Prognosztikai faktorok fej-nyaki laphámrákokban, szerepük a terápia tervezésében
Ph.D. Doktori értekezés tézisei
Írta: Dr. Kraxner Helga
Témavezető: Dr. Szende Béla egyetemi tanár
Programvezető: Dr. Jeney András egyetemi tanár
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 8/1 Patológiai Tudományok 2002
Bevezetés és irodalmi áttekintés
A fej-nyaki régiók (gége, algarat, középgarat és szájüregi régió) laphámrákjai rossz prognózisú daganatok, különösen, ha előrehaladott állapotban kerülnek felismerésre. Jelentőségüket mutatja, hogy incidenciájuk – különösen Magyarországon – folyamatosan emelkedik, egyre agresszívebb, gyorsan progrediáló formák jelennek meg. Hazánkban 1996-ban az összes férfi rákhalálozás 9.9%-át, a női rákhalálozásnak pedig 1.9%-át tették ki, ezzel mindkét nem esetében Magyarország áll az első helyen Európában. A Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinikáján kezelt daganatos betegeknél is az ezekben a lokalizációkban előforduló malignómák a leggyakoribbak,
amelyek
a
hasonló
etiológiai
faktorok
(a
dohányzás
és
az
alkoholfogyasztás a két legfontosabb), hasonló szöveti szerkezet (több, mint 90%-ban elszarusodó, illetve el nem szarusodó laphámrák), valamint a hasonló terápiás elvek és módok miatt viszonylag egységes csoportot képeznek. Ezért vizsgálatainkat csak gége-, algarat-, középgarat- és szájüregi laphámrákos betegek körében (valamint laphámrák sejtvonalon) végeztük, vizsgálati anyagunkba nem kerültek be az Európában jóval ritkábban előforduló, és többnyire más szövettani típusú orrgarat, orr- és orrmelléküreg tumoros esetek, valamint - az egyébként jelentős csoportot képező - bőrtumoros, pajzsmirigy-, és nyálmirigy daganatos betegek sem. A továbbiakban „fej-nyaki tumorok” alatt tehát a gége-, az algarat-, a középgarat- és a szájüreg laphám eredetű karcinómái értendők. Keveset tudunk azokról a prognosztikai tényezőkről, amelyek a fej-nyaki malignómák klinikai lefolyását érintik. Sok egyéb tényező mellett széles körben vizsgált a klinikai TNM stádium, a patológiai TNM stádium, a szövettani grading, az apoptózis- és mitózisindex, bizonyos géntermékek (többek között a p53, bcl-2, Rb, mdm2, PCNA, Ki-67), a sejtenkénti DNS-tartalom (ploidia, DNS-index, S-fázis arány) prognosztikai értéke. Mindezidáig azonban a prognózist egyértelműen előrejelző faktort (ill. faktorokat) nem sikerült találni. A prognosztikai faktorok minél pontosabb megismerésének jelentősége lehet az alkalmazott terápia megválasztása szempontjából is, esetleg lehetővé válhatna egy daganat agresszivitásának megítélése már a kezelés megkezdése előtt. A fej-nyaki laphámrákok primer terápiája legtöbbször a sebészi eltávolítás. Ha ez nem végezhető el a daganat kiterjedése, vagy a beteg rossz általános állapota miatt, esetleg a beteg nem egyezik bele a
2
műtétbe, a következő választandó terápiás lehetőség a sugárkezelés. Az egyes daganatok sugárérzékenysége azonban hasonló klinikai paraméterek, azonos lokalizáció, azonos szövettani típus, azonos grádus mellett is különböző lehet. Irodalmi adatok alapján a fejnyaki karcinómák 30-40 %-a sugárrezisztens. Amennyiben sikerülne a sugárérzékenységet meghatározó prognosztikai faktort vagy faktorokat találni, azok vizsgálata a kezelés megkezdése előtt segíthetne a legmegfelelőbb egyéni, személyre szabott terápia megválasztásában. Ha egy daganat - a faktorok vizsgálata alapján - sugárérzékenynek bizonyul, akkor a sugárkezelés esetleg elsőként választandó terápiás lehetőség is lehetne, amelynek jelentősége lehet a súlyosan csonkító beavatkozások elkerülése, szervmegtartás, funkciómegőrzés szempontjából. Más esetekben továbbra is műtéti, ill. egyéb terápia (pl. citosztatikus kezelés), esetleg több terápiás modalitás kombinálása (pl. műtét és citosztatikum; vagy citosztatikummal kiegészített sugárkezelés) jöhet szóba. Így lehetővé válna az individuális terápia kidolgozása. A későbbiekben ismertetésre kerülő első humán klinikopatológiai vizsgálataink során, valamint in vitro kísérleteinkben is az ionizáló sugárzás sejtpusztító, apoptózist indukáló hatása állt figyelmünk középpontjában. Az apoptózist Kerr és Wyllie írta le 1972-ben. Az apoptózis az aktív sejthalál egyik fő formája, amelyet meghatározott morfológiai és biokémiai változások sorozata jellemez. Indukálhatják különböző fiziológiai és stresszingerek, amelyek több különböző szignálút aktiválásán keresztül vezethetnek aktív sejthalálhoz. A folyamat 2 lépésben történik: először a sejt elkötelezetté válik a sejthalál irányába, ezt követi az effektor fázis, amelyet a sejtszerkezetben bekövetkező sztereotíp morfológiai változások jellemeznek. Az eredmény a szubcellulláris struktúrák rendezett dezintegrációja, membránnal körülvett, ép sejtalkotókat tartalmazó apoptotikus testek létrejötte, amelyet a környező sejtek fagocitálnak. Az apoptózist a nukleáris kromatin kondenzációja és fragmentációja, a citoplazmatikus sejtalkotók tömörülése, az endoplazmatikus retikulum dilatációja, a sejt volumenének csökkenése jellemzi. Nem kíséri a környező sejtekre nézve toxikus anyagok felszabadulása. A folyamatban részt vevő biokémiai események sorozata kalcium- és magnézium-dependens endonukleázok aktiválódásához vezet, ezek az enzimek végzik a nukleáris kromatin fragmentálását. A fragmentálás szelektíven az internukleoszomális linker-régiókban történik, ami által 180200 bázispárból, valamint azok többszöröseiből álló nukleáris fragmentumok keletkeznek. A sejtalkotók közül a mitokondrium központi helyet foglal el a sejthalál folyamatában, ez
3
alapján az apoptózist 3 fázisra oszthatjuk: (a) pre-mitokondriális fázisra, ami sejthalált indukáló inger hatására a különböző jelátvivő (szignál-transzdukciós) utak aktiválódását foglalja magába; (b) mitokondriális fázisra, amikor a mitokondrium membránpotenciálja elvész; (c) poszt-mitokondriális fázisra, amely során a mitokondriumból felszabaduló proteinek aktiválják a kaszpázokat és nukleázokat, szisztematikus celluláris destrukciót eredményezve. Az ionizáló sugárzás által indukált apoptózis Az ionizáló sugárzás többféle úton képes apoptózist kiváltani: DNS-károsító hatása által, valamint a sejtmembránban és a citoplazmában okozott elváltozások útján. Egyelőre azonban nem ismert a pontos mechanizmus, amellyel irradiáció esetén a különböző jelátvivő utak aktiválódhatnak. A DNS-károsodás kiváltotta apoptózisban az ionizáló sugárzás által okozott DNS kettőslánc-törés lehet a primer lézió, amit a sejt DNS-figyelő (monitorozó) rendszere felismer. Ez két, egymással kölcsönösen összefüggő úton indíthat el válaszreakciót. Egyrészt DNS repair-enzimek koncentrálódnak a károsodás helyén az eredeti DNS struktúra helyreállítása céljából. Másrészt jelátvivő kaszkádok indulnak el, amelyek gének egy csoportjának aktiválódásán keresztül a sejtciklus leállását eredményezik - lehetővé téve a DNS hiba kijavítását -, nagyfokú károsodás esetén pedig a sejt apoptózisához vezethetnek. A DNS-károsodás felismerésében a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP), a DNS-dependens protein kináz (DNA-PK), az ATM (ataxia teleangiectasia mutated) protein és a p53 játszanak kulcsfontosságú szerepet, amely fehérjék szoros kapcsolatban vannak egymással. A PARP, a DNA-PK és az ATM a p53 szabályozásán keresztül hatnak, míg a p53 további génekre ill. fehérjetermékeikre fejt ki hatást. Az egyik legfontosabb target a p21 gén, amelynek promoter régiójához kötődve a p53 fokozza a gén transzkripcióját. A p21 protein a ciklin-dependens kinázokat gátolja, aminek következtében a Rb fehérje foszforilációja - amely szükséges lenne az E2F S-fázis specifikus transzkripciós faktor leválásához és aktiválódásához - elmarad, így a sejtciklus leáll G1 fázisban. A repair enzimek helyreállítják az eredeti DNS struktúrát, súlyos károsodás esetén bekövetkezik az apoptózis. Emellett valószínű, hogy a p53 expresszió a G2 fázis megnyúlásához is hozzájárul, fokozza a pro-apoptotikus bax protein termelődését, valamint serkenti a GADD45 (growth arrest DNA-damage) csoportba tartozó fehérjék szintézisét, amelyek megkötik a DNS replikációban szerepet játszó PCNA-t (proliferating
4
cell nuclear antigen), így blokkolják a replikációt. Aktiválja olyan gének transzkripcióját is, amelyek által kódolt (ún. redox related) proteinek reaktív oxigéngyökök keletkezése útján a mitokondriumok oxidatív degradációját eredményezik. A p53 mellett, attól függetlenül egyéb tumorszuppresszor gének fehérjetermékei is szerepet játszhatnak besugárzás után a jelátvitelben. Egyik képviselőjük, az IRF-1 (interferon regulatory factor-1) funkciója részben átfedésben áll a p53 funkciójával. A nukleáris proteineket kódoló BRCA1 és BRCA2 (breast cancer susceptibility) gének fehérjetermékei közül a BRCA1 egy transzkripciós faktor, amely képes a p21 gén transzkripciójának aktiválására p53-tól független úton. Mind a BRCA1, mind a BRCA2 hiányos egerek elpusztulnak már az embrionális fejlődés során. Az ionizáló sugárzás a citoplazmában okozott elváltozások útján is képes apoptózishoz vezetni: a víz radiolízise által direkt módon reaktív hidroxilgyökök keletkezhetnek, amelyek celluláris károsodást, mitokondriális- és sejtmembrán-károsodást okoznak. Irradiációt követően apoptózishoz vezető jelátvivő út a sejtmembránban is indulhat, amelyben a szfingomyelináz enzim aktiválódásának van elsődleges szerepe. A szfingomyelin hidrolízise során ceramid keletkezik, a ceramid az ioncsatornák megnyitásával a mitokondriumok membránpotenciálját csökkenti, ami az apoptózis korai fázisának obligát lépése. Humán leukémia és endotel sejtekben kimutatták, hogy a ceramid apoptózist indukáló hatásához a SAPK (Stress Activated Protein Kinase) kaszkád tagjainak szekvenciális aktiválódása is szükséges. Ceramid a szfingomyelináz enzim aktiválódása nélkül is keletkezhet: humán endotelsejtekben kimutatták, hogy az irradiáció hatására keletkező DNS kettőslánc-törések képesek a ceramid de novo szintéziséért felelős ceramid szintetáz enzimet aktiválni. Az még nem tisztázott, hogy a ceramid szintetáz enzim aktiválódásának van-e szerepe p53 által mediált apoptózisban. Még nem teljesen tisztázott, hogy a besugárzás hatására keletkező DNS- és sejtmembránkárosodás által iniciálódó szignálutak hogyan futnak össze, és okoznak kaszpáz aktivációt. A kaszpázok - cisztein proteázok. Aktiválódásuk hierarchikus rendben történik, és különböző celluláris szubsztrátok hasítását eredményezi - mint pl. a PARP, DNA-PK, Rb protein, laminok (a maghártya fő strukturális proteinjei), H1 hiszton -, kiváltva az
5
apoptózis során tapasztalható morfológiai változásokat. Van néhány kulcsfontosságú kaszpáz (kaszpáz-8 és -10), amely több más kaszpáz aktiválására is képes („iniciátor” kaszpázok), valamint vannak a hierarchiában lejjebb elhelyezkedő ún. „effektor” kaszpázok. A kaszpázoknak az irradiáció által indukált apoptózis folyamatában elfoglalt helye, szerepe még nem teljesen tisztázott. Pro-apoptotikus stimulusokat követően a mitokondriális membránon keresztül citokróm c szabadul fel és áramlik a citoszolba. Valószínű, hogy a citokróm c felszabadulása jelenti a sejt elköteleződését a sejthalál irányába. Úgy tűnik, hogy a citokróm c felszabadulása az apoptózis összes formájában, minden körülmények között bekövetkezik. Okozhatják aktivált kaszpázok, DNS károsodás, növekedési faktor megvonás, Ca2+, oxidánsok. Ez utóbbiak a kaszpázok előzetes aktiválása nélkül is citokróm c felszabaduláshoz vezethetnek. A mitokondriumból felszabaduló citokróm c a citoszolban komplexet képez az Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) fehérjével, amely a citokróm c kötése révén aktiválódik, és aktiválja a prokaszpáz-9-et. Az Apaf-1 N-terminális végén található egy régió (CARD domén), amely erős homológiát mutat néhány kaszpáz prodoménjével (kaszpáz-2, -9). Az aktív Apaf-1 és a prokaszpáz-9 a két CARD doménen keresztül kötődik egymáshoz, így jön létre a prokaszpáz-9 aktivációja aktív kaszpázzá. Az aktív kaszpáz-9 aktiválhatja a prokaszpáz-3-at, az aktív kaszpáz-3 további kaszpázok aktiválásához, egyéb szubsztrátok proteolíziséhez, végső soron a sejt apoptózisához vezet. Úgy tűnik, hogy a külső mitokondriális membránban és egyéb intracelluláris membránokban található, bcl-2 családba tartozó gátló proteinek (bcl-2, bcl-XL) a citokróm c felszabadulásának akadályozása útján fejtik ki anti-apoptotikus hatásukat. Az általunk vizsgált prognosztikai faktorok irodalmi áttekintése Apoptózis-index (AI). Az apoptotikus sejtek százalékos arányát fejezi ki a teljes sejtpopulációhoz viszonyítva. Prognosztikai értékére vonatkozóan ellentmondásosak az eredmények. Szájüregi és szájgarat karcinómás esetek vizsgálatakor Ito és mtsai nem találtak összefüggést az apoptózis-index nagysága és a betegség klinikai lefolyása között. Naresh és mtsai nyelvkarcinómában alacsony apoptózis-index esetén kevesebb nyirokcsomó metasztázist és hosszabb betegségmentes túlélést tapasztaltak. Shintani és mtsai szájüregi laphámrákok vizsgálatakor úgy találták, hogy az alacsony apoptózis-index gyenge sugárterápiás válaszkészséggel jár együtt.
6
Mitózis-index (MI). A mitotikus sejtek százalékos arányát fejezi ki a teljes sejtpopulációhoz viszonyítva.
Egy adott tumorban a sejtek proliferációs aktivitására
jellemző érték, rosszindulatú daganatok esetében a malignitási fok meghatározásának fontos paramétere. Akashi-Tanaka és mtsai lokálisan előrehaladott emlőrákoknál magas mitózis-index
esetén
jobb
hisztopatológiai
válaszkészséget
találtak
preoperatív
kemoterápiára, de a 10 éves túlélés kisebb volt, mint alacsony mitózis-index esetén. Komaki és mtsai eredményei alapján tüdő laphámkarcinómában a magas mitózis-index szignifikánsan nagyobb arányú 5 éves túléléssel, és hosszabb távoli metasztázis-mentes idővel párosul. Tüdő adenokarcinómában ellenkezőleg, alacsony mitózis-index esetén tapasztaltak hosszabb túlélést. Aihara és mtsai prosztata adenokarcinómában nem találtak szignifikáns összefüggést a mitózis-index és a prognózis között. p53 fehérje. A „genom őreként” funkcionál, ha a sejt génkészlete károsodik. Direkt módon vesz részt a sejtciklus szabályozásában, stimulálhatja magát a DNS repair mechanizmust, vagy nagymértékű károsodás esetén beindíthatja az apoptózist, megakadályozva ezzel, hogy a génhiba az utódsejtekbe kerüljön. A p53 gén sérülése esetén a fehérje ellenőrző funkciója nem működik, ennek következtében a sejt genetikailag instabillá válik, genetikai hibák halmozódhatnak fel. A kóros p53 fehérje lassabban bomlik le, mint a normál, felhalmozódik a sejtmagban, ezért immunhisztokémiai reakcióval kimutathatóvá válik. Fej-nyaki karcinómák esetében a közlemények 50-70%-ban jelzik a p53 gén mutációját. A mutáció prognosztikai jelentőségével kapcsolatban ellentmondó eredményeket találunk az irodalomban. Egyes szerzők szerint fej-nyaki daganatokban a p53 génmutáció rossz prognózist jelez, míg mások nem találtak értékelhető kapcsolatot a mutáció jelenléte és a klinikai lefolyás között. Nyelvgyöki karcinómában leírták, hogy a p53 akkumuláció hosszabb túléléssel társulhat. A másik izgalmas kérdés, hogy a mutáns p53 fehérje jelenléte jelzi-e a tumorok terápiás befolyásolhatóságát? Az irodalomban található eredmények ebben a kérdésben sem egységesek. A legtöbb tanulmány szerint a p53 deficiencia emelkedett radiorezisztenciával jár együtt. Ezzel szemben Servomaa és mtsai 20, különböző típusú fej-nyaki laphámrák sejtvonalon a különféle p53 mutációk megnövekedett radioszenzitivitással történő társulását írják le. A legnagyobb szenzitivitást annál a sejtvonalnál találták, amelynél a p53 mindkét allélje hiányzott, a legkisebbet pedig azokban a sejtekben, amelyekben mindkét allél „vad-típusú”, azaz ép volt. Sejtenkénti DNS-megoszlás. A kvantitatív patológiai módszerek csoportjába tartozó egyik legjelentősebb eljárás a sejtenkénti DNS-tartalom meghatározása. A mért adatokat
7
hisztogram formájában jelenítjük meg, és statisztikai módszerekkel értékeljük. A DNShisztogramok matematikai analízise során a sejtenkénti DNS-eloszlásból meghatározzuk a szubpopulációnkénti G0,1-S-G2 fázisú sejtek számát, valamint a normális vagy kóros DNStartalomra utaló mérőszámot (DNS-index). A vizsgált faktorok a következők: Ploidia: egy adott daganatos sejt kromoszóma tartalma normális-e, vagy ettől eltérő. DNS-index (DI): A megváltozott (tumoros) és ép G0,1-fázisú sejtek átlagos DNS-tartalmának a hányadosa. S-fázis arány (SPF%): A DNS hisztogram analízisekor
kapott
S
(szintetikus)
-fázisú
sejtek
%-os
arányát
fejezi
ki
(szubpopulációnként). Poliploid frakció % (PF%): A DNS-hisztogramon a G2-csúcs után jelentkező tartomány. A ploidia (és ezzel együtt a DI érték) sok daganat esetében prognosztikai jelentőséggel bír. Fej-nyaki karcinómáknál általában az aneuploid tumorokat találták agresszívebb lefolyásúnak, ugyanakkor Goldsmith és mtsai gége- és hypopharynx karcinómás betegeknél
aneuploidia
esetén
kedvezőbb
prognózist
tapasztaltak.
Fej-nyaki
malignómáknál sok közlemény az SPF értéket is értékes prognosztikai faktornak tartja. Humán klinikopatológiai vizsgálatok I. Célkitűzés Választ kerestünk arra, hogy vannak-e olyan patológiai faktorok, amelyek fej-nyaki daganatok sugárérzékenységét a terápia megkezdése előtt jelezhetik, valamint mely paraméterek befolyásolhatják primer sugárterápián átesett betegek esetében a prognózist. Az első sugárkezelés előtt vett biopsziás anyagban meghatároztuk az apoptózis-indexet, mitózis-indexet, mutáns p53 expressziót, ploidiát (DI értéket), S-fázis arányt. Irodalmi adatok szerint azonban nemcsak a kezelést megelőzően meghatározott apoptózis-index érték, hanem az apoptózis indukálhatósága is szerepelhet prognosztikai faktorként bizonyos tumorok esetében, ezért az irradiáció első, 2Gy dózisú frakcióját követően a 20. órában ismételten meghatároztuk az AI értékét. Mitózis-index meghatározást és p53 immunhisztokémiai vizsgálatot is végeztünk ebben az időpontban. Több kérdésre kerestük a választ: Az apoptózis- és mitózis-index változása az első 2Gy irradiációt követően használható-e prognosztikai faktorként? A kezelés előtti és az első kezelés utáni paraméterek összehasonlításával lehet-e következtetni korai időpontban az egyes daganatok radioszenzitivitására, így fennállhat-e individuális terápia kidolgozásának
8
lehetősége? Változik-e a p53 expresszió a besugárzás első frakcióját követően? Van-e összefüggés a p53 expresszió és a többi vizsgált paraméter között? Anyag és módszer 15 – primer radioterápiában részesülő – fej-nyak rákos beteget vettünk be a vizsgálatba. Az apoptózis- és mitózis-index meghatározása az első kezelés előtt, valamint azt követően a 20. órában vett, paraffinba ágyazott szövettani mintákból készített metszeteken, hematoxilin-eozin festést követően, morfológiai jellemzők alapján történt. Az apoptózis-indexet Apop-Tag (Oncor, Gaithersburg, MD, USA) immunhisztokémiai festéssel kontrolláltuk. A mutáns p53 expresszió vizsgálata előzetes antigén feltárást (mikrohullámú kezelést)
követően
p53
immunhisztokémiai
festéssel történt, amelyhez
primer
ellenanyagként PB53-12-1 (BioGenex, San Ramon, CA, USA) monoklonális anti-p53 immunglobulint használtunk, valamint avidin-biotin-alkalikus foszfatáz (Vector ABC-AP: Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) technikát alkalmaztunk. Az értékelésnél a mintát negatívnak tekintettük, ha nem találtunk pozitív sejtet, “+” -nak, ha elszórtan néhány izolált pozitív sejt volt identifikálható, “++”-nak, amikor a tumor egyes részein nagy csoportokban találtunk pozitív sejteket, más részek negatívok voltak, “+++”-nak, amikor minden sejt pozitív reakciót adott. A DNS-hisztogram paraméterek meghatározása sejtmag-izolálást, Feulgen-festést követően citofotometriával történt egy digitális képanalizáló rendszer segítségével (DNACE: KFKI-OOI, Budapest, Magyarország). Eredmények és következtetések Mundle megfigyelésével összhangban a spontán apoptotikus rátát alacsonynak találtuk fej-nyaki daganatokban, míg a mutáns p53 fehérjét expresszáló tumorok száma relatíve magas. Az apoptózis indukálhatósága nagyon alacsony volt a vizsgált esetekben, ami összhangban áll a gyenge terápiás effektussal. Alacsonyabb
kiindulási
apoptózis-indexszel
rendelkező
malignómák
megbízhatóbban reagáltak irradiációra, mint a magasabb AI-vel bírók. Nem találtunk azonban összefüggést az apoptózis indukálhatósága és a daganatok sugárterápiás
9
válaszkészsége, valamint a kiindulási apoptózis-index nagysága, annak indukálhatósága, és a betegség várható lefolyása, prognózisa között. A mitózis-index azonnali (első 2 Gy irradiáció utáni) csökkenése a magasabb kiindulási mitózis-index értékek esetén jelentkezett. Azt tapasztaltuk, hogy az MI csökkenése - azaz a nagyobb kiindulási MI érték - jobb terápiás hatékonyságot, és nagyobb esélyt jelenthet a relatíve hosszabb túlélésre. Ezáltal a mitózis-index meghatározása a kezelés megkezdése előtt lényeges lehet a várható terápiás hatékonyság, és a prognózis megítélése szempontjából fej-nyak karcinómás betegek sugárterápiája esetén. A p53 státusz és a prognózis, valamint a p53 pozitivitás és a radioszenzitivitás között nem tudtunk kimutatni kapcsolatot. Magas S-fázis arány és diploid DNS tartalom esetén a tumorok rezisztensebbnek bizonyultak sugárkezeléssel szemben. A túlélésre vonatkozóan azonban nem tudtunk következtetést levonni a DNS-hisztogram paraméterei alapján. Humán klinikopatológiai vizsgálatok II. Célkitűzés Nagyobb létszámú fej-nyak karcinómás beteganyagon – a terápia módjára való tekintet nélkül – a hagyományos klinikai paraméterek, mutáns p53 expresszió és DNS-hisztogram paraméterek prognosztikai jelentőségének vizsgálata, e paraméterek összefüggése a diagnózistól számított teljes túlélési idővel, a terápiát követő recidiva-mentes idő hosszával, és a metasztázis-mentes idővel. Anyag és módszer A Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinikájának 51 betegét vettük be a vizsgálatba. A betegekről részletes adatlapot vettünk fel, rögzítettük a klinikai paramétereket a tumor pontos lokalizációjával (ez utóbbit videoendoszkópos úton is). A betegeket rendszeresen kontrolláltuk. A patológiai paraméterek meghatározását vagy az első, diagnosztikus biopszia során vett szövettani mintából, vagy a primer sebészi terápia során eltávolított szövetblokkból végeztük. A p53 immunhisztokémiai vizsgálat, valamint a sejtenkénti DNS-tartalom vizsgálata a korábbiakban ismertetett módon történt.
10
A
matematikai
analízishez
a
BMDP
Statistical
Software-t
(Dept.
of
Biomathematics, Univ. of California, Los Angeles, USA) használtuk. Eredmények és következtetések A matematikai analízis során nem tudtunk korrelációt kimutatni a betegek klinikai paramétereinek többsége és a prognózis között. Szignifikáns korrelációt találtunk azonban a nyaki nyirokcsomó-státusz és a teljes túlélési idő hossza között: a nyaki nyirokcsomók érintettsége jelentősen lerövidíti a teljes túlélési időt. A klinikai paraméterek közül tehát az N-státusz lehet a legjelentősebb prognosztikai faktor. Eredményeink alapján a p53 gén mutációja egyértelműen csökkenti a metasztázismentes időtartamot fej-nyaki daganatok esetében, nem tudtunk azonban szignifikáns kapcsolatot kimutatni a p53 státusz és a teljes túlélési idő hosszúsága között. A DNS-hisztogram paraméterek közül mind az S-fázis arány, mind a poliploid frakció jelentős prognosztikai faktornak bizonyult. Alacsony S-fázis érték esetén mind a teljes túlélési idő, mind a regionális metasztázis-mentes idő szignifikánsan hosszabb volt, mint magas S-fázis értéknél. Alacsony poliploid frakció mellett szignifikánsan hosszabb teljes- és metasztázis-mentes túlélési időt tapasztaltunk, mint magas poliploid frakció esetén. A fenti eredmények megteremthetik annak gyakorlati lehetőségét, hogy a primer biopsziás
anyagban
a
kóros p53-fehérje kimutatásával
és
a DNS-hisztogram
paramétereinek (S-fázis arány és poliploid frakció) mérésével a klinikus felmérje a tumor agresszivitását, és ennek ismeretében a lehető legpontosabban tervezze meg a terápiát: a műtét kiterjesztését, az elektív nyaki blokk-disszekció, vagy a posztoperatív sugárkezelés szükségességét. Dibrómdulcit és sugárkezelés kombinációjával végzett in vitro vizsgálatok A különböző kiindulási helyű laphámrákok radio-monoterápiája után tapasztalható gyenge túlélési eredmények - a nagyobb terápiás hatékonyság reményében - szükségessé tehetik a kezelés módosítását, amelyre az egyik lehetőség a sugárkezelés kombinálása különböző citosztatikumokkal. A kombinált terápia hatékonyságát sokféle antineopláziás szer alkalmazásával vizsgálták különböző lokalizációjú laphámrákoknál, az eredmények változók.
11
Saját vizsgálatainkhoz a kombinált kezelés hatékonyságának tanulmányozására citosztatikumként a dibrómdulcitot (DBD) választottuk. A DBD egy alkilálószer (ezen belül a citotoxikus hexitek csoportjába tartozó dihalogén hexit), ami a korábbi klinikai tapasztalatok
során
hatékonynak
bizonyult
különböző
kiindulási
helyű
humán
laphámrákokban, többek között fej-nyaki laphámkarcinómákban is. A DBD antineopláziás hatásáért elsősorban a DNS kettősspirálban létrejövő keresztkötések lehetnek felelősek. A DNS mellett a DBD molekulák kötődnek a hiszton és non-hiszton fehérjékhez is, ezáltal megakadályozzák a DNS-hiszton komplexek kialakulását. Célkitűzés In vitro kísérleti modellt állítottunk fel az irradiációból és DBD-ből álló kombinált kezelés hatékonyságának tanulmányozására. Modellünk lehetővé tette, hogy a kemoterápiás szert az irradiációt megelőzően, valamint azt követően adva a kétféle kezelési kombináció hatékonyságát egymással, valamint az önmagában adott besugárzás és citosztatikus kezelés eredményességével összehasonlítsuk. A különböző kezelési módok effektivitására az adott időpontokban meghatározott sejtszám, apoptózis-index és mitózis-index értékek alapján következtettünk. Emellett vizsgáltuk a különböző kezelések hatását a sejtproliferációt és az apoptózist befolyásoló onkoproteinek (p53, Rb, bcl-2, PCNA) expressziójára. Anyag és módszer Kísérleteinkhez A-431 laphámrák sejtvonalat használtunk. A sejteket 24 lyukú Greiner edényekben tenyésztettük 5x104 indulási sejtszámmal. A különböző kezeléseket 6 lyukú Greiner edényekbe leoltott fedőlemezes kultúrákon végeztük, minden kultúra leoltáskor 105 sejtet tartalmazott. A sejttenyészetek besugárzására 4 Gy dózisú Co60-g-irradiációt használtunk (Gammatron-3:
Siemens,
Erlangen,
Németország),
a
DBD-t
15/45mg/ml-es
koncentrációban alkalmaztuk. A dózisokat előkísérletek során határoztuk meg. A vizsgálathoz beállítottunk kontrollcsoportokat, csak irradiációval, csak DBD-vel, valamint a kettő kombinációjával kezelt tenyészeteket is. A kombinált kezelés 2 módon történt: az egyiknél a sejtek a DBD-t előkezelésként, a sugárkezelést megelőzően, a másiknál utókezelésként, a besugárzást követően kapták. DBD előkezelés esetén a DBD-t 24 órával a sejtek leoltása után adtuk, amelyet 24 órával később besugárzás követett. DBD
12
utókezelés esetén 24 órával a leoltást követően történt a tenyészetek besugárzása, amelyet újabb 24 óra múlva követett a DBD kezelés. A tenyészeteket a leoltást követő 72. és 96. órában állítottuk le. Fixálást végeztünk, azt követően pedig sejtszám, apoptózis-, mitózisindex és onkoprotein expresszió meghatározást. A sejtszámolás kezelési formánként 3-3 sejtkultúrából, mosást és tripszines emésztést követően, Bürker hemocitométer használatával történt. Mind az apoptózis-, mind a mitózis-indexet 2000 sejt figyelembe vételével, a sejtek morfológiai jellemzői alapján határoztuk meg HE-nal festett fedőlemezes tenyészetekben, metanolos fixálást követően. Az apoptózist in situ Apop-Detec (DAKO, Glostrup, Dánia) reakcióval kontrolláltuk. Az onkoproteinek meghatározása western blot analízissel történt. Az elsődleges immunreakcióhoz
monoklonális
egér-antitesteket
(DAKO,
Glostrup,
Dánia),
a
másodlagos immunreakcióhoz Vectastain ABC kit-et (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) használtunk. Eredmények és következtetések A DBD és besugárzás együttes alkalmazása esetén laphámrák sejttenyészeten azt tapasztalatuk, hogy a sejtszámokat a kombinált kezelések jobban csökkentették a kontrollhoz képest, mint az önmagában alkalmazott irradiáció. A sejtszámokat vizsgálva a DBD monoterápia szintén hatékonyabbnak bizonyult a sugárkezelésnél, csaknem elérte a kombinált kezelések eredményességét. Apoptózis-index növelés szempontjából ugyancsak azt figyelhettük meg, hogy a kezelési kombinációk az önálló besugárzásnál hatásosabbak voltak. Az önmagában adott DBD kezelés elérte az irradiáció hatékonyságát, de azt nem haladta meg. A mitózis-indexeket vizsgálva minden kezelési módot követően hasonlóan alacsony MI értékeket tapasztaltunk a kontrollhoz képest, lényeges különbség nem mutatkozott az egyes csoportok között. A terápiás modalitások kétféle kombinációja közül (a DBD-t előkezelésként ill. utókezelésként adva) összességében egyik sem tűnt hatásosabbnak a másiknál. Eredményeink azt sugallják, hogy a DBD hasznos lehet sugárkezeléssel kombinációban alkalmazva, de egyedüli eszközként is hatásos fej-nyaki laphámrákok terápiájában. További vizsgálatok szükségesek azonban kombinált kezelés esetén a DBD terápia optimális idejének és dózisának meghatározására, terápiás protokoll kidolgozására.
13
A különböző kezelési módokat követően a p53 és a Rb fehérje szintjében bekövetkező növekedés arra enged következtetni, hogy mindkettőnek szerepe lehet mind a besugárzás, mind a DBD kemoterápia által indukált apoptózis szabályozásában és a proliferáció-gátlásban laphámrák sejtekben. A PCNA expresszió - kezeléseket követően tapasztalt - fokozódása valószínűleg kompenzatórikus túlemelkedés eredménye lehet, és/vagy a DNS-károsodást követően tapasztalható megnövekedett repair funkciót jelezheti. Eredmények és következtetések összefoglalása 1.
Primer sugárkezelésen átesett fej-nyaki laphámkarcinómás betegek vizsgálata során úgy tapasztaltuk, hogy a magas kiindulási mitózis-index, az alacsony apoptózis-index és S-fázis arány, valamint az aneuploid DNS-tartalom kedvezően befolyásolhatja a radioterápia sikerét.
2.
Ugyanebben a betegcsoportban a magasabb kiindulási mitózis-index érték nagyobb esélyt jelenthet a relatíve hosszabb túlélésre is. Ugyanakkor nem találtunk összefüggést sem az apoptózis-index nagysága, az apoptózis indukálhatósága és a túlélési időtartam között, sem a DNS-hisztogram paraméterek és a túlélés között.
3.
Fenti eredmények alapján valószínű, hogy primer radioterápiával kezelt fej-nyaki laphámrákok esetében a terápiás válaszkészséget megjósoló, prediktív paraméterek különbözhetnek a prognózist meghatározóktól.
4.
Nagyobb létszámú fej-nyaki laphámkarcinómás betegcsoport (amelybe különböző módon, többnyire műtéti terápiával kezelt betegek tartoztak) adatainak elemzésekor szignifikáns korrelációt találtunk a nyaki nyirokcsomó-státusz és a teljes túlélési idő között: a nyaki nyirokcsomók érintettsége jelentősen lerövidíti a túlélést. A többi klinikai paraméter és a túlélési idő között azonban nem tudtunk összefüggést kimutatni. Ennek alapján azt mondhatjuk, hogy a klinikai paraméterek közül az Nstátusz a legjelentősebb prognosztikai faktor.
5.
A p53 gén mutációja, illetve a génmutációt mutató daganatsejtek magas aránya egyértelműen csökkenti a nyaki nyirokcsomó-metasztázis megjelenéséig várható időtartamot, de a teljes túlélés időt nem befolyásolja.
6.
Az utóbbi betegcsoportnál a DNS-hisztogramok analízise során mind az S-fázis arány, mind a poliploid frakció jelentős prognosztikai faktornak bizonyult. Alacsony
14
S-fázis értékek esetén mind a teljes túlélési időt, mind a regionális metasztázis-mentes időt szignifikánsan hosszabbnak találtuk, mint magas S-fázis értékeknél. Alacsony poliploid frakció mellett szignifikánsan hosszabb teljes és metasztázis-mentes túlélési időt tapasztaltunk, mint magas poliploid frakció esetén. 7.
A fenti eredmények megteremthetik annak gyakorlati lehetőségét, hogy a primer biopsziás anyag vizsgálata során a kóros p53-fehérje kimutatásával és a DNShisztogram paramétereinek (S-fázis arány és poliploid frakció) meghatározásával a klinikus felmérje egy tumor agresszivitását, és ennek ismeretében a lehető legpontosabban tervezze meg a terápiát: a műtét kiterjesztését, az elektív nyaki blokkdisszekció, vagy a posztoperatív radioterápia szükségességét.
8.
In vitro körülmények között, laphámrák sejttenyészeten a Co60 γ-besugárzás és a citosztatikus kezelés (DBD) együttes hatásának vizsgálatakor úgy találtuk, hogy a kettő kombinációja szignifikánsan hatásosabb volt az önmagában alkalmazott besugárzásnál
mind
sejtszám-csökkentés,
mind
apoptózis-index
növelés
szempontjából. Mitózis-index változás tekintetében nem tapasztaltunk lényeges különbséget a különféle kezelési módok között. Eredményeink azt sugallják, hogy DBD-vel kiegészítve eredményesebbé lehetne tenni a fej-nyaki laphámrákok sugárterápiáját, további vizsgálatok szükségesek azonban a DBD kezelés optimális idejének és dózisának meghatározására. 9.
Bármely − általunk alkalmazott − kezelési mód után a p53 és a Rb fehérje szintjében megfigyelhető növekedés arra enged következtetni, hogy mindkettőnek szerepe lehet mind
a
besugárzás,
mind
a
DBD
kemoterápia
által
indukált
apoptózis
szabályozásában és a proliferáció-gátlásban laphámrák sejtekben. A PCNA expressziónak
a
kezeléseket
követően
tapasztalt
fokozódása
valószínűleg
kompenzatórikus túlemelkedés eredménye lehet, és/vagy a DNS-károsodást követően megnövekedett repair funkciót jelezheti.
15
16
Közlemények 1. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Search for Prognostic Factors in Head and Neck Cancer. Acta Otolaryngologica (Stockholm), Suppl. 527, 145-149 (1997) 2. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Prognosztikai faktorok vizsgálata
fej-nyaki daganatokban. Fül-orr-gégegyógyászat, 43, 162-167
(1997) 3. Tamás L., Kraxner H., Szentkúti G., Ribári O., Répássy G., Járay B., Szentirmay Z.: Kapcsolat a fej-nyaki daganatok metasztatizáló képessége és a sejtenkénti DNStartalom között. Fül-orr-gégegyógyászat, 44, 184-190 (1998) 4. Tamás L., Kraxner H., Mechtler L. Répássy G., Ribári O., Hirschberg A., Szentkúti G., Járay B., Szentirmay Z.: Prognostic Significance of p53 Histochemistry and DNA Histogram Parameters in Head and Neck Malignancies. Anticancer Research, 20, 4031-4038 (2000). 5. Kraxner H., Tamás L., Sáfrány G., Ribári O., Oláh J., Hidvégi E., Répássy G., Szende B.: Apoptotic and Mitotic Activity in Squamous Cell Carcinoma Cells after Combined Modality Treatment with g-irradiation and Dibromodulcitol. Cell Biology International,25, 599-606 (2001)
Előadások 1. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Search for Prognostic Factors in Head and Neck Cancer.
International Conference on
epithelial Hyperplastic Lesion of the Larynx, Ljubljana, Slovenia. October 28-29. 1996 2. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Changes in apoptotic and mitotic activity in squamous cell carcinoma after irradiation and /or
17
chemotherapy. XVIth European Congress of Pathology, Maastricht, The Netherlands. Aug. 31-Sept. 4., 1997 3. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Változások az
apoptotikus
és
mitotikus
aktivitásban
fej-nyaki
laphámcarcinomában
sugárkezelés és/vagy kemoterápia után. Magyar Onkológusok Társaságának XXII. Nemzeti Kongresszusa, Budapest, nov. 10-12, 1997 4. Tamás L., Kraxner H., Járay B., Ribári O., Répássy G., Szentirmay Z.: Relationship between the Cellular DNA Content, p53 Protein Overexpression and Metastatic Potential of Head and Neck Cancer. Int. Symp. on Metastases in Head and Neck Cancer, Kiel, Germany. 15-18 Jan. 1998 5. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Kombinációs kezelés
lehetősége
fej-nyaki laphámrákoknál. Magyar Fül-orr-gégeorvosok
Egyesületének 35. Kongresszusa, Pécs, jún. 17-20, 1998 6. Tamás László, Kraxner Helga, Ribári Ottó, Répássy Gábor, Járay Balázs, Szentirmay Zoltán: Kapcsolat a fej-nyaki daganatok metasztatizáló potenciálja és a p53 génmutáció, illetve a sejtenkénti DNS-tartalom között. Magyar Fül-orrgégeorvosok Egyesületének 35. Kongresszusa, Pécs, jún. 17-20, 1998 7. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Changes in Apoptotic and Mitotic Activity after Irradiation and/or Chemotherapy. 4th Internatinal Congress of the WHMA, Budapest, Hungary. Aug. 27-29, 1998 8. Kraxner H., Tamás L., Szende B., Répássy G.: Combined Modality Treatment with g-irradiation and Dibromo-dulcitol is Squamous Cell Carcinoma Cells. 4th European Congress of Oto-Rhino-Laryngology, Head and Neck Surgery, Berlin, Germany. May 13-18, 2000 9. Kraxner H., Tamás L., Sáfrány G., Hidvégi E., Jeney A., Répássy G., Szende B.: Kombinált kezelés hatásosságának vizsgálata laphámrák sejtvonalon. Magyar Onkológusok Társaságának 24. Kongresszusa, Budapest, nov. 22-24, 2001
18
