disesuaikan dengan PH darah. Optimasi berikutnya adalah menentukan konformasi yang paling sesuai dan cocok dengan reseptor 1HD2, penentuan konformasi ini dengan menggunakan metode conformers. Terdapat 10 konformasi yang mewakili semua posisi ligand terhadap pocket. Konformasi yang paling sesuai dapat diketahui dengan docking (Penambatan Molekul)PLANTS.
Penambatan molekul merupakan suatu metode untuk memprediksikan ikatan ligand dengan reseptor (Alvarez Juan et al, 2005). penentuan aktivitas suatu ligand didasarkan pada score docking. Penurunan skor docking diindikasikan sebagai kestabilan ikatan ligand dengan reseptor, semakin kecil skor docking maka semakin stabil ikatannya dan dengan kata lain semakin poten senyawa tersebut (Schneider G et al,2000). METODE PENELITIAN Alat dan Bahan Perangkat Keras : Satu set computer yang mampu melakukan perhitungan C - 58
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012 temp_conf” lanjutkan dengan “grep -Ev “bindingsite_” temp_conf > temp_conf2”. Untuk mengaktifkan pesan galat diatas ketik “cat temp_conf2 bindingsite.def > plantsconfig”. Setelah semua preparasi selesai maka running docking dilakukan dengan mengetik “./PLANTS --mode screen plantsconfig” kemudian akan muncul 10 konformasi ligand yang berikatan dengan 1HD2 dengan energi yang berbeda-beda. Untuk evaluasi dan iterpretasi data hasil docking ketik “cd results/” lanjutkan dengan “more bestranking.csv”. hasil skor docking akan muncul, kemudian dari 10 input konformasi dipilih yang memiliki energi paling kecil.
b. Preparasi Protein Enzim Homologi modeling dilakukan dengan membuka program YASARA. File fasta dari 1HD2, kemudian load file pdb 1HD2 ke YASARA. Kemudian dihapus bagian dari sistem yang tidak diperlukan dalam protocol docking (yang dibutuhkan hanya satu protein, termasuk air jika esensial, dan satu ligand). Tambahkan hydrogen ke dalam system dengan bantuan YASARA, sebab resolusi struktur Kristal tidak mampu memprediksi keberadaan hydrogen (Edit > Add > Hydrogen to: all). Simpan file sebagai YASARA Object (File > Save as > YASARA Object), simpan sebagai 1HD2.yob. Delete ligand asli sehingga hanya menyisakan protein target saja dengan pocket untuk docking (Edit > Delete > Residue); Pilih Name BEZ, Belongs to or has All, klik “OK” ,simpan sebagai protein.mol2. Koordinat pocket dapat diketahui dengan merujuk pada koordinat ligand 3D asli. Untuk itu hanya diperlukan file mol2 yang hanya berisi ligand asli.
HASIL DAN PEMBAHSAN Telah banyak diketahui bahwa vit C dapat digunakan sebagai antioksidan. Salah satu mekanisme vit C sebagai antioksidan adalah penghambatan ion logam Fe2+ atau Cu2+ memfasilitasi oksigen menjadi singlet oksigen sehingga tidak terbentuk senyawa radikal. Nilai IC50 untuk vitamin C telah disajikan dalam Table 1.
c. Docking PLANTS Buka “console” di CoPendrivelinux-KDE, kemudian ketik perintah “cp /mnt/win/docking_plants/PLANTS PLANTS”. Setelah muncul perintah berikutnya ketik “chmod u+x PLANTS” lanjutkan dengan “./PLANTS” untuk mengaktifkan program PLANTS. Untuk memasukkan protocol docking yang diperlukan ketik “cp /mnt/win/docking_plants/*.mol2 .” kemudian aktifkan plantsconfig dalam proses docking “cp /mnt/win/docking_plants/plantsconfig .” lalu ketik “./PLANTS --mode bind ref_ligand.mol2 5 protein.mol2” untuk memasukkan pocket ke dalam protein yang digunakan sebagai tempat berikatannya dengan reseptor. Setelah dilakukan perbaikan pada ref_ligand maka ketik “grep -Ev “# binding site definition” plantsconfig >
Tabel 1. Nilai IC50 beberapa antioxidant Banyak penelitian mengenai aktivitas kurkumin sebagai antioksidan. Kurkumin memiliki mekanisme antioksidan yang hampir sama dengan vitamin C. Curcumin memiliki nilai IC50 sebesar 0.0013 µg/ml sedangkan nilai IC50 vitamin C adalah 1.96 µg/ml. Hal ini membuktikan bahwa curcumin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan curcumin. C - 59
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012 SCORE SCORE 1HD2 Curcumin Vitamin C Berdasarkan uji in vivo curcumin memiliki aktivitas yang lebih tinggi _entry_00001 -66.769 -59.5626 dibandimgkan vit C. Dari hasil penambatan molekul (docking molecular) maka dapat dikatakan bahwa curcumin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan parasetamol. Diketahui bahwa senyawa curcumin memilki ikatan yang lebih stabil berikatan dengan 1HD2 dibandingkan dengan Vit C, hal ini terlihat dari score docking bahwa senyawa curcumin memiliki energi yang lebih rendah (-67.2015) daripada Vit C (-59.6986) untuk berikatan dengan 1HD2 sehingga dapat dikatakan bahwa senyawa curcumin membutuhkan energi yang lebih kecil dibandingkan Vitamin C untuk berikatan dengan 1HD2, dengan kata memiliki aktivitas sebagai antioksidan yang lebih tinggi. Hal ini juga menunjukkan bahwa adanya korelasi antara uji invivo dengan uji penambatan molekul PLANTS in silico. Aktivitas tersebut juga dapat ditegaskan dengan melihat ikatan curcumin terhadap protein 1HD2. Curcumin memiliki jarak ikatan 1.45 angstrom dengan asam amino leusin 116, hal dapat membuktikan kedekatan curcumin dengan suatu protein target.
_entry_00002
-67.2105
-59.5846
_entry_00003
-66.7355
-59.5793
_entry_00004
-65.3597
-59.5711
_entry_00005
-66.0848
-59.5985
_entry_00006
-66.7282
-59.6565
_entry_00007
-63.5335
-59.6031
_entry_00008
-65.1545
-59.6567
_entry_00009
-66.8175
-59.6254
_entry_00010_
-65.5248
-59.6986
Tabel 2. Nilai skor Penambatan Molekul(Docking Molecular) PLANTS KESIMPULAN 1. Berdasarkan Penambatan Molekul PLANTS dapat disimpulkan bahwa senyawa curcumin memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan vit C. 2. disimpulkan bahwa ada korelasi aktivitas kurkumin sebagai antioksidan dengan hasil uji penambatan molekul PLANTS in silico DAFTAR PUSTAKA
Gambar 3. Jarak ikatan curcumin dengan protein 1HD2
Alvarez Juan, Shoichet Brian. Virtual Screening in Drugs Discovery,.CRC Press, Taylor and France.2005
C - 60
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2012 – ISBN : 978-979-028-550-7 Surabaya, 25 Pebruari 2012
Fuchs J, Huflejt ME, Rothfuss LM, Wilson DS, Carcamo G, Packer L. Impairment of enzymic and nonenzymic antioxidants in skin by UVB irradiation. J Invest Dermatol. 1989;93:769-773. Robinson, T. P., Ehlers, T. Hubbard IV, R. B., Bai, Xianhe, Arbiser, J. L., Goldsmith, D. J., and Bowen, J. P., 2003, Design, Synthetis, and Biological Evaluation of Angiogenesis Inhibitors: Aromatic Enone and Dienone Analogues of curcumin, Bioorg. Med. Chem. Lett, 13, 115-117 S. A. B. E. van Acker, D.-J. van den Berg, M. N. J. L. Tromp, D. H. Griffioen,W. P. van Bennekom,W. J. F. van der Vijgh, and A. Bast, Free Radical Biol. Med. 20 (1996) 331–342. Sánchez FG, Díaz AN, García JA. Relation between the structure of
some heterocyclic derivatives and other compounds, and their ef-fects as enhancers or inhibitors of the luminol-H2O2-horseradish peroxidase chemiluminescence. Photochemistr Photobiol. 1997;105:11-14. Schneider G., Bohm J. Virtual Screening for Bioactive Molecules. WILEYVHC., 49469 Weinheim, Germany. 2000 Yasaei PM, Yang GC, Warner CR, Daniels DH, Kau Y. Singlet oxygen oxidation of lipids resulting from photochemical sensitizers in presence of antioxidants. JAOCS. 1996;73:1177-1181 Yoshikawa, T, S. Toyokuni, Y. Y. Naito, and Y. Yamamoto. Free Radicals in Chemistry, Biology and Medicine OICA International: London, 2000.
C - 61
