Prognosztikai faktorok fej-nyaki laphámrákokban, szerepük a terápia tervezésében

Prognosztikai faktorok fej-nyaki laphámrákokban, szerepük a terápia tervezésében Ph.D. doktori értekezés

Írta: Dr. Kraxner Helga Témavezető: Dr. Szende Béla egyetemi tanár Programvezető: Dr. Jeney András egyetemi tanár

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 8/1 Patológiai Tudományok Budapest 2002

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS..........................................................................................................................................4 2. CÉLKITŰZÉSEK ..................................................................................................................................7 3. IRODALMI ÁTTEKINTÉS .................................................................................................................9 3.1. AZ APOPTÓZIS ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI ..............................................................................................9 3.2. IONIZÁLÓ SUGÁRZÁS ÁLTAL INDUKÁLT APOPTÓZIS .........................................................................12 3.2.1. A DNS-KÁROSODÁS LÉTREJÖTTE ÉS FELISMERÉSE (INTRANUKLEÁRIS SZENZOROK)....................13 3.2.2. EXTRANUKLEÁRIS SZENZOROK ÉS AZ ÁLTALUK KIVÁLTOTT SZIGNÁL-TRANSZDUKCIÓ .................22 3.2.3. A CERAMID SZINTETÁZ ENZIM SZEREPE .......................................................................................27 3.2.4. A CERAMID-SZINTÉZIS SZABÁLYOZÁSA. ANTI-APOPTOTIKUS JELÁTVITEL ....................................28 3.2.5. A KALPAIN SZEREPE .....................................................................................................................30 3.2.6. A KÖZÖS ÚT - KASZPÁZOK SZEREPE .............................................................................................31 3.2.7. A MITOKONDRIUM SZEREPE .........................................................................................................37 3.3 AZ ÁLTALUNK VIZSGÁLT PROGNOSZTIKAI FAKTOROK IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁSA .........................39 3.3.1 APOPTÓZIS-INDEX .........................................................................................................................39 3.3.2. MITÓZIS-INDEX ............................................................................................................................40 3.3.3. P53 FEHÉRJE ................................................................................................................................40 3.3.4. A SEJTENKÉNTI DNS MEGOSZLÁS................................................................................................43 4. SAJÁT VIZSGÁLATOK ....................................................................................................................48 4.1. HUMÁN KLINIKOPATOLÓGIAI KUTATÁSOK I. ..................................................................48 4.1.1. IRODALMI BEVEZETÉS ..................................................................................................................48 4.1.2. CÉLKITŰZÉS .................................................................................................................................48 4.1.3. ANYAG ÉS MÓDSZER ....................................................................................................................49 4.1.3.1. BETEGCSOPORT ........................................................................................................................49 4.1.3.2. PATOLÓGIAI ELJÁRÁS ...............................................................................................................50 4.1.3.3. A VIZSGÁLATOK ÉRTÉKELÉSÉNEK MÓDSZEREI ..........................................................................58 4.1.4. EREDMÉNYEK ..............................................................................................................................58 4.1.4.1. HISZTOLÓGIA ............................................................................................................................58 4.1.4.2. TNM BEOSZTÁS........................................................................................................................58 4.1.4.3. TUMOR-REGRESSZIÓ .................................................................................................................60 4.1.4.4. P53-EXPRESSZIÓ.......................................................................................................................60 4.1.4.5. DNS-HISZTOGRAM PARAMÉTEREK ...........................................................................................63 4.1.4.6. APOPTÓZIS-INDEX (AI) .............................................................................................................63 4.1.4.7. MITÓZIS-INDEX (MI).................................................................................................................66 4.1.5. MEGBESZÉLÉS..............................................................................................................................67 4.1.6. KÖVETKEZTETÉSEK .....................................................................................................................71 4.2. HUMÁN KLINIKOPATOLÓGIAI KUTATÁSOK II..................................................................73 4.2.1. IRODALMI BEVEZETÉS ..................................................................................................................73 4.2.2. CÉLKITŰZÉS .................................................................................................................................74 4.2.3. ANYAG ÉS MÓDSZER ....................................................................................................................74 4.2.3.1.BETEGCSOPORT .........................................................................................................................74 4.2.3.2. PATOLÓGIAI ELJÁRÁS ................................................................................................................74 4.2.3.3.STATISZTIKAI ANALÍZIS ..............................................................................................................76 4.2.4. EREDMÉNYEK ..............................................................................................................................76 4.2.4.1. KLINIKAI PARAMÉTEREK ...........................................................................................................76 4.2.4.2. HAGYOMÁNYOS HISZTOLÓGIAI PARAMÉTEREK .........................................................................77 4.2.4.3. MUTÁNS P53-EXPRESSZIÓ .........................................................................................................77 4.2.4.4. A SEJTENKÉNTI DNS-TARTALOM VIZSGÁLATA .........................................................................78 4.2.5. MEGBESZÉLÉS .............................................................................................................................82 4.2.6. KÖVETKEZTETÉSEK .....................................................................................................................85

2

4.3. DBD ÉS SUGÁRKEZELÉS KOMBINÁCIÓJÁVAL VÉGZETT IN VITRO VIZSGÁLATOK87 4.3.1. IRODALMI BEVEZETÉS ..................................................................................................................87 4.3.2. VIZSGÁLATUNK CÉLKITŰZÉSE ......................................................................................................96 4.3.3. ANYAG ÉS MÓDSZER ....................................................................................................................96 4.3.3.1. SEJTVONAL ÉS SEJTKULTÚRA ....................................................................................................96 4.3.3.2. BESUGÁRZÁS ............................................................................................................................96 4.3.3.3. DIBRÓMDULCIT KEZELÉS ..........................................................................................................97 4.3.3.4. SEJTSZÁM MEGHATÁROZÁS ......................................................................................................97 4.3.3.5. APOPTÓZIS- ÉS MITÓZIS-INDEX MEGHATÁROZÁS......................................................................97 4.3.3.6. KÍSÉRLETI TERV ........................................................................................................................97 4.3.3.7. BCL-2, PCNA, P53 ÉS RB FEHÉRJE-MEGHATÁROZÁS ..............................................................101 4.3.3.8. A VIZSGÁLATOK ÉRTÉKELÉSÉNEK MÓDSZEREI - ÖSSZEFOGLALÁS ...........................................102 4.3.4. EREDMÉNYEK ............................................................................................................................103 4.3.4.1. CO60-g-SUGÁRZÁSSAL VÉGZETT ELŐKÍSÉRLETEK. DÓZIS-VÁLASZ ...........................................103 4.3.4.2. DBD-VEL VÉGZETT ELŐKÍSÉRLETEK. TÁJÉKOZÓDÓ, DÓZIS-KERESŐ VIZSGÁLAT.....................104 4.3.4.3. AZ EGYEDI ÉS KOMBINÁLT KEZELÉSEK HATÁSA ......................................................................104 4.3.5. MEGBESZÉLÉS ...........................................................................................................................110 4.3.6. KÖVETKEZTETÉSEK ...................................................................................................................117 5. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK ÖSSZEFOGLALÁSA ..........................................118 6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...........................................................................................................120 7. IRODALOMJEGYZÉK.....................................................................................................................122 ....................................................................................................................................................................... 8. A SZERZŐ ÉRTEKEZÉSSEL KAPCSOLATOS KÖZLEMÉNYEI ÉS ELŐADÁSAI.............146 9. AZ ÉRTEKEZÉSBEN ELŐFORDULÓ RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ......................................149 ÖSSZEFOGLALÓ.................................................................................................................................151 SUMMARY............................................................................................................................................153

3

1. Bevezetés Vizsgálataink klinikai beteganyagába a Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej- Nyaksebészeti Klinikájának betegei közül a gége-, az algarat-, a középgarat- és a szájüregi tumoros eseteket választottuk be. Ennek oka egyrészről az ezekben a lokalizációkban előforduló malignómák hasonló etiológiája, szöveti szerkezete – amely több, mint 90 %-ban laphámrák (elszarusodó, illetve el nem szarusodó) -, hasonlók a terápiás elvek és módok is (174, 208, 47). Másrészről jelentőségüket előfordulásuk gyakorisága adja (184), a klinikán kezelt daganatos betegségek közül is ezek a tumorok alkotják a legnagyobb csoportot. Vizsgálati anyagunkba nem kerültek be az Európában jóval ritkábban előforduló, és többnyire más szövettani típusú orrgarat, orr- és orrmelléküreg tumoros esetek, valamint - az egyébként jelentős csoportot képező bőrtumoros, pajzsmirigy-, és nyálmirigy daganatos betegek sem. A továbbiakban „fejnyaki tumorok” alatt tehát a gége-, az algarat-, a középgarat- és a szájüreg laphám eredetű karcinómái értendők. Ezen régiók laphámrákjai gyakori, rossz prognózisú daganatok. Incidenciájuk folyamatosan emelkedik, egyre agresszívebb, gyorsan progrediáló formák jelennek meg (184). Hazánkban 1996-ban az összes férfi rákhalálozás 9.9%-át, a női rákhalálozásnak pedig 1.9%-át tették ki, ezzel mindkét nem esetében Magyarország áll az első helyen Európában (184). A fej-nyaki daganatok előfordulása összefüggést mutat környezeti tényezőkkel, a dohányzás és az alkoholfogyasztás jelenti a két legfontosabb etiológiai faktort (174, 208). Ezen kívül felvetik a herpes simplex és a humán papillomavírus (1, 125), valamint szájüregi- és garatrákok esetében a rossz szájhigiéne kóroki szerepét is. Keveset tudunk azokról a prognosztikai tényezőkről, amelyek a fej-nyaki malignómák klinikai lefolyását érintik. Sok egyéb tényező mellett széles körben vizsgált a klinikai TNM stádium (157), a patológiai TNM stádium, a szövettani grading, az apoptózis- és mitózis-index (145), bizonyos géntermékek, többek között a p53 (142), bcl-2 (34), Rb (retinoblastoma), mdm2 (murine double minute 2) prognosztikai értéke. Ugyanígy

4

kutatják a sejtenkénti DNS-tartalom (ploidia, DNS-index, S-fázis arány)1 (178); a proliferációs aktivitásra jellemző antigének (PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen, Ki-67) (12) és számos, tumormarkerként ismert antigén (pl. CEA - Carcinoembrionalis Antigen, SCCA - Squamous Cell Carcinoma Antigen, CYFRA 21-1), enzim (pl. NSE Neuronspecifikus Enoláz) és metabolit (pl. LASA – Lipid-associated Sialic Acid) (153, 205) jelentőségét is a fej-nyaki daganatos betegségek lefolyása, kimenetele szempontjából. Mindezidáig azonban a prognózist egyértelműen előrejelző faktort (ill. faktorokat) nem sikerült találni. A prognosztikai faktorok minél pontosabb megismerésének jelentősége lehet az alkalmazott terápia megválasztása szempontjából is. A fej-nyaki laphámrákok rossz prognózisú daganatok, különösen, ha előrehaladott állapotban kerülnek felismerésre. A legtöbb esetben a sebészi eltávolítás jelenti a primer terápiát. Ha ez nem végezhető el a daganat kiterjedése, vagy a beteg rossz általános állapota miatt, esetleg a beteg nem egyezik bele a műtétbe, a következő választandó terápiás lehetőség a sugárkezelés. Az egyes daganatok sugárérzékenysége azonban hasonló klinikai paraméterek, azonos lokalizáció, azonos szövettani típus, azonos grádus mellett is különböző lehet (13). Irodalmi adatok alapján a fej-nyaki karcinómák 30-40 %-a sugárrezisztens (25). Amennyiben sikerülne a sugárérzékenységet meghatározó prognosztikai faktort vagy faktorokat találni, azok vizsgálata a kezelés megkezdése előtt segíthetne a legmegfelelőbb egyéni, személyre szabott terápia megválasztásában. Ha egy daganat - a faktorok vizsgálata alapján - sugárérzékenynek bizonyul, akkor a sugárkezelés esetleg elsőként választandó terápiás lehetőség is lehetne, amelynek jelentősége lehet a súlyosan csonkító beavatkozások elkerülése, szervmegtartás, funkciómegőrzés szempontjából. Más esetekben továbbra is műtéti, ill. egyéb terápia (pl. citosztatikus kezelés), esetleg több terápiás modalitás kombinálása (pl. műtét és citosztatikum; vagy citosztatikummal kiegészített sugárkezelés) jöhet szóba. Így lehetővé válna az individuális terápia kidolgozása. Ezekből a megfontolásokból kiindulva klinikopatológiai munkám során prognosztikai faktorok vizsgálatával, valamint terápiás jelentőségük kutatásával foglalkoztam. Emellett in vitro kísérletes modellen tanulmányoztam az irradiáció és a citosztatikus kezelés 1

A fogalmak definíciója, rövid magyarázata az értekezés 8. oldalán olvasható.

5

együttes hatását, a terápiás hatékonyság fokozásának lehetőségét többféle modalitás kombinálásával. A vizsgálatok egy részét paraffinba ágyazott szövetblokkokon, másik részét sejttenyészeteken végeztem. A szövettani mintavétel a Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinika betegeiből történt, a minták feldolgozását szövetblokkokká a II. számú Pathologiai Intézet munkatársai végezték. Az apoptózis- és mitózis-indexet minden esetben az I. számú Pathologiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben határoztam meg Szende Béla professzor úr irányítása mellett. A kóros p53 fehérje jelenlétét és a sejtenkénti DNS-tartalmat az Országos Onkológiai Intézet Molekuláris Pathologiai Osztályán vizsgáltam Szentirmay Zoltán tanár úr vezetésével. A sejtkultúrákon végzett kísérletek során a tenyészetek besugárzását és citosztatikus kezelését az Országos Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Kutató Intézetben végeztem Hidvégi Egon professzor úr és Dr. Sáfrány Géza szakmai segítségével. Az onkoproteinek vizsgálata az I. számú Pathologiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben történt Jeney András professzor úr irányítása mellett. Formai megjegyzések Az értekezésben az ábrákat és a táblázatokat arab számokkal jelöltem, amelyeket kiemeltem félkövér betűkkel. Azokban az esetekben, amikor egy korábban szereplő ábrára, vagy táblázatra visszautalok, azok oldalszámát is feltüntettem. Az idézett közleményeket a szövegben szintén arab számokkal, kurzív betűtípussal jelöltem. Az orvosi szavak írásmódjában az MTA ajánlásait követtem (Brencsán: Új orvosi szótár, 2002). Törekedtem a magyar helyesírás szabályainak megfelelő, kiejtés szerinti írásmód alkalmazására azoknál a szavaknál, amelyek esetében az ajánlás ezt lehetővé teszi (pl. limfocita, limfoid). Amelyeknél nem, ott a hagyományos, latin, görög, esetleg angol írásmódot követtem (pl. lymphoma). A rövidítések, mozaikszavak magyarázata e szavak első előfordulása alkalmával, közvetlenül azokat követően szerepel zárójelben, valamint a dolgozat végén, rövidítésjegyzékben is megtalálható, összefoglalva. Azok a patológiai fogalmak (pl. gének, receptorok) amelyek az irodalomban több néven is előfordulnak, az értekezésben – a jobb áttekinthetőség céljából – egyféleképpen szerepelnek: pl. p21/WAF1/CIP1 helyett p21, vagy CD95/Fas/APO1 helyett Fas.

6

2. Célkitűzések 1)

Humán klinikopatológiai kutatásaink során első ízben arra kerestünk választ, hogy melyek azok a faktorok, amelyek fej-nyaki daganatok sugárérzékenységét a terápia megkezdése előtt jelezhetik, sugárterápián átesett betegek esetében a prognózist befolyásolhatják. Prospektív vizsgálatunkba azokat a fej-nyak rákos betegeket vontunk be, akik primer radioterápiában részesültek. Az első sugárkezelés előtt vett biopsziás anyagban olyan faktorokat vizsgáltunk, amelyeknek irodalmi adatok szerint prognosztikai jelentősége lehet: ·

apoptózis-index1,2 (145)

·

mitózis-index3 (186)

·

p53 tumorszuppresszor gén expressziója (17, 112)

·

DNS-index4 (93), ploidia5 (29, 93)

·

S-fázis arány6 (43, 108)

Mivel irodalmi adatok szerint nemcsak a kezelést megelőzően meghatározott apoptózis-index érték, hanem az apoptózis indukálhatósága is szerepelhet prognosztikai faktorként bizonyos tumorok esetében (145), felmerült annak a lehetősége, hogy ezt a szempontot fej-nyaki daganatok prognosztikájában is figyelembe vegyük. Feltételezésünk szerint a besugárzás apoptózist fokozó hatása már az első kezelés után kimutatható. Ebből kiindulva az irradiáció első, 2Gy dózisú frakcióját követően ismételten meghatároztuk az apoptózis-indexet. Mitózis-index meghatározást és p53 immunhisztokémiai vizsgálatot is végeztünk ebben az időpontban. Ezt követően több kérdésre kerestük a választ: ·

Az apoptózis- és mitózis-index változása az első 2Gy irradiációt követően használható-e prognosztikai faktorként?

·

A kezelés előtti és az első kezelés utáni paraméterek összehasonlításával lehet-e következtetni korai időpontban a terápiás hatékonyságra az egyes daganatok esetében, így fennállhat-e individuális terápia kidolgozásának lehetősége?

·

Változik-e a p53 expresszió a besugárzás első frakcióját követően?

·

Van-e összefüggés a p53 expresszió és a többi vizsgált paraméter között?

7

2)

Második humán klinikopatológiai vizsgálat-sorozatunkban retrospektív módon értékeltük a ·

p53 expresszió

·

sejtenkénti DNS-tartalom

prognosztikai szerepét különbözőképpen kezelt, többségében műtéti terápián átesett fej-nyaki laphámrákos betegeken. 3)

Tekintettel a fej-nyaki daganatok primer sugárterápiáját követően tapasztalható gyenge

túlélési

eredményekre,

felvetődött

a

sugárkezelés

kombinálása

citosztatikummal. In vitro modellen a Co60-g-irradiációból és DBD-ből (1,6dibróm-1,6-didezoxi-dulcit)

álló

kezelési

kombináció

hatékonyságát

hasonlítottuk össze a radio-monoterápia, valamint az önmagában alkalmazott DBD kezelés hatékonyságával. Az egyes kezelések effektivitására a különböző időpontokban meghatározott sejtszám, apoptózis-index és mitózis-index értékek alapján következtettünk. Mindenek előtt arra kerestünk választ, hogy a kombinált kezelés hatékonyabb lehet-e az önmagában alkalmazott sugárkezelésnél. Emellett vizsgáltuk az egyes kezelési módok hatását több - a sejtproliferációt és az apoptózist befolyásoló - onkoprotein (p53, Rb, bcl-2, PCNA) expressziójára. Indexszel ellátott fogalmak rövid áttekintése 1

Apoptózis:

Programozott sejthalál, amelyet meghatározott morfológiai elváltozások kísérnek (95).

2

2000 tumorsejtben az apoptotikus sejtek száma százalékban kifejezve.

3

2000 tumorsejtben a mitotikus sejtek száma százalékban kifejezve.

4

A megváltozott (tumoros) és ép G0,1-fázisú sejtek átlagos DNS-

Apoptózis-index: Mitózis-index: DNS-index (DI):

értékének a hányadosa (67). 5

Ploidia:

az adott daganatos sejt kromoszóma tartalma normális-e, vagy ettől eltérő. Euploid sejtekben a DNS-index (DI) egész szám, a diploid sejtek DI-értéke 1. Az aneuploid sejtek DNS-indexe legalább 10%-os eltérést mutat az egész számtól.

6

S-fázis arány:

A DNS hisztogram analíziskor kapott S-fázisú sejtek %-os aránya (szubpopulációnként).

8

3. Irodalmi áttekintés Első, prospektív klinikopatológiai vizsgálataink során, valamint in vitro kísérleteinkben is az ionizáló sugárzás sejtpusztító, apoptózist indukáló hatása állt figyelmünk középpontjában. Ezért a fejezet első részében - az apoptózis általános jellemzőinek összefoglalása után - az ionizáló sugárzás sejtkárosító hatásmechanizmusával kapcsolatos irodalom áttekintése olvasható. Ezt követi az általunk vizsgált prognosztikai faktorok irodalmi összefoglalója. Az in vitro kísérleteinkhez használt citosztatikummal (DBD)

kapcsolatos

irodalom

áttekintése

-

mivel

szorosan

csak

ahhoz

a

kísérletsorozathoz tartozik - közvetlenül a laphámrák sejtvonalon végzett vizsgálatok ismertetése előtt található. Az ionizáló sugárzás sejtkárosító hatását széles körben vizsgálták és vizsgálják. A sugárzás a sejtben több szinten okozhat elváltozást: egyrészt ismert DNS-károsító hatása, emellett elváltozást okozhat a sejtmembrán egyes összetevőiben, valamint a víz radiolízise útján reaktív oxigéngyökök képződése által is károsíthatja a sejtet (199). Adott helyen a károsodás létrejöttekor tisztázatlan mechanizmus útján ún. „alarm szignál” generálódik (182), amely képes jelátvivő utakat aktiválni. A folyamat végső kimenetelét a sejtre és a károsító ágensre jellemző tényezők határozzák meg; többek között függ a sejt típusától, valamint a károsodás mértékétől. Pl. a besugárzásra keletkező kisebb genetikai hibákat a sejtek képesek kijavítani, nagyobb - a repair kapacitást meghaladó - károsodás esetén aktív sejthalál (apoptózis) figyelhető meg, míg bizonyos sugárdózis felett nekrotizálnak a sejtek.

3.1. Az apoptózis általános jellemzői Az apoptózist Kerr és Wyllie írta le 1972-ben (95). Az apoptózis az aktív sejthalál egyik fő formája, amelyet meghatározott morfológiai és biokémiai változások sorozata jellemez. Fontos szerepet tölt be különböző biológiai rendszerek széles skálájában, többek között normál sejtek turnoverében, az immunrendszerben, embrionális fejlődés során, hormon-dependens atrófiában, citosztatikumok és egyéb kémiai szerek által okozott sejthalálban (28). Sok humán betegségben megfigyelhető kóros mértékű

9

apoptózis, pl. neurodegeneratív kórképekben (Alzheimer-kór), isémiás károsodásban, autoimmun betegségekben, rákos megbetegedések különböző formáiban. Az apoptózist indukálhatják különböző fiziológiai és stressz-ingerek, amelyek több különböző szignálút aktiválásán keresztül vezethetnek aktív sejthalálhoz (59). Az apoptózis 2 lépésben történik: először a sejt elkötelezetté válik a sejthalál irányába, ezt követi az effektor fázis, amelyet a sejtszerkezetben bekövetkező sztereotíp morfológiai változások jellemeznek (28). Ez egy közös effektor mechanizmus létét feltételezi különböző sejtekben, ami cisztein proteázok egy csoportja (kaszpázok) és nukleázok aktiválódását foglalhatja magában (199). A folyamat eredménye a szubcellulláris struktúrák rendezett dezintegrációja, membránnal körülvett, ép sejtalkotókat tartalmazó apoptotikus testek létrejötte, amelyet a környező sejtek fagocitálnak. Az apoptózist a nukleáris kromatin kondenzációja és fragmentációja, a citoplazmatikus sejtalkotók tömörülése, az endoplazmatikus retikulum dilatációja, a sejt volumenének csökkenése jellemzi (1. ábra). A plazmamembránban olyan változások jönnek létre, amelyek alapján az apoptotikus sejteket a fagociták felismerik és fagocitálják, gyulladásos reakció nélkül. A folyamatot nem kíséri a környező sejtekre nézve toxikus anyagok felszabadulása (94). Az apoptózis folyamatában részt vevő biokémiai események sorozata kalcium- és magnézium-dependens endonukleázok aktiválódásához vezet (59), ezek az enzimek végzik a nukleáris kromatin fragmentálását. A fragmentálás szelektíven az internukleoszomális linker-régiókban történik, ami által 180-200 bázispárból, valamint azok többszöröseiből álló nukleáris fragmentumok keletkeznek, amelyek agaróz gél elektroforézisen létra-diagram formájában jelennek meg (94). Úgy tűnik, hogy az internukleoszomális DNS hasítás az apoptózis folyamatának relatíve késői eseménye, de egyszerű kimutathatósága miatt a legtöbb szerző ezt tartja a fő kritériumnak annak eldöntésére, hogy egy sejt apoptotikus-e vagy sem.

10

1. ábra1 Az apoptózis folyamata. Ultrastruktúrális változások a sejtben apoptózis során. 1. Normál sejt. 2. Az apoptózis kezdeti lépései: a kromatinállomány feltöredezése, tömörülése a maghártya belső felszíne mentén. A citoplazma kondenzálódása, enyhe behúzódások létrejötte a sejtmembrán és a maghártya felületén. 3. A folyamat gyors progressziója a nucleus fragmentálódásával, a sejtmembrán felszínének kifejezett behúzódásaival,

amely

eredményeként

a

sejtből

membránnal

körülvett,

ép

citoplazmatikus sejtalkotókat és nukleáris fragmentumokat tartalmazó apoptotikus testek keletkeznek. 4. Az apoptotikus testek fagocitózisa a környező sejtek által.

1

Átvéve: Kerr J.F.R., Harmon B.V.: Definition and incidence of apoptosis: an historical perspective. 1. ábra In: Apoptosis, the Molecular Basis of Cell Death. Current Communications 3 in Cell and Molecular Biology (ed.: Tomei L., Cope F.O.) p7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1991) (94)

11

A sejtalkotók közül a mitokondrium központi helyet foglal el a sejthalál folyamatában, ez alapján az apoptózist 3 fázisra oszthatjuk (199): (a) pre-mitokondriális fázisra, ami sejthalált indukáló inger hatására a különböző jelátvivő (szignál-transzdukciós) utak aktiválódását foglalja magába; (b) mitokondriális fázisra, amikor a mitokondrium membránpotenciálja

elvész;

(c)

poszt-mitokondriális

fázisra,

amely

során

a

mitokondriumból felszabaduló proteinek aktiválják a kaszpázokat és nukleázokat, szisztematikus celluláris destrukciót eredményezve. Sokáig a kaszpázok szerepét esszenciálisnak gondolták az apoptózis folyamatában, de létezik kaszpáz-independens apoptózis is (36).

3.2. Ionizáló sugárzás által indukált apoptózis Az ionizáló sugárzás többféle úton képes sejtkárosodást okozni, apoptózist kiváltani (199). Egyrészt DNS-károsító hatása által, ami olyan szignálutak összehangolt aktiválását eredményezi, amelyek felelősek a sejtciklus leállásáért, a DNS-repair folyamatok aktiválásáért, az apoptózisért és a stresszreakcióért. A DNS-károsodást felismerő és jeltovábbító rendszerek a sejtciklust meghatározott ellenőrzési pontokon kontrollálják, az ezeken a helyeken észlelt hibák sejthalálhoz vezethetnek (199). A DNS hibáit felismerő rendszer elemei a károsodás intranukleáris szenzorainak tekinthetők (182). Közéjük tartozik a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP), a DNS-dependens protein kináz (DNA-PK), az ATM (ataxia teleangiectasia mutated) gén fehérjeterméke és a p53 fehérje. A károsodás felismerése együtt jár ún. „alarm szignálok” keletkezésével, amely poli(ADP-ribóz) polimerek szintézisét, valamint foszforilációs kaszkádok protein kinázok által történő elindítását foglalhatja magába (182). Léteznek az irradiáció kiváltotta sejtkárosodásnak extranukleáris szenzorai is. Ennek megfelelően alarm szignál nemcsak a DNS-károsodás helyén, hanem extranukleárisan is generálódhat, részben a sejtmembránban, részben a citoplazmában (182). A sejtmembránban kezdődő, apoptózishoz vezető jelátvivő út indulhat membránhoz kötött kinázok (tirozin kinázok), valamint a szfingomyelináz enzim aktiválódásán keresztül is. A szfingomyelináz a szfingomyelin bontását végzi, amely során ceramid keletkezik. A ceramid - több sejttípus esetében - a másodlagos messenger szerepét tölti be az apoptózis indukció mediálásában irradiációt követően (59, 199). Az ionizáló sugárzás a

12

citoplazmában a víz radiolízise útján, reaktív oxigéngyökök generálásán keresztül képes apoptózishoz vezetni (199). Egyelőre nem ismert a pontos mechanizmus, amellyel a besugárzás a különböző szignálutakat aktiválni képes. Ezek közül a sejtek egyet vagy többet is használhatnak sejttípustól, differenciáltsági foktól, környezettől, sugárdózistól függően. Mérsékelt dózisú besugárzás például, amely már mérhető DNS károsodást okoz és a sejtek túlélését jelentősen csökkenti, nem biztos, hogy komoly károsodáshoz vezet a sejtmembránban, vagy a citoplazmatikus sejtalkotókban (182). Ebben az értelemben a feltételezett alarm-szignál generációja nem szükségszerűen jelenti citoplazmatikus struktúrák károsodását. A p53 molekula központi helyet foglal el a posztirradiációs jelátvitelben, de léteznek p53-independens szignálutak is. A p53-dependens és -independens jelátvivő utak hálózatának összehangolt működése szükséges a sugárzás által indukált sejtválasz létrejöttéhez (182). A sejtválasz magában foglalja bizonyos gének aktiválódását, a sejtprogresszió kontrollját a sejtciklus ellenőrzési pontjain keresztül, replikáció- és transzkripció-gátlást, apoptózis indukciót (182). Az apoptózis bonyolult szabályozás alatt áll, a pro-apoptotikus szignálutak mellett minden sejtben többféle anti-apoptotikus jelátvivő rendszer is működik, amely szabályozza a folyamatot. Végül a pro- és anti-apoptotikus folyamatok egyensúlya határozza meg bármilyen mikrokörnyezeti feltétel esetén az apoptotizáló sejtek arányát (11).

3.2.1. A DNS-károsodás létrejötte és felismerése (intranukleáris szenzorok) A DNS-károsodás létrejötte Az ionizáló sugárzás által okozott celluláris DNS károsodás kb. 60-70 %-a indirekt módon, víz radiolízise által keletkezett szabadgyökök, főként hidroxilgyökök útján jön létre. Ilyenek pl. a purin- és pirimidingyűrű károsodásai, a DNS egyeslánc-törés, a bázisvesztés. Ezekről a károsodásokról azt gondoljuk, hogy nincs nagy jelentőségük az

13

ionizáló sugárzás sejtpusztító és mutagén hatása szempontjából (197). Több ok lehetséges, amelyekre tekintettel a szabadgyökök által indukált DNS-károsodásokat nem tartjuk a sejtre nézve letálisnak: egyrészt az így keletkezett hibák nagyon hasonlóak az oxidatív metabolizmus során létrejövő károsodásokhoz, amelyekből különböző becslések alapján naponta 10.000-150.000 keletkezik spontán egy humán sejtben. Ezekhez az értékekhez képest ionizáló besugárzás esetén, a celluláris közepes letális dózis alkalmazása mellett a szabadgyökök indukálta DNS hibák száma alacsony (197). A keletkezett hibákat egy nagyon hatékonyan működő repair rendszer (BER: base excision repair) kijavítja. Ennek a rendszernek a feladata az endogén DNS-károsodások (pl. spontán purin-vesztés, amin-vesztés, alkiláció) kijavítása is, amelyek egyébként potenciálisan citotoxikusak és mutagének lennének (197). Egy DNS károsodás biológiai konzekvenciáját a repair folyamatok hatékonysága, és a ki nem javított hibák DNS replikációs apparátussal való interakciója határozza meg (197). Egy adott lézió potenciális citotoxicitása és mutagenitása attól függ, hogy egy DNS polimeráz enzim át tudja-e hidalni a léziót, és ha igen, akkor milyen bázist illeszt be. Feltehetően az tekinthető adott sejtre nézve potenciálisan letális léziónak, amely blokkolja a DNS polimerázokat. Ha a léziót egy polimeráz át tudja hidalni, de nem a megfelelő bázist illeszti be, akkor a lézió potenciálisan mutagén. Egy DNS polimeráznak az a képessége, hogy át tud-e hidalni egy adott léziót egy bizonyos bázis beültetésével komplex folyamat, függ a lézió struktúrájától, magától a DNS polimeráztól, valamint a lézió környezetében levő bázisszekvenciától (197). Az ionizáló sugárzás citotoxikus hatásával az általa okozott DNS kettőslánc-törések vannak összefüggésben, ezt tartjuk a primer léziónak a sejthalál folyamatában (197). Martin és Haseltine 125I izotóp segítségével igazolták, hogy ionizáló sugárzás képes DNS kettőslánc-törést okozni (121), a kettőslánc-törés pedig képes apoptózist indukálni (147). A besugárzás hatására direkt módon keletkező kettőslánc-törések mennyisége azonban olyan kicsi, hogy nem tehető az irradiáció okozta sejtpusztulás kizárólagos felelősévé (198). Valószínű, hogy egyéb módon is keletkeznek kettőslánc-törések besugárzás folyamán, pl. egymáshoz közeli szemközti, egyébként nem letális léziók létrejöttekor (pl. szabadgyökök által okozott egyeslánc-törések, bázisvesztések), vagy azok repair folyamata során. Ez különösen azokon a helyeken lehetséges, ahol a DNS halmozottan

14

károsodik a víz - DNS közeli helyen történő - ionizációja és szabadgyökök felszabadulása miatt (197). A DNS-károsodás felismerése Az ionizáló sugárzás hatására keletkező DNS-károsodást a sejt DNS-figyelő (monitorozó) rendszere felismeri, alarm szignált generál, amely két, egymással kölcsönösen összefüggő úton indít el válaszreakciót (182). Egyrészt DNS repair-enzimek koncentrálódnak a károsodás helyén az eredeti DNS struktúra helyreállítása céljából. Másrészt jelátvivő kaszkádok indulnak el, amelyek gének egy csoportjának aktiválódásán keresztül a sejtciklus leállását eredményezik - lehetővé téve a DNS hiba kijavítását -, nagyfokú károsodás esetén pedig a sejt apoptózisához vezetnek. Azok az enzimek, amelyek a DNS-lánc törésekor aktiválódnak, az irradiáció okozta DNS-károsodás potenciális szenzorainak tekinthetők. A DNS-károsodás felismerésében a poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP), a DNS-dependens protein kináz (DNA-PK), az ATM (ataxia teleangiectasia mutated) protein és a p53 játszanak kulcsfontosságú szerepet (182), amely fehérjék szoros kapcsolatban vannak egymással. A PARP, a DNAPK és az ATM a p53 szabályozásán keresztül hatnak, míg a p53 további génekre ill. fehérjetermékeikre fejt ki hatást (ezek közé tartozik a későbbiekben említésre kerülő p21, Rb, bax, mdm2, GADD45 fehérje) (199). A szenzorproteinek közül a PARP a lánctörés helyén kötődik a DNS-hez, ami poli(ADPribóz) polimerek szintézisét eredményezi (6). Ezt követően a PARP-hoz kötött polimerek több olyan nukleáris proteint vonzanak a DNS-károsodás helyéhez, amelyek képesek a polimereket megkötni. A kötődés egy 22 aminosavból álló polimerkötő szekvencián keresztül történik, amelyhez a poli(ADP-ribóz) molekulák non-kovalensen kapcsolódnak. Ilyen szekvenciát tartalmaznak például a p53, a p21, a DNA-PK és a hiszton fehérjék is. A polimerkötés átmenetileg megváltoztatja a proteinek funkcióját, módosíthatja a protein-protein kölcsönhatást egészen addig a lépésig, amikor a poli(ADP-ribóz) glikohidroláz enzim lebontja a polimereket, és megszűnik a fehérjekötés (6). Althaus és mtsai leírták, hogy a p53 molekulának három polimerkötő helye van, kettő a szekvencia-specifikus DNS-kötő doménen, egy pedig a tetramer formációért

15

felelős doménen (6). A p53-hoz kötődő poli(ADP-ribóz) polimerek megváltoztatják a p53 DNS-kötő funkcióját, emellett valószínűleg védik a molekulát a degradációtól, ami nélkülözhetetlen a megfelelő p53 funkció szempontjából DNS károsodást követően (6). A PARP egy másik feltételezett funkciója, hogy a DNS-törés helyét elfoglalva addig is megakadályozza a szabálytalan rekombinációt, amíg a repair enzimek a sérülés körül koncentrálódnak, és kijavítják a hibát (161). A DNA-PK (DNS-dependens protein kináz) szintén szenzor protein, amely képes egy foszforilációs kaszkádot kezdeni, szignál-transzdukciót elindítani (182). A DNS kettőslánc-törés törvégeinek újraegyesítésében van szerepe G1 és S-fázisban. Az enzim egy - a DNS szabad végeihez kötődő - Ku alegységet tartalmaz, amely egy 70 és egy 86 kDa-os alegységből álló heterodimer, valamint egy 460 kDa-os katalitikus alegységet (DNA-PKcs) (28). A potenciális szenzor mechanizmus a Ku-kötés. A PARP és a DNAPK Ku alegysége egymással kompetícióban állnak a szabad DNS-végek kötéséért. A katalitikus alegység (DNA-PKcs) a repair folyamatban, a DNS végek újraegyesítésében szerepet játszó XRCC4 (X-ray repair cross-complementing gene 4) - ligáz IV proteinkomplexet köti (182). A p53 fehérje a p53 tumorszuppresszor gén produktuma, szintén a DNS-károsodás potenciális szenzora. Fontos szerepet játszik az irradiáció hatására létrejövő celluláris válaszban. Sugár hatására - főként poszt-transzlációs mechanizmus útján - p53 szintemelkedés következik be, megnövekszik a p53 fehérje transzportja a sejtmagba, a sejt halad a repair folyamatokat lehetővé tevő sejtciklus leállás, ill. az apoptózis irányába (182, 199). Már egyetlen kettőslánc-törés a nukleáris genomban elegendő lehet a p53 aktiválásához (182). Szoros kapcsolat van a DNA-PK, az alábbiakban részletezésre kerülő ATM (ataxia teleangiectasia mutated) protein és a p53 funkció között (199). A DNA-PK és az ATM a p53 foszforilációját végzi a 15-ös szerinen, ami csökkenti a kötődést az mdm2-höz (az mdm2 a p53 negatív regulátora, a degradációját segíti elő), így stabilizálja a p53 fehérjét. A DNA-PK az mdm2 foszforilációjára is képes a 17-es szerinen, amely ezáltal nem tud a p53-hoz kötődni. Feltételezik, hogy in vivo a DNA-PK addig képes fenntartani a foszforilációt, amíg a DNS-törvégek újraegyesülnek, ekkor inaktiválódik a kináz. Ezt

16

követően az mdm2 a p53-hoz kötődik és annak gyors degradációját okozza (65, 106), így a DNS-károsodás által beindított szignálút inaktiválódik. Az ATM (ataxia teleangiectasia mutated) fehérje egy protein kináz, amely szintén a DNS-károsodás detektálásában részt vevő faktorok hálózatához tartozik (126, 182, 199). A fehérjét kódoló gén ép működése esetén az ATM megteremti a kapcsolatot a DNSkárosodás

felismerése

és

olyan szignálutak aktiválódása között, amelyek a

sejtprogresszió leállásához vezetnek a sejtciklus G1/S, S és G2/M ellenőrzési pontjain, valamint a DNS repair aktiválódását eredményezik (182). Besugárzás kiváltotta DNS-károsodásnál normál ATM funkció esetén az ATM protein a G1/S fázis határán p53 által mediált módon (a p53 foszforilációját végzi a 15-ös szerinen) indukálja p21-et, amely képes a ciklin-cdk (ciklin-dependens kináz) komplexek megkötésére, és gátolja a kinázok (cdk1, 2, 4, 6) aktivitását (56, 75). A ciklinD-cdk4 komplex egyik szubsztrátja a retinoblastoma (Rb) fehérje, amely foszforilációja szükséges ahhoz, hogy az E2F (S-fázis specifikus) transzkripciós faktor képes legyen róla leválni és aktiválódni. Az E2F biológiai funkciója a sejtproliferációt elősegítő gének expressziójának beindítása. A cdk4 gátlása esetén az Rb fehérje hipofoszforilált állapotban marad, továbbra is kötődik az E2F-fel, gátolva a proliferációhoz szükséges génaktivációt. A sejtciklus pedig megáll G1 fázisban, aktiválódnak a repair folyamatok, súlyos károsodás esetén a sejt apoptózissal elpusztul (139). Ataxia teleangiectasiás betegek - normál ATM funkció hiányában - extrém módon érzékenyek besugárzásra, irradiációt követően hiányzik, vagy késleltetett a p53 válasz (199). Az ataxia teleangiectasiához hasonló tünetekkel jár az autoszómális recesszív módon öröklődő Nijmegen breakage szindróma (NBS), amelynek fő jellemzői a kromoszóma instabilitás, sugárérzékenység, daganatos betegségek iránti fogékonyság. Az NBS fehérje valószínűleg ugyanazon a szinten játszik szerepet a DNS károsodásra bekövetkező alarm-szignál generációjában, mint az ATM protein (182). Az NBS fehérjét kódoló gén mutációjának következménye a p53 által mediált sejtválasz elmaradása irradiációindukálta DNS károsodást követően (199). A hiányzó NBS funkció nem helyettesíthető ATM proteinnel.

17

Több kutatócsoport vizsgálatai alapján mind az ATM, mind a DNA-PK képes reakcióba lépni a c-Abl fehérjével (10, 96, 167). A c-Abl egy non-receptor tirozin kináz, amely regulátor szerepét feltételezik DNS-károsodás indukálta apoptózisban. Az ATM és a DNA-PK proteinek komplexet képeznek a c-Abl-lal, amit foszforiláció útján aktiválnak. Az aktív enzim további foszforilációt végez a p53 és a Rb proteineken, gátló hatást fejt ki a sejtciklus progressszióra a G1/S fázis átmenetben. Besugárzást követő DNS károsodás után a G2 fázis megnyúlása is észlehető, amiben szintén szerepe van az ATM proteinnek, és ami az ép, ún. „vad típusú” p53 fehérje hiányában is megfigyelhető (75). A sejtek G2 fázison történő átjutásához, a mitózis fázisába való belépéséhez aktív ciklinB1-cdk1 komplexek létrejötte szükséges. Ez teszi lehetővé, hogy a cdk1 fehérje ki tudja fejteni kináz aktivitását, és létrejöjjön a H1 hisztonok foszforilációja. A foszforilált H1 hisztonok funkcionális jelentősége valószínűleg a mitotikus kromoszóma kondenzáció erősítése lehet (56). Guo és mtsai úgy találták, hogy ionizáló sugárzást követően a foszforilált H1-szint ATM-dependens, p53-independens módon, reverzibilisen lecsökken, amely hátterében kimutatták a H1 hisztonok foszforilációját eredményező kináz aktivitás csökkenését, valamint a foszfatáz aktivitás növekedését (56). A folyamat valószínűleg a sugár indukálta DNS károsodással kezdődik, amelyet az ATM fehérje érzékel, és a megfelelő jelátvivő utak aktiválásával végül a H1 hisztonok foszforilációs szintjének csökkenéséhez vezet. Ennek eredményeképpen feltehetően könnyebben hozzáférnek a DNS repair faktorok a károsodás

helyéhez

(mivel

a

H1

hisztonok

defoszforilációja

a

kromatin

dekondenzációját eredményezi). A H1 foszforilációt lehetővé tevő aktív ciklinB1-cdk1 komplexek kialakulásának - így a sejt G2 fázison történő átjutásának - regulációját illetően leírták, hogy amennyiben a sejt nincs kitéve DNS károsító ágensnek, az aktív komplexek létrejöttét segíti egyrészt a ciklinB1 szintjének a G2 fázisban bekövetkező 10szeres emelkedése (75). Másrészt sorozatos foszforilációk útján szabályozott a cdk1 aktivitása. Az első foszforiláció a 161-es pozíciójú treoninon történik, amely a CAK (Cyclin-dependent kinase Activating Kinase) által katalizált. Amikor a cdk1 fehérje kötődik a ciklinB1-hez, gátló jellegű foszforilációk következnek be a 14-es treoninon és a 15-ös tirozinon. A komplex akkor válik enzimatikusan aktívvá, amikor a cdc25 (cell division cycle 25) foszfatáz mindkét gátló foszfátot lehasítja. Irradiációt követően a cdc25 aktivitása - amely szintén foszforilációk által szabályozott - lecsökken, a cdk1

18

fehérje tartós foszforilációját eredményezve. Így a komplex nem tud aktiválódni, aktív ciklinB1-cdk1 hiányában pedig a sejtciklus leáll G2 fázisban. A gátolt cdc25 funkcióval kapcsolatban Peng és mtsai kimutatták, hogy a sugár hatására bekövetkező DNS károsodás - feltehetően az ATM protein közreműködésével - aktiválja a chk1 (checkpoint kinase 1) enzimet, amely foszforilálja a cdc25-öt a 216-os szerinen (144). Ez a foszforiláció gátolja a cdc25 aktivitását, mivel lehetővé teszi a 14-3-3 protein család tagjainak kapcsolódását a cdc25-höz, amely kötődés feltehetően megakadályozza a serkentő jellegű foszforilációk bekövetkeztét a molekulán (144). Matsuoka és mtsai irradiáció hatására bekövetkező DNS károsodás követően a chk2 (checkpoint kinase 2) fehérje ATM-dependens foszforilációját és aktiválódását mutatták ki (122). A chk2-nek a chk1-hez hasonló funkciót tulajdonítanak: szintén képes a cdc25-öt a 216-os szerinen foszforilálni, ezáltal gátolni a cdc25 aktivitását, ami megakadályozza aktív ciklinB1cdk1 komplexek kialakulását. Ennek következtében a sejt nem tud továbbhaladni G2-ből a mitózis fázisába. Valószínű tehát, hogy besugárzást követően a G2 fázis megnyúlása a cdk1 foszforilációja útján szabályozott, amit a cdc25 foszforilációja kontrollál. A csökkent cdc25 aktivitás mellett besugárzást követő G2 megnyúlás során csökkent ciklinB1 szintet is tapasztaltak (75). A G2 fázis megnyúlásának biológiai szerepe nem teljesen tisztázott. Feltehetően a sejtek genetikai stabilitását, DNS-károsodást követő túlélését, radioszenzitivitását befolyásolja (75). A fent leírt, DNS-károsodást felismerő és jeltovábbító fehérjék közül több is az apoptózis során aktiválódó cisztein proteázok (kaszpázok) targetje, például a PARP, a DNA-PK, a Rb és az ATM protein (199). p53-hoz kapcsolódó szignálutak A korábbiakban említett, DNS károsodást felismerő rendszerek – a már részben ismertetett módokon - további jelátvivő utakat aktiválnak, amely nyomán létrejön a besugárzás által indukált sejtválasz. A p53 molekula központi helyet foglal el a posztirradiációs jelátvitelben, de léteznek p53-independens szignálutak is. A p53dependens és -independens jelátvivő utak hálózatának összehangolt működése szükséges a sejtválasz létrejöttéhez (182). A sejtválasz magában foglalja bizonyos gének

19

aktiválódását, a sejtprogresszió kontrollját a sejtciklus ellenőrzési pontjain keresztül, replikáció- és transzkripció-gátlást, apoptózis indukciót. A p53 a TP53 tumorszuppresszor gén fehérjeterméke. A DNS-károsodáskor keletkező „alarm” szignált egy - apoptózisra vagy sejtciklus leállásra - specifikus szignálút közvetíti a p53 felé (126). A DNS-károsodásra bekövetkező p53-szint emelkedés különböző gének transzkripciójának aktiválódásához vezet (182). Az egyik legfontosabb target a korábbiakban említett p21 gén, amelynek promoter régiójához kötődve a p53 fokozza a gén transzkripcióját. A p21 protein a ciklindependens kinázokat gátolja, aminek következtében a Rb fehérje foszforilációja - amely szükséges lenne az E2F S-fázis specifikus transzkripciós faktor leválásához és aktiválódásához - elmarad, így a sejtciklus leáll G1 fázisban (139, 182, 199). A repair enzimek helyreállítják az eredeti DNS struktúrát, súlyos károsodás esetén bekövetkezik az apoptózis. Ezt követően a hipofoszforilált Rb fehérjét a kaszpázok (a 3.2.6. fejezetben összefoglalt cisztein proteázok) hasítják (199). A kaszpázok által történő hasítás érzékenyebbé teszi a retinoblastoma fehérjét egyéb proteázok hasító hatásával szemben is. A Rb fehérje overexpressziója – valószínűleg a hasító enzimekért való kompetíció által – gátolja a p53-dependens apoptózist. Lehetséges, hogy a p53 expresszió a G2 fázis megnyúlásához is hozzájárul (75). Egyrészt a ciklin-dependens kináz inhibitor p21 indukálásával, ami - bár erősebb gátlást fejt ki a cdk2, 4 és 6-ra -, kisebb affinitással a cdk1 gátlására is képes. Másrészt DNS károsodást követően a normál p53 a 14-3-3 családba tartozó 14-3-3 szigma fehérje mRNS-ének indukciójára is képes (75). A fehérje a korábbiakban említett módon gátolja a cdc25 foszfatáz működését, ezzel megakadályozza az aktív ciklinB1-cdk1 komplexek kialakulását, így a sejtciklus leáll G2 fázisban. A p53 a pro-apoptotikus bax protein transzkripcióját fokozza. A bax fehérje a bcl-2 család egyéb proteinjeivel áll kapcsolatban. A családba tartozó pro- és anti-apoptotikus fehérjék egymással dimereket alkotnak, a különböző dimerek aránya határozza meg az adott sejt apoptózisra való hajlamát (182). /A p53 képes lehet pro-apoptotikus szignálátvitelre a bax-indukciótól független úton is. Ezt támasztja alá az a megfigyelés is, hogy bax-/- timocitákban a p53-dependens apoptózis zavartalanul végbement (199)/.

20

A p53 a GADD45 (growth arrest DNA-damage) csoportba tartozó fehérjék szintézisét serkenti, amelyek megkötik a DNS replikációban szerepet játszó PCNA-t (proliferating cell nuclear antigen), így blokkolják a replikációt (182). A p53 fokozza az mdm2 (murine double minute 2) protein szintézisét, amely a p53 negatív regulátora. Aktiválja olyan gének transzkripcióját is, amelyek által kódolt (ún. redox related) proteinek reaktív oxigéngyökök keletkezését eredményezik. A reaktív oxigéngyökök a mitokondrium komponenseinek oxidatív degradációjához vezetnek. A sugárzás a víz radiolízisével

direkt

módon

is

okozhat

reaktív

oxigéngyök-felszabadulást és

mitokondrium károsodást (182). p53-tól független tumorszuppresszorok által mediált szignálutak A p53 mellett, attól függetlenül egyéb tumorszuppresszor gének fehérjetermékei is szerepet játszhatnak besugárzás után a jelátvitelben (182). Egyik képviselőjük, az IRF-1 (interferon regulatory factor-1) funkciója részben átfedésben áll a p53 funkciójával. IRF-1 hiányos egér embrió fibroblasztok - a p53 hiányos sejtekhez hasonlóan - képtelenek a p21-dependens sejtciklus leállásra gsugárzást követően. A két tumorszuppresszor valószínűleg együttműködik a DNS károsodásra adott sejtválaszban. A nukleáris proteineket kódoló BRCA1 és BRCA2 (breast cancer susceptibility) gének fehérjetermékei közül a BRCA1 egy transzkripciós faktor, amely képes a p21 gén transzkripciójának aktiválására p53-tól független úton, ezzel hozzájárul a sejtciklus leállásához G1 fázisban. A BRCA1 hiányos egerek már az embrionális fejlődés során elpusztulnak. BRCA2 hiányában is megáll az embrionális fejlődés, a sejtek fokozottan radioszenzitívek, fenotípusukat tekintve az ATM hiányos sejtekre hasonlítanak. Mindkét BRCA gén által kódolt fehérje képes lehet kapcsolatot teremteni a sejtciklus kontroll és a DNS repair között (182). Az XRCC4-ligázIV komplexben - amely a DNS végeket egyesítő mechanizmus része - ugyanazon a BRCT (BRCA carboxy terminus)

21

doménen keresztül kötődik a ligáz IV az XRCC4-hez, ami jelen van a BRCA1-ben is és számos DNS repair enzimben. DNS-károsító hatásra sejttípustól, károsító ágenstől függően más-más jelátvivő utak aktiválódásával jöhet létre apoptózis. A p53-independens apoptózist leírták pédául p53deficiens egerek mitogénekkel aktivált T-limfocitáiban, besugárzást követően szintén p53 hiányos egerek gasztrointesztinális epitheliumában, humán colorectalis adenoma és karcinóma sejtvonalban, prosztata sejtekben, endotel sejtekben (199).

3.2.2. Extranukleáris szenzorok és az általuk kiváltott szignál-transzdukció Ionizáló sugárzásnak kitéve a sejteket, léteznek a DNS-károsodástól különböző faktorok, amelyek képesek a p53 protein citoplazmából a sejtmagba történő transzlokációjának serkentésére. Ezek játszhatják a károsodás extranukleáris szenzorainak szerepét (182). Az irradiáció hatására induló extranukleáris alarm-szignálok generációjának pontos mechanizmusa még nem tisztázott. A citoplazmában ionizáló sugárzás hatására a víz radiolízise által direkt módon reaktív oxigéngyökök keletkezhetnek, amelyek celluláris károsodást, mitokondriális- és sejtmembrán-károsodást okoznak (8). A reaktív oxigéngyökök képződésével járó ionizáló besugárzás után a p53 transzlokációja következik be a citoplazmából a sejtmagba. A bcl-2, amely citoplazmatikus membránfehérje (onkoprotein), képes meggátolni a p53 nukleáris importját, a reaktív oxigéngyökök által okozott celluláris károsodást és apoptózist (182). Besugárzáskor a sejtmembránban keletkező egyik extranukleáris alarm-szignál a szfingomyelináz enzim aktiválódása, amely ceramid-képződést eredményez, és apoptózishoz vezet (11). A ceramid metabolizmusát a 2. ábra mutatja. A ceramid a sejtmembránban koncentrálódó szfingomyelin lebontása útján keletkezik. A jelátvitelhez szükséges gyors ceramid-generáció egy szfingomyelin-specifikus foszfolipáz C (szfingomyelináz) aktiválódása útján történik, amely a szfingomyelin foszfodiészter

22

kötésének hidrolízisével ceramidot és foszforilkolint hoz létre. A szfingomyelináz enzimnek 2 típusát írták le, amelyek a pH optimumuk alapján különíthetők el egymástól. A savas szfingomyelináz enzimet (pH optimum: 4.5-5.0) eredetileg mint lizoszomális hidrolázt azonosították, amely a celluláris membránok turnoveréhez szükséges, azonban a plazmamembránban is jelen van. Aktiválása összefügg a Fas, CD28, TNF (tumornekrózis faktor) és IL-1b (interleukin-1b) receptorokon történő jelátvitellel és az ionizáló sugárzással. Egy genetikai betegségben, a Niemann-Pick kórban a savas szfingomyelinázt kódoló gén mutációját találták. A neutrális szfingomyelináz (pH optimuma 7.4) egy Mg2+-dependens enzim, amely a plazmamembrán külső rétegében helyezkedik el, aktiválása a Fas, TNF-a és IL-1b receptorok által indukált sejtválasszal van összefüggésben.

2. ábra A ceramid metabolizmusa

23

Nem teljesen tisztázott az a mechanizmus, amellyel a receptorok ingerlése a szfingomyelináz enzim aktiválódásával párosul. A TNF-a esetében leírtak egy proteint (FAN: Factor Associated with N-sphingomyelinase activation), amely a TNF-a receptort a neutrális szfingomyelinázhoz kapcsolja, míg az ún. TRADD (TNF Receptor Associated Death Domain) protein és a FADD (Fas Associated Death Domain) protein a nevükben jelzett receptor és a savas szfingomyelináz enzim között képes kapcsolatot teremteni (199). Niemann-Pick kóros betegekből vett limfoblasztokon és savas szfingomyelináz deficiens egerekből vett tüdőszöveten végzett vizsgálatokból valószínűsíthető, hogy az ionizáló sugárzás a savas szfingomyelináz enzim aktiválódásával párosul (199), de a pontos mechanizmus nem tisztázott. Az enzim aktiválódása útján keletkező ceramid a másodlagos messenger szerepét töltheti be. Mind a reaktív oxigéngyökök, mind a ceramid a mitokondriumok membránpotenciálját csökkenti az ioncsatornák megnyitásával, amely az apoptózis korai fázisának obligát lépése (182). A szfingomyelináz enzim aktiválódása mellett szintén a sejtmembránban generálódó alarm-szignál a membránhoz kötött tirozin kinázok (epidermális növekedési faktor receptor, Bruton’s tirozin kináz) aktivációja. Ezek közül a Bruton’s tirozin kináz B-sejtes lymphomában nélkülözhetetlennek tűnik sugár indukálta apoptotikus válasz kiváltásában (199). Sejtmembrán-károsodás által generált apoptózis Ashwell és mtsai (8) megfigyelték, hogy az ionizáló sugárzás hatására keletkezett oxigéngyökök károsították a sejtmembrán foszfolipid rétegét és apoptózist váltottak ki B-limfocitákban. A ceramidnak, mint másodlagos messengernek a szerepe a TNF-a által indukált apoptózis mechanizmusának vizsgálatával kapcsolatosan vetődött fel (133). Haimovitz-Friedman és mtsai (57) vizsgálatai szintén a ceramidnak, mint másodlagos messengernek a szerepét igazolták ionizáló sugárzás indukálta apoptózisban. BAEC (bovine aortic endothelial cells) és U937 humán mieloid leukémia sejteket sugaraztak be különböző

dózisokkal,

amelyet

követően 24

másodperceken

belül

megindult

a

szfingomyelin dózis-függő hidrolízise ceramiddá. A protein kináz C (PKC) aktiválása TPA-val (12-O-tetradekanoil-phorbol-13-acetát) teljesen blokkolta a szfingomyelináz aktiválódását, a ceramid keletkezését és az apoptózist, míg a sejtek kezelése exogén ceramiddal visszaállította az apoptózisra való hajlamot. BL30A Burkitt-lymphoma sejtekben TPA-val szintén sikerült meggátolni a sugár-indukálta ceramid generációt és az apoptózist (199). Annak alátámasztására, hogy a szfingomyelináz enzim aktiválódása és a ceramid generációja az ionizáló sugárzás és a sejtmembrán interakciójának következménye lehet, Haimovitz-Friedman és mtsai felállítottak egy kísérletes modellt (58). Sejtmagtól megfosztott humán leukémia sejtek sejtmembrán preparátumait besugarazták, és mérték a ceramid-szint emelkedését. Sugárkezelést követően a ceramidszint másodperceken belül elkezdett emelkedni a preparátumokban, 4 perc elételtével az emelkedés mértéke ugyanakkora volt, mint ép sejtek besugárzása esetén. A ceramid szerepének direkt bizonyítékát in vitro a Niemann-Pick kóros betegekből akik savas szfingomyelináz hiányban szenvednek öröklött módon - vett limfoblasztokon végzett vizsgálatok jelentették (159). A sejtekben még nagydózisú (20 Gy) besugárzást követően sem volt ceramid-szint emelkedés, valamint apoptózis. A szfingomyelináztermelés helyreállítását követően (az enzimet kódoló cDNS-t retrovírusokkal juttatták a sejtekbe) azonban a ceramid generációja a normál szintre állt vissza, és apoptózist is a normál sejtekkel megegyező mértékben tudtak kimutatni. Santana és mtsai in vivo kísérletek során igazolták, hogy a sugárzás legalább 2 egymástól független szignáltranszdukciós úton válthat ki apoptózist, valamint kimutatták a ceramidnak mint másodlagos messengernek a szerepét szfingomyelináz által mediált apoptózisban (159). Savas szfingomyelináz deficiens egerekben vizsgálták a sugár hatására létrejövő ceramid generációt és apoptózist. Normál állatokban a tüdő 20 Gy besugárzását követően a szöveti ceramid-szint 2.3-szorosára emelkedett, és extenzív apoptózist tapasztaltak, míg szfingomyelináz deficiens egerekben sem ceramid-szint emelkedést, sem apoptózist nem tudtak kimutatni még 30 Gy besugárzást követően sem. Összehasonlították továbbá az apoptózisra való hajlamot teljes test besugárzást követően savas szfingomyelináz deficiens és p53 deficiens egerekben. Arra a következtetésre jutottak, hogy a savas szfingomyelináz és a p53 által mediált apoptózis egymástól függetlenül, különböző utakon megy végbe: míg az endocardialis sejtekben, a tüdő endoteliális, valamint a pleura és a pericardium serosus sejtjeiben az apoptózis

25

szfingomyelináz által mediált (és p53 negatív állatokban zavartalan), addig a tímusz Tsejtjeiben az apoptózis p53-dependens, és a szfingomyelinázt kódoló gén deléciója nem befolyásolja. Ezzel ellentétes következtetésre jutottak Dbaibo és mtsai, akik úgy találták, hogy Molt-4 humán leukémia és L929 patkány fibroblaszt sejtekben g-irradiációt követően a ceramid akkumulációja p53-dependens módon zajlott, csak normál p53 funkcióval rendelkező sejtekben volt megfigyelhető (32). Magyarázatára a szerzők feltételezik, hogy az általuk (sugárkezelés után) megfigyelt p53-dependens ceramid-felszaporodás valószínűleg nem a savas, hanem a neutrális szfingomyelináz aktiválódásával állhat kapcsolatban. Ugyanakkor - szintén Dbaibo és mtsai - megfigyeltek p53-independens ceramidakkumulációt is: L929 sejtekben TNF kezelést követően, Molt-4 sejtekben szérum megvonás után (32). Ezek alapján elképzelhetőnek tartják, hogy a kétféle szfingomyelináz enzim aktiválódása függhet a sejtkárosító ágenstől, valamint ugyanolyan károsító hatást követően egy adott sejttípusra, szövetre nézve jellemző lehet. Valószínű, hogy azokban az esetekben, amikor a p53 fehérjének kulcsszerepe van a sejtválasz létrejöttében különböző sejtkárosító hatásokat követően, a p53 a ceramid felett helyezkedhet el a jelátviteli kaszkádban, szabályozza a ceramid generációját, és nem fordítva (32). Humán leukémia és endotel sejtekben kimutatták, hogy a membránkárosodást okozó ionizáló sugárzás (és egyéb stresszhatások, pl. UV sugárzás, hősokk, ozmotikus sokk, növekedési faktor megvonás) apoptózist kiváltó hatásához a SAPK (Stress Activated Protein Kinase) kaszkád tagjainak: SAPK kináz kináz, SAPK kináz, SAPK és JUN foszforiláció útján történő szekvenciális aktiválódása is szükséges (59). Az ionizáló sugárzás gyors ceramid generációt indukál, amely aktiválja a kaszkád tagjait és apoptózist okoz. A kaszkád szerepét támasztja alá, hogy JUN negatív U937 leukémia sejtekben sem stresszhatás, sem exogén ceramid nem váltott ki apoptózist annak ellenére, hogy maga a ceramid képződés és a SAPK aktiváció zavartalan volt. Hallahan és mtsai humán epiteliális tumorsejteken végzett vizsgálatainak eredményei szintén a transzkripciós faktorokat kódoló - JUN géncsalád szignáltranszducer szerepére utalnak ionizáló sugárzás kiváltotta sejtválaszban (60). Besugárzást követően 0.5-3 órán belül a JUN gének expressziójának fokozódását tapasztalták. Cuvillier és mtsai feltételezik, hogy a sejtek apoptotizáló hajlamát végül a pro-apoptotikus SAPK, és a 3.2.4. pontban

26

említésre kerülő anti-apoptotikus, túlélést elősegítő MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) kaszkád aktivációjának egyensúlya határozza meg (31).

3.2.3. A ceramid szintetáz enzim szerepe A besugárzást követő DNS kettőslánc-törések által kiváltott apoptózis mediálásában - a sejtmembrán károsodás által indukálthoz hasonlóan - szintén szerepe lehet a ceramidnak, de a szfingomyelináz enzim aktiválódása nélkül. Haimovitz-Friedman és mtsai endotelsejtekben kimutatták, hogy az irradiáció hatására keletkező DNS kettőslánctörések képesek a ceramid de novo szintéziséért felelős ceramid szintetáz enzimet aktiválni (59). A szintézis az endoplazmatikus retikulumban és a mitokondriumban történik. Szfinganin és zsírsav-koenzimA (FA-CoA) kondenzációjával - amelyet a ceramid szintetáz enzim végez - először dihidroceramid képződik, amely ceramiddá oxidálódik (2. ábra, 23. oldal). Az még nem tisztázott, hogy a ceramid szintetáz enzim aktiválódásának van-e szerepe p53 által mediált apoptózisban, valamint részt vesz-e az apoptózis szabályozásában a G2/M ellenőrzési ponton. Vidair és mtsai kimutatták, hogy patkány embrió fibroblasztokban a sugár-indukálta apoptózis 96 %-a poszt-mitotikus, 1-4 sejtosztódással a károsodást követően történik (195). Az apoptózist megelőző sejtciklusok száma változhat a sejtpopuláción belül. A poszt-mitotikus apoptózis magyarázatára felállítottak egy modellt, amely szerint a sejtek a sugár indukálta G2/M-fázis blockból kikerülve tartalmazhatnak reziduális DNS károsodást, amely kiválthatja a ceramid-szintetáz enzim aktiválódását, ennek mértéke azonban nem elegendő apoptózis indukálásához. Ahogy a besugarazott sejt áthalad az újabb és újabb mitotikus ciklusokon, a DNS károsodás mértéke nő a mutációk és kromoszómaaberrációk folyamatos képződésének köszönhetően. Végül a ceramid szintetáz aktivációjának intenzitása és a ceramid celluláris koncentrációja annyira megemelkedik, hogy - legyőzve az apoptózis ellen ható tényezőket - bekövetkezik az apoptózis. Ez összhangban áll azzal a megfigyeléssel, amely szerint a ceramid szintetáz enzim aktiválódása útján létrejövő ceramid-szint emelkedés órákkal a sugárkezelést követően kezdődik, fokozatos, elhúzódó, a kiindulási ceramid-szint 4-6-szorosát éri el. Ezzel szemben a besugárzás utáni szfingomyelináz aktiváció és ennek következtében

27

kialakuló ceramid termelődés percekkel a kezelést követően alakul ki, és még nagy dózisok esetén sem haladja meg a 1.5-2-szeres emelkedést (58)

3.2.4. A ceramid-szintézis szabályozása. Anti-apoptotikus jelátvitel A ceramid szintetáz enzim aktivitásának szabályozása irradiációt követően egyelőre nem ismert, míg a savas szfingomyelináz által mediált ceramid generáció és apoptózis a DAG/PKC (1,2-diacilglicerol/protein kináz C) jelátvivő rendszer kontrollja alatt áll (133). A PKC aktiválódása a szfingomyelináz enzim gátlása révén védi a sejteket az apoptózistól, amely eredményeképpen nem jön létre a szfingomyelin sugár-indukálta hidrolízise, így gátolt a ceramid-generáció. Bazális fibroblaszt növekedési faktorral (FGF2), amely aktiválja a PKC-t, sikerült a sugár-indukálta apoptózist gátolni endotelsejtekben (57). Ennek a folyamatnak a szignál-transzdukciós mechanizmusában szerepet játszhat az FGF2 receptor tirozin kináz, amely gátlása specifikus inhibitorával (tyrphostinnal) felfüggesztette az FGF2 radioprotektív hatását. Az FGF2 receptor tirozin kináz aktiválódása mellett az FGF2 hatására végbemenő anti-apoptotikus folyamat lépései magukba foglalják a DAG generációt, a citoplazmatikus PKC a-izoformjának a sejtmembránba történő transzlokációját és aktivációját 30 másodperccel az FGF2 stimulust követően. Az FGF2 nem befolyásolja a besugárzás által okozott DNS kettőslánc-törések mennyiségét és a repair-kinetikát (46). A PKC direkt aktivációja TPA-val (12-O-tetradekanoil-phorbol-13-acetát) az FGF2-vel megegyező radioprotektív hatást fejt ki (57). Mind az FGF2, mind a TPA képes meggátolni az apoptózisra jellemző DNS degradációt. HL-60 és U937 humán mieloid leukémia sejtekben kimutatták, hogy a diglicerid, a PKC természetes aktivátora is gátolja a ceramid mediálta apoptózist (199). Ugyanakkor a ceramid - valószínűleg egy foszfatázon keresztül - képes inaktiválni a PKC-a-t (111), ami egy szabályozókör létét feltételezi. U937 sejtekben, TNF-a-val kiváltott apoptózisnál írtak le Cuvillier és mtsai egy mechanizmust (31), amellyel a PKC a MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) kaszkád aktiválása útján gátolja a ceramid mediálta apoptózist. A PKC aktiválja a

28

ceramidáz enzimet, amely a ceramid hidrolízisét végzi. Ezáltal szfingozin keletkezik, amely szfingozin-kináz segítségével szfingozin 1-foszfáttá alakul (2. ábra, 23. oldal). A szfingozin-kinázt a PKC szintén aktiválja. Kimutatták, hogy a szfingozin 1-foszfát másodlagos messengerként viselkedik a MAPK kaszkád aktiválásában, és a TNF-a által indukált apoptózis megakadályozásában. Egyelőre kérdéses, hogy ionizáló sugárzás esetében is így zajlik-e a folyamat. A SAPK kaszkád és a MAPK kaszkád tagjai egymással ellentétes módon vesznek részt az apoptózis szabályozásában (59). A SAPK kaszkád tagjait aktiváló, apoptózishoz vezető hatások csökkentik a MAPK aktivitását, míg a MAPK kaszkádot aktiváló antiapoptotikus tényezők a SAPK aktivitását csökkentik. A PKC-t aktiváló faktorok (pl. FGF2) másodlagosan a MAPK kaszkádot is serkentik. Az ionizáló sugárzás által kiváltott apoptózis szabályozási mechanizmusainak minél pontosabb megismerése lehetséges magyarázatot adhat a sejtek sugárrezisztenciájára is. Azok a sejtek lehetnek sugárrezisztensek, amelyekben az ionizáló sugárzás direkt módon aktiválja a PKC-t (59). Ezzel összhangban sugárrezisztens A549 humán tüdő adenocarcinoma sejtekben kimutatták, hogy a besugárzás a PKC enzim e-izoformját aktiválja (59). Az in vitro leírt szabályozási mechanizmust in vivo is sikerült igazolni: egerek teljestestbesugárzása esetén parenteralisan beadott FGF2-vel sikerült a tüdő mikrovaszkuláris hálózatának endotelsejtjeiben megakadályozni az apoptózist, ami egyébként a sugár okozta tüdőkárosodás patogenezisének kezdeti lépése (46). Emellett az FGF2 meggátolta a letális sugár-pneumonitist is. Az FGF2 nagy affinitással kötődik a vaszkuláris endotelsejtek intralumináris felszínét borító heparan szulfát proteoglikánhoz és nem lép ki a perivaszkuláris térbe, amely felveti a normál szövetek szelektív sugárvédelmének lehetőségét gyógyszeres úton. Így tehát a PKC aktivátorainak sejtvédő hatása apoptózissal szemben nagy klinikai jelentőséggel bírhat. Hallahan és mtsai PKC inhibitorokkol végzett in vitro kísérleteik során két humán laphámrák

sejtvonalon

kimutatták,

hogy

a

PKC

gátlói

növelik

a

sejtek

radioszenzitivitását, fokozzák a besugárzás által indukált sejtpusztulást (61). In vivo vizsgálatok is alátámasztották, hogy tumorok sugárkezelése alatt PKC inhibitorok

29

használatával az apoptózis kiváltásához szükséges küszöb csökkenthető és a tumorsejtpusztulás növelhető (26). A DAG/PKC jelátvivő rendszeren kívül egyéb anti-apoptotikus mechanizmusok is ismertek, pl. a bcl-2 család (181), a p53 aktivitás elvesztése (153), TNF által indukált apoptózisban a NF-kB (nuclear regulatory factor - kappaB) aktiváció (117). Az említettek közül a bcl-2 családnak vannak az apoptózis irányába ható és azzal ellentétes tagjai is. Apoptózis irányába hat pl. a bax, bad, bcl-XS míg a bcl-2, bcl-XL antiapoptotikus. A család tagjainak közös tulajdonsága, hogy képesek homo- és heterodimerek létrehozására. A dimerek összetétele határozza meg egy stimulált sejtben az apoptózisra való hajlamot. Pl. a bcl-2/bax és a bcl-XL/bax anti-apoptotikus hatású, míg a bcl-XS/bcl-2 pro-apoptotikus hatással bír (181). Az IL-3 (interleukin-3) elősegíti a bad foszforilációját,

ami

akadályozza

a

dimerizációt

bcl-XLD-vel

pro-apoptotikus

komplexszé. TPA-val ugyanez a hatás kiváltható, ami a DAG/PKC jelátvivő rendszer szerepére utal az IL-3 anti-apoptotikus hatásában (11).

3.2.5. A kalpain szerepe Irradiáció kiváltotta apoptózisban felvetődik a kalpain szerepe (199). A kalpain egy kalcium-dependens neutrális proteáz, amelynek két izoenzim formája létezik, az mkalpain és a m-kalpain. Régóta feltételezik, hogy a kalcium a sejthalál egyik mediátora, valamint kimutatták, hogy egy sejtmentes rendszerben a kalcium a kaszpáz-aktivitás egyik triggere. A kalpain specifikus inhibitorával - amely az enzim Ca-kötő helyéhez kötődik, és nem gátolja más proteázok aktivitását - sikerült a dexametazon kiváltotta apoptózist megakadályozni timocitákban (199). A kalpain a szubsztrátjait jól definiált fragmentumokra hasítja. Szubsztrátjai közé tartozhat többek között az aktin, a fodrin (citoszkeletális proteinek, amelyek hasítása az apoptózis során megfigyelhető sejtzsugorodással és sejtmembrán felhólyagosodással állhat kapcsolatban), a p53 (a kalpain a p53 fehérje stabilitásának szabályozásában vehet részt), továbbá HL-60 humán leukémia sejtek gyógyszer indukálta apoptózisa során a bax (a bcl-2 géncsalád pro-apoptotikus tagja) (199).

30

A kalpainnak sugár által indukált apoptózisban is szerepe lehet, például timociták és Burkitt-lymphoma sejtek irradiáció kiváltotta apoptózisában (199). Sugárérzékeny Burkitt-lymphoma sejtekben a kaszpáz aktivitást szabályozza, míg sugárrezisztens Burkitt-lymphoma (BL30K) sejtekben nem aktiválódik. A kalpain valószínűleg a sugár által indukált apoptózis korai fázisának regulációjában vesz részt (199).

3.2.6. A közös út - kaszpázok szerepe Még nem teljesen tisztázott, hogy a besugárzás hatására keletkező DNS- és sejtmembrán-károsodás által iniciálódó szignálutak hogyan futnak össze, és okoznak kaszpáz aktivációt. A kaszpázok - cisztein proteázok. Jelentőségükre akkor figyeltek fel, amikor felismerték, hogy az emlősök sejtjeiben található egyik cisztein proteáz, az interleukin-1b-konvertáló enzim (ICE) kifejezett szekvencia hasonlóságot mutat a nematoda Caenorhabditis elegans CED-3 proteinjével, amely elengedhetetlen a normál egyedfejlődéshez szükséges apoptózis létrejöttéhez. Ezzel összhangban megfigyelték, hogy az ICE overexpressziója apoptózist indukál, ami arra enged következtetni, hogy az ICE kulcsszerepet tölthet be az apoptózis indukciójában (28). Az ICE apoptózisban való jelentőségének felismerése óta azonosították az egymáshoz kapcsolódó cisztein proteázokból álló, apoptózis során aktiválódó enzimcsalád egyes tagjait, amelyeket kaszpázoknak neveztek el. A kaszpázok 3 alcsaládba oszthatók: ICE-alcsalád (ebbe tartozik a kaszpáz-1, -4, -5, -13), CED-3 alcsalád (a kaszpáz-3, -6, -7, -8, -9, -10 proteázokat foglalja magába) és ICH-1 alcsalád (amelybe egy ICE és CED-3 homológ proteáz, a kaszpáz-2 tartozik) (114, 149). A

kaszpázok

inaktív

proenzimek

formájában

szintetizálódnak,

aktiválódásuk

meghatározott helyeken történő enzimatikus hasítás útján következik be, hierarchikus rendben (28). Minden kaszpáz tartalmaz egy N-terminális peptidet (prodomént), valamint egy nagy és egy kis alegységet. Néhányuk esetében a nagy és a kis alegységet egy ún. linker régió választja el egymástól, amely funkciója nem teljesen tisztázott, de valószínűleg az enzim aktivációjának szabályozásában lehet szerepe. A legtöbb kaszpáz

31

esetében hasonló funkciót tulajdonítanak a prodoménnek is. Alternatív splicing miatt sok kaszpáznak léteznek izoformjai, amelyek feltehetően az enzimaktivitás regulátoraiként viselkednek. Egyrészt inhibitorként, másrészt inaktív heteromer komplexek képződése útján vehetnek részt a szabályozásban (28). A kaszpázok apoptózis során történő aktivációja különböző celluláris szubsztrátok hasítását eredményezi - mint pl. a PARP, DNA-PK, Rb protein, laminok (a maghártya fő strukturális proteinjei), H1 hiszton -, kiváltva az apoptózis során tapasztalható morfológiai változásokat (28). Néhány kaszpáz egymást átfedő szubsztrát specificitással rendelkezik, pl. a PARP-t a kaszpáz-3 és kaszpáz-7 is bontja, ugyanakkor pl. a kaszpáz-3 többféle szubsztrát proteolízisét is végzi (PARP, DNA-PK, Rb protein). Más kaszpázok szubsztrát specificitásában azonban átfedés nem tapasztalható, pl. a laminok bontásában csak a kaszpáz-6 ismert. A PARP proteolízise során egy 24 kDa-os, az N-terminális DNS-kötő domént tartalmazó és egy 89 kDa-os, a C-terminális katalitikus domént tartalmazó fragmentum keletkezik, ezáltal valószínűleg megszűnik az enzim DNS repair funkciója (28). A PARP hasításának biológiai relevanciája még nem tisztázott. A kaszpáz-3 végzi DNA-PK katalitikus alegységének bontását, ami az apoptotizáló sejtben a DNS repair kapacitás csökkenését eredményezi, ezzel elősegítve az apoptózisra jellemző DNS degradációt. A laminoknak, a maghártya fő struktúrális proteinjeinek a proteolízise megfigyelhető különböző apoptotizáló sejtekben, és felelős lehet néhány, az apoptózis során megfigyelhető

nukleáris változásért. A laminok bontásának eredményeképpen

megszűnik a lamin-lamin kölcsönhatás, valamint a laminok interakciója egyéb nukleáris komponensekkel. A kaszpáz-6-ot tartják apoptotizáló sejtekban a fő lamináz funkciójú enzimnek, amely aktivitásának szabályozásában szerepe van a bcl-2 és bcl-XL proteineknek. Az apoptózis során tapasztalható sejtzsugorodás és sejtmembrán felhólyagosodás a citoszkeletális proteinek hasításának eredménye lehet, amelyek egyike a fodrin. Az afodrin egy membrán-asszociált citoszkeletális protein, a Fas és TNF receptorok által mediált

apoptózis

során

gyorsan

elhasad,

ami

valószínűleg

a

sejtmembrán

felhólyagosodásával áll kapcsolatban. Amint a korábbiakban említésre került, a fodrin

32

proteolízisére a kalpain is képes lehet (199), de a kaszpázok szerepe sem zárható ki. Az enzimcsalád tagjai közül a kaszpáz-6 végezheti nagy valószínűséggel a hasítást (28). A protein kináz C d-t a kaszpáz-3 egy katalitikusan aktív fragmentummá alakítja. Ennek a fragmentumnak az overexpressziója - de a teljes hosszúságú enzimé nem - kromatin kondenzációhoz, nukleáris fragmentációhoz és sejthalálhoz vezet, ami valószínűvé teszi, hogy a protein kináz C d proteolitikus aktivációja hozzájárul az apoptózisra jellemző fenotípus bizonyos jegyeinek kialakításához (28). Leírták a Rb protein hasadását is apoptózis során, amely eredményeképpen különböző nagyságú hasítási termékek keletkezhetnek. Ez több kaszpáz lehetséges szerepére utal a Rb fehérje proteolízisében, amelyek egyike valószínűleg a kaszpáz-3 (28). A kaszpáz aktivitásnak a sejtben léteznek inhibitorai, amelyek részt vesznek az apoptózis szabályozásában. Az inhibitorok közé soroljuk a bcl-2 család egyes tagjait (bcl-2, bcl-XL) és a CrmA (citokine response modifier) gén fehérjetermékét, amelyek a különböző, apoptózishoz vezető szignálutakat különbözőképpen befolyásolják. Azok a szignálutak, amelyek a bcl-2/ bcl-XL okozta gátlásra szenzitívek, rezisztensek a CrmAval szemben és fordítva. Ez alapján az apoptózis indukciónak létezhet egy CrmA szenzitív/ bcl-XL inszenzitív és egy bcl-XL szenzitív/CrmA inszenzitív útja. Mivel a bcl2 családba tartozó fehérjék, és a CrmA protein különböző - általában egymással ellentétes - mértékben gátolják az egyes kaszpázok aktivitását, a CrmA szenzitív és inszenzitív szignálutak léte arra enged következtetni, hogy nem ugyanazok a kaszpázok aktiválódnak minden apoptózishoz vezető szignálút során (28). A CrmA és bcl-2/bcl-XL apoptózist gátló képessége függ a sejthalált kiváltó stimulustól, így ugyanazon sejttípuson belül különböző ingerek hatására különböző lehet. Úgy tűnik, hogy a CrmA szenzitivitás általában a plazmamembrán receptorok (Fas, TNF) által mediált apoptózis során

tapasztalható,

míg

a

bcl-2/bcl-XL

fehérjék

relatíve

ineffektívek

a

membránreceptorok mediálta apoptózisban, de hatásosabbak az apoptózis egyéb formáinak (pl. irradiáció kiváltotta sejthalál) gátlásában. Valószínű, hogy a bcl-2 és bclxl bizonyos kaszpázok katalitikusan aktív formává történő átalakulása előtt, ill. annak során fejtik ki anti-apoptotikus hatásukat (28). (Léteznek szintetikus peptid kaszpáz-inhibitorok is, amelyek non-toxikus formáinak klinikai jelentősége lehet pl. vírushepatitis fulmináns formáinak, valamint különböző neurodegeneratív kórképek kezelésében.)

33

A kaszpázok egymás utáni, egymást aktiváló hierarchikus rendjének koncepcióját alátámasztó eredmények nagy része rekombináns enzimekkel végzett in vitro vizsgálatokból származik (28). Fontos meghatározni - ahol lehetséges -, hogy a kaszpázoknak ez a kaszkád-szerű aktiválódása az apoptotizáló sejtekben is végbemegye. A rekombináns enzimekkel végzett in vitro kísérletek hátránya ugyanis, hogy azok során az egyes proteázok olyan szubsztrátokat is bonthatnak, amelyeket in vivo nem bontanának. Ennek több oka lehetséges, egyrészt nem biztos, hogy az enzim-szubsztrát arány a sejtben is eléri a megfelelő szintet, másrészt elképzelhető, hogy az enzim a vizsgált szubsztráttól elkülönülten, más szubcelluláris környezetben van jelen a sejtben. A kaszpázok szubsztrát specificitása azt jelenti, hogy az egyes proteázok azokat a szubsztrátokat preferálják, amelyek a hasítási helyen egy bizonyos aminosavszekvenciával rendelkeznek. Ez alapján lehet következtetni a különböző kaszpázok specifikus aktivitására, valamint arra is, hogy a kaszkádban mi lehet az egyes kaszpázok aktiválásának sorrendje. Ennek megfelelően, a kaszpáz-2, -6 és -9 hasítási helyén levő aminosav-mintázat azt sugallja, hogy a három proteázt ugyanaz a kaszpáz, nevezetesen a kaszpáz-3 aktiválja. Ezzel összhangban megfigyelték, hogy apoptotizáló sejtben a PARP proteolízise - amelyet elsődlegesen a kaszpáz-3 és -7 végez - általában megelőzi a laminok kaszpáz-6 által történő hasítását, ami alapján valószínű, hogy apoptotizáló sejtben a kaszpáz-3 és -7 aktivációja megelőzi a kaszpáz-6-ét. Van ennek ellentmondó közlemény is (116), amelyben a szerzők egy hörcsögmájból izolált kaszpáz-6 homológot írnak le, amely képes a kaszpáz-3 aktiválására. Valószínű, hogy a kaszpáz-3 aktivációja a kaszpáz-6 aktiválását eredményezi, de ugyanúgy a kaszpáz-6 aktivációja is képes a kaszpáz-3-at aktiválni, így egy kaszpáz amplifikációs kör jön létre (175). Van néhány kulcsfontosságú kaszpáz, amely több más kaszpáz aktiválására képes, ezek közé tartozik a kaszpáz-8 és -10. A kaszpázok aktivációja bekövetkezhet membránba ágyazott receptorokon (pl. Fas, TNFR-1) keresztül, de azoktól függetlenül is pl. DNSkárosodás során (28). A Fas és a TNF receptorok ingerlésének hatására aktiválódik a kaszpáz-8, amely képes az összes többi kaszpáz aktiválására, alátámasztva azt a hipotézist, hogy bizonyos receptor-mediálta aktiváció során ez a kaszpáz áll az apoptotikus kaszkád csúcsán (15, 130). A kaszpáz-10 is képes az összes többi kaszpáz aktiválására, míg néhány kaszpázról

34

kimutatták (kaszpáz-3 és -7), hogy nem tudják aktiválni a kaszpáz-10-et. Ez azt sugallja, hogy a kaszpáz-10 a kaszpáz-3 és -7 felett áll a hierarchiában, vagy a kaszkád csúcsán, vagy annak közvetlen közelében. Valűszínű, hogy míg a Fas és TNFR-1 receptorok ingerlése által kiváltott apoptózis során a kaszpáz-8 áll a kaszpáz-kaszkád csúcsán, addig más típusú receptorok által mediált apoptózis, valamint sok non-receptor-mediálta, CrmA inszenzitív sejthalál (pl. girradiáció után) a kaszpáz-8 aktiválódása nélkül megy végbe, esetükben a kaszpáz-10 tölthet be kulcsszerepet (28). A kaszpázok ICH-1 alcsaládjába csak a kaszpáz-2 tartozik, amelynek alternatív splicing miatt 2 formája létezik. Az egyik forma overexpressziója apoptózist eredményez, a másik apoptózist gátol, tehát a kaszpáz-2 szerepet játszhat a programozott sejthalál pozitív és negatív szabályozásában is (28). A kaszpáz-2 az apoptotikus folyamat elején aktiválódik, de nincs arra vonatkozó adat, hogy megelőzné más kaszpázok aktiválódását. Felvetődik a kérdés, hogy a sejtet ért külső hatások milyen mechanizmus útján okozhatják a kaszpáz-kaszkád aktvációját. Mind a Fas receptor, mind a TNFR-1 tartalmaz egy intracelluláris, ún. death domént. 3 proteint azonosítottak, amelyek vagy a Fas, vagy a TNFR-1, vagy mindkét receptor death doménjéhez képesek kötődni. Ezek az ún. adapter molekulák, a Fas-hoz kapcsolódó FADD (Fas-associating protein with death domain), a TNFR-1-hez kötődő TRADD (TNFR-1-associated death domain protein), valamint a mindkét receptorhoz kötődő RIP (receptor-interacting protein) (28). Az adapter molekulák teremtik meg a kapcsolatot a sejtfelszíni membránreceptorok és a citoplazmatikus enzimek között. A FADD molekula N-terminális végén található az apoptózis beindítására képes DED (death effector domain). Több Fas vagy TNFR-1 receptor molekula death doménjeinek oligomerizációja teszi lehetővé a citoszolban levő adapter molekulák hozzájuk történő kötődését, ezáltal a DISC (death inducing signalling complex) kialakulását. A Fas receptor a FADD fehérjét használja a kaszpáz-8-hoz történő kötődéshez (28). Az inaktív kaszpáz-8 a többi prokaszpázhoz hasonlóan aktív alegységet és egy N-terminális prodomént tartalmaz. A prodomén két, a FADD death effector doménjéhez (DED) nagyfokú hasonlóságot mutató doménből áll, az enzim aktív része a kaszpázok CED-3 alcsaládjának többi tagjához mutat kifejezett hasonlóságot. A prokaszpáz-8 a FADD death effector doménjéhez kötődik, ezt követően aktiválódik, az

35

aktív enzim képes a PARP bontására. Overexpressziója apoptózist eredményez, katalitikus részének mutációja az apoptotikus potenciál megszűnéséhez vezet. Sokféle izoformja létezik a molekulának, egy részük inkomplett kaszpáz régióval rendelkezik, másokban a kaszpáz régió teljesen hiányozhat. Ezek negatív regulátorként működhetnek, és fontosak lehetnek az apoptózis in vivo szabályozásában. Nem teljesen tisztázott, hogy a prokaszpáz-8 milyen mechanizmus útján aktiválódik a FADD-hoz való kötődéskor. Valószínű, hogy inaktív állapotban a kaszpáz-8 két DED-je egymáshoz kötődik. A Fas receptoron vagy a TNFR-1-en keresztül közvetített apoptotikus szignál hatására a FADD az adott receptor molekulához kapcsolódik (TNFR-1 esetében ez a kötődés az említett TRADD molekulán keresztül történik), amely megváltoztatja a FADD death effector doménjének a konformációját elősegítve a prokaszpáz-8 egyik DED-jéhez való kötődést. Ezáltal a proenzim két death effector doménje közötti kötés megszűnik, ami az aktív alegység autokatalitikus aktivációjához vezethet (28). A Fas receptorhoz kapcsolódó ligandum és TNF indukálta apoptózisban a kaszpáz-10nek is lehet szerepe. Erre utal, hogy a kaszpáz-10 - ugyanúgy, mint a kaszpáz-8 - a FADD death effector doménjéhez hasonló két DED-ből álló prodomént tartalmaz. Humán leukémia sejteken kimutatták, hogy a Fas receptor ingerlése az „iniciátor” kaszpázokon

keresztül

(kaszpáz-8

és

-10)

a

savas

szfingomyelináz

enzim

aktiválódásához, ezáltal ceramid generációhoz és JNK aktiválódáshoz vezethet. Az ionizáló sugárzás kiváltotta ceramid generáció a kaszpáz-8 aktivációját okozhatja (59). Valószínű, hogy irradiáció által indukált apoptózisban a kaszpázok aktiválódása és a ceramid generációja kölcsönösen befolyásolja egymást. U937 humán leukémia sejtekben a kaszpáz aktivitást gátló szintetikus proteáz inhibitor a sugárzás kiváltotta apoptózist megakadályozza (59). Nyugvó B-limfociták sugár-indukálta apoptózisa során az „iniciátor” kaszpázok valószínűleg nem, csak a későbbi, ún. „effektor” kaszpázok (kaszpáz-3, -6, -7) aktiválódnak (59). A kaszpázoknak az irradiáció által indukált apoptózis folyamatában elfoglalt helye, szerepe azonban még nem teljesen tisztázott.

36

3.2.7. A mitokondrium szerepe Pro-apoptotikus stimulusokat követően a mitokondriális membránon keresztül citokróm c szabadul fel és áramlik a citoszolba (149). Úgy tűnik, hogy a citokróm c felszabadulása az apoptózis összes formájában, minden körülmények között bekövetkezik. Okozhatják aktivált kaszpázok, DNS károsodás, növekedési faktor megvonás, Ca2+, oxidánsok (149). A citokróm c a külső és belső mitokondriális membrán közötti térben található, ahol a belső membránba lokalizálódó citokróm c oxidáz komplexhez simul. A külső membránon való átjutásának mechanizmusa nem tisztázott, magyarázatára több hipotézis is létezik (149). Az egyik szerint apoptózis során a belső membránban megnyílik egy nagy áteresztőképességű, ciklosporinnal gátolható csatorna, ami a H+ grádiens eltűnéséhez, a belső membrán két oldala között levő potenciálkülönbség megszűnéséhez, a mitokondriális mátrix ozmotikus duzzanatához vezet. A folyamat a belső membrán felületének jelentős megnövekedését eredményezi, ami ennek következtében a külső membrán felületének méretét nagymértékben meghaladja, és annak ruptúráját okozza. Egy másik modell szerint a külső membránban van egy specifikus csatorna, ami lehetővé teszi a citokróm c felszabadulását. Ilyen csatornát képezhet a bcl-2 család proapoptotikus tagjaként ismert bax. A bax csatorna-képző tulajdonságát támasztja alá az a megfigyelés, amely szerint rekombináns bax fehérjét adva szintetikus membránokhoz csatornák képződését tapasztalták (149). A bax fehérje csatorna-képző tulajdonságát a bcl-2 és valószínűleg a bcl-XL is gátolni képes. A 3. feltételezés az elsőhöz hasonlóan szintén a külső mitokondriális membrán ruptúrájával magyarázza a citokróm c citoszolba történő kiáramlását, de a jelenség az említett nagy áteresztőképességű ioncsatorna megnyílása, és a belső membrán két oldala közti potenciálkülönbség megszűnése nélkül is bekövetkezhet (194). Ennek lehetséges magyarázata, hogy a mitokondriális mátrix, valamint a belső és külső membrán közti intermembranózus tér közötti potenciálkülönbség szabályozása a belső membránba ágyazott respiratórikus lánc (amely működése következményeként H+ ionok jutnak az intermembranózus térbe), valamint a - szintén a belső membránban elhelyezkedő - F0F1 ATP-áz protonpumpa, a K+/H+ pumpa, és az elektrogén K+ pumpa részvételével történik. Az F0F1 ATP-áz protonpumpa és a K+/H+ pumpa a H+ ionokat visszajuttatja a mátrixba, míg ugyancsak a K+/H+ pumpa, valamint az elektrogén K+ pumpa a mátrixból az

37

intermembranózus térbe transzportál K+ iont. A mitokondriális mátrix volumenének legfőbb

meghatározója

a

K+

koncentráció,

ezért

elképzelhető,

hogy

annak

kontrollálásában részt vevő K+ transzporterek aktivitásában bekövetkező változás tehető felelőssé

a

mitokondriumok

apoptózis

során

tapasztalható

patológiás

megnagyobbodásáért, a külső membrán ruptúrájáért és a citokróm c kiáramlásáért. Apoptotikus stimulust követően az anti-apoptotikus bcl-XL képes a mitokondriális volument normál határok között tartani, megakadályozni a külső membrán ruptúráját, és a citokróm c kiáramlását (194). A mitokondriumból felszabaduló citokróm c a citoszolban komplexet képez az Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) fehérjével, amely a citokróm c kötése révén aktiválódik, és dATP vagy ATP jelenlétében aktiválja a prokaszpáz-9-et (149). Az Apaf1 N-terminális végén található egy régió (CARD domén), amely erős homológiát mutat néhány kaszpáz prodoménjével (kaszpáz-2, -9). Az aktív Apaf-1 és a prokaszpáz-9 a két CARD doménen keresztül kötődik egymáshoz, így jön létre a prokaszpáz-9 aktivációja aktív kaszpázzá. Az aktív kaszpáz-9 aktiválhatja a prokaszpáz-3-at, az aktív kaszpáz-3 további kaszpázok aktiválásához, egyéb szubsztrátok proteolíziséhez, végső soron a sejt apoptózisához vezet. Úgy tűnik, hogy a külső mitokondriális membránban és egyéb intracelluláris membránokban található, bcl-2 családba tartozó gátló proteinek (bcl-2 és bcl-XL) a citokróm c felszabadulásának akadályozása útján fejtik ki anti-apoptotikus hatásukat. Ezt támasztja alá az a megfigyelés, amely szerint citoszol kivonatokhoz citokróm c-t adva a bcl-2 nem képes a kaszpáz aktivációt megakadályozni, míg kaszpáz inhibitorokkal a gátlás bekövetkezett (149). Bizonyos stimulusok, pro-apoptotikus ágensek (irradiáció, DNS-károsodást okozó szerek, Ca2+, oxidánsok, növekedési faktor megvonás) a kaszpázok előzetes aktiválása nélkül eredményezhetik a mitokondriumokból citokróm c felszabadulását (149). Az apoptózis nem minden formájában van azonban a mitokondriumoknak primer szerepe. Amint az előző, 3.2.6. fejezetben említésre került, a TNF receptorok, Fas receptor képesek a kaszpázok csaknem direkt aktiválására. A receptorok ingerlése nyomán beindul a proteáz aktivációs kaszkád egészen az effektor kaszpázok (pl. a kaszpáz-3)

38

aktiválásáig. Az aktív kaszpázok megváltoztathatják a mitokondriumok permeabilitását, citokróm c kiáramlást okozhatnak, ami erősíti a kaszpáz aktivációs folyamatot. Valószínű, hogy a citokróm c felszabadulása jelenti a sejt elköteleződését a sejthalál irányába (149). A pán-kaszpáz-inhibitor peptidekkel végzett kísérletek azt bizonyítják, hogy a kaszpáz aktivitás gátlásával a növekedési faktor megvonás, citosztatikum, bax overexpresszió által indukált apoptózist sikerült megakadályozni, de a sejt elhalásának folyamata nem állt meg. Ilyen körülmények között megfigyelhető a citokróm c felszabadulása, a belső mitokondriális membrán két oldala közti potenciálkülönbség esése. Reaktív oxigéngyökök generálódnak, és a sejt kaszpáz-independens, nekrózisra emlékeztető módon pusztul el. Így, a citokróm c felszabadulása a mitokondriumokból két úton vezethet sejthalálhoz: (a) kaszpáz aktivációval az Apaf-1-en keresztül; (b) az elektrontranszport-lánc

megszakítása

révén,

ami

az

oxidatív

foszforiláció

megszűnéséhez, szabadgyök-képződéshez, a sejt ATP készletének a kimerüléséhez vezet. Valószínű, hogy többnyire a kaszpáz-dependens út gyorsabb, ezért apoptózissal pusztulnak el a sejtek (149).

3.3 Az általunk vizsgált prognosztikai faktorok irodalmi összefoglalása

3.3.1 Apoptózis-index Az apoptózis-index (AI) az apoptotikus sejtek százalékos arányát fejezi ki a teljes sejtpopulációhoz

viszonyítva

(206).

Prognosztikai

értékére

vonatkozóan

ellentmondásosak az eredmények. Az alacsony kiindulási apoptózis-index érték kedvezőtlen prognózissal való társulását írták le emlőrákban (185), colorectalis karcinómában (92, 160), tüdő laphámrákban (99), míg prosztata adenocarcinoma esetén az alacsony AI kedvezőbb prognózist jelent (4). Ugyanakkor oligodendrogliomákban nem bizonyult megbízható prognosztikai markernek (162). Hamada és mtsai nyelőcső karcinómában az apoptózis-indexet szignifikánsan magasabbnak találták jól és mérsékelten differenciált tumoroknál, mint rosszul differenciáltaknál. Vizsgálati anyagukban preoperatív sugárterápia hatására a spontán apoptózis könnyebben indukálhatónak bizonyult differenciált tumorokban, mint rosszul differenciáltak esetén (62).

39

Szájüregi és szájgarat karcinómás esetek vizsgálatakor Ito és mtsai nem találtak összefüggést az apoptózis-index nagysága és a betegség klinikai lefolyása között (85). Naresh és mtsai nyelvkarcinómában alacsony apoptózis-index esetén kevesebb nyirokcsomó metasztázist és hosszabb betegségmentes túlélést tapasztaltak (131). Lera és mtsai gégekarcinómákban ugyancsak azt írták le, hogy az alacsonyabb apoptózisindex hosszabb recidiva-mentes idővel és hosszabb túléléssel társul (113). Shintani és mtsai szájüregi laphámrákok vizsgálatakor úgy találták, hogy az alacsony apoptózisindex gyenge sugárterápiás válaszkészséggel jár együtt (169).

3.3.2. Mitózis-index A mitózis-index (MI) a mitotikus sejtek százalékos arányát fejezi ki a teljes sejtpopulációhoz viszonyítva (206).

Egy adott tumorban a sejtek proliferációs

aktivitására jellemző érték, rosszindulatú daganatok esetében a malignitási fok meghatározásának fontos paramétere (206). A mitózis-index több daganatcsoportban hasznos prognosztikai indikátornak bizonyult, így szupratentoriális agydaganatokban, emlőrákban, tüdőkarcinómákban (5, 99, 172). Akashi-Tanaka és mtsai lokálisan előrehaladott

emlőrákoknál

magas

mitózis-index

esetén

jobb

hisztopatológiai

válaszkészséget találtak preoperatív kemoterápiára, de a 10 éves túlélés kisebb volt, mint alacsony mitózis-index esetén (5). Komaki és mtsai eredményei alapján tüdő laphámkarcinómában a magas mitózis-index szignifikánsan nagyobb arányú 5 éves túléléssel,

és

hosszabb

távoli

metasztázis-mentes

idővel

párosul.

Tüdő

adenokarcinómában ellenkezőleg, alacsony mitózis-index esetén tapasztaltak hosszabb túlélést (99). Aihara és mtsai prosztata adenokarcinómában nem találtak szignifikáns összefüggést a mitózis-index és a prognózis között (4).

3.3.3. p53 fehérje A p53 egy 53 kd tömegű nukleáris protein, amelyet a 17-es kromoszóma rövid karjára lokalizálódó (17p13) TP53 tumorszuppresszor gén kódol. Mint a dolgozat korábbi fejezetében, az irradiáció kiváltotta apoptózissal kapcsolatban már említésre került, a normál, ún. vad-típusú p53 fehérje direkt módon vesz részt a sejtciklus szabályozásában.

40

A „genom őreként” funkcionál, ha a sejt génkészlete károsodik (104, 181). DNS károsodás hatására a normál p53 fehérje akkumulálódik, és a p21 gén promoter régiójához kötődve fokozza annak expresszióját. A p21 fehérje a ciklin-dependens kinázok inaktiválását végzi, amely következtében a Rb fehérje foszforilációja - amely szükséges lenne az E2F (S-fázis specifikus) transzkripciós faktor leválásához és aktiválódásához - elmarad. A Rb fehérje defoszforilált állapotban marad, továbbra is kötődik az E2F transzkripciós faktorhoz, ezáltal gátolja annak transzkripciós aktivitását, megakadályozza a DNS szintézist és a sejt belépését S-fázisba. A sejtciklus megáll G1fázisban, lehetővé téve a DNS-sérülés helyreállítását. A p21 a DNS replikációban fontos szerepet játszó PCNA-hoz (proliferating cell nuclear antigen) való direkt kötődéssel is képes blokkolni a DNS szintézist. Emellett a p53 fokozza a GADD 45 (growth arrest DNA damage) protein transzkripcióját, amely a p21hez hasonló módon kötődik a PCNA-hoz, és gátolja a DNS szintézist (206). A normál p53 fehérje direkt vagy indirekt módon stimulálhatja magát a DNS repair mechanizmust is (166). Ha a DNS károsodása olyan mértékű, hogy azt a repair folyamatok nem képesek kijavítani, a p53 beindíthatja a programozott sejthalált (apoptózist), megakadályozva ezzel, hogy a génhiba az utódsejtekbe kerüljön. Valószínű, hogy a sejtek rendelkeznek olyan képességgel, amely segítségével felismerik, hogy egy genetikai hiba mikor túl mélyreható ahhoz, hogy gyorsan és teljesen kijavítható legyen - ezért beindul a p53dependens apoptózis (206). A p53 gén sérülése esetén a fehérje ellenőrző funkciója nem működik, aminek következtében a sejt genetikailag instabillá válik, genetikai hibák halmozódhatnak fel (104, 181). A p53 gén mutációja azt eredményezi - mivel a kóros p53 fehérje lassabban bomlik le, mint a normál -, hogy a p53 felhalmozódik a sejtmagban, ezért immunhisztokémiai reakcióval kimutathatóvá válik. Az immunhisztokémiai vizsgálat tehát jól jelzi a kóros p53-génműködést. A mutációnak sok oka lehet. A különböző karcinogének hatására különböző báziscserék következnek be a DNS-ben, amelyek a karcinogénre és az adott szövetre lehetnek jellemzőek a génben is. A mutáció jellegéből tehát következtetni lehet a karcinogén anyagra (173). Például a dohányban lévő benzpirén igen gyakran G:C®T:A transzverziót okoz. Nem véletlen, hogy tüdő- és fejnyaki daganatokban ez a mutáció lényegesen gyakoribb a p53-génben, mint egyéb

41

szervek (pl.: colon, emlő, ovárium) daganataiban, vagy leukémiákban és lymphomákban (173). A mutáns p53 gén és termékeinek prognosztikai jelentőségével kapcsolatban emlőkarcinómánál Cattoretti és mtsai 1988-ban leközölték, hogy a p53 pozitív (mutáns p53-mal rendelkező) emlőtumorok prognózisa rosszabb, mint a p53 negatívoké (23). Azóta a kutatások kiderítették, hogy elsősorban a nyirokcsomó-áttét nélküli emlőrákos betegeknél van a p53-nak prognosztikai szerepe (170, 187). Goh és mtsai (54), illetve Hamelin és mtsai (64) vastagbél karcinómánál is azt találták, hogy a mutáns p53 gén expressziója a betegség rossz prognózisát jelenti. Fej-nyaki karcinómák esetében a közlemények 50-70%-ban jelzik a p53 gén mutációját. A p53 fehérje akkumulációja nagymértékben jelzi a malignus elfajulást (már a korai premalignus léziókban is kimutatható), míg a normál epithelium és a benignus léziók következetesen p53 negatív eredményt adnak immunhisztokémiai vizsgálatra (206). Az irodalmi adatok elemzésénél ellentmondó eredményeket találunk a p53 gén mutációjának prognosztikai jelentőségével kapcsolatban. Egyes szerzők szerint fej-nyaki daganatokban a p53 génmutáció rossz prognózist jelez (17, 22, 49, 91, 112), míg mások nem találtak értékelhető kapcsolatot a p53 mutáció jelenléte és a klinikai lefolyás között (45, 74, 113, 132, 146). Nyelvgyöki karcinómában leírták, hogy a p53 akkumuláció hosszabb túléléssel társulhat (206). A másik izgalmas kérdés, hogy a mutáns p53 fehérje jelenléte jelzi-e a tumorok terápiás befolyásolhatóságát? Azaz a radioszenzitivitás és kemoszenzitivitás szempontjából van-e prognosztikai értéke? Az irodalomban található eredmények ebben a kérdésben sem egységesek. A sugár vagy citosztatikumok által okozott sejtpusztulás az apoptózis aktív folyamatának tulajdonítható, amelyet legtöbbször a p53 gén működése közvetít (118). A p53 gén mutációjának - radio- és kemoszenzitivitás szempontjából - elvileg két, egymás ellen ható következménye lehet (166). Egyrészt azt várnánk, hogy a p53 mutációja esetén sugárkezelés vagy citosztatikum hatására nem következik be apoptózis, vagyis a sejtek rezisztensek lesznek DNS károsító ágensekkel szemben. Más szempontból viszont a mutáns vagy hiányzó p53 allélekkel rendelkező sejtek esetében DNS-károsító hatást követően a G1-fázis blokkja elmarad, a sejtek gátlás nélkül progrediálhatnak, nincs elegendő idő a DNS hibák kijavítására, a repair mechanizmus effektivitása csökken, ami a sejtek csökkent életképességét, nagyobb arányú pusztulását eredményezheti (166). Servomaa és mtsai szerint emiatt a két, egymásnak ellentmondó következmény miatt

42

nem meglepő, hogy a normál p53 funkció hiányának terápiás konzekvenciáit vizsgálva egyes szerzők kemo- és/vagy radioszenzitivitás növekedést (18, 53, 166), mások csökkenést írnak le (25, 62, 124, 169, 207), míg néhány esetben nem találtak összefüggést a p53 státusz és a terápiás szenzitivitás között. A legtöbb tanulmány szerint a p53 deficiencia emelkedett radiorezisztenciával jár együtt (25, 62, 124, 169). McIlwrath és mtsai 12, különböző radioszenzitivitású humán tumor sejtvonalban szignifikáns kapcsolatot találtak a mutáns p53 fehérje jelenléte, ionizáló sugárzást követően a G1-fázis blokkjának elmaradása, valamint a radiorezisztens fenotípus között (124). Hasonló eredményekről számolnak be Chang és mtsai is mutáns p53 gént tartalmazó, radiorezisztens fej-nyaki laphámrák sejtvonalon (25). Normál - „vad típusú” - p53-gént tartalmazó adenovírus vektor sejtekbe juttatásával sikerült a sejtciklus regulációját és az apoptózist helyreállítaniuk, a sejteket érzékennyé tenniük sugárkezeléssel szemben in vitro. Eredményeik klinikai relevanciáját növeli, hogy in vivo is sikerült mutáns p53 gént hordozó, radiorezisztens fej-nyaki laphámrák sejtekből álló egér xenograftokat radioszenzitívvé tenniük normál p53 gén - adenovírus vektor segítségével történő - sejtekbe juttatásával (25). Ezzel szemben Servomaa és mtsai 20, különböző típusú fej-nyaki laphámrák sejtvonalon a különféle p53 mutációk megnövekedett radioszenzitivitással történő társulását írják le (166). A szenzitivitás mértéke nagy mértékben függ a mutáció pontos helyétől és típusától. A legnagyobb szenzitivitást annál a sejtvonalnál találták, amelynél a p53 mindkét allélje hiányzott, a legkisebbet pedig azokban a sejtekben, amelyekben mindkét allél „vad-típusú” volt. A mutáns alléleket tartalmazó sejtek szenzitivitása a két szélsőérték között helyezkedett el.

3.3.4. A sejtenkénti DNS megoszlás A daganatok klasszikus szövettani diagnosztikája meglehetősen sok szubjektív elemet tartalmaz, ezért előfordulhat, hogy ugyanazt a típusú elváltozást, vagy a szöveti kép egyes részleteit különböző vizsgálók eltérően ítélik meg (183). E diagnosztikus különbségeknek terápiás konzekvenciái lehetnek. Ezért vált fontossá a szöveti szerkezet valamiféle "mérése", ezáltal az objektivitás és reprodukálhatóság fokozása, továbbá az olyan elváltozások felismerése, amelyek pusztán szemmel értékelve egyáltalán nem kifejezettek. Ennek következtében egyre szélesebb körben használják az úgynevezett

43

kvantitatív patológiai módszereket, amelyek közül az egyik legjelentősebb eljárás a sejtenkénti DNS-tartalom meghatározása (183). A mért adatokat hisztogram formájában jelenítjük meg (3. ábra), és statisztikai módszerekkel értékeljük. A DNS-hisztogramok matematikai

analízise során

a sejtenkénti

DNS-eloszlásból meghatározzuk a

szubpopulációnkénti G0,1-S-G2 fázisú sejtek számát, valamint a normális vagy kóros DNS-tartalomra utaló mérőszámot (DNS-index). A vizsgált faktorok a következők: Ploidia:

alatt azt értjük, hogy egy adott daganatos sejt kromoszóma tartalma normális-e, vagy ettől eltérő. A normál (2n) kromoszómaszámmal rendelkező szomatikus sejtek az euploid-diploid sejtek. Poliploidiáról a genetikában akkor beszélünk, ha a normál kromoszómaszám többszöröse van egy sejtben. Euploid-poliploid sejtek kromoszómaszáma egész számú többszöröse a diploidnak. Aneuploidiáról beszélünk, ha a kromoszómaszám nem egész számú többszöröse a diploidnak.

DNS-index (DI): A megváltozott (tumoros) és ép G0,1-fázisú sejtek átlagos DNStartalmának a hányadosa (67). Az euploid sejtekben a DNS-index egész szám, a diploid sejtek DNSindex értéke 1 Az aneuploid sejtek DNS-indexe legalább 10%-os eltérést mutat az egész számtól. Ha egy homogén sejtpopulációban minden egyes sejt DNS-tartalmát megmérjük, a gyakorisági hisztogramon két csúcs található. Az első, nagyobb csúcs felel meg a G0,1-fázisú sejteknek, a kisebb csúcs tartalmazza a G2-(és mitózis-) fázisban lévő sejteket (3. ábra). Malignus transzformáció során azonban gyakran kettő vagy több szubpopuláció jelenik meg a sejtben (heteroploidia) egymástól eltérő DNS-tartalommal és ennek kifejeződéseként eltérő G0,1-csúcsokkal (3.C ábra).

44

S-fázis arány (SPF%): A DNS hisztogram analízisekor kapott S-(szintetikus) fázisú sejtek %-os arányát fejezi ki (szubpopulációnként). A DNShisztogramon a G1 és G2 csúcs között találhatók az S-fázisú sejtek. Poliploid frakció % (PF%): A DNS-hisztogramon a G2-csúcs után jelentkező tartomány (mind diploid mind aneuploid daganatokban a poliploid frakció alacsony és magas is lehet) A malignus transzformáció során egyre több olyan sejt alakulhat ki, amelyek DNStartalma különbözik az ép sejtekétől, ismerünk azonban diploid DNS-készlettel rendelkező rosszindulatú daganatokat is (156). A ploidia (és ezzel együtt a DI érték) sok daganat esetében prognosztikai jelentőséggel bír. Az aneuploidia - mint a genetikai instabilitás egyfajta kifejeződése - legtöbbször kedvezőtlen prognózissal párosul. Aneuploid DNS tartalom esetén szignifikánsan rövidebb túlélési időt tapasztaltak többek között tüdő- (156), nyelőcső- (127), emlő(196) gyomor- (41) és colorectalis karcinómában (52). Míg colorectalis karcinómában a DNS-index a többi faktortól független, nagy jelentőségű prognosztikai tényezőnek bizonyult (52), addig sok daganat esetében a ploidia önmagában nem elegendő, csak hozzájárul más klinikai és patológiai faktorokkal együtt a várható kórlefolyás meghatározásához, és sokváltozós statisztikai analízissel nem mindig tudjuk független prognosztikai értékét igazolni (110). Bizonyos daganatoknál (pl. hepatocelluláris karcinóma) nem találtak összefüggést a ploidia és a prognózis között (63), míg több tumor esetében - neuroblastoma, gyermekkori akut leukémia - a diploid DNS tartalmúak párosultak rosszabb prognózissal (38, 176).

45

Sejtszám Euploid – diploid tumor DNS-index: 1 S-fázis arány: 15.7 %

Relatív DNS tartalom

3.A ábra Mesopharynx (tonsilla) karcinómából származó daganat-sejtmagok DNS hisztogramja (I. klinikopatológiai vizsgálat, 6. beteg) Sejtszám Aneuploid – hiperdiploid DNS tartalom DNS-index: 1.4 S-fázis arány: 20.9 %

Relatív DNS tartalom

3.B ábra Mesopharynx (tonsilla) karcinómából származó daganat-sejtmagok DNS hisztogramja (I. klinikopatológiai vizsgálat, 11. beteg)

46

Sejtszám Aneuploid – poliploid DNS tartalom

Relatív DNS tartalom

3.C ábra Mesopharynx (nyelvgyök) karcinómából származó daganat-sejtmagok DNS hisztogramja (I. klinikopatológiai vizsgálat, 10. beteg) A tumor két szubpopulációt tartalmazott. Az első szubpopuláció DNS-indexe 1.33, a második szubpopulációé 2.49. S-fázis arány az első szubpopulációban 46.5%, a másodikban 11.1%. Fej-nyaki karcinómáknál több tanulmány szerint a ploidia befolyással bír a betegség kimenetelére (29, 55, 128, 179), míg egyes szerzők szerint ezen daganatcsoport bizonyos fajtái - pl. nyelvkarcinóma - esetében nincs összefüggés a ploidia típusa és a prognózis között (30, 200). A fej-nyaki daganatoknál általában az aneuploid daganatokat találták agresszívebb lefolyásúnak (29, 128). Goldsmith és mtsai ezzel megegyező eredményre jutottak szájüregi laphámrákokon végzett vizsgálataik során, ugyanakkor gége- és hypopharynx karcinómás betegeknél azt tapasztalták, hogy az aneuploidia szignifikánsan jobb prognózist jelent, mint a diploid DNS tartalom (55). Kearsley és mtsai szintén aneuploidia esetén tapasztaltak kedvezőbb prognózist (93). Kevesebb adat található az irodalomban az S-fázis prognosztikai szerepével kapcsolatban. Egyes tumoroknál kimutatták, hogy az S-fázis érték jobban segítheti a prognózis meghatározását, mint a ploidia (66, 152). A fej-nyaki daganatoknál sok közlemény értékes prognosztikai faktornak tartja az S-fázis indexet (19, 43, 108, 154, 188).

47

4. Saját vizsgálatok

4.1. Humán klinikopatológiai kutatások I. Prognosztikai faktorok vizsgálata primer sugárterápiával kezelt fejnyaki laphámrákokban

4.1.1. Irodalmi bevezetés A fej-nyaki daganatok túlnyomó többsége laphámrák, amelynek incidenciája az utóbbi évtizedekben - különösen Magyarországon - folyamatosan emelkedik (184). A sebészi kezelés, radioterápia és kemoterápia fejlődése ellenére is ezen tumorok prognózisa rossz, különösen, ha előrehaladott állapotban kerülnek felismerésre. A primer terápiát általában a sebészi eltávolítás jelenti. Ha ez nem végezhető el a tumor kiterjedése, vagy a beteg rossz általános állapota miatt, esetleg a beteg nem egyezik bele a műtétbe, a következő választandó terápiás lehetőség a sugárkezelés. Irodalmi adatok alapján azonban a fejnyaki karcinómák 30-40 %-a sugárrezisztens (25). Amennyiben sikerülne a radioterápia sikerét előrejelző prognosztikai faktort vagy faktorokat találni, azok vizsgálata a kezelés megkezdése előtt segíthetne a legmegfelelőbb egyéni, személyre szabott terápia megválasztásában (25, 166, 169). Ha egy daganat - a faktorok vizsgálata alapján sugárérzékenynek bizonyul, akkor a sugárkezelés esetleg elsőként választandó terápiás lehetőség is lehetne, amelynek jelentősége lehet a súlyosan csonkító beavatkozások elkerülése, szervmegtartás, funkciómegőrzés szempontjából. Más esetben továbbra is műtéti, ill. egyéb terápia (pl. citosztatikus kezelés), esetleg több terápiás modalitás kombinálása

(pl.

műtét

és

citosztatikum;

vagy citosztatikummal

kiegészített

sugárkezelés) jöhet szóba. Így lehetővé válna az individuális terápia kidolgozása.

4.1.2. Célkitűzés Munkánk során - primer irradiációval kezelt daganatokban a terápia megkezdése előtt vett szövettani mintákban meghatároztuk az apoptózis- és mitózis-indexet, a DNS-

48

indexet, ploidiát és S-fázis arányt, valamint a mutáns p53 expressziót. A betegek utánkövetésével

vizsgáltuk

ezen

faktorok

prognosztikai

értékét,

valamint

összefüggésüket a sugárterápiás válaszkészséggel. Az első sugárkezelést követő 20. órában ismételten elvégeztük a szövettani mintavételt az apoptózis-index, mitózis-index és a p53 újbóli meghatározása céljából. Választ kerestünk arra, hogy a besugárzás apoptózist fokozó hatása már az első 2 Gy irradiáció után kimutatható-e, valamint változik-e a mutáns p53 fehérje expressziója az első kezelést követően. Felmerült a kérdés, hogy az apoptózis- és mitózis-index változása használható-e prognosztikai faktorként, azaz az első kezelést megelőzően és azt követően meghatározott paraméterek összehasonlításával lehet-e korai időpontban következtetést levonni a kezelés sikerére, a betegség várható lefolyására, kimenetelére vonatkozóan az egyes esetekben, így fennállhat-e individuális terápia kidolgozásának lehetősége.

4.1.3. Anyag és módszer 4.1.3.1. Betegcsoport 15 fej-nyak rákos beteget vettünk be a vizsgálatba, akik primer terápiaként sugárkezelésben részesültek. 14 beteg telecobalt irradiációt kapott (a besugárzás a Fővárosi Onkoradiológiai Központban történt), 1 beteg telecéziumot (Semmelweis Egyetem Radiológiai Klinika). A 15-ből 3 nő, 12 férfi; az életkor 41 és 79 év között változott a vizsgálat idején, lokalizáció szerint 8 tonsilla-, 1 lágyszájpad-, 2 nyelvgyök-, 2 szájfenék-, 1 mesopharynx hátsó fal- és 1 epiglottis-carcinomában szenvedő beteget vizsgáltunk. A sugárkezelés a beteg kivizsgálását, a diagnózis felállítását (klinikai és szövettani vizsgálattal) és a beteg előkészítését követően rögtön kezdődött. Az összgócdózis 14 és 70 Gy között változott (napi 2 Gy-os frakciókban) attól függően, hogy a beteg állapota lehetővé tette-e a teljes dózisú irradiációt. Betegeink közül 1 esetben volt jelentősen alacsonyabb az összgócdózis (14 Gy) az általában alkalmazott dózisoknál, mivel a beteg rossz általános állapotára való tekintettel nem tudtuk folytatni a kezelést. A legtöbb tumor már a diagnózis felállításakor előrehaladott állapotban volt. A betegek életkora, neme, a daganat lokalizációja, a TNM stádium, a kezelés összdózisa,

49

ill. a kezelésre adott válasz az 1. táblázatban látható összefoglalva. Ugyanez a táblázat jelzi a recidiva, ill. metasztázis megjelenési idejét, a sugárkezelést követő egyéb terápiát, és a betegek túlélési idejét. Minden esetben 2 alkalommal történt szövettani mintavétel: a sugárkezelés kezdete előtt, ill. az első kezelést követő 20. órában abból a célból, hogy ellenőrizzük a kezelés azonnal kiváltott hatását az első 2 Gy frakció után. A kétszeres szövettani mintavételhez minden beteg tájékozott beleegyezését kértük a SOTE Etikai Bizottságának szabályai szerint.

4.1.3.2. Patológiai eljárás Az első biopszia során kivett szövetmintát 4%-os formalinban fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk. 6 µ-os metszeteket készítettünk, amelyeket hematoxilin-eozinnal (HE) megfestettünk, ill. p53 és Apop-Tag immunhisztokémiai festést végeztünk. p53 immunhisztokémia A legtöbb celluláris fehérje harmadlagos szerkezete a fixálószerek-okozta keresztkötések miatt jelentősen megváltozik, ezért számos szöveti antigén-epitóp maszkírozódik. Olyan jelentős lehet a fehérjeszerkezet-torzulás a szövetben, hogy számos, a fagyasztott metszeten intenzív immunhisztokémiai reakció a fixálás után negatívvá válik. Ezért szükséges az elfedett epitópok feltárása (antigen retrieval), amelynek célja az immunhisztokémiai reakció megbízhatóvá tétele. Kivitelezésére több eljárás ismert (proteolitikus emésztés, mikrohullámú besugárzás, autokláv-előkezelés), amelyek közül mi a mikrohullámú kezelést alkalmaztuk. Az előkezelések hatásmechanizmusa nem teljesen tisztázott. A mikrohullám keresztkötéseket szabadít fel. A pufferben lévő citrátionok megkötik a Ca-ionokat a formaldehid-protein láncban, és a hőhatással együtt valamennyire

megszüntetik

a

formalin-okozta

durva

szerkezetében, így az ellenanyag hozzáfér az epitóphoz.

50

torzulásokat

a

fehérjék

1. táblázat1 Fej-nyak laphámrákos betegek klinikai adatai N°

Nem

Kor

Lokalizáció

TNM

Hatás

T3N0M0

Irradiatio összdózis (Gy) 60

1.

ffi

44

tonsilla

2. 3.

nő ffi

45 79

4. 5. 6. 7. 8.

ffi ffi ffi nő ffi

54 47 75 53 52

tonsilla mesopharynx hátsó fal lágyszájpad tonsilla tonsilla tonsilla szájfenék

9. 10. 11.

nő ffi ffi

50 53 42

12. 13. 14.

ffi ffi ffi

15.

nő

T4N2cM0 T3N2cM0

63 30

NR NR

T1N1M0 T3N0M0 T4N2bM0 T4N1M0 T1N0M0

66 66 68 66 66

TR TR NR NR TR

tonsilla nyelvgyök tonsilla

T3N0M0 T4N2cM0 T4N2aM0

70 70 70

TR RR TR

8 10 met.:1 rec.:2 2 42

78 55 59

epiglottis nyelvgyök szájfenék

T4N2bM0 T2N2cM0 T1N0M0

14 40 66

NR RR TR

10

61

tonsilla

T1N0M0

70

TR

-

RND: radikális nyaki block-dissectio rec.: recidiva met.: NR: nem reagált RR: CP: cisplatinum 5-FU:

1

Rec./met. megjel. ideje (hónap)

NR -

Egyéb kezelés 5x(30 mg CP + 800 mg 5-FU) 20 Gy TeCo irrad. 1x CAP 1x CAP 2x lézer vap. 6 x CAP műtét (RND) 6x(30 mg CP+ 800 mg 5-FU) 3x CAP műtét (exst. tu. mesophar.+RND) 6x(30 mg CP + 800 mg 5-FU) 3x lézer vap. 3x(30 mg CP + 800 mg 5-FU) -

exst. tu. mesophar.: exstirpatio tumor mesopharyngei metastasis részleges regresszió 5-fluorouracil

TR: teljes regresszió CAP: 1000 mg cyclophosphamid +50 mg doxorubicin + 50 mg cisplatin

A betegek túlélési adatai különböznek a témában megjelent közleményekben olvasható adatoktól a megjelenés óta eltelt idő miatt.

Túlélés (hónap) 15 15 2,5 17 38 7 3 13 11 18 62 2 6 23 16

Antigén retrieval mikrohullámmal 1) A paraffinba ágyazott szövetekből 6 mm vastagságú metszeteket készítettünk és felvittük szilános tárgylemezre. 2) Hőlégsterilizátorban történő előmelegítést követően a metszeteket kétszer váltott xilolban 20-20 percig deparaffináltuk, leszálló alkoholsorban (95%, 70%, 50%), majd desztillált vízben öblítve rehidráltuk. 3) Előmelegített üveg küvettába helyeztük a metszeteket, és annyi demaszkírozó-oldatot {Antigen Restitution Solution BICIT (HistoLabor, Győr, Magyarország)} öntöttünk rá, hogy a szöveteket a rákövetkező forralás alatt is ellepje. Az oldat 0.005 M Trisodium citrátot, 0.003 M citromsavat és 0.002 NaHCO3-ot tartalmaz. A lefedetlen küvettát egy hagyományos (háztartási) mikrohullámú sütőbe helyeztük, és nagy energiával addig sugároztuk, amíg a folyadék éppen forrni kezdett. Ezt követően néhány másodpercig hagytuk az oldatot hűlni. A besugárzást 5-ször megismételtük (mindig éppen forrásig), majd hagytuk a küvettát hűlni 15 percig. 4) A metszeteket desztillált vízben, majd PBS-ben {phosphate buffered saline, pH 7.6 (Reanal, Budapest, Magyarország)} mostuk 5 percig. Ezután elvégeztük az immunhisztokémiai reakciót. Immunhisztokémiai reakció 1) Aspecifikus kötőhelyek blokkolása PBS pufferben oldott 1% BSA-val (bovine serum albumin) és 3% Skim milkkel (15 perc, 37°C). 2) Mosás 1 percig PBS-pufferben. 3) Primer ellenanyag - monoklonális anti-p53 immunglobulin {PB53-12-1 (BioGenex, San Ramon, CA, USA)} - hígítása 1% BSA-t tartalmazó PBS-ben (pH 7.6). Inkubálás a primer ellenanyaggal 37°-on 1 órán át. Az antitest egy denaturációrezisztens epitópot ismer fel az 1-45 kodon között. 4) Mosás PBS-pufferben. 5) LINK: Inkubálás a másodlagos - biotinilált - ellenanyaggal {MultiLink (BioGenex, San Ramon, CA, USA)} 37°C-on 60 percig. 6) Mosás PBS-pufferben. 7) LABEL: Az 5. lépés során végbemenő reakció láthatóvá tételének első lépéseként avidin-biotin-alkalikus foszfatáz (ABC-AP) technikát alkalmaztunk. A metszeteket a korábban elkészített ABC-AP oldattal {Vector ABC-AP (Vector Laboratories,

52

Burlingame, CA, USA)} inkubáltuk 37°C-on 30 percig. Ennek során az avidin és a másodlagos ellenanyaghoz kötött biotin kapcsolódása által avidin-biotin-alkalikus foszfatáz komplex keletkezett. 8) Mosás PBS-pufferben. 9) Inkubálás frissen készült szubsztráttal {Biomeda Ultra Probe Phosphatase Reagens (Biomeda, Hayward, CA, USA)} 20 percig 37°C-on. A szubsztrát-oldat BCIP-et (bromo-chloro-indolil foszfát), NBT kromogént (iodonitroblue-tetrasolium só) és puffer-oldatot tartalmazott. A 7. pontban adott foszfatáz a szubsztrátból foszfátot hasít le, amely a kromogénnel csapadékot képez. 10) Gondos öblítés savanyított desztillált vízben (pH 4.5). 11) Kontraszt plazmafestés: 0.1M TRIS-HCl -pufferben (pH 4.8) oldott 0.01%-os light green-nel (fényzöld). Plazmafestés előtt mostuk a metszetet 0.1M TRIS-HCl pufferben (pH 4.8). 12) Öblítés desztillált vízzel. 13) Dehidrálás szárítással. Fedés Canada balzsammal.

Az apoptózis kimutatása Apop-Tag kittel

Az Apop-Tag in situ Apoptosis Detection Kit - Peroxidase (Oncor, Gaithersburg, MD, USA) az apoptotikus sejteket detektálja fixált szövetmintából készített vékony metszeteken. Az apoptózis morfológiai jeleihez kapcsolódó jellegzetes biokémiai változás a DNS fragmentációja, amely a Ca2+- és Mg2+-dependens endonukleáz aktivitás eredménye. A fragmentáció az internukleoszomális linker régiókban következik be, amely következtében 180 bázispárból, ill. annak többszöröseiből álló (agaróz gél elektroforézis során létra-diagramként megjelenő) nukleoszomális egységek jönnek létre (94). Az internukleoszomális hasítás során 3’-OH DNS-végek keletkeznek, amelyek Apop-Tag kittel detektálhatók. Ezzel szemben a normál sejtmagok (mivel 3’-OH DNSvégeket csak minimális mennyiségben tartalmaznak) nem festődnek a kittel (7). Az eljárás első lépéseként a DNS végeket meghosszabbítjuk digoxigenin-nukleotidok hozzáadásával. A reakciót a terminális deoxinukleotidil transzferáz enzim (TdT) katalizálja, amely képes az egy- vagy kétszálú DNS 3’-OH végeihez deoxiribonukleotidtrifoszfátot templát-independens módon kapcsolni. A beépített nukleotidok olyan

53

random heteropolimereket alkotnak, amelyek az anti-digoxigenin antitest kötődéséhez optimális arányban tartalmazzák a digoxigenin-11-dUTP-t és dATP-t. Az antidigoxigenin antitest hordozza a peroxidáz enzimet, amely a kromogén szubsztrát átalakulását (ennek következtében intenzív színreakció kiváltódását) katalizálja. Mivel digoxigenin a természetben csak a digitálisz növényben fordul elő, emberi vagy állati szövetekben nem kell immunokémiailag hasonló ligandum előfordulásával számolni, amely megköthetné az anti-digoxigenin antitestet. Ez eredményezi az alacsony háttér-festődést. Az anti-digoxigenin antitest kevesebb, mint 1%-ban mutat keresztreaktivitást egyéb szteroidokkal. Az antitest Fc fragmensét proteolitikus úton eltávolították, hogy elkerüljék a non-specifikus kötődést a celluláris Fc receptorokhoz. Az apoptózis kimutatásának lépései Apop-Tag kittel: 1) Paraffinos szövetblokkból 6mm vastagságú metszeteket készítettünk. 2) Deparaffinálás, amely során a metszeteket 2x váltott xilolban 5-5 percig, 2x váltott abszolút alkoholban 5-5 percig, majd 95%-os és 70%-os alkoholban 3-3 percig mostuk. A metszeteket PBS-ben (phosphate buffered saline) öblítettük 5 percig. 3) Emésztés proteináz K-val (20mg/ml) 15 percig szobahőmérsékleten. 4) Mosás 4x váltott desztillált vízben 2-2 percig. 5) Blokkolás metanolban oldott 1%-os hidrogénperoxiddal 37°C-on 30 percig. 6) Mosás PBS-ben 3x5 percig. 7) Inkubálás Equilibrációs Pufferrel (S7100-1) szobahőmérsékletű nedves kamrában 10 percig. 8) Inkubálás a Reakció Puffert (S7100-2) és TdT enzimet (S7100-3) tartalmazó munkaoldattal 37°C-os nedves kamrában 60 percig. 9) Az enzimreakció leállítása céljából inkubálás desztillált vízben oldott Stop/Wash Pufferrel (S7100-4) 37°C-on 30 percig. 10) Mosás 3x váltott PBS-ben 5-5 percig. 11) Inkubálás Anti-Digoxigenin Peroxidázzal (S7100-5) szobahőmérsékletű nedves kamrában 30 percig. 12) Mosás 3x váltott PBS-ben 5-5 percig. 13) Festés frissen készített diaminobenzidin (DAB) szubsztrát-oldattal 5-10 percig szobahőmérsékleten. Az oldat 0.05% DAB-ot tartalmazott PBS-ben oldva. Használat előtt közvetlenül átszűrtük, és 0.02% hidrogén-peroxidot adtunk hozzá. A

54

9. lépésben adott peroxidáz a DAB-ot oxidálja, dinitrobenzidin keletkezik, ami barna színreakcióval jár. 14) Mosás desztillált vízben 3x 1-1 percig, majd 1x 5 percig. 15) Kontrasztfestés 0.5 %-os metilzölddel (0.1 M Na-acetátban oldva, pH 4.0) 10 percig, szobahőmérsékleten. 16) Öblítés 3x váltott desztillált vízben 17) Dehidrálás 100% butanolban háromszor. 18) Derítés 3x váltott xilolban 2-2 percig. 19) Fedés Canada balzsammal. DNS-index, S-fázis arány, ploidia A sejtenkénti DNS tartalom meghatározása 3 lépésben történt: 1. Sejtmag-izolálás, 2. Feulgen-festés, 3. DNS citofotometria Sejtmag-izolálás A próbaexcíziós paraffin-blokk harmadik részéből végeztük el a sejtmag-izolálást. A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetekből enzim-extrakcióval lehet sejtmagokat nyerni citometriás célokra. Lépések: 1) A paraffinba ágyazott szövetekből 1-3 darab, 50 µm vastagságú metszetet készítettünk, amelyeket Eppendorf-tubusba helyeztünk. 2) A metszeteket kétszer váltott xilolban 20-20 percig deparaffináltuk (37°C-os termosztátban), leszálló alkoholsorban (95%, 70%, 50%), majd desztillált vízben öblítve rehidráltuk. Emésztés 0.07 M HCl-ben oldott 0.5% pepszinnel (SIGMAAldrich Corp., St.Louis, MO, USA) 37°Con, 30-50 percen át állandó, enyhe rázás mellett. Az inkubációs idő a kinyert magok mennyiségétől függ, általában 0.5-1 óra között változhat. Vigyáztunk arra, hogy az izolálási idő ne legyen a szükségesnél hosszabb, nehogy a magizolálás során DNS-veszteség keletkezzen. Ezért ellenőrzést végeztünk

1%-os

toluidinkék

festéssel,

fénymikroszkópos

úton,

hogy

a

reakciókeverékben megfelelő mennyiségű szuszpendált sejtmagot találunk-e. Amennyiben igen, az enzim-reakciót leállítottuk az Eppendorf-tubus jégre helyezésével (15 perc), a keverék 4°C-ra történő gyors lehűtésével. 3) Szükség esetén a szuszpenziót centrifugálással dúsítottuk (1000 G , 1 perc).

55

4) Szűrés 40 µm pórusátmérőjű hálón, amelyen csak az izolált sejtmagok mennek át. Ezt követően az izolátumot tárgylemezre cseppentettük (3x5-5 ml tárgylemezenként és mintánként), majd posztfixációt végeztünk 4%-os hideg paraformaldehid oldattal 10 percen át. Szárítás hűtőszekrényben, ezt követte a Feulgen-festés. Feulgen-festés A Feulgen-festés rendkívül specifikusan a DNS-t tünteti fel. Az eljárás azon alapul, hogy enyhe savas kezelés a purin és pirimidin bázisokat lehasítja a DNS-ről, de nem bontja a foszforsav- és cukor-molekulák közötti észterkötéseket, és így a cukor-foszfát váz az eredeti pozícióban marad. A lehasított nukleotidok helyén a ribóz első szénatomján aldehid-csoport alakul ki, amely egy következő lépésben a Schiff-reagensben lévő bázikus leucofuchsint kovalens kötéssel megköti és egyúttal színes termékké alakítja (rekolorizálja). Az RNS legnagyobb része a savas hidrolízis alatt feltöredezik és kioldódik a sejtből. A mégis visszamaradt RNS-darabok ribozil-maradványain aldehidcsoport nem alakul ki, valószínűleg a 2. szénatomon lévő hidroxilcsoport gátló hatása miatt. Az eljárás lépései: 1) Hidrolízis 1N HCl-ben 60°C-on 8 percig, amely során a purin- és pirimidin-bázisok leválnak, helyükre aldehidcsoport kerül. A különféle sejttípusra egyformán jól alkalmazható hidrolízis-idő nem adható meg, hanem azt alkalmanként kell meghatározni. Ez úgy történt, hogy párhuzamos preparátumokat a választott hidrolízis-eljárásnak megfelelő időintervallumban (az általunk használt eljárásban 4-8 perc) különböző ideig sósavkezelésnek vetettük alá, majd megfigyeltük, vagy citofotométerrel megmértük a sejtmagok festődését. Ezzel meghatároztuk az ún. hidrolízis-görbét (a magfestődés intenzitásának változása a hidrolízis-idő függvényében). A görbe jellemzője, hogy kezdetben a hidrolízis-idő növekedésével párhuzamosan a magfestődés intenzitása rohamosan nő, majd egy bizonyos időtartam alatt a festődés lényegesen nem változik, végül a DNS előrement depolimerizációjának megfelelően csökken. Az optimális hidrolízis-időt úgy választottuk ki, hogy a görbe stacionáris szakaszára essen, ezzel biztosítottuk, hogy az optimumtól való kis eltérés nem okozhatott észrevehető színintenzitás-változást. 2) Festés Schiff-reagensben (80 perc). A Schiff-reagens elkészítéséhez Pararosalint {color index:4250 (SIGMA-Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA)} használtunk.

56

3) Kénessavas mosás 2x10 percig. A kénessav elkészítéséhez 200 ml desztillált vízbe 10 ml 1N HCl-t és 1g Na-piroszulfitot tettünk. 4) Szárítás. 5) Fedés Canada-balzsammal. Citofotometria Egy digitális képanalizáló rendszer segítségével - DNACE (KFKI-OOI, Budapest, Magyarország) - segítségével meghatároztuk a DNS indexet, S-fázis arányt, ploidiát. Betegenként 1-1 sejtmag szuszpenziót vizsgáltunk, mindegyikből véletlenszereűen kiválasztottunk 400 tumorsejt-magot és max. 50 leukocita sejtmagot diploid referenciakontrollnak. Egy interaktív tanulási algoritmust alkalmaztunk a referenciaként szolgáló, és a tumoros sejtmagok megkülönböztetésére. A sejtmagok denzitását egyenként meghatároztuk. Az egyes sejtmagokat fénymikroszkóp (Zeiss, Oberkochen, Németo.) és egy fekete-fehér TV kamera (Oscar, St. Louis, MO, USA) segítségével vizsgáltuk. A minta fénymikroszkópos megvilágításra 540 nm hullámhosszú monokromatikus fényt használtunk, amelyet egy interferencia-filterrel állítottunk elő. A mikroszkóp alatt a minta mozgatása komputer által ellenőrzött módon, motorikusan történt. A számítógép sejtmagonként általában 15 - morfometriára, denzitásra, és a nukleáris szerkezetre jellemző - paramétert határozott meg. A sejtmagokat a számítógép kis részekre osztotta, ezek optikai denzitását külön-külön meghatározta, a denzitás értékeket integrálta, és kiszámolta az egész sejtmag optikai denzitását. A tumorsejtek integrált denzitás értékeit a leukocita sejtmagok - mint diploid DNS referencia - denzitás értékeihez viszonyította. Az összes lemért sejtmagot a számítógép egy képtárban (galéria) tárolta az utólagos ellenőrzés lehetőségének biztosítása céljából. A DNS-hisztogramból számított paraméterek a következők (szubpopulációnként): 1) G1-fázisú sejtek száma 2) S-fázisú sejtek száma 3) G2-fázisú sejtek száma 4) DNS-index 5) Poliploid frakció

57

4.1.3.3. A vizsgálatok értékelésének módszerei A hisztológiai diagnózist HE-nal festett metszetek vizsgálatával állítottuk fel. Az apoptózis-indexet 2000 tumorsejt vizsgálata alapján határoztuk meg mind HE, mind Apop-Tag festés felhasználásával. A mitózis-index meghatározásánál szintén 2000 sejtet vettünk alapul, HE festést használtunk. A p53 immunoreaktivitás értékelésénél a mintát negatívnak tekintettük, ha nem találtunk pozitív sejtet, “+” -nak, ha elszórtan néhány izolált pozitív sejt volt identifikálható, “++”-nak, amikor a tumor egyes részein nagy csoportokban találtunk pozitív sejteket, más részek negatívok voltak, “+++”-nak, amikor minden sejt pozitív reakciót adott. A második mintavételnél szintén az egész anyagot formalinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, HE-nal festettük, ill. Apop-Tag és p53 immunohisztokémiát végeztünk. A HEnal festett metszeteket a hisztológiai struktúra vizsgálatára használtuk, meghatároztuk az apoptózis- és mitózis-indexet. Az apoptózis-indexet Apop-Tag festéssel kontrolláltuk, a p53 pozitivitást pedig arra alkalmas immunhisztokémiai módszerrel mutattuk ki. A 2. táblázatban foglaltuk össze a sugárkezelés előtt, ill. 2 Gy besugárzás után meghatározott apoptózis-index értékeket, mitózis-indexeket, p53 immunoreaktivitást, valamint ezen a táblázaton tüntetjük fel a sugárkezelés előtt mért DNS-indexeket, ploidiát és S-fázis arányt. 4.1.4. Eredmények 4.1.4.1. Hisztológia Mindegyik vizsgált tumor szövettanilag elszarusodó laphámrák volt különböző fokú keratinizációval (4. ábra).

4.1.4.2. TNM beosztás A tumorok többsége a diagnózis felállításakor már elérte a T3-T4 stádiumot. Minden T4es tumor - és néhány kisebb is - nyaki metasztázist adott. Egy esetben sem találtunk távoli metasztázist. (1. táblázat, 51. oldal)

58

2. táblázat p53 pozitivitás, apoptózis- és mitózis-index, DNS-index, ploidia és S-fázis arány fejnyaki tumorokban - sugárkezelés előtt és után

N°

p53

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

neg. neg. neg. neg. neg. +++ neg.

Apo. index (%) 2,5 2,6 3,9 5,1 2,9 1,6 1,7

8. 9. 10.

neg. + +++

0,4 1,8 1,4

11. 12. 13. 14. 15.

neg. neg. +++ +++ +++

0,7 3,1 1,8 0,2 0,7

Sugárkezelés előtt Mito. DNS S-fázis index index (%) (%) 3,0 1,5 34,8 0,1 0,97 28,9 1,6 1 30,7 0,5 2,2 0,6 1 15,7 1,8 1:1,86* 1:41* 2:1,22 2:21,8 2,9 1,26 14,5 5,2 3,44 46 * 1,7 1:1,33 1:46,5* 2:2,49 2:11,1 1,7 1,4 20,9 0,2 0,2 2,48 25 0,2 1,89 15 1,6 -

Ploidia

A D D D A A A A A A A A A -

* két szubpopulációt találtunk A: aneuploid;

D: diploid; Apo.: apoptózis;

Mito.: mitózis

„-” : technikai okok miatt nem vizsgáltuk

59

Sugárkezelés után p53 Apo. Mito. index index (%) (%) neg. 12,8 0,1 neg. 3,0 1,0 neg. 2,5 1,2 neg. 3,8 0,5 neg. 1,2 0.7 +++ 3,0 0,4 neg. 1,7 0,2 neg. + ++

0,6 1,7 2,6

1,0 0,0 0,0

neg. neg. +++ +++ +++

0,7 1,6 0,7 2,6 0,6

0,2 1,7 1,0 0,4 2,6

4.1.4.3. Tumor-regresszió A sugárkezelés eredményességét a WHO beosztása (202) szerint határoztuk meg. Az 1. táblázatban (51. oldal) feltüntetett besugárzási dózisokat követően 6 esetben nem találtunk regressziót (NR), 2 esetben parciális (RR), 7 esetben totális regressziót (TR) figyeltünk meg klinikailag. Ez utóbbi 7-ből azonban 6-nál lokális recidiva ill. nyaki metasztázis jelentkezett a kezelés befejezésétől számított 1-12 hónapon belül. 1 esetben recidiva nem, viszont az eredeti primer tumorhoz képest az ellenoldalon második primer daganat és nyaki metasztázis jelent meg 42 hónap elteltével. A betegek 50%-a a diagnózis felállításának időpontjához képest 2-13 hónapon belül meghalt, a túlélésüket relatíve rövidnek vettük. A másik 50% a diagnózis időpontjához képest 15 hónapig, vagy annál tovább élt (1 esetben 62 hónapig), túlélésük relatíve hosszú. A sugárkezelésre teljes regresszióval reagáló betegek közül 5-nél hosszú, 2-nél rövid volt a túlélés. A nem reagálók közül a túlélés 4 betegnél rövidnek, 2-nél hosszúnak bizonyult (bár a „hosszú” túlélési eredmények közül a legrövidebb: 15-15 hónap volt). A részlegesen reagáló 2 betegnél egyikük túlélése hosszúnak, másikuké rövidnek mutatkozott. 9 beteg kiegészítő sebészi, radio- és/vagy kemoterápiában részesült, ezek közül 7 esetben hosszú, 2 esetben rövid túlélést tapasztaltunk.

4.1.4.4. p53-expresszió 6 betegnél találtunk a tumorban p53 pozitivitást (5., 6., 7. ábra); 3 betegnél hosszú, 3nál rövid volt a túlélés. Azok közül, akiknél a túlélés hosszúnak bizonyult, 2 beteg reagált teljes regresszióval a kezelésre (1 esetben tíz, 1 esetben pedig tizenkét hónap múlva jelentkezett lokális recidiva és nyaki metasztázis), 1-nél a regresszió parciális volt. A rövid túlélést mutató betegek közül 1 esetben teljes regressziót tapasztaltunk sugárterápiát követően (1 hónapon belül azonban nyaki metasztázis, 2 hónapon belül lokális recidiva jelentkezett), 1 esetben parciális regresszió volt megfigyelhető, 1 beteg pedig nem reagált a kezelésre. A kilenc, p53 negatív daganattal bíró beteg közül 4-nél teljes tumor-regressziót tapasztaltunk, míg 5 beteg nem reagált sugárterápiára. A p53 expresszió a kezelés során nem változott.

60

4. ábra Laphámrák szigetek kötőszöveti strómába ágyazva (3. eset) HE-festés, x 150

5. ábra +++p53 pozitivitás mesopharynx laphámrákban (10. eset) p53 immunhisztokémia, x 150

61

6. ábra +++ p53 pozitivitás laphámcarcinoma sejtekben (14. eset) p53 immunhisztokémia, x150

7. ábra +++ p53 pozitivitás laphámcarcinoma sejtekben (15. eset) p53 immunhisztokémia, x300

62

4.1.4.5. DNS-hisztogram paraméterek A sejtmag DNS tartalmát 11 esetben határoztuk meg ( a többi esetben a biopsziás anyag kevés volt sejtmag izoláláshoz), ebből 8 tumor aneuploid DNS eloszlást mutatott különböző DNS-index értékekkel (3.B ábra, 46. o.). A 8-ból 4 beteg túlélése hosszú, 4 betegé rövid. Két tumornál két aneuploid szubpopulációt találtunk (3.C ábra, 47. o.). Három esetben találtunk diploid kromatin tartalmat (3.A ábra, 46. o.), ebből 1 esetben a túlélés hosszú, 2 esetben rövid volt. A legmagasabb DNS indexszel rendelkező tumoroknál p53 pozitivitást is találtunk. A diploid tumorok esetében sugárterápiát követően egy esetben sem tapasztaltunk terápiás válaszkészséget, az aneuploid tumorok közül 4-nél teljes, 2-nél részleges regresszió volt megfigyelhető, 2 daganat nem reagált a kezelésre. Az S-fázis arány a vizsgált tumorok felénél 28% fölé esett (ezeknél az S-fázis arányt relatíve magasnak vettük), másik felénél 28% alatti - relatíve alacsony - értéket kaptunk. (Két szubpopuláció esetén a magasabb S-fázis értéket vettük figyelembe.) A 28% feletti csoportba tartozó 6 daganat esetében a betegek túlélése 3-nál hosszú, 3-nál rövid, a 28 % alatti csoportba tartozó 5 daganat esetében a túlélés 2-nél hosszú, 3-nál rövid volt. A magas S-fázis aránnyal rendelkező 6 tumor közül 4 nem reagált a sugárkezelésre, 1 részleges, 1 teljes regressziót mutatott. Az alacsony S-fázis értékkel bíró daganatok közül 3 mutatott teljes, 1 parciális regressziót, 1 pedig nem reagált a kezelésre.

4.1.4.6. Apoptózis-index (AI) A 8-11. ábra apoptotikus tumorsejteket mutat laphámráksejtek között. 4 betegnél az apoptózis-index az első besugárzást követően emelkedett (2. táblázat, 59.oldal). A 4-ből 3 túlélése hosszú (23, 18 és 15 hó), 1-é rövid volt. Hét esetben nem változott az apoptózis-index az első kezelést követő 24 órán belül, 3 esetben hosszú (62, 16 és 15 hó), 4 esetben rövid a túlélés. Az AI 4 esetben csökkent, a túlélést 2 esetben hosszúnak (38 és 17 hó), 2-ben rövidnek találtuk. Azoknál a betegeknél, akiknél AI növekedést tapasztaltunk, a sugárterápiát követően 1 esetben teljes regresszió, 1 esetben részleges regresszió volt megfigyelhető terápiát követően, míg 2 beteg nem reagált a kezelésre. Az apoptózis-index változatlanul

63

maradása 3 betegnél terápiás hatástalansággal, 4-nél teljes regresszióval járt. Csökkenése esetén 2 betegnél teljes regressziót, 1-nél parciális regressziót figyeltünk meg, 1 nem reagált a kezelésre. A kezelést megelőzően meghatározott AI a tumorok felénél 1.8, valamint annál magasabb értéket mutatott, míg másik felénél 1.8 alá esett. A magasabb kiindulási apoptózis-indexszel rendelkező daganatok közül 4 esetben nem tapasztaltunk terápiás választ, 1 tumor parciális, 3 pedig totális regresszióval reagált a sugárkezelésre. Magas AI esetén 4 beteg túlélése hosszúnak, 4-é rövidnek bizonyult. Alacsonyabb AI értékek mellett a 7 tumorból 5 reagált a kezelésre (4 teljes, 1 parciális regresszióval), 2 nem. A 7ből 4 beteg túlélése hosszú, 3-é rövid volt.

8. ábra Két apoptikus tumorsejt ép laphámráksejtek között (14. eset) Apop-Tag festés; x150

64

9. ábra Apoptotikus sejtek ép laphámrák sejtek között (10. eset) Apop-Tag, x 150

10. ábra Apoptotikus sejt ép laphámrák sejtek között (9. eset) Apop-Tag, x 300

65

11. ábra Apoptikus tumorsejt laphámráksejtek között (10. eset) HE festés; x150

4.1.4.7. Mitózis-index (MI) 7 tumornál a mitózis-index az első kezelést követően csökkent. A 7-ből 4 beteg túlélése hosszú (62, 38, 18 és 15 hó), 3 esetben rövid volt. Négy esetben nem változott a mitózisindex, 2 betegnél hosszú (17 és 16 hó), 2-nél rövid túlélést tapasztaltunk. Emelkedett a mitózis-index 4 betegnél, akik közül szintén 2-nél hosszú (15 és 23 hó), 2-nél rövid volt a túlélés. A mitózis-index csökkenése 7 tumorból 4-nél teljes, 1-nél részleges regresszióval járt, míg 2 daganat nem reagált a kezelésre. A teljes regresszió csak 2 esetben párosult hosszú túléléssel. Azok közül a betegek közül, akiknél az MI nem változott a tumorban 2 Gy besugárzást követően, 2-nél teljes regressziót tapasztaltunk, 2-nél nem volt megfigyelhető terápiás válasz. Az MI emelkedése 2 ízben terápiás válaszképtelenséggel, 1 betegnél részleges, 1-nél teljes regresszióval járt. A kezelés előtt meghatározott MI érték a tumorok felénél 1.6, ill. annál kisebb volt, míg másik felénél 1.6 fölé esett. Az alacsonyabb kiindulási mitózis-indexet mutató daganatok

66

közül 4 nem reagált a kezelésre, 1 esetben parciális, 3-nál teljes regressziót tapasztaltunk. A magasabb MI-értékkel bíró 7 tumor közül 5 reagált (1 parciális, 4 teljes regresszióval) a sugárterápiára, 2 nem. A magasabb kiindulási mitózis-index értékkel rendelkező esetek egybeestek azokkal, amelyeknél 2 Gy besugárzás hatására mitózisindex csökkenést tapasztaltunk. A 12. ábrán egy mitotikus tumorsejt látható mesopharynx laphámrákban.

4.1.5. Megbeszélés A fej-nyak régió malignus daganatainak - különösen a későn felismert szájüregi és garat tumoroknak - rendkívül rossz a prognózisa mind sugárkezelés, mind egyéb terápia mellett (134, 183). Vizsgálati anyagunk szintén ezt a tényt tükrözi: a vizsgálatba bevett 15 betegből csak heten reagáltak teljes regresszióval a sugárkezelésre, közülük is 6 betegnek a kezelés végétől számított 1-12 hónapon belül helyi recidivája és/vagy nyaki metasztázisa keletkezett. 1 betegnél lokális recidiva és metasztázis nem, ellenben második primer tumor jelentkezett 42 hónappal az első primer daganat diagnózisa után, amely végső soron a beteg halálához vezetett. Mundle (129) megfigyelésével összhangban a spontán apoptotikus rátát alacsonynak találtuk a vizsgált tumorokban, míg a mutáns p53 fehérjét expresszáló tumorok száma relatíve magas. 2Gy besugárzás hatására az apoptózis-index (1 kivétellel) csak mérsékelten emelkedett 4 esetben, 11 esetben nem változott, ill. csökkent. Mindez arra enged következtetni, hogy az apoptózis indukálhatósága nagyon alacsony a fej-nyaki daganatokban, ami összhangban van a gyenge terápiás effektussal. Schiffer és mtsai (162) oligodendrogliomákban vizsgálták az apoptózis- és mitózis-index prognosztikai jelentőségét. Eredményeik azt mutatják, hogy az apoptózis-index jól korrelál a mitózis-indexszel, és p53 pozitív tumorokban szignifikánsan magasabb, mint p53 negatív daganatoknál. Az apoptózis-index nagysága és a túlélés között csak gyenge összefüggést találtak. Tannapfel és mtsai (186) hepatocelluláris karcinómákban szignifikáns összefüggést tapasztaltak a mitózis-index nagysága és a túlélés között, ezzel ellentétben az apoptózis-index és a túlélési időtartam között nem volt kimutatható kapcsolat.

67

12. ábra Mitotikus alak szájfenék laphámrákban (8.eset) HE-festés x300

68

Lera és mtsai műtéti és posztoperatív radioterápián átesett gégekarcinómás betegek esetében leírták, hogy az alacsony kiindulási apoptózis-index hosszabb recidiva-mentes idővel és túléléssel párosul (113). Vizsgálataink során az apoptózis-index nagysága, valamint annak (sugárkezelés hatására történő) indukálhatósága és a túlélés között nem találtunk összefüggést. A tumorok sugárterápiás válaszkészségét illetően Shintani és mtsai eredményeivel ellentétben - akik szájüregi laphámrákok vizsgálatakor úgy találták, hogy az alacsony apoptózis-index gyenge válaszkészséggel jár együtt sugárterápiára (169) - anyagunkban azt tapasztaltuk, hogy az alacsonyabb kiindulási apoptózis-indexszel bíró daganatok megbízhatóbban reagáltak a kezelésre (7-ből 5 tumor reagált, 4 totális, 1 parciális regresszióval), mint a magasabb AI-vel rendelkezők. Az apoptózis-index 2 Gy besugárzással történő indukálhatósága nem vetítette előre a vizsgált tumorok terápiás befolyásolhatóságát. Adataink alapján úgy tűnik, hogy a mitózis-index csökkenése, amelyet 7 esetben tapasztaltunk - a 7-ből 4 beteg túlélése hosszú, 3 betegé rövid volt - nagyobb esélyt jelenthet relatíve hosszabb túlélésre. Ebben a csoportban tapasztaltuk a leghosszabb túlélési eredményeket, 1 betegnél helyi recidiva és metasztázis nem jelentkezett, a beteg halálához második primer tumor megjelenése vezetett. A mitózis-index változása a sugárterápiás válaszkészség jobb indikátorának bizonyult, mint az apoptózis indukálhatósága. Mitózis-index csökkenést mutató daganatoknál megbízhatóbb sugárterápiás válaszreakciót tapasztaltunk (7-ből 5 malignoma reagált a kezelésre, 4 teljes, 1 parciális regresszióval), mint az MI növekedése, ill. változatlanul maradása esetén. A mitózis-index csökkenését 2 Gy besugárzást követően azoknál, és csak azoknál a tumoroknál tapasztaltuk, amelyek kiindulási MI értéke relatíve magas volt. Ennek értelmében a magasabb kiindulási MI érték jobb radioterápiás válaszkészséggel, valamint kedvezőbb prognózissal párosulhat, mint az alacsony MI. Nem találtunk összefüggést a p53 pozitivitás és a diagnózistól számított túlélés között: 6 tumor mutatott p53 pozitivitást (3 esetben a beteg túlélése hosszú, 3-nál rövid volt), míg a többi 9, p53 negatív biopsziás anyag esetében öt beteg túlélése hosszú, négyé rövid. Gasparini és mtsai különböző kiindulási helyű fej-nyaki laphámrákok esetében 73, kombinált

radiokemoterápián

(g-besugárzás

69

cisplatinnal

vagy

carboplatinnal

kombinálva) átesett beteg adatainak feldolgozása után ugyancsak nem találtak kapcsolatot a p53 státusz és a diagnózistól számított teljes túlélési időtartam között. Megállapították, hogy a terápiát követő betegségmentes túlélés szempontjából viszont előnyt jelent a p53 negativitás (49). Hamada és mtsai a spontán apoptózis-indexet, valamint az apoptózis sugárkezelés hatására történő indukálhatóságát is nagyon alacsonynak találták p53 pozitív nyelőcső karcinómákban (62). Pulkkinen és mtsai gége laphámrákok esetében nem találtak összefüggést a p53 státusz és az apoptotikus sejtek száma között (146). Vizsgálati anyagunkban szintén nem találtunk szoros összefüggést a p53 pozitivitás és az apoptózis-index nagysága között, bár a p53 pozitív tumorok alacsonyabb apoptózisindex értékeket mutattak. Ez összhangban van a p53 fehérje ismert genetikai funkciójával, amely szerint a p53 a „genom őre” (104, 109). Eredményeink alapján a p53 pozitivitás és az apoptózis sugárterápia hatására történő indukálhatósága között nem volt kimutatható kapcsolat. 3 esetben azt tapasztaltuk, hogy a p53 pozitivitás az apoptózis hajlam növekedésével párosult (2 betegnél a túlélés hosszú, 1-nél rövid volt), a többi 3 p53 pozitív tumornál viszont hasonló növekedést nem tapasztaltunk, az apoptózis-index sugárkezelést követően 2 esetben nem változott, 1 esetben csökkent. A p53 pozitivitás és a fej-nyaki daganatok sugárterápiás válaszkészsége közti kapcsolat kutatása során több, egymással ellentétes következtetésre jutó közlemény látott napvilágot. Servomaa és mtsai a p53 pozitív tumorok emelkedett sugárterápiás válaszkészségéről számolnak be (166), míg mások ennek ellenkezőjét tapasztalták (25, 169), illetve nem találtak összefüggést a p53 pozitivitás és a radioszenzitivitás között (207). Vizsgálati anyagunkban nem találtunk összefüggést a tumorok p53 státusza és sugárterápiás válaszkészsége között. Dunphy és mtsai fej-nyaki daganatok kemoterápiáját követően (2 v. 3 alkalommal adott paclitaxel és carboplatin) a reziduális tumorokban vizsgálták, hogy megváltozott-e a p53 státusz a kezelés előttihez képest (35). Azt tapasztalták, hogy 42%-ban a p53 pozitív tumorok negatívvá váltak. Saját vizsgálatank során irradiációt követően - az első besugárzás utáni 20. órában - egy tumor esetében sem tudtunk kimutatni változást a p53 státuszban. Bizonyos daganatok, pl. gyomorrák esetében a DNS-index és ploidia szignifikáns prognosztikai faktornak bizonyult (155). Kimura és mtsai a gasztrointesztinális

70

traktusból kiinduló leiomyosarcomák esetében szoros összefüggést találtak a tumorok aneuploid jellege és a betegek rövidebb túlélési ideje között (97). Ezzel szemben fejnyaki daganatoknál vizsgálati anyagunkban a DNS-index, ploidia, S-fázis arány alapján nem tudtunk következtetést levonni a betegség várható lefolyására, prognózisára vonatkozóan. Ezen DNS-hisztogram paraméterek és a sugárterápiás válaszkészség kapcsolatának vizsgálatakor azt tapasztaltuk, hogy a magas S-fázis arány csökkent terápiás hatékonysággal párosul. A hat, magas S-fázis értékkel rendelkező tumor közül négy egyáltalán nem reagált a sugárkezelésre, egy mutatott részleges, egy teljes regressziót (2 hónap elteltével azonban recidiva jelentkezett). Az öt alacsony S-fázisú daganat közül négy reagált a kezelésre: három teljes mértékben regrediált (egy esetben recidiva és metasztázis egyáltalán nem jelentkezett), egy pedig részlegesen. A diploid daganatok közül egyik sem bizonyult sugárszenzitívnek. Az aneuploid tumorok DNS-indexének nagysága és sugárterápiás válaszkészsége között nem találtunk összefüggést.

4.1.6. Következtetések Vizsgálataink során úgy találtuk, hogy fej-nyak rákokban a mitózis-index azonnali (első 2 Gy irradiáció utáni) csökkenése a magasabb, 1.6 feletti kiindulási mitózis-index értékek esetén jelentkezett. Azt tapasztaltuk, hogy az MI csökkenése - azaz a nagyobb kiindulási MI érték - jobb terápiás hatékonyságot, és nagyobb esélyt jelenthet a relatíve hosszabb túlélésre. Ezáltal a mitózis-index meghatározása a kezelés megkezdése előtt lényeges lehet a várható terápiás hatékonyság, és a prognózis megítélése szempontjából fej-nyak karcinómás betegek sugárterápiája esetén. Alacsonyabb kiindulási apoptózis-indexszel rendelkező malignómák megbízhatóbban reagáltak irradiációra, mint a magasabb AI-vel bírók.

Nem találtunk azonban

összefüggést az apoptózis indukálhatósága és a daganatok sugárterápiás válaszkészsége, valamint a kiindulási apoptózis-index nagysága, annak indukálhatósága, és a betegség várható lefolyása, prognózisa között. Úgyszintén nem tudtunk kimutatni kapcsolatot a p53 státusz és a prognózis, valamint a p53 pozitivitás és a radioszenzitivitás között.

71

Magas S-fázis arány és diploid DNS tartalom esetén a tumorok rezisztensebbnek bizonyultak sugárkezeléssel szemben. A túlélésre vonatkozóan azonban nem tudtunk következtetést levonni a DNS-hisztogram paraméterei alapján. Eredményeink alapján tehát elmondhatjuk, hogy fej-nyak rákok esetén a mitózis-index vizsgálata mellett a kiindulási apoptózis-index érték, az S-fázis arány és a ploidia meghatározása

is

értékes

információt

jelenthet

egy

daganat

sugárterápiás

válaszkészségének megítélése szempontjából. Emelett megfigyeléseink azt sugallják, hogy a terápiás válaszkészséget megjósoló paraméterek

különbözhetnek

a

betegség

prognózisát

előrejelzőktől.

Hasonló

következtetésre jutottak - bár más paraméterek (PCNA, bcl-2, p53, vaszkularizáció mértéke) vizsgálata alapján - Gasparini és mtsai (49) is fej-nyaki tumoros betegek kemoradioterápiája esetén. A prognózist és a terápiás válaszkészséget meghatározó faktorok különbözőségére utalhat az a tény is, hogy a sugárkezelésre teljes regresszióval reagáló esetek nem estek mindig egybe a hosszú túlélést mutatókkal, valamint a részleges regresszió, vagy sugárterápiás válaszképtelenség sem jelentett feltétlenül rövid túlélési időt. Vizsgálati eredményeink alapján prognosztikai faktornak csak a kiindulási mitózis-index nagysága (és annak a kezelés hatására történő változása) tekinthető, a sugárterápiás válaszkészséget előrejelző paraméternek pedig szintén az MI nagysága, a kiindulási apoptózis-index érték, az S-fázis arány és a ploidia bizonyult. Tekintettel arra azonban, hogy ez utóbbi mutatók együttes vizsgálata alapján sem lehet biztosan megjósolni a radioterápia várható sikerét vagy sikertelenségét, további paraméterek vizsgálata szükséges ebben az irányban. Az alacsony esetszám az általunk vizsgált faktorok szélesebb körű vizsgálatát is szükségessé teszi mind prognosztikai, mind terápiás szempontból. Következő lépésként a p53, a DNS hisztogram- és a klinikai paraméterek kiterjedtebb, prognosztikai szempontból történő vizsgálatát tűztük ki célul a fej-nyaki régió laphám eredetű karcinómái esetében, nagyobb létszámú beteganyagon. Ennek során retrospektív vizsgálatban, nem csak sugárkezelésen átesett betegek bevonásával tanulmányoztuk az egyes faktorok prognosztikai értékét.

72

4.2. Humán klinikopatológiai kutatások II. A

p53

immunhisztokémia

és

a

sejtenkénti

DNS-megoszlás

prognosztikai értéke fej-nyaki daganatokban 4.2.1. Irodalmi bevezetés Az onkológusokat régóta foglalkoztatja, hogy a különböző kiindulási helyű malignómák esetében sikerüljön a betegség várható lefolyását, terápiás befolyásolhatóságát, kimenetelét előrejelző biológiai markereket, prognosztikai faktorokat találni. Ezek vizsgálatával ki lehetne egészíteni a hagyományos klinikai paraméterek, TNM-stádium, szövettani grading meghatározását. Ezáltal a klinikusok pontosabb képet kaphatnának egy adott daganat biológiai természetéről, agresszivitásának mértékéről, és lehetővé válna az eddiginél racionálisabb, kellő radikalitású, de a funkciómegőrzést mindig szem előtt tartó terápia-tervezés. A biológiai faktorok vizsgálata kompenzálhatná a grading- és TNM-rendszer hiányosságait (183). Az új diagnosztikai lehetőségek elterjedésével (endoszkópia, videostroboszkópia,

mikrolaringoszkópia,

ultrahang,

UH

vezérelt

tűbiopszia,

komputertomográf, mágneses magrezonancia) lehetővé vált a korábbinál pontosabb klinikai TNM-stádium felállítása. Ezt egészíti ki a műtéti preparátum feldolgozása során a primer tumor szövettani vizsgálata, a patológiai TNM meghatározása, valamint a grading. A diagnosztikus módszerek fejlődése ellenére is azt tapasztaljuk azonban, hogy azonos kiindulási helyű, azonos szövettani szerkezetű, azonos TNM-et és gradinget mutató tumorok kimenetele ugyanolyan terápia mellett nagyon eltérő lehet. A tradicionális Broders-féle grading rendszer még ma is a legelterjedtebben használt módszer az egyes daganatok agresszivitásának hisztológiai értékelésére. Az eljárás egyszerű, de szubjektivitása miatt nehezen reprodukálható, ami nehezíti az adatok összehasonlítását a különböző vizsgálóközpontok között (141). Mindezek szükségessé tették és teszik az eddiginél objektívebb és prognosztikailag megbízhatóbb faktorok keresésére irányuló kutatásokat. Az eddigi vizsgálatok azt mutatják, hogy prognosztikai szempontból kiemelkedő jelentősége lehet a p53 és a sejtenkénti DNS-tartalom meghatározásának. Ezzel kapcsolatosan - néhány irodalmi

73

hivatkozás kiemelése mellett (22, 29, 55, 91, 112, 128) - utalnék az értekezés 3.3.3. és 3.3.4. alfejezeteire. 4.2.2. Célkitűzés Fej-nyaki laphámrákban szenvedő betegeknél vizsgáltuk a hagyományos klinikai paramétereknek, valamint a tumorok egyes biológiai jellemzőinek (p53 státusz, DNShisztogram paraméterek) prognosztikai jelentőségét, összefüggésüket a diagnózistól számított teljes túlélési idővel, a terápiát követő recidiva-mentes idő hosszával, és a metasztázis-mentes idővel.

4.2.3. Anyag és módszer

4.2.3.1.Betegcsoport A Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinikájának 51 betegét vettük be a vizsgálatba 1993-tól kezdődően. A betegek közül 43 férfi és 8 nő, életkoruk 40 és 78 év között változott, az átlagéletkor 59.29 év volt. Minden beteg különböző kiindulási helyű fej-nyaki laphámrákban szenvedett (39 gége-, 9 garat- és 3 szájüregi karcinóma szerepelt vizsgálati anyagunkban). A betegekről részletes adatlapot vettünk fel, amelyen rögzítettük születési adataikat, nemüket, a diagnózis időpontját, a státuszt a tumor pontos lokalizációjával (amelyről videoendoszkópos felvételt is készítettünk), a TNM stádiumot, a műtét, vagy egyéb beavatkozás időpontját, a daganat szövettanát és a gradinget. A betegeket rendszeresen kontrolláltuk (3. táblázat).

4.2.3.2. Patológiai eljárás A szövettani diagnózis felállítása 4%-os formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetblokkokból készített, HE-nal festett metszeteken történt. A biológiai paraméterek meghatározását vagy az első, diagnosztikus biopszia során vett szövettani mintából, vagy a primer sebészi terápia során eltávolított szövetblokkból végeztük. A p53 gén expresszióját 45 esetben, a sejtenkénti DNS-megoszlást 44 esetben határoztuk meg (3. táblázat).

74

3. táblázat No. Nem Életkor 1 férfi 46 2 férfi 50 3 férfi 58 4 férfi 49 5 férfi 60 6 férfi 58 7 férfi 68 8 férfi 60 9 férfi 62 10 férfi 54 11 nő 62 12 férfi 49 13 férfi 60 14 férfi 58 15 férfi 48 16 férfi 45 17 férfi 50 18 férfi 78 19 férfi 63 20 nő 41 21 nő 42 22 férfi 71 23 férfi 62 24 férfi 70 25 férfi 42 26 férfi 40 27 férfi 72 28 férfi 68 29 férfi 48 30 nő 48 31 nő 74 32 nő 73 33 férfi 57 34 férfi 46 35 férfi 53 36 férfi 40 37 férfi 56 38 férfi 51 39 férfi 53 40 férfi 62 41 férfi 51 42 férfi 64 43 nő 49 44 férfi 54 45 férfi 58 46 férfi 45 47 férfi 41 48 nő 42 49 férfi 46 50 férfi 54 51 férfi 41

Lokalizáció gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége gége garat nyelv gége garat gége gége gége nyelv gége gége gége garat garat nyelv gége gége garat gége gége gége gége gége gége gége gége gége garat gége gége garat garat gége garat gége

TNM Grading 200 300 210 210 200 210 100 100 100 200 200 310 310 310 100 300 410 310 100 300 320 300 210 200 410 100 200 300 410 110 100 100 321 400 410 300 400 211 100 100 120 300 400 410 310 300 200 110 410 100 300

II II II III I I I I II I I I I II II III II II II II I II II II I I I II II II II I III II II I I I I I III I II I I II II II I I II

Hisztogram típus Diploid Aneuploid 2 szubpop. Diploid Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 1 pop. Diploid Diploid Tetraploid Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Diploid Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Diploid Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Tetraploid Tetraploid Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Tetraploid Diploid Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 2 szubpop. Aneuploid 1 pop. Aneuploid 1 pop. Tetraploid Tetraploid Diploid Diploid -

75

S-fázis frakció % 20,92 13,14 17,88 13,84 15,18 20,21 14,91 13,42 10,26 6,34 18,70 18,43 19,85 9,95 13,57 20,32 31,04 14,30 4,32 21,31 27,64 24,65 41,13 16,06 17,31 7,91 3,49 15,72 36,67 32,74 33,06 8,93 7,29 24,30 25,63 4,86 4,49 12,83 9,79 12,83 25,02 12,00 19,77 12,51 -

Polyploid kóros p53 frakció % expresszió 4,00 pozitív 11,38 pozitív 0,79 pozitív 1,93 pozitív 0,02 pozitív 4,44 pozitív 3,65 negatív 10,03 pozitív 0,04 pozitív 0,60 pozitív 4,35 negatív 4,87 pozitív 2,07 negatív 3,07 negatív 2,19 negatív 3,32 negatív 8,21 negatív 2,37 negatív 0,97 3,03 pozitív 5,27 0,009 pozitív 6,03 negatív 2,42 pozitív 1,96 pozitív 3,19 negatív 0,012 negatív 0,04 5,14 0,009 negatív 8,99 negatív 0,01 pozitív 1,54 3,20 negatív 6,69 negatív 0,05 negatív 0,009 negatív 0,15 negatív 2,14 0,53 negatív 1,52 negatív 0,01 pozitív 5,48 pozitív 5,28 negatív pozitív pozitív negatív pozitív negatív pozitív pozitív

Mind a p53 immunhisztokémiai vizsgálat, mind a sejtenkénti DNS-tartalom meghatározásának módszere a dolgozat 4.1.3.1. fejezetében olvasható. A p53 immunhisztokémiai vizsgálat kivitelezését illetően a metodikában a korábbiakhoz képest lényegi változtatás nem történt, egyes reagensek azonban eltértek az előző vizsgálatban használtaktól. A 3. lépésben primer ellenanyagként PB53-12-1 (BioGenex, San Ramon, CA, USA) helyett Do7-et (DAKO, Glostrup, Dánia) használtunk, szubsztrátként pedig a Vector ABC-AP Substrate Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) szolgált.

4.2.3.3.Statisztikai analízis A matematikai analízishez a BMDP Statistical Software-t (Dept. of Biomathematics, Univ. of California, Los Angeles, USA) használtuk. Ezen belül elemi statisztikával (BMDP 2D) végeztük az egyes változók populáción belüli eloszlásának meghatározását. Faktoranalízissel (BMDP 4M) és diszkriminancia-analízissel (BMDP 7M) választottuk ki a betegek klinikai, illetve a hisztológiai paraméterei közül azokat, amelyek - a betegek túlélési eredményeivel összehasonlítva - prognosztikai jelentőséggel bírhatnak. A diszkriminancia-analízis kiválogatja azokat a változókat, amik a leginkább megszabják egy beteg túlélési esélyeit. A kiválasztott paramétereket Kaplan-Meier szignifikancia-analízisnek (BMDP 1L) vetettük alá, amely az idő függvényében vizsgálja az egyes változók jelentőségét (szignifikanciáját). Megmutatja, hogy egy bizonyos változót figyelembe véve adott időpontban mekkora valószínűséggel él egy beteg.

4.2.4. Eredmények

4.2.4.1. Klinikai paraméterek A klinikai paramétereket multifaktoriális analízisnek alávetve, a betegek kora, neme, a primer tumor lokalizációja, a T-státusz és az alkalmazott terápia (műtét és/vagy sugárkezelés, kemoterápia) közül egyiknek sem volt prognosztikai jelentősége. Ezzel

76

szemben szignifikáns összefüggést találtunk a patológiailag bizonyított nyaki nyirokcsomó metasztázis megléte vagy hiánya, és a teljes túlélési idő között (p=0.0008). A megvizsgált 51 beteg közül 30-nál tapasztaltunk a diagnózis felállításakor N0 nyaki státuszt, 18-nál N1, 3-nál pedig N2-státuszt. N0 nyaki nyirokcsomó-státusszal rendelkező betegek átlagos túlélési ideje 114.4 hónap, míg N1 státusz esetén 26.08 hónap (13. ábra). A 3 N2 státusszal rendelkező beteg közül mindhárom él (a diagnózis felállítása óta eltelt idő viszonylag rövid).

13. ábra Összefüggés az N-státusz és a teljes túlélési idő hosszúságának valószínűsége között

4.2.4.2. Hagyományos hisztológiai paraméterek Az összes vizsgált tumor szövettanilag laphámrák volt, ebből 6 nem-elszarusodó típusú, 45 pedig elszarusodó. A grading beosztás szerint 23 tumor tartozott a GI, 24 GII, 4 pedig GIII csoportba. Sem a szövettani típus, sem a grading nem állt összefüggésben a teljesill. betegségmentes túlélési idővel.

4.2.4.3. Mutáns p53-expresszió A mutáns p53 gén-expresszió szempontjából megvizsgált 45 tumor közül 22-nél tapasztaltunk p53 pozitivitást (49%), 23-nál p53 negativitást (51%). A p53 mutáció jelenléte vagy hiánya nem mutatott korrelációt a teljes túlélési idővel, valamint a 77

recidiva-mentes időszak hosszával. Jelentős, a szignifikancia határán lévő összefüggést tudtunk azonban kimutatni a regionális metasztázis megjelenési ideje és a daganatok p53 státusza között (p=0.06). p53 pozitív tumoroknál a metasztázis-mentes időszak átlagosan 26.8 hónap volt, míg p53 negatív esetekben 110.4 hónap (14. ábra).

14. ábra Összefüggés a p53-pozitivitás és a metasztázis-mentes időtartam hosszúságának valószínűsége között

4.2.4.4. A sejtenkénti DNS-tartalom vizsgálata A vizsgálat során a 44 esetben meghatározott DNS-hisztogram paramétereit vetettük össze a betegség lefolyásával és kimenetelével. Ploidia. A 44 daganat közül 29 (66%) mutatott aneuploid, 15 (34%) pedig euploid DNS eloszlást. A 29 aneuploid tumor közül 18-hoz (62%) társult N0 nyaki státusz a diagnózis felállításakor, 11 esetben (38%) tapasztaltunk nyaki nyirokcsomó metasztázist. Az euploid DNS eloszlás a 15-ből 8 betegnél (53%) járt nyirokcsomó negativitással a vizsgálat kezdetekor, 7-nél (47%) pozitivitással. A követési idő alatt 25 betegnél fordult elő lokális recidiva, 15 (60%) az aneuploid, 10 (40%) az euploid csoportból került ki. Későbbi regionális metasztázisa 12 betegnek lett, ebből 8 (67%) tartozott az aneuploid, 4 (33%) az euploid csoportba. Az aneuploid tumorok tehát gyakrabban adtak recidivát vagy késői regionális áttétet, mint az euploidok, de az eltérés nem szignifikáns. Az

78

euploid és az aneuploid daganatok sem a teljes túlélési időtartam szempontjából, sem a terápiát követő recidiva- és metasztázis-mentes időszak hosszúságát illetően nem mutattak szignifikáns különbséget. S-fázis frakció (SPF). Vizsgálati anyagunkban az S-fázisú sejtek aránya 3.49 és 41.13 % között változott. A betegeket 2 csoportra osztottuk az SPF nagysága szerint. Az egyik csoportba - a Kaplan-Meier szignifikancia-analízis eredményei alapján - azok kerültek, akik tumorában az SPF értéke relatíve alacsony (15%-nál kisebb), a másikba pedig azok, akik daganatában az SPF értéke relatíve magas (15%-nál nagyobb) volt. Teljes túlélési idő szempontjából 21 beteg került az alacsony S-fázis értékű csoportba, 23 beteg a magas SPF értékűbe. Az előbbi csoportba tartozó 21-ből 6 beteg (28%) meghalt, 15 (72%) él, míg az utóbbiba tartozó 23 közül 15 beteg (65%) halt meg és 8 (35%) él. A teljes túlélési idő szignifikánsan (p=0.029) hosszabb volt alacsony SPF értékek esetén (az átlagos túlélési idő 63.2 hónap), mint magas SPF-ek mellett (átlagos túlélési idő 31.7 hónap, 15. ábra). A regionális metasztázis megjelenési idejére vonatkozóan is hasonló összefüggést tapasztaltunk. Szignifikánsan (p=0.05) hosszabb metasztázis-mentes időszak jellemezte az alacsony SPF-fel rendelkező csoportot (58.5 hónap), mint a magas SPF-fel bírót (37.2 hónap, 16. ábra).

15. ábra Kapcsolat az S-fázis frakció nagysága és a teljes túlélési idő hosszúságának valószínűsége között

79

16. ábra Korreláció az S-fázis arány értéke és a metasztázis-mentes időtartam hosszúságának valószínűsége között

Poliploid frakció (PF). A PF értéke 0.009 és 11.38 között változott. 2% felett magasnak, alatta alacsonynak tekintettük a Kaplan-Meier szignifikancia-analízis eredményei alapján. A PF érték szoros korrelációt mutatott mind a teljes túlélési idővel, mind a metasztázis-mentes időtartammal. A teljes túlélési idő szempontjából az alacsony PF értékű csoportba 19 beteg, a magas PF értékűbe pedig 25 beteg került. A 19-ből 5 beteg (26%) halt meg, 14 (74%) él, míg a 25ből 16 beteg (64%) halt meg, 9 (36%) él. Alacsony PF esetén szignifikánsan hosszabb teljes túlélési-időt tapasztaltunk (átlagosan 66.4 hónap), mint magas PF-nél, amikor az átlagos túlélési idő 28.5 hónap volt (p=0.0128). 17. ábra Alacsony PF mellett a metasztázis-mentes idő hosszúsága (átlagosan 64.3 hónap) jelentősen meghaladta a magas PF esetén tapasztalt értéket (28.3 hónap, p=0.0038). 18. ábra

80

17. ábra Összefüggés a polyploid-frakció nagysága és a teljes túlélési idő hosszúságának valószínűsége között

18. ábra Korreláció a polyploid-frakció értéke és a metasztázis-mentes időtartam hosszúságának valószínűsége között

81

4.2.5. Megbeszélés Klinikai paraméterek. A TNM magasabb értékei általában kedvezőtlenebb prognózissal párosulnak, mint az alacsonyabbak. Stell vizsgálatai szerint gégekarcinóma esetében a Tstátusz növekedésével párhuzamosan a túlélési idő nagymértékű csökkenést mutatott, ez azonban szinte teljes egészében a nyirokcsomó metasztázis gyakoribb előfordulásával állt összefüggésben. A T nem, csak az N-státusz bizonyult szignifikáns prognosztikai faktornak (177). Ezzel szemben Resnick és mtsai szignifikáns korrelációt találtak a magas T-státusz és a rövid túlélési idő között, valamint eredményeik azt mutatják, hogy a nyaki nyirokcsomók érintettsége szignifikánsan alacsonyabb betegség-mentes időtartammal és rövidebb teljes túlélési idővel párosul (151). Saját vizsgálataink során nem találtunk összefüggést a betegek kora, neme, a primer tumor lokalizációja, a terápia módja (műtét és/vagy sugárkezelés, citosztatikum) és a prognózis között. A nyaki nyirokcsomó metasztázissal rendelkező betegeknél azonban szignifikánsan rövidebb teljes túlélési időt tapasztaltunk (p=0.0008, 13. ábra, 77. oldal). Hagyományos hisztológiai paraméterek. A tradicionális grading rendszer még ma is a legelterjedtebben használt módszer az egyes daganatok agresszivitásának megítélésére. Az eljárás egyszerű, de a túlélésre, a betegség lefolyására, prognózisára vonatkozóan nem biztosít kellő információt. Sok szubjektív elemet tartalmaz, ami miatt könnyű egy elváltozást felül- vagy alulértékelni az egyes vizsgálóközpontoktól, vizsgálóktól függően, nehezíti az eredmények összehasonlítását a különböző vizsgálóközpontok között (93, 141). Jelen vizsgálatunkban nem találtunk összefüggést a grading és a teljes, ill. betegség-mentes - túlélés között. Mutáns p53 gén expreszió. A kóros p53 fehérje felszaporodásának prognosztikai jelentőségét széles körben vizsgálták és vizsgálják. Emlőkarcinómák esetében a p53pozitív tumorok prognózisát rosszabbnak találták - különösen nyirokcsomó metasztázis nélküli betegekre vonatkoztatva -, mint a p53 negatívokét (23, 170, 187). Goh és mtsai (54), illetve Hamelin és mtsai (64) vastagbélrákoknál is azt tapasztalták, hogy a mutáns p53-gén expressziója a betegség rossz prognózisát jelzi.

82

Fej-nyaki karcinómák esetében a közlemények 50-70%-ban jelzik a p53-gén mutációját. Az irodalmi adatok elemzésénél ellentmondó eredményeket találunk a p53-gén mutációjának prognosztikai jelentőségével kapcsolatban. Egyes szerzők szerint a fejnyaki daganatokban a p53-gén mutációja rossz prognózist jelez (17, 22, 49, 91, 112), míg mások nem találtak értékelhető kapcsolatot a p53-gén mutációjának jelenléte és a klinikai lefolyás között (45, 74, 113, 132, 146). Nyelvgyöki karcinómáknál leírták, hogy a p53 akkumuláció hosszabb túléléssel társulhat (206). Saját vizsgálataink során nem találtunk szignifikáns összefüggést a mutáns p53 expresszió és a teljes túlélési idő között. A szignifikancia határát megközelítő korrelációt találtunk viszont a metasztázismentes idő hosszúsága, és a p53 expresszió között (p53 pozitív esetekben az áttétmentes idő rövidebb volt, p=0.06) (14. ábra, 78. oldal). Sejtenkénti DNS-tartalom vizsgálata.A malignus transzformáció során egyre több olyan sejt alakulhat ki, amely DNS-tartalma különbözik az ép sejtekétől. A sejtenkénti DNStartalom mérése, prognosztikai jelentőségének vizsgálata az utóbbi évtizedekben az érdeklődés középpontjába került. Az eredmények azonban nagyon eltérőek lehetnek az egyes daganatfajtákat illetően (38, 63, 156), de még azonos kiindulási helyű, azonos szövettani szerkezetű tumorok esetében is (128, 200). Fej-nyaki daganatoknál a legtöbb szerző jelentős prognosztikai faktornak tartja a DNShisztogram egyes részeit. A ploidia mint prognosztikai faktor vita tárgyát képezi, ellentmondó eredményekről lehet olvasni az irodalomban. Tytor és mtsai szerint az aneuploidia

kedvezőtlen

prognózissal

párosul,

korrelál

a

nyaki

metasztázis

kifejlődésével (191). Cooke és mtsai 102 előrehaladott fej-nyaki daganatos beteg vizsgálata során azt találták, hogy az aneuploid csoportba eső betegeknél cisplatinkezelésre az átlagos túlélési idő 224 nap volt, ezzel szemben a diploid csoportba esőké 118. Azok az aneuploid csoportba eső betegek, aki nem kaptak kezelést, a diagnózistól számítva átlagosan 55 napig éltek, míg a diploid csoportba tartozók 74 napig (29). Ruá és mtsai 133 fej-nyaki tumoros beteg vizsgálatánál szintén ki tudtak mutatni kapcsolatot a ploidia és a prognózis között. A négy éves túlélési időt 42 %-nak találták diploid tumorosok esetében, 28 %-nak a nem diploid daganatos csoportban. Azoknál az N0-s betegeknél, akiknél műtét történt, a négy éves túlélés a diploid tumorosok között 82 %os, a nem diploid tumorosok között 49 %-os volt (154). Goldsmith és mtsai szájüregi laphámrákok esetében az aneuploid daganatokat találták kedvezőtlenebb lefolyásúnak,

83

ugyanakkor hypopharynx- és gégeráknál azt tapasztalták, hogy az aneuploid tumorok prognózisa szignifikánsan jobb, mint a diploid daganatoké (55). Oloffson és Golusinski eredményei (141): az aneuploid szájüregi tumorok többször adnak nyaki metasztázist, ugyanakkor a preoperatív sugárkezelésre jobban reagálnak, mint a diploidok. Lampe az aneuploidia,

illetve a regionális

nyirokcsomóáttét megjelenése között talált

összefüggést (108). Más szerzők, mint Resnick és mtsai (151), valamint Wennerberg és mtsai (200) nem tapasztaltak a ploidia és a prognózis között kapcsolatot. Saját vizsgálati anyagunkban a tumorok túlnyomó többségét aneuploidnak találtuk. A teljes és a betegség-mentes túlélési idő szempontjából sem találtunk szignifikáns különbséget az euploid és az aneuploid daganatok között. Az S-fázis arány (SPF) prognosztikai szerepéről - a ploidiához hasonlóan ellentmondásos eredményeket találni az irodalomban. Egyes szerzők szerint az S-fázis arány a ploidiánál értékesebb prognosztikai szereppel bír (66, 152). Élő 3H-TdR hisztoautoradiográfiás módszerrel vizsgálta gégerákos betegek daganatában az S-fázis frakció nagyságát. Minél nagyobb volt a jelzési index (labelling index, L.I.%), annál gyakrabban észleltek regionális metasztázist (42, 43). Lampe összefüggést talált az SPF nagysága és a metasztázis-mentes túlélési idő között fej-nyaki malignómákban (108). Ruá és mtsai flow citometriás vizsgálatai alapján az SPF korrelál a teljes túlélési idővel (154). Ugyanakkor Wennerberg és mtsai flow citometriás vizsgálataikkal sem a ploidia, sem az SPF-érték meghatározása során nem tudtak összefüggést kimutatni ezen paraméterek és a túlélési idő között (200). Oloffson és Golusinski szintén nem találták az S-fázis-értéket prognosztikai faktornak (141). Resnick és mtsai az S-fázis és a túlélés, illetve a regionális nyirokcsomó-áttét megjelenése között nem találtak összefüggést (151). Saját vizsgálati anyagunkban szoros korrelációt tapasztaltunk az S-fázis arány és a teljes túlélési idő (p=0.029), valamint az S-fázis arány és a metasztázis-mentes túlélési idő (p=0.05) között (15-16. ábra, 79-80. oldal). A poliploid frakció (PF) - egy adott tumorsejt-populáció DNS hisztogramján - a G2 csúcs után jelentkező tartomány. A poliploid sejtek számának prognosztikai szerepe a különböző daganatokban még nem tisztázott. Több tanulmány az aneuploidiát és a poliploidiát egymással összefüggésben említi prognosztikai jelentőségüket illetően (73, 123), kevés adat van a poliploidia önálló prognosztikai szerepére vonatkozóan. Decaestecker és mtsai a tranzicionális sejtes hólyagkarcinómák grade II-es, klinikailag heterogén csoportját próbálták szubtípusokra osztani a ploidia és a prognózis

84

összefüggésének vizsgálata segítségével. A szerzők 9, ploidiával kapcsolatos paramétert értékeltek digitális képanalizátor segítségével. A 9-ből 2 paraméter, a hiperdiploid és a hipertetraploid sejtmagok arányának meghatározása tette lehetővé az egyes szubtípusok elkülönítését, azonosítását, míg a poliploid sejtmagok aránya nem befolyásolta a klinikai kórlefolyást (33). Saját vizsgálataink alapján a poliploid frakció az aneuploidiától független prognosztikai paraméternek bizonyult, szoros összefüggésben mind a teljes túlélési idő (p=0.0128), mind a metasztázis-mentes idő hosszával (p=0.0038). (17-18. ábra, 81. oldal)

4.2.6. Következtetések A multifaktoriális matematikai analízis során nem tudtunk korrelációt kimutatni a betegek klinikai paramétereinek többsége (a betegek kora, neme, a tumor lokalizációja, mérete, a kezelés fajtája) és a prognózis között. Szignifikáns korrelációt találtunk azonban a nyaki nyirokcsomó-státusz és a teljes túlélési idő hossza között: fej-nyaki tumoroknál a nyaki nyirokcsomók érintettsége jelentősen lerövidíti a teljes túlélési időt. Ennek alapján azt mondhatjuk, hogy a klinikai paraméterek közül az N-státusz a legjelentősebb prognosztikai faktor. Az általunk vizsgált hagyományos hisztológiai paraméterek egyike sem állt összefüggésben a teljes- ill. betegségmentes túlélési idővel. Vizsgálati anyagunkban nagy arányban fordult elő p53 pozitivitás. Nem tudtunk szignifikáns kapcsolatot kimutatni a mutáns p53 expresszió a teljes túlélési idő hosszúsága között, a szignifikancia határán lévő korrelációt találtunk azonban a p53 pozitivitás, és a késői nyaki nyirokcsomó-metasztázis megjelenési ideje között. Eredményeink alapján a p53 gén mutációja egyértelműen csökkenti a metasztázis-mentes időtartamot fej-nyaki daganatok esetében. A DNS-hisztogram paraméterek közül a ploidiát vizsgálva az aneuploid tumorok számát a diploidnál magasabbnak találtuk, de a ploidia nem állt összefüggésben a prognózissal. Vizsgálataink során azonban mind az S-fázis arány, mind a poliploid frakció jelentős

85

prognosztikai faktornak bizonyult. Alacsony S-fázis érték esetén mind a teljes túlélési idő, mind a regionális metasztázis-mentes idő szignifikánsan hosszabb volt, mint magas S-fázis értéknél. Alacsony poliploid frakció mellett szignifikánsan hosszabb teljes- és metasztázis-mentes túlélési időt tapasztaltunk, mint magas poliploid frakció esetén. A fenti eredmények megteremthetik annak gyakorlati lehetőségét, hogy a primer biopsziás anyagban a kóros p53-fehérje kimutatásával és a DNS-hisztogram paramétereinek (S-fázis arány és poliploid frakció) mérésével a klinikus felmérje a tumor agresszivitását, és ennek ismeretében a lehető legpontosabban tervezze meg a terápiát: a műtét kiterjesztését, az elektív nyaki blokk-disszekció, vagy a posztoperatív sugárkezelés szükségességét.

86

4.3. DBD és sugárkezelés kombinációjával végzett in vitro vizsgálatok 4.3.1. Irodalmi bevezetés A fej-nyaki laphámrákok rossz prognózisú daganatok, különösen, ha előrehaladott állapotban kerülnek felismerésre. Elsőként választandó terápiájukat legtöbb esetben a sebészi eltávolítás jelenti. Ha ez valamilyen oknál fogva nem végezhető el - akár a tumor előrehaladott stádiuma, vagy a beteg rossz általános állapota miatt, esetleg a beteg nem egyezik bele a műtétbe -, a következő választandó terápiás lehetőség a sugárkezelés. Az egyes tumorok radioszenzitivitása azonban még azonos szövettani típuson belül, azonos lokalizáció, azonos grádus mellett is különböző lehet, és általánosságban elmondható, hogy sugárkezelést követően a prognózis lényegesen rosszabb, mint sebészi eltávolítás után (13, 165). Ezért felvetődik a kérdés, hogy a besugárzást citosztatikummal kombinálva lehetséges-e a kezelés hatékonyságát fokozni. Egy daganat radioterápiájának sikeréhez vagy sikertelenségéhez a tumort alkotó sejtekben rejlő eltérő radioszenzitivitás járul hozzá (165). Schwartz és mtsai 8 különböző humán laphámrák sejtvonalon vizsgálták meg, hogy a radiorezisztens fenotípus kialakulásában mennyiben játszanak szerepet a sugárkezelés által a kromószóma organizációban okozott szerkezeti, és mennyiben a génexpresszióban indukált változások. Azt tapasztalták, hogy az egyes sejtvonalak eltérő radioszenzitivitásának hátterében a DNS repair hatékonyságában megfigyelhető különbség rejlik, ami a kromoszóma organizációban bekövetkező eltérő szerkezeti változásokkal van szoros összefüggésben. Radiorezisztens sejtvonalakban besugárzást követően a DNS- és kromoszóma-törvégek egymás szoros közelében maradnak, így újraegyesülésük sokkal gyorsabb és pontosabb, mint szenzitív sejtvonalakban (165). A különböző kiindulási helyű laphámrákok radio-monoterápiája után tapasztalható gyenge túlélési eredmények - a nagyobb terápiás hatékonyság reményében - szükségessé tehetik a kezelés módosítását, amelyre az egyik lehetőség a sugárkezelés kombinálása különböző citosztatikumokkal. A kombinált terápia hatékonyságát sokféle antineopláziás szer alkalmazásával vizsgálták különböző lokalizációjú laphámrákoknál, az eredmények változók. Blum és mtsai a citosztatikus kezelésből (cisplatin és vinblastin) és az azt

87

követő besugárzásból álló terápiás kombinációt a kezelésre történő tumorregresszió és a túlélés szempontjából is eredményesebbnek találták a radio-monoterápiánál nem kissejtes tüdőrákok (többek között laphámkarcinómák) esetében (14). Az anális csatorna előrehaladott karcinómáinál radiokemoterápiát (5-fluorouracillal és mitomycin-C-vel kombinált sugárkezelés) követően több szerző is magasabb arányú 5 éves túlélést tapasztalt, mint radio-monoterápia után (51, 204). Ezzel szemben Sundfor és mtsai előrehaladott méhnyakrákok esetében a kemoterápiával (cisplatin és 5-fluorouracil) kombinált radioterápia és az önmagában alkalmazott radioterápia eredményeinek összehasonlításakor nem találtak eltérést a különböző módon kezelt két betegcsoport között sem túlélés, sem recidiva-, sem metasztázis-megjelenés szempontjából (180). Calais és mtsai száj-garati laphámrákoknál hasonlították össze a sugárkezelés, és az indukciós kemoterápiával (cisplatin, bleomycin, vincristin vagy vindesin, 5-fluorouracil) kombinált sugárkezelés eredményeit. Csak az N3 nyirokcsomó státusszal rendelkező betegeknél találtak szignifikáns különbséget 5 éves túlélés szempontjából a két csoport között a kombinált kezelésben részesültek javára. Egyéb esetekben a kombinált kezelés nem jelentett előnyt az egyedüli sugárkezeléssel szemben (21). Marcial és mtsai számolnak be az RTOG (Radiation Therapy Oncology Group) által végzett vizsgálatokról, amely során nagy számú, fej-nyak rákos beteganyagon próbálták ki a sugárkezelésből és az azt megelőzően adott methotrexatból álló terápiás kombináció hatását. A kombinált kezelést nem találták effektívebbnek az önmagában adott irradiációnál. Ezzel szemben a besugárzással egyidejűleg adott cisplatin kezelés megnövelte az irradiáció tumorgátló hatását, a kezelés jól tolerálhatónak bizonyult (120). A citosztatikumból és besugárzásból álló kombinált kezelés és a radio-monoterápia eredményességének összehasonlítása céljából végzett saját kísérleteinkhez egy in vitro modellt, A-431 humán laphámrák sejtvonalat használtunk, citosztatikumként pedig egy alkilálószert, az 1,6-dibróm-1,6-didezoxi dulcitot (DBD-t) választottuk. A DBD az alkilálószerek között egyedülálló kémiai struktúrával rendelkezik (88), hatékonynak bizonyult különböző kiindulási helyű humán laphámrákokban (37, 71, 72, 137, 138), előállítása olcsó, ezen okok miatt esett erre a citosztatikumra a választásunk.

88

Alkilálási reakció, alkilálószerek Az alkilálási reakció során egy - elektrofil csoporttal rendelkező - vegyület (alkilálószer) kovalens kötés kialakításával alkilcsoportra cseréli ki egy másik - nukleofil csoporttal rendelkező - vegyület H+ atomját (88). Már az 1950-es évektől kezdve megkísérelték a sejtproliferációt szelektíven befolyásoló - a daganat növekedésének gátlása mellett az egészséges sejteket nem károsító alkilezőszer előállítását. Ennek során az alkilezési reakcióra képes csoportokat (pl. klóretil-amino csoport) különböző hordozómolekulákhoz kötötték, és vizsgálták a proliferációt gátló hatást. Hordozómolekulaként felvetődött a sejt különböző metabolitjainak szerepe, amelytől az egyes anyagcsereutak célzott befolyásolását várták. Ekkor állították elő a fenilalaninmustárt, valamint Magyarországon a cukoralkohol származékokat, amelyet Vargha írt le 1955-ben (88). Ezek a molekulák eleinte csak mint az alkilezési reakcióra képes klór-etil-amino- és metánszulfonsav-csoportok hordozói szerepeltek, majd Horváth és Institóris - hatásosabb citosztatikum előállítása reményében - előbb a mannit, később a dulcit 1-6 szénatomjához brómot kapcsolt, így előállították az 1,6-dibróm-1,6-didezoxi dulcitot, vagyis DBD-t (1967). Az új funkciós csoport alkalmazásának lehetősége miatt a citotoxikus hexitek az alkilező citosztatikumok külön osztályát képviselik. Az alkilező vegyületek legfontosabb biológiai hatása a citotoxicitásban, mutagenitásban és karcinogenitásban nyilvánul meg, amely molekuláris alapja a DNS-hez történő kötődés (88). A nukleinsavakon az alkilezési reakció elsősorban a guanin N7 és az adenin N3 atomját érintheti, de a nukleinsavak és nukleotidok foszfátjainak primer és szekunder hidroxiljait, a guanin 6. szénatomjának oxigénjét, valamint a sejt egyéb alkotórészei közül a szabad és fehérjékben levő SH-, amino- és karboxilcsoportokat is fiziológiás körülmények között alkalmasnak találták alkilezési reakcióra (88). A DNS-en alkilezés létrejöhet az egyik polinukleotidláncon, két polinukleotidlánc között keresztkötés-szerűen, vagy a DNS és a kromatinfehérjék között. Az alkilált bázis a DNSről lehasadhat, így purinmentes (apurin) DNS marad vissza, amely stabilitása lényegesen kisebb, mint az ép DNS-é, ennek következménye a molekula degradációja (88). Alkilálószerrel történő kezelés után a DNS szintézis még lezajlik, a sejtosztódás csak a G2 fázisban, vagy a következő sejtciklusban áll le (88).

89

Az alkiláló vegyületek citotoxikus hatásának érvényesüléséhez szükséges, hogy a sejtek a kezelést követően rövid időn belül osztódjanak (88). A sejtek nyugvó állapota ugyanis lehetővé teszi a repair folyamatok lezajlását, így a DNS-károsodás esetleg nem válik nyilvánvalóvá. Az alkilálószerek között a citotoxikus hexitek csoportjába, ezen belül a dihalogén hexitek közé tartozó 1,6-dibróm-1,6-didezoxi dulcit (DBD) bizonyult a leghatékonyabb, legszélesebb spektrumú dihalogén hexitnek (82), amely laphámrákokban, többek között fej-nyaki laphámkarcinómákban is eredményesen alkalmazható (71). Az alkilálószerek közül a DBD - a dianhidrogalaktikol mellett - egyedülállóan képes áthatolni a vér-agy gáton (88). A DBD hatásának vizsgálata sejtpopuláció szinten Kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejtjein tanulmányozták a DBD hatását a sejtciklus különböző fázisaiban (140, 143). A késői G1- és a korai S-fázisban levő sejtek mutatkoztak a legérzékenyebbnek, míg az S-fázis közepén levők a legkevésbé érzékenynek DBD-vel szemben. Több szerző is vizsgálta az összefüggést a DBD-hatás és a sejtpopuláció proliferációs státusa között. Oláh és mtsai (140) a proliferáló sejteket érzékenyebbnek találták DBDvel szemben, mint a stacioner sejteket emlő sejtkultúrában. Jeney és mtsai (87) nem találtak szignifikáns összefüggést a DBD-hatás és a sejt proliferációs státusa között P388 egér limfoid sejtekben in vitro. Lapis és mtsai (143) a stacioner állapotú Yoshida tumor sejteket érzékenyebbnek találták DBD-re, mint a proliferáló sejteket (alacsony DBD koncentráció esetén), míg magasabb koncentrációnál egyforma DBD-érzékenységet tapasztaltak. Gáti és mtsai (50) ugyancsak Yoshida szarkóma sejtek vizsgálatakor azt tapasztalták, hogy a gyorsan proliferáló sejtpopuláció érzékeny, míg a lassan proliferáló rezisztens DBD-vel szemben. Kopper és mtsai a tumor-növekedés mértéke és a DBD szenzitivitás közötti összefüggést különböző növekedési rátájú NK/Ly ascites tumor sejteken vizsgálták. A „fiatal”, gyorsan proliferáló sejtekből álló tumorokat érzékenyebbnek találták DBD-vel szemben, mint a lassan proliferáló sejtekből álló tumorokat. A „fiatal” tumorok dózis-dependens

90

DBD szenzitivitást mutattak, míg a lassan proliferáló sejtekből álló „öreg” tumorokban a sejtszaporodást a DBD alig befolyásolta (101, 102, 143). Jeney és mtsai leírták, hogy in vitro, V79 kínai hörcsög sejtekből álló szferoidokban a belső, nyugvó sejtek érzékenyebbek a DBD-vel szemben, mint a szferoidok külső részében elhelyezkedő, proliferáló sejtek. Valószínű, hogy a belső, nyugvó sejtekre kifejtett fokozott hatékonyságban a hipoxiás körülménynek is szerepe lehet (89). A DBD hatása a makromolekulák szintézisére Hatás a DNS-szintézisre A DBD már kis dózisban is gátolja a DNS szintézist (68), amely a kezelés utáni 6. órától mutatható ki. A gátló hatás valószínűleg a DNS-károsodással (pl. a kettősspirálban létrehozott interhelikális keresztkötésekkel) van összefüggésben, amelyek szintén a kezelést követő 6. órában kezdenek kialakulni (77, 78). A keresztkötések a guanin bázisok 7. N-atomjai között képződnek (80). Hatás az RNS-szintézisre A DBD kis és közepes dózisai mind in vitro, mind in vivo körülmények között fokozzák az RNS-szintézist a kezelés utáni korai időszakban, később azonban (valamint magasabb DBD koncentrációk esetén) szintézis-gátlás figyelhető meg (44, 68, 69, 193, 209). Az RNS-szintézis fokozódása nem jár együtt a fehérje-szintézis növekedésével (193). Hidvégi és mtsai humán tonsillasejteken végzett in vitro vizsgálatok során, 10/25 mg/ml DBD koncentrációk esetén az RNS szintézis 30-50 %-os fokozódását tapasztalták a szerrel való 1 órás inkubációt követően (69). Az inkubációs idő növelésével a stimuláló hatás egyre csökkent, fokozatosan (2-3 órás inkubációt követően) szintézis-gátlás fejlődött ki. 100/150/250 mg/ml DBD koncentrációk esetén a koncentráció növelésével a prekurzorok egyre csökkenő beépülését tapasztalták az RNS molekulába, a gátló hatás kifejlődése és annak mértéke az utóbbi koncentrációknál is függött az inkubációs időtől.

91

Hatás a fehérje-szintézisre A fehérje-szintézist a DBD kezelés nem befolyásolja számottevően (68, 69, 193). Esetlegesen tapasztalható csökkenése valószínűleg a DBD molekula nukleinsavképződésre kifejtett hatásának köszönhető. Ezt támasztja alá Hidvégi és mtsainak megfigyelése, akik sejtmentes, protein-szintetizáló riboszomális rendszerhez adtak DBDt, és még magas koncentrációk esetén sem tapasztalták az aminosavak csökkent beépülését a fehérjemolekulákba (68). Ezzel szemben a kromoszómális fehérjék szintézisét a DBD szelektíven gátolja. Jeney és mtsai (86) Yoshida tumor sejtekben kimutatták, hogy egyszeri 250 mg/kg-os DBD-dózis csökkenti a hiszton és non-hiszton fehérjék képződését, míg a citoplazmatikus fehérjék termelődését nem befolyásolja. DBD-kromatin kölcsönhatás A DBD molekulák a sejtmagban akkumulálódnak (103), változásokat indukálnak a kromatin összetevőkben (80, 86, 90). Kötődnek a DNS-hez, a hiszton és non-hiszton fehérjékhez, ezáltal megakadályozzák a DNS-hiszton komplexek kialakulását. Institóris és mtsai a DBD tumornövekedés-gátló hatásának kifejlődésével összefüggésben mutatták ki a szer kötődését a különböző kromatin komponensekhez patkányok Yoshida ascites tumor sejtjeiben (83). A kezelés utáni 10. órában a kromoszómális proteinekhez kötődő DBD mennyisége többszöröse volt a DNS-hez kötődőének, a 24. órára viszont 1/4-ére esett vissza a fehérjéhez kötött mennyiség, míg a DNS-hez kötődő mennyiség fokozatosan emelkedett. Ezzel párhuzamosan fejlődött ki a molekula tumornövekedésgátló hatása. Jeney és mtsai (90) vizsgálatai szerint a kromoszómális proteinekhez kötődő DBD mennyisége 1/10 részére esik vissza a kezelést követő első 24 órában. A DBD jelenléte csökkenti a hiszton fehérjék komplex-képző képességét, ez a csökkenés a kezelést követő 2. órában a legkifejezettebb. Ezt követően egyre kevésbé érvényesül, összhangban a fehérjéhez kötött gyógyszer csökkenő mennyiségével. A DBD antineopláziás hatásáért elsősorban a DNS kettősspirálban létrejövő keresztkötések lehetnek felelősek (84). A DBD, mint bifunkcionális alkilálószer olyan nukleofil csoportok összekapcsolására képes, amelyek egymástól meghatározott (kb. 900

92

pm) távolságban vannak. A DNS molekula antiparalell dupla-hélixében a guanin bázisok N7 atomjainak távolsága ezzel megegyezik (84). Institóris és mtsai vizsgálatai igazolták, hogy a DBD a purinbázisokat többnyire az N3 és N7 atomon alkilálja (80, 81). Jeney és mtsai in vitro, plazmid DNS-en végzett vizsgálataik alapján arra a következtetésre jutottak, hogy a DBD kezelés plazmid DNS-re kifejtett elsődleges hatása a DNS molekula egyszálú törése lehet (89). DBD-vel szerzett klinikai tapasztalatok A DBD effektívnek bizonyult különböző humán tumorokban monoterápiaként és kombinált terápiás protokollok részeként alkalmazva egyaránt. Monoterápiaként hatásosnak találták mieloproliferatív betegségekben, akut és krónikus mieloid leukémiában valamint Hodgkin kórban is (71). Akut limfoid leukémia kezelésében szintén eredményesnek bizonyult a szer (171). Sikeres indukciót követő fenntartó kezelésben hasonlították össze a DBD és a cyclophosphamid hatását. DBD esetén a remissziós periódus rövidebb volt, de nem fordult elő a központi idegrendszer leukémiás infiltrációja. A DBD-t a cyclophosphamidnál kevésbé találták toxikusnak. Schuler és mtsai (163) eredményesen alkalmaztak DBD-t tartalmazó kombinált kemoterápiás protokollt (módosított MOPP protokollt: DBD, vincristin, prednisolon, procarbazin) besugárzással együtt gyerekkori Hodgkin kórban. Egyes szolid humán tumorok kezelésében szintén jók a DBD-vel szerzett tapasztalatok: Kedvező farmakokinetikai paraméterei, a liquorban elért magas koncentrációja, hosszú felezési ideje teszik alkalmassá a szert agydaganatok terápiájára. Schuler és mtsai (164) a DBD-t vincristinnel és procarbazinnal kombinálva eredményesnek találták gyerekkori medulloblastomában. Áfra és mtsai (3) malignus szupratentoriális gliomák posztoperatív terápiájában próbálták ki a szert, sugárkezeléssel kombinálva. A radioterápiát és a párhuzamosan adott DBD kezelést a műtét után 3-5 héttel kezdték. Ennek befejeződése után

a

betegek

egyik

csoportja

CCNU-ból

{1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexil-1-

nitrosourea} és DBD-ből álló, míg másik csoportja CCNU-ból és procarbazinból álló

93

citosztatikus kezelésben részesült. A túlélési eredményeket mindkét csoport esetében szignifikánsan jobbnak találták, mint azoknak a betegeknek az eredményeit, akik a posztoperatív időszakban csak sugárkezelésben részesültek. Nem tapasztaltak azonban hosszabb túlélési időt azokhoz viszonyítva, akik a posztoperatív irradiáció ideje alatt intermittáló DBD kezelést kaptak, egyéb terápiában azonban nem részesültek. Áfra és mtsai eredményei alapján tehát a besugárzással párhuzamosan adott DBD kezelésnek fontos szerepe lehet a túlélés javításában (3). Elliot és mtsai (39) magas malignitású astrocytoma miatt kezelt betegeknél terápiás hatékonyság és toxicitás szempontjából összehasonlították a DBD-vel kombinált sugárkezelést a BCNU-val {1,3-bis(2chloroethyl)-3-cyclohexil-1-nitrosourea}

kombinált

irradiációval.

Terápiás

hatékonyságban nem találtak különbséget a két csoport között, az átlagos túlélési idő és a betegség progressziójáig átlagosan eltelt idő is közel azonos volt a két csoportban. A BCNU esetében azonban mind a hematológiai, mind a nem hematológiai toxicitás szignifikánsan magasabb volt, mint DBD-nél. A DBD effektívnek bizonyult a központi idegrendszeren kívüli, egyéb szolid tumorok, például emlőkarcinóma (24, 189, 190), tüdőkarcinóma (203), szájüregi és más fej-nyaki daganatok, hólyagtumorok terápiájában is. A szolid tumorok közül a legjobb eredményeket laphámrákok, ezen belül fej-nyaki és tüdődaganatok kezelésében sikerült elérni (71, 72). A fej-nyaki tumorok (beleértve a szájüregi daganatokat is) túlnyomó többsége hisztológiailag laphámrák. Ezen tumorok rossz prognózisa, valamint kezelésükben a többi citosztatikus szer relatíve alacsony hatékonysága eredményezte a hexitol derivátumok - mint például a DBD - klinikai kipróbálását. Fej-nyaki daganatok kezelése során a DBD-t először önállóan alkalmazták, és így hatásosnak találták (27). Ezt követően próbálták ki a szert gyógyszerkombinációban adva (37, 135). Olasz és mtsai (138) a DBD hatékonyságát kombinált terápia részeként tanulmányozták előrehaladott szájüregi laphámkarcinómák esetében. A bleomycinből, vincristinből, DBD-ből, methotrexatból és prednisolonból álló kemoterápiás kombinációt a tervezett műtétet megelőzően adták. 3 kezelést követően a betegek 46 % -ánál klinikailag teljesen visszafejlődött a daganat, míg 54 % -ánál megkisebbedett. Az alkalmazott gyógyszerkombináció adása kellően biztonságosnak és hatékonynak tűnt szájüregi laphámrákok kezelésében. Egy másik vizsgálatban a preoperatíve adott Co60 g-irradiáció hatékonyságát

hasonlították

össze

a

bleomycinből, 94

vincristinből,

DBD-ből,

methotrexatból álló kemoterápia hatékonyságával (137). A gyógyszerkombinációval kezelt betegek között kevesebb volt a recidiv tumor, és hosszabb a 3 éves túlélés, mint a besugarazottak között, de a különbség nem volt szignifikáns. Bár laboratóriumi vizsgálat, de a klinikum szempontjából a későbbiek során nagy jelentőséggel bírhat Jeney és mtsainak tanulmánya, amely cisplatinból és a DBD-ből álló kombinált terápia biológiai aktivitásának vizsgálatára irányult (89). A szerzők a két citosztatikum szinergista hatását tapasztalták. Egerekbe transzplantált P388 szolid lymphoma esetében kombinált kezelést követően az állatok túlélése hosszabb volt, mint akár az egyik, akár a másik szerrel történő terápia után. HT-168 humán melanoma xenograftok vizsgálatakor azt találták, hogy a tumorok kezelés utáni térfogatát, és megduplázódási idejét figyelembe véve is a kombinált terápia antineoplasztikus hatása szignifikánsan erősebb mindkét gyógyszer egyedüli hatásánál.

95

4.3.2. Vizsgálatunk célkitűzése Kísérleti modellt állítottunk fel annak vizsgálatára, hogy laphámkarcinómák esetében lehetséges-e a sugárkezelés hatékonyságát citosztatikummal fokozni. Modellünk lehetővé tette, hogy a kemoterápiás szert az irradiációt megelőzően, valamint azt követően adva a kétféle kezelési kombináció hatékonyságát egymással, valamint az önmagában

adott

besugárzás

és

citosztatikus

kezelés

eredményességével

összehasonlítsuk. A különböző kezelési módok effektivitására az adott időpontokban meghatározott

sejtszám,

apoptózis-index

és

mitózis-index

értékek

alapján

következtettünk. Emellett vizsgáltuk a különböző kezelések hatását a sejtproliferációt és az apoptózist befolyásoló onkoproteinek expressziójára.

4.3.3. Anyag és módszer

4.3.3.1. Sejtvonal és sejtkultúra Kísérleteink során hitelesített A-431 humán laphámrák sejtvonalat használtunk (ATCC No. 1553) alacsony passzázsszámmal. A sejteket mycoplasma kontamináció szempontjából teszteltük, az eredmény negatív volt. A sejttenyésztést 37°C-on, 5% CO2ot tartalmazó nedveskamrában, 10 % borjúszérumot (Gibco, Bécs, Ausztria) tartalmazó DMEM táptalajban (Gibco, Bécs, Ausztria), 24 lyukú Greiner tenyésztőedényben (Kremsmünster, Ausztria) végeztük 7x104 indulási sejtszámmal. A fedőlemezes kultúrákhoz fedőlemezekkel ellátott 6 lyukú Greiner tenyésztőedényeket (plate-eket) használtunk. Minden kultúra leoltáskor 105 sejtet tartalmazott.

4.3.3.2. Besugárzás A fedőlemezes sejttenyészetek egy részét Co60-g-besugárzásnak tettük ki, amelyhez Gammatron-3 (Siemens, Erlangen, Németország) típusú készüléket használtunk. Az alkalmazott 4 Gy sugárdózist különböző dózisokkal végzett előkísérletek alapján határoztuk meg. Az előkísérletek leírása, értékelésének módja, valamint eredményeinek

96

összefoglalása a dolgozat 4.3.3.6., 4.3.3.8. és a 4.3.4.1. pontjaiban olvasható. Az irradiáció szobahőmérsékleten történt, borjúszérumot tartalmazó médiumban.

4.3.3.3. Dibrómdulcit kezelés Különböző

koncentrációjú

dibrómdulcittal

(DBD,

Chinoin,

Budapest) végzett

előkísérletek alapján, a 4.3.3.6., 4.3.3.8. és a 4.3.4.2. pontokban leírt módon választottuk ki az alkalmazott 15mg/ml-es és 45mg/ml-es koncentrációt. A DBD-t szérum-mentes táptalajban adtuk a tenyészetekhez, a citosztatikum 1 órán keresztül érintkezett a sejtekkel. A kezelés befejezése után ismét borjúszérumot tartalmazó médiumot adtunk a kultúrákhoz, amelyet ezt követően a tenyészetek leállításáig már nem cseréltünk.

4.3.3.4. Sejtszám meghatározás A sejtszámolást kezelési formánként 3-3 sejtkultúrából, PBS-sel (phosphate buffered saline) történő mosást, és tripszines emésztést (0.25%) követően, Bürker hemocitométer használatával végeztük.

4.3.3.5. Apoptózis- és mitózis-index meghatározás Mind az apoptózis-, mind a mitózis-indexet 2000 sejt figyelembe vételével, a sejtek morfológiai jellemzői alapján (95) határoztuk meg HE-nal festett fedőlemezes tenyészetekben, metanolos fixálást követően. Az apoptózist a 4.1.3.2. fejezetben leírt módon, in situ Apop-Detec (DAKO, Glostrup, Dánia) reakcióval kontrolláltuk.

4.3.3.6. Kísérleti terv Co60-g-sugárzással végzett előkísérletek Az irradiáció - későbbi kísérleteink során alkalmazandó - dózisának meghatározása céljából előkísérleteket végeztünk. Különböző dózisokkal történő besugárzást követően adott időpontban meghatároztuk a túlélő sejtekből képződött kolóniák számát (a sejtek túlélési frakcióját), valamint az apoptózis- és mitózis-indexet.

97

Kolónia számlálás (colony assay). A kolónia számláláshoz szükséges leoltási sejtszám meghatározására megvizsgáltuk az A-431 laphámrák sejtek kolónia-képző képességét (plating efficiency). A kolónia-képző képesség egy adott sejttípusra jellemző érték, a leoltott sejtekből képződött kolóniák számának százalékos arányát fejezi ki a leoltási sejtszámhoz viszonyítva. kolóniák száma kolónia-képző képesség (%) =

x 100 leoltási sejtszám

A kolónia-képző képesség vizsgálatára különböző sejtszámokkal végeztünk leoltást Petri-csészékbe, 10% borjúszérumot (Gibco, Bécs, Ausztria) tartalmazó DMEM táptalajba (Gibco, Bécs, Ausztria). A médiumot 1 hét eltelte után cseréltük. A képződött kolóniák számát a leoltástól számított 2 hét múlva határoztuk meg. Az A-431 sejtek kolónia-képző képessége 10 %-nak bizonyult. A kolónia számláláshoz végül azt a leoltási sejtszámot választottuk, amely esetében a képződött kolóniák száma Petricsészénként kb. 100, ennek megfelelően 103 leoltási sejtszámmal dolgoztunk. A leoltást 10 % borjúszérumot tartalmazó DMEM táptalajba végeztük. Ezt követően a 12. órában történt a Co60-g-irradiáció különböző dózisokkal: 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 és 20 Gy (dózisonként 3-3 mintát sugaraztunk be). A sejteken 1 hét múlva cseréltük a médiumot, 2 hét eltelte után meghatároztuk a túlélő sejtekből képződött kolóniák számát. Apoptózis- és mitózis-index meghatározása. A sejtek leoltását a későbbi, kezelési kombináció hatékonyságának vizsgálatára irányuló kísérletekkel megegyezően 105 leoltási sejtszámmal végeztük 6 lyukú Greiner tenyésztőedényekbe (Kremsmünster, Ausztria), amelyek fedőlemezeket tartalmaztak. A leoltás utáni 24. órában végeztük a besugárzást különböző dózisokkal (dózisonként 3-3 sejtkultúrát). Mind az apoptózis-, mind a mitózis-indexet a leoltástól számított 72. és 96. órában, metanolos fixálást és HEfestést követően, a sejtek morfológiai jellemzői alapján (95) határoztuk meg, 2000 sejt figyelembe vételével. Az apoptózist a 4.1.3.2. fejezetben leírt módon, in situ Apop-Detec (DAKO, Glostrup, Dánia) reakcióval kontrolláltuk.

98

DBD-vel végzett előkísérletek (Tájékozódó, dózis-kereső vizsgálat a DBD - későbbi kísérleteinkben alkalmazandó - dózisának meghatározására) Jeney és mtsai korábbi vizsgálatai, személyes tapasztalatai és javaslata alapján alkalmaztuk előkísérleteink során az 5, 15 és 45 mg/ml DBD dózist az A-431 sejtekből álló fedőlemezes tenyészetek - 3-3 tenyészet dózisonként – kezelésére a sejtek leoltását követő 24. órában (87, 89, 193). A sejtek leoltását 105 leoltási sejtszámmal végeztük, 6 lyukú Greiner plate-ekbe (Kremsmünster, Ausztria), 10% borjúszérumot tartalmazó DMEM táptalajba. DBD kezeléskor a szérumot tartalmazó médiumot szérum-mentesre cseréltük. A DBD-t 1 órán keresztül hagytuk a sejteken, majd a táptalajt ismét szérumtartalmúra cseréltük. A leoltást követő 48., 72. és 96. órában a korábban ismertetetett módon (4.3.3.4. és 4.3.3.5. pont) meghatároztuk a sejtszámot, az apoptózis- és mitózisindex értékeket. Kombinált kezelés irradiáció és DBD alkalmazásával A vizsgált kezelési kombinációk lényegében 2 csoportba sorolhatók. Az egyik csoportban a sejtek a DBD-t előkezelésként, a sugárkezelést megelőzően, míg a másik csoportban utókezelésként, a besugárzást követően kapták. DBD előkezelés esetén 15 vagy 45 mg/ml dózisú DBD-t adtunk 24 órával a sejtek leoltása után szérummentes médiumban, amelyet 24 órával később 4 Gy besugárzás követett (19D ábra). 9 fedőlemezes tenyészetet vizsgáltunk, a tenyészeteket a leoltást követő 72. ill. 96. órában állítottuk le. Ezt követően elvégeztük a sejtszámolást, az apoptózis- és mitózis-index meghatározását. DBD utókezelés esetén 24 órával a leoltást követően történt a tenyészetek 4 Gy besugárzása, amelyet újabb 24 óra múlva követett a 15 vagy 45 mg/ml dózisú DBD kezelés (19E ábra). 9 fedőlemezes tenyészetet vizsgáltunk, a fixálást, az apoptózis- és mitózis-index meghatározását, a sejtszámolást a leoltás utáni 72. és 96. órában végeztük. Kísérleteinkhez beállítottunk kezeletlen kontrollcsoportokat, valamint csak DBD-vel, ill. csak besugárzással kezelt csoportokat is. Ezeket a tenyészeteket szintén vizsgáltuk a sejtszám, valamint az apoptózis- és mitózis-index nagysága szempontjából a leoltást követő 72. és 96. órában (9-9 tenyészetet időpontonként és kezelési módonként). (19A-C ábra)

99

(A)

M1

M2

72h

96

M1

M2

h

96

M1

M2

h

96

M1

M2

h

96

M1

M2

h

96

t 0h

24h

48h

h

Leoltás

(B) t 0h

24h

Leoltás

48

h

72

h

DBD (15/45 mg/ml)

C) t 0h

24

Leoltás

h

48

h

72

h

4 Gy

(D) t 0

h

24

Leoltás

h

DBD (15/45 mg/ml)

48

h

72

h

4 Gy

(E) t 0h

24

Leoltás

h

4 Gy

48

h

72

DBD (15/45 mg/ml)

19. ábra: A-431 sejtek kezelési sémája 4 Gy Co60 -girradiáció és DBD alkalmazásával. M1 = 1. mintavétel M2 = 2. minrtavétel

100

h

4.3.3.7. bcl-2, PCNA, p53 és Rb fehérje-meghatározás Western blot analízis 1) A kezeletlen kontroll- és a kezelt A-431 laphámrák sejteket hideg PBS-ben {phosphate buffered saline (Reanal, Budapest, Magyarország)} mostuk. 2) Kezelési csoportonként 106 sejtet lizáltunk enzimgátlókat tartalmazó puffer oldatban {50mM TRIS/HCl (pH 7.5), 2mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% NP-40 (Nonidet P40), 20mg/ml aprotinin, 20 mg/ml leupeptin és 1mM PMSF (phenil-metil-sulfonilfluorid)}. Az oldat összetevőit a SIGMA-tól (SIGMA-Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA) vásároltuk. A lizálást 30 percig, 4 C°-on végeztük. 3) A sejteket centrifugáltuk 10.000 rpm-mel 30 percig. 4) Laemmli-módszer szerint (107) a felülúszót 1:1 arányban hígítottuk 2x-es koncentrációjú minta-pufferrel {100mM TRIS/HCl (pH 6.8), 20% glicerin, 2% SDS (Na-laurilszulfát), 0.02% brómfenolkék}. Kezelési csoportonként 5x104 sejtet 12%os poliakrilamid-gélen futtattuk konstans 200 Volt feszültség mellett 30 percig, amelyhez BioRad Miniprotean II Cell készüléket (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) használtunk. 5) A molekulasúly szerint szétválasztott fehérjéket nitrocellulózra transzferáltuk. 6) A nem specifikus kötőhelyeket blokkoltuk 5%-os BSA-val {bovine serum albumin (SIGMA-Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA)} 37 C°-on, 60 percig. 7) Az elsődleges immunreakció során a mintákat monoklonális egér-antitestekkel (DAKO, Glostrup, Dánia) reagáltattuk: anti-p53, anti-PCNA (mindkettőt 1:400 arányú hígításban alkalmaztunk), valamint anti-bcl-2 és anti-Rb (1:300 hígítási arányban). Az inkubáció egy éjszakán át tartott 4 C°-on. 8) Mosás TBST pufferben {20 mmól TRIS/HCl (pH 7.5), 150 mmól NaCl, 0.05% TWEEN 20 (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Németország} 5 x 5 percig. 9) A másodlagos immunreakcióhoz Vectastain ABC kit-et (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) használtunk, amely tartalmazza a másodlagos ellenanyagot (biotinilált antiegér-antitest) és az ABC-t (avidin-biotin komplex). A másodlagos ellenanyagot 1:400 arányban hígítottuk 3% BSA-t tartalmazó TRIS pufferben. Ezzel inkubáltuk a vizsgált mintákat 30 percig szobahőmérsékleten, majd a felesleges ellenanyagot 5 x 5 perces, TBST pufferben történő mosással eltávolítottuk. Ezt

101

követően adtuk a rendszerhez a peroxidázt is tartalmazó ABC-t. Ismét inkubáció 60 pecig, szobahőmérsékleten. Ennek során az avidin reagál és komplexet képez a másodlagos ellenanyaghoz kötött biotinnal. 10) Mosás TBST pufferben 5 x 5 percig. 11) Az avidin és biotin reakcióját diaminobenzidinnel (DAB) tettük láthatóvá. Az ABC által tartalmazott peroxidáz a DAB-ot dinitrobenzidinné oxidálja, ami barna színreakcióval jár.

4.3.3.8. A vizsgálatok értékelésének módszerei - összefoglalás A g-sugárzással végzett előkísérletek során a különböző dózisok hatására bekövetkező reakciót a túlélő sejtekből képződött kolóniák számának meghatározásával mértük a leoltástól számított 2 hét elteltével, dózisonként 3-3 tenyészetben. A kolóniák közül azok tekinthetők élőnek (osztódásra képesnek), amelyek legalább 50 sejtet tartalmaznak (9), így számoláskor csak ezeket vettük figyelembe. Emellett vizsgáltuk az apoptózis- és mitózis-indexet is a sejtek leoltását követően 72 és 96 óra múlva. A DBD-vel végzett előkísérletek különböző gyógyszerdózisai által kiváltott választ a sejtszám, az apoptózis- és a mitózis-index meghatározásának segítségével értékeltük a leoltást követő 48., 72. és 96. órában. A kombinált kezelések hatását a sejtszám, valamint az apoptózis- és a mitózis-index meghatározásával vizsgáltuk a leoltás után 72 és 96 óra elteltével. A western-blot analízisnél a blotok denzitását Eagle Eye II denzitométerrel (Stratagene, La Jolla, CA, USA) mértük, az értékelést One-Dscan számítógépes programmal (Scanalytics Inc., Fairfax, VA, USA) végeztük. Az eredményeket denzitometriás egységekben adtuk meg 5x104 sejtre vetítve (4. táblázat). Statisztikai analízis. Kétmintás t-próbát használtunk a középérték +/- standard deviáció és a szignifikancia kiszámítására.

102

4.3.4. Eredmények

4.3.4.1. Co60-g-sugárzással végzett előkísérletek. Dózis-válasz A 20. ábra mutatja a dózis-válasz görbét: az A-431 sejtek túlélését (túlélő kolóniák számát) a különböző sugárdózisok függvényében. Az 1 Gy dózishoz tartozó értéket tekintettük a görbe „vállának” (ez alatt a dózis alatt a sejtregeneráció magas, e felett pedig alacsony volt, a görbe 4 Gy dózis felett vált lineárissá.) A sejttenyészetek további kezelésére végül a 4 Gy sugárdózist választottuk, mivel az apoptózis indukciója és a mitotikus aktivitás csökkenése 4 Gy alatt bizonytalan volt, 4 Gy felett azonban következetesen tapasztaltuk.

1

0,1

Túlélő frakció (%)

0,01

0,001

0,0001

0,00001

0,000001 0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Dózis [Gy]

20. ábra A-431 sejtek túlélési görbéje a Co60 g- irradiáció dózisának függvényében

103

4.3.4.2. DBD-vel végzett előkísérletek. Tájékozódó, dózis-kereső vizsgálat Az általunk használt legalacsonyabb DBD-dózisnak (5 mg/ml) nem volt szignifikáns hatása a mitózisra és apoptózisra. A magasabb dózisok (15 és 45 mg/ml) megnövekedett apoptotikus aktivitást eredményeztek, valamint kevesebb lett a mitózisok száma. A két dózis hatása között csak csekély eltérést tapasztaltunk, ezért a további vizsgálatok során mindkettőt alkalmaztuk.

4.3.4.3. Az egyedi és kombinált kezelések hatása Sejtszám. 72 órával a leoltás után a sejtszám szignifikánsan alacsonyabb volt minden kezelt mintában a kezeletlenekhez képest (4. táblázat). A DBD-ből és besugárzásból álló kombinált kezelés a DBD-t mind előkezelésként (15 és 45 mg/ml-es koncentrációban),

mind

utókezelésként

(45

mg/ml-es

koncentrációban)

adva

szignifikánsan hatásosabbnak bizonyult, mint az önállóan alkalmazott 4 Gy irradiáció. 96 órával a leoltás után szintén az összes kezelt minta szignifikánsan alacsonyabb sejtszámokat mutatott, mint a kezeletlen kontroll (4. táblázat). Mind az önállóan alkalmazott 15 és 45 mg/ml DBD, mind pedig ezen dózisok besugárzással kombinációban történő alkalmazása - kezelési sorrendtől függetlenül - szignifikánsan hatásosabbnak bizonyult a sugár-monoterápiánál. Sejtszám-csökkenés szempontjából a besugárzás és az azt követően adott 15 mg/ml DBD hatása szignifikánsan erősebbnek mutatkozott, mint ugyanekkora dózisok mellett fordított sorrendben alkalmazva a két terápiás modalitást, de mindkettő hatásosabb volt, mint a monoterápiában adott DBD.

104

4. táblázat

Sejtszám változás g-irradiációt és/vagy DBD kezelést követően Kísérlet Sejtszám (x106) 72 h 96 h A

Kezeletlen kontroll

6.30 + 1.90

5.87 + 0.76

B

DBD 15 µg/ml

1.80 + 1.25

2.67 + 0.50

C

DBD 45 µg/ml

1.80 + 0.95

0.83 + 0.29

D

4 Gy

2.37 + 0.40

3.50 + 0.10

E

DBD 15 µg/ml + 4 Gy

1.37 + 0.25

2.23 + 0.21

F

DBD 45 µg/ml + 4 Gy

1.50 + 0.56

1.20 + 0.40

G

4 Gy + DBD 15 µg/ml

1.67 + 0.51

1.63 + 0.15

H

4 Gy + DBD 45 µg/ml

1.37 + 0.25

0.83 + 0.60

Statisztikai analízis eredménye: 72 óránál: A: p<0.001 vs1 B-H

96 óránál: B: p<0.01 vs A; p<0.05 vs D

2

B és C: n.s. vs D E: p<0.05 vs D; n.s. vs B és G F: p<0.05 vs D; n.s. vs C és H G: n.s. vs D, B és E H: p< 0.05 vs D; n.s. vs C és F

1 2

C: p<0.001 vs A; p<0.001 vs D D: p<0.01 vs A E: p<0.001 vs A; n.s. vs B; p<0.01 vs D; p<0.01 vs G F: p<0.001 vs A; n.s. vs C; p<0.05 vs D G: p<0.001 vs A; p<0.005 vs B; p<0.001 vs D; p<0.05 vs E H: p<0.001 vs A;p<0.001 vs D;n.s. vs F; n.s. vs C

vs: versus n.s.: nem szignifikáns

105

Apoptózis-index. 72 órával a leoltást követően az apoptotikus sejtek (21. ábra) aránya az összes kezelt tenyészetben - 1 csoport kivételével, amelyik előbb 4 Gy besugárzást, azt követően 24 órával 15 mg/ml DBD-t kapott - szignifikánsan magasabb volt a kezeletlen kontrollhoz képest (5. táblázat). Apoptózis-index tekintetében nem találtunk különbséget azok között a tenyészetek között, amelyek monoterápiaként kaptak 15/45 mg/ml DBD-t összevetve azokkal, amelyeknél ugyancsak önálló kezelésként alkalmaztunk 4 Gy besugárzást. A 15/45 mg/ml DBD előkezelés irradiációval történő kombinációja szignifikánsan hatékonyabbnak bizonyult mind a monoterápiában adott 15/45 mg/ml DBD-nél, mind a 4 Gy sugárkezelésnél, mind pedig a 4 Gy besugárzás DBD utókezeléssel (15/45 mg/ml) történő kombinációjánál. Ez utóbbi kezelési kombináció azonban nem volt hatékonyabb sem az önállóan adott 15/45 mg/ml DBD-nél, sem a 4 Gy besugárzásnál. 96 órával a leoltást követően az összes minta, amelyet 15 vagy 45 mg/ml DBD-vel kezeltünk akár önmagában, akár kombinációban adva a szert, szignifikánsan magasabb apoptózis-index értékeket mutatott - az önmagában adott 15 mg/ml DBD kivételével -, mint a csak besugarazott minták. A 15 mg/ml-es DBD előkezelés sugárral történő kombinációja szignifikánsan hatékonyabb volt, mint a 15 mg/ml DBD önállóan adva. A 4 Gy

besugárzás

kombinálva

15/45

mg/ml

DBD

utókezeléssel

szignifikánsan

hatékonyabbnak bizonyult, mint a 15/45 mg/ml DBD monoterápia. A 4 Gy irradiáció és 45 mg/ml DBD utókezelés kombinációját szignifikánsan hatékonyabbnak találtuk apoptózis-index növelés szempontjából, mint a DBD-t előkezelésként adva ugyanebben a dózisban (5. táblázat).

Mitózis-index. A leoltás utáni 72. órában a mitotikus alakok (21. ábra) aránya szignifikánsan alacsonyabb volt az összes kezelt sejtkultúrában, mint a kezeletlen kontrollcsoportokban (6. táblázat). A 4 Gy besugárzás a mitózis-indexet a 15 vagy 45 mg/ml dózisban, önmagában adott DBD kezelésnél szignifikánsan nagyobb mértékben csökkentette. A besugárzás és a citosztatikus kezelés kombinációját - a 15/45 mg/ml dózisú DBD-t mind előkezelésként, mind utókezelésként adva - szignifikánsan hatékonyabbnak találtuk, mint a 15 vagy 45 mg/ml DBD-t önmagában. Nem tudtunk kimutatni szignifikáns különbséget a monoterápiaként alkalmazott sugárkezelés utáni, és az egyes kombinált kezelések utáni mitózis-index értékek között (a 45 mg/ml dózisú 106

DBD utókezelés kivételével, amelynél gyenge szignifikancia mutatkozott a kombinált kezelés javára). A 45 mg/ml DBD-vel történő utókezelés a 45 mg/ml-es DBD előkezelésnél szignifikánsan hatékonyabbnak bizonyult. A 96. órára az összes kezelt mintában szignifikánsan alacsonyabb volt a mitotikus alakok száma a kezeletlen kontrollhoz képest. A különböző kezelésen átesett csoportok mitózis-indexei között szignifikáns eltérés nem, vagy csak kis mértékben volt kimutatható (6. táblázat).

5. táblázat

Apoptózis-index változás g-irradiációt és/vagy DBD kezelést követően Kísérlet Sejtszám (%) 72 h 96 h A Kezeletlen kontroll

1.41±0.24

1.20±0.70

B DBD 15 µg/ml

3.30±0.71

3.34±1.20

C DBD 45 µg/ml

3.08±1.10

4.65±1.25

D 4 Gy

3.03±1.11

3.40±1.21

E DBD 15 µg/ml+4 Gy

5.12±1.12

6.98±1.76

F DBD 45 µg/ml+4 Gy

4.90±1.22

4.57±0.96

G 4 Gy+DBD 15 µg/ml

2.25±1.40

6.57±0.46

H 4 Gy+DBD 45 µg/ml

3.47±0.50

9.15±1.72

Statisztikai analízis eredménye: 72 óránál: B: p<0.001 vs A; n.s. vs C, D

96 óránál: A: p<0.001 vs B-H

C: p<0.005 vs A; n.s. vs B, D D: p<0.001 vs A E: p<0.001 vs A; p<0.001 vs B; p<0.001 vs D F: p<0.001 vs A; p<0.001 vs C; p<0.005 vs D G: n.s. vs A; n.s. vs D; p<0.05 vs B; p<0.005 vs E H: p< 0.001 vs A; n.s. vs C, D; p<0.05 vs F

B: n.s. vs D C: n.s. vs B; p<0.01 vs D E: p<0.001 vs B; p<0.001 vs D F: n.s. vs C; p<0.05 vs D G: p<0.001 vs B; p<0.001 vs D; n.s. vs E H: p<0.001 vs C; p<0.001 vs D; p<0.001 vs F

107

6. táblázat

A B C D E F G H

Mitózis-index változás g-irradiációt és/vagy DBD kezelést követően Kísérlet Sejtszám (%) 72 h 96 h Kezeletlen kontroll 7.01±2.19 8.07±0.79 DBD 15 µg/ml 3.86±0.60 0.48±0.23 DBD 45 µg/ml 3.02±0.80 0.67±0.51 4 Gy 0.90±0.50 0.78±0.54 DBD 15 µg/ml+4 Gy 1.67±1.13 0.28±0.19 DBD 45 µg/ml+4 Gy 1.51±0.77 0.77±0.41 4 Gy +15 µg/ml DBD 0.98±1.25 0.87±0.42 4 Gy +45 µg/ml DBD 0.25±1.50 1.50±0.86

Statisztikai analízis eredménye: 72 óránál: B: p<0.005 vs A; p<0.005 vs D

96 óránál: A: p<0.001 vs B-H

C: p<0.001 vs A; p<0.005 vs D D: p<0.001 vs A E: p<0.001 vs A; p<0.005 vs B; n.s. vs D F: p<0.001 vs A; p<0.005 vs C; n.s. vs D G: p<0.001 vs A; n.s.vs D;p<0.005 vs B; n.s.vs E H: p<0.001 vs A; p<0.05 vs D; p<0.001 vs C; p<0.005 vs F

B: n.s. vs D C: n.s. vs D E: p<0.05 vs B; p<0.05 vs D F: n.s. vs D; n.s. vs C G: p<0.05 vs C; p<0.005 vs D; p<0.05 vs F

PCNA, p53, bcl2 és Rb expresszió. A PCNA expresszió a leoltás utáni 72. órában kisfokú emelkedést mutatott a kontrollhoz képest 4 Gy besugárzást követően. A DBD kezelésnek hasonló hatását ugyanebben az időpontban nem tapasztaltuk. A 96. órában a 4 Gy irradiációból és 45 mg/ml DBD-ből álló kombinált kezelések - a DBD-t elő- ill. utókezelésként adva is - emelkedett PCNA expressziót eredményeztek. A p53 expresszió a 72. órában emelkedett volt mind az önmagában adott 45 mg/ml DBD-t, mind a 4 Gy besugárzást követően a kontrollhoz képest. A 96. órában ugyanezt tapasztaltuk az összes vizsgált kezelési formánál. A bcl2 expressziót sem a DBD kezelés, sem a sugárzás, sem a kettő kombinációja nem befolyásolta szignifikánsan egyik időpontban sem. A Rb fehérje expressziója a 72. és a 96. órában is emelkedett volt a kontrollhoz képest az összes kezelt tenyészetben (7A és 7B táblázat).

108

21. ábra Apoptotikus és mitotikus alakok A-431 laphámrák sejttenyészetben kombinált kezelést (45 mg/ml DBD + 4Gy besugárzás) követően fekete nyíl: apoptotikus sejt, fehér nyíl: mitotikus sejt

109

7A táblázat 4 Gy besugárzás és/vagy DBD kezelés hatása a PCNA-, p53-, bcl2-, Rb-expresszióra A-431 sejtekben in vitro (72 h) Kísérlet

Kezeletlen kontroll DBD 45 µg/ml 4 Gy DBD 45 µg/ml+4Gy 4Gy+DBD 45 µg/ml

Denzitometriás érték 5 x 104 sejtben µgDNA 105 sejtben 14.16 12.73 14.8 n.a. n.a.

PCNA

p 53

bcl2

Rb

2.27 2.42 3.8 n.a. n.a.

2.48 3.7 3.12 n.a. n.a.

0.19 0.18 0.23 n.a. n.a.

0.31 0.76 0.69 n.a. n.a.

7B táblázat 4 Gy besugárzás és/vagy DBD kezelés hatása a PCNA-, p53-, bcl2-, Rb-expresszióra A-431 sejtekben in vitro (96 h) Kísérlet

Kezeletlen kontroll DBD 45 µg/ml 4 Gy DBD 45 µg/ml+4Gy 4Gy+DBD 45 µg/ml

Denzitometriás érték 5 x 104 sejtben µgDNA 105 sejtben 14.16 17.0 n.a. 18.0 16.0

PCNA

p 53

bcl2

Rb

2.27 4.6 n.a. 4.1 3.9

2.48 3.1 n.a. 3.1 3.6

0.19 0.3 n.a. 0.18 0.28

0.31 0.6 n.a. 0.69 0.6

4.3.5. Megbeszélés

A DBD-ből és sugárkezelésből álló kombináció hatását először Áfra és mtsai (2) vizsgálták malignus gliomák posztoperatív kezelésében. Szignifikánsan hosszabb túlélést tapasztaltak azoknál a betegeknél, akik kombinált terápiát kaptak szemben a radio-monoterápiában részesült betegekkel. Hasonló eredményekről számoltak be szintén Áfra és mtsai egy másik tanulmányukban, 1986-ban (3). Arra a következtetésre jutottak, hogy a besugárzással párhuzamosan adott DBD fontos faktor lehet a túlélési idő javítása szempontjából. Ezeket az eredményeket Hildebrandt és mtsai-nak - szintén malignus gliomában szenvedő betegek körében végzett - vizsgálatai is alátámasztják (70).

110

Mangel és mtsai kísérletes agytumorokban tanulmányozták a DBD-vel kombinált sugárkezelés

hatékonyságát

(119).

Ependymoblastoma

és

glioma

sejteket

transzplantáltak intrakraniálisan egerekbe, és figyelték a túlélést. Ependymoblastoma esetében DBD monoterápiára a túlélési idő szignifikánsan megnőtt, míg irradiációra nem változott a kezeletlen kontrollcsoporthoz képest. Gliománál a két terápiás modalitás hatása az előzővel ellentétes volt: a túlélést a sugárkezelés meghosszabbította, a DBD nem változtatta meg. A két terápiás modalitás kombinálása azonban mindkét daganattípus esetében szupra-additív effektust mutatott. Unger és mtsai szintén a besugárzásból (esetükben rtg sugárzásból) és DBD-ből álló kombinált kezelés eredményességéről számolnak be egy in vivo vizsgálatban, amelyet egerekbe transzplantált szolid Ehrlich karcinómán végeztek (192). Összevetették az önmagában adott sugárkezelés, DBD kezelés és a kettő kombinációjának a hatását. A sugárkezelés során több csoportot alakítottak ki, a különböző csoportokba tartozó állatok a terápiát ugyanazon összdózis mellett különböző frakciószámban kapták. A DBD kezelés 250 mg/kg dózisban, intraperitoneálisan történt összesen 4 alkalommal, 3-4 napos szünetekkel. Az értékelést 5 paraméter összehasonlításával végezték (az összes tumoros sejt száma, a mitózisok-, a piknotikus tumorsejtek-, az erősen duzzadt, óriásmaggal rendelkező tumorsejtek-, valamint a nagy, degenerált, hosszúkás sötét maggal rendelkező tumorsejtek száma). Ezek vizsgálata alapján arra a következtetésre jutottak, hogy közepes frakciószámú, alacsonyabb napi dózisú (10x5Gy) rtg besugárzás alkalmazása esetén - a sejtszámban, a mitózisok számában bekövetkező változást, valamint a duzzadt, óriásmaggal rendelkező tumorsejtek számát figyelembe véve - a kombinált kezelés hatékonyabb az önmagában alkalmazott irradiációnál. A kombinált kezelés hatásosabbnak bizonyult az önmagában adott DBD-nél is: a terápiát követően a vizsgált időpontokban a sejtszámok és mitózis-index értékek alacsonyabbak, míg a duzzadt, óriásmagvú sejtek száma magasabb volt kombinált terápia esetén, mint DBD kezelés után. Saját in vitro modellünkön - A-431 laphámrák sejtvonalat használva - az önmagában adott DBD kezelés, Co60g-sugárzás és a kettő kombinációjának eredményességét vizsgáltuk. A kezelések hatékonyságát az azokat megelőzően, majd azokat követően (a leoltás utáni 72. és 96. órában) meghatározott sejtszám, apoptózis- és mitózis-index értékek segítségével hasonlítottuk össze az egyes csoportok között.

111

Sejtszám. Vizsgálataink azt mutatják, hogy az önmagában adott DBD szignifikánsan gátolja a sejtek proliferációját a kezeletlen kontrollhoz képest. A proliferáció-gátlás elérhető 4 Gy g-besugárzással is, de kísérleti modellünkben a leoltást követő 96. órában mért sejtszám-értékek alapján a 15 vagy 45 mg/ml DBD hatása szignifikánsan jobb volt, mint a 4 Gy irradiációé. A DBD-t sugárkezeléssel kombinálva akár előkezelésként, akár utókezelésként adva a szert, a sejtproliferáció (a sejtszámokat figyelembe véve) a 72. és 96. órában is tovább gátolhatónak bizonyult, bár az eredmények nem mutattak statisztikailag szignifikáns eltérést az önállóan alkalmazott DBD kezeléshez képest. Ezzel szemben a kombinált kezelés és a radio-monoterápia összehasonlításakor a kombinált kezelést a besugárzásnál szignifikánsan eredményesebbnek találtuk. Ez megegyezik Unger és mtsai-nak eredményeivel (192), akik egerekbe transzplantált szolid Ehrlich karcinómában - a közepes frakciószám mellett alacsonyabb napi dózissal (10 x 5Gy) besugarazott csoportban - DBD-vel kombinált sugárkezelést követően alacsonyabb sejtszámokat találtak, mint egyedüli sugárkezelés, valamint egyedüli DBD kezelés után. Vizsgálataikban az alacsony frakciószám mellett magasabb napi sugárdózisban (4 x 12.5Gy) részesülő esetekben a kombinált terápia nem bizonyult az egyszerű besugárzásnál hatásosabbnak. Mitotikus aktivitás tekintetében Inoue és mtsai kísérletesen kiváltott nyelvrákok Co60 gbesugárzásakor (amelyet egyszeri, 20 Gy dózisban alkalmaztak) a terápiát követő 24. és 72. órában is csökkent mitózis-index értékeket tapasztaltak a kezeletlen kontrollhoz képest (76). Kísérleti modellünkben szintén csökkent mitózis-index értékeket tapasztaltunk a kezeletlen kontrollhoz képest 4 Gy besugárzás után a leoltást követő 72. és 96. órában egyaránt. A mitotikus aktivitást figyelembe véve a 4 Gy irradiáció ugyanúgy, mint annak kombinációja DBD utókezeléssel a többi kezelési módnál hatásosabbnak bizonyult a korábbi időpontban, míg 24 órával később az összes kezelt minta hasonló mitózis-index értékeket mutatott. A 72. órában a 4 Gy besugárzás és bármelyik kombinált kezelés eredményesebb volt a 15/45 mg/ml DBD-nél. A kétféle kezelési kombináció és az irradiáció hatékonysága között azonban sem a 72., sem a 96. órában nem találtunk szignifikáns különbséget mitózis-index változás szempontjából. Az önálló DBD terápiát követően tapasztalt mitózis-számokkal összevetve alacsonyabb mitózis-értékekről számolnak be radio-monoterápiát és kombinált kezelést (besugárzás és DBD) követően Unger és mtsai is (192). A kombinált kezelés hatékonyságát az önmagában alkalmazott irradiációhoz viszonyítva kimutatták, hogy mitózisszám112

csökkentés szempontjából a kezelési kombináció akkor volt a besugárzásnál hatékonyabb, ha közepes frakciószámmal alacsonyabb napi dózist (10 x 5Gy) adtak, míg alacsony frakciószámú magasabb napi dózis alkalmazásakor (4 x 12.5Gy) a kombinált terápia nem bizonyult a sugárkezelésnél hatékonyabbnak. Az

apoptotikus

aktivitást

szignifikánsan

magasabbnak

-

így

a

kezelést

eredményesebbnek - találtuk DBD előkezelés és 4 Gy irradiáció kombinációjának alkalmazásakor az összes többi kezelési módhoz képest a 72. órában. A 96. órában ezt a hatást elérheti, vagy meghaladhatja a 4 Gy besugárzás és DBD utókezelés kombinációjának, vagy az önállóan alkalmazott 45 mg/ml DBD-kezelésnek az eredményessége, szemben a 4 Gy irradiációval. Összefoglalva, eredményeink alapján az apoptotikus aktivitást és a sejtszámokat figyelembe véve a kombinált kezelések eredményessége szignifikánsan jobbnak mondható, mint a kizárólagos sugárkezelésé. Mitózis-index változás tekintetében nem találtunk szignifikáns eltérést a különböző módon kezelt csoportok között. A terápiás modalitások kétféle kombinációja közül (a DBD-t előkezelésként ill. utókezelésként adva) - a sejtszám-, az apoptózis-index és a mitózis-index értékeket is figyelembe véve - összességében egyik sem tűnt hatásosabbnak a másiknál. A sejtproliferációt és apoptózist befolyásoló géntermékek tekintetében (p53, Rb, bcl-2, PCNA) arra kerestünk választ, hogy a különböző kezelési módok hogyan befolyásolják a szintjüket a kezelés előtti értékekhez viszonyítva. A p53 és a Rb fehérje a sejtben tumorszuppresszor funkciót lát el, működési zavarukat a humán tumorok jelentős részében kimutatták (100, 168). Mint a dolgozat korábbi fejezeteiben már említésre került, a normál p53 fehérje a „genom őreként” funkcionál, ha a sejt génkészlete károsodik (104, 181). DNS károsodás hatására a p53 fehérje akkumulálódik, és a p21 gén promoter régiójához kötődve fokozza annak expresszióját. A p21 fehérje a ciklin-dependens kinázok inaktiválását végzi, amely következtében a Rb fehérje foszforilációja - amely szükséges lenne az E2F (S-fázis specifikus) transzkripciós faktor leválásához és aktiválódásához - elmarad. A Rb fehérje defoszforilált állapotban marad, továbbra is kötődik az E2F transzkripciós faktorhoz (amely beindítaná a proliferációt elősegítő gének expresszióját), ezáltal gátolja annak transzkripciós

113

aktivitását. A sejtciklus megáll G1-fázisban, lehetővé téve a DNS-sérülés helyreállítását. Ha a DNS károsodása olyan mértékű, hogy azt a repair mechanizmusok nem képesek kijavítani, a p53 beindíthatja a programozott sejthalált (apoptózist), megakadályozva ezzel, hogy a génhiba az utódsejtekbe kerüljön (206). A Rb protein a sejtciklus progresszió szabályozása mellett szintén részt vesz az apoptózis regulációjában is. Általában anti-apoptotikusnak tartják, mivel az általa mediált sejtciklus feltartóztatás feltehetőleg az apoptózishoz vezető intracelluláris jelátviteli utakat is blokkolja (16, 181). A normál Rb funkció hiánya megnövekedett apoptózist eredményezhet, a funkció helyreállítása védi a sejtet apoptózissal szemben. Ennek ellentmondó eredményekről számolnak be azonban Bowen és mtsai (16), akik Rb deficiens prosztatarák sejtvonalon (DU-145) vizsgálták az irradiáció indukálta apoptózist. A DU-145 sejtek nagyfokú rezisztenciát mutatnak mind a besugárzás által kiváltott, mind az exogén ceramid által indukált apoptózissal szemben. A normál Rb expresszió helyreállítását követően azonban mindkét stimulusra apoptózissal reagáltak a sejtek. Vizsgálataink során az A-431 laphámrák sejtekben a pro-apoptotikus p53 szintje kb. ugyanolyan mértékben emelkedett meg mind a 4 Gy besugárzás, mind a 45 mg/ml DBD kezelés, mind a kombinált kezelések hatására. A Rb expresszió mértéke minden kezelési mód után, mindkét vizsgálati időpontban nagyobb volt, mint a kezeletlen kontrollcsoportban. Az eredmények arra engednek következtetni, hogy mind a p53, mind a Rb gén termékének szerepe lehet mind a besugárzás, mind a DBD kemoterápia által indukált apoptózis szabályozásában, és a proliferáció-gátlásban laphámrák sejtekben. A bcl-2 onkogén fehérjetermékének felszaporodását számos humán tumorban leírták, pl. lymphomákban, prosztata-, emlő- és petefészekrákokban, neuroblastomákban (158). Humán

limfoid neopláziákban kimutatták a t(14;18)(q32;q21)

kromoszómális

transzlokációt, amely következtében a bcl-2 protein - a normál szabályozási folyamat alól kikerülve - overexpresszálódik (158, 206). A bcl-2 fehérje védi a sejtet a különböző genotoxikus ágensek (pl. g-irradiáció) által kiváltott apoptózissal szemben, ezáltal szerepe lehet a terápiás rezisztencia kilakulásában (158). Az apoptózis gátlása következtében a sejtek túlélési ideje megnő a sejtproliferáció direkt befolyásolása nélkül (148, 206). A bcl-2 fehérje a sejtben a külső mitokondriális membránban, a

114

maghártyában és az endoplazmatikus retikulumban van jelen (206), valószínűleg védi a mitokondriális membránt az apoptózis folyamata során bekövetkező funkcióváltozástól, és megakadályozza a kaszpáz-kaszkád aktiválódását (206). A bcl-2 expresszió prognosztikai értékét illetően eltérőek a vélemények. Fej-nyaki laphámrákok esetében egyes szerzők úgy találták, hogy a bcl-2 pozitivitás kedvezőtlen prognózissal párosul (48, 146), míg mások ennek ellenkezőjét írták le (49, 53, 74). Salo és mtsai 9 fej-nyaki laphámrák sejtvonalat vizsgáltak meg bcl-2 génstátusz, valamint sugárszenzitivitás szempontjából (158). Azt tapasztalták, hogy a bcl-2 pozitivitás radiorezisztenciával párosul, ami annál a sejtvonalnál volt a legkifejezettebb, amelynél a legnagyobb mértékű bcl-2 felszaporodást találták. A radiorezisztencia kialakulása valószínűleg a bcl-2 anti-apoptotikus funkciójával van összefüggésben, és még a vad-típusú p53 jelenléte sem tudta a vizsgált sejtvonalakban elnyomni az antiapoptotikus hatást (158). Gallo és mtsai a bcl-2 lehetséges szerepét vizsgálták sugárterápiás válaszkészség és prognózis szempontjából fej-nyaki laphámkarcinómákban in vivo (48). Kimutatták, hogy reziduális, valamint recidiv tumorok esetében a terápiát követően vett minták között megnőtt a bcl-2 pozitívok aránya (60%) a terápia előtti arányhoz képest (30%). A sugárkezelést megelőzően is bcl-2 pozitivitást mutató biopsziás minták közül csak 1 esetben nem sikerült a pozitivitását a kezelést követően vett anyagban is kimutatni, az összes többi esetben sugárterápia után a bcl-2 pozitív sejtek aránya emelkedett, vagy változatlan maradt. Humán neuroblastomák primer kemoterápiáját követően a reziduális daganatokból vett minták vizsgálatakor szintén úgy találták, hogy a bcl-2 pozitivitás aránya megnőtt a kezelés előtti értékhez képest (48). Ezek az eredmények a bcl-2 szerepére engednek következtetni a besugárzás által indukált apoptózis és a sugárterápiára adott válasz szabályozásában fej-nyaki laphámrákokban, valamint ugyancsak a bcl-2 részvételét támasztják alá a kemoterápia által indukált apoptózis befolyásolásában neuroblastomákban (48). Az általunk vizsgált A-431 humán laphámrák sejtekben az anti-apoptotikus bcl-2 mennyisége változatlan maradt 4 Gy irradiációt, valamint 45 mg/ml kezelést követően a 72. órában. A 96. órában is csak enyhe emelkedést mutatott mind 45 mg/ml DBD monoterápia, mind 4 Gy besugárzásból és 45 mg/ml DBD utókezelésből álló kombináció hatására. DBD előkezelésből és ezt követő irradiációból álló kombináció után nem változott a bcl-2 szintje ebben az időpontban.

115

A sejtproliferációt jelző PCNA (proliferating cell nuclear antigen) egy nukleáris protein, amely a sejtciklus G1/S fázisának hisztológiai markere (136). A DNS polimeráz delta és epszilon segéd-proteinjeként a DNS replikációban és a repair folyamatban van szerepe, valamint más celluláris proteinekkel (ciklin D, Gadd45, p21) interakcióba lépve részt vesz a sejtciklus szabályozásában (201, 206). A PCNA-szint prognosztikai jelentőségével kapcsolatban megoszlanak a vélemények. Egyes szerzők szerint a magas PCNA érték kedvezőtlen prognózist jelez (98, 105), míg mások nem találtak összefüggést a PCNA és a prognózis között (188). Több szerző azt tapasztalta, hogy a fej-nyaki régió és a nyelőcső laphám eredetű daganatainak kemoradio- vagy radioterápiája esetén a magas PCNA érték kedvezőbb prognózissal párosul: Gasparini és mtsai különböző kiindulási helyű fej-nyaki laphámkarcinómák esetében 73 beteg adatainak feldolgozása után megállapították, hogy magas PCNA jelölési index esetén radiokemoterápiát követően nagyobb az esély a hosszabb túlélésre (49). Gégekarcinóma esetében 166 betegből vett biopsziás anyag vizsgálatát követően Bradford és mtsai leírták, hogy a magasabb PCNA nagyobb esélyt jelent a szervmegtartó kezelést jelentő kemoradioterápia sikerére (18). Nyelőcső tumoroknál úgy találták, hogy a relatíve emelkedett PCNA a lokális recidiva megjelenésének kisebb kockázatával jár definitív radioterápia esetén (136), sebészi terápia után azonban rövidebb túléléssel párosulhat, mint az alacsony PCNA (98). Vizsgálataink során feltettük a kérdést, hogy humán laphámrák sejtvonalban hogyan változik a PCNA szintje irradiációt, kemoterápiát, ill. a kettő kombinációját követően. Wenz és mtsai humán - radioszenzitív és radiorezisztens - limfoblaszt sejtvonalakon vizsgálták a PCNA-szint változását ionizáló sugárzást követően, és nem tapasztaltak különbséget az irradiáció előtti értékekhez képest (201). Ezzel ellentétben saját anyagunkban több kezelési mód után is a kiindulási PCNA-szintnél magasabb értékeket mértünk. Az általunk - 4 Gy besugárzást követően a 72. órában, valamint az összes vizsgált kezelési módot követően a 96. órában - tapasztalt expresszió-fokozódás feltehetően egy kompenzatórikus túlemelkedés (overshoot) eredménye lehet. Az is elképzelhető azonban, hogy a PCNA-szint emelkedése nem a proliferációs aktivitással, hanem a DNS-károsodást követően tapasztalható megnövekedett repair funkcióval van összefüggésben.

116

4.3.6. Következtetések Az orális és mesopharyngeális laphámrákok esetében tapasztalt gyenge radioterápiás válaszkészség sürgeti a kutatást új terápiás lehetőségek után. Citosztatikum (DBD) és besugárzás együttes alkalmazása esetén laphámrák sejttenyészeten azt tapasztalatuk, hogy a sejtszámokat a kombinált kezelések jobban csökkentették a kontrollhoz képest, mint az önmagában alkalmazott irradiáció. A sejtszámokat vizsgálva a DBD monoterápia szintén hatékonyabbnak bizonyult a sugárkezelésnél, csaknem elérte a kombinált kezelések eredményességét. Apoptózis-index növelés szempontjából ugyancsak azt figyelhettük meg, hogy a kezelési kombinációk az önálló besugárzásnál hatásosabbak voltak. Az önmagában adott DBD kezelés elérte az irradiáció hatékonyságát, de azt nem haladta meg. A mitózis-indexeket vizsgálva minden kezelési módot követően hasonlóan alacsony MI értékeket tapasztaltunk a kontrollhoz képest, lényeges különbség nem mutatkozott az egyes csoportok között. A terápiás modalitások kétféle kombinációja közül (a DBD-t előkezelésként ill. utókezelésként adva) - a sejtszám-, az apoptózis-index és a mitózis-index értékeket is figyelembe véve - összességében egyik sem tűnt hatásosabbnak a másiknál. Eredményeink azt sugallják, hogy a DBD hasznos lehet sugárkezeléssel kombinációban alkalmazva, de egyedüli eszközként is hatásos fej-nyaki laphámrákok terápiájában. További vizsgálatok szükségesek azonban kombinált kezelés esetén a DBD terápia optimális idejének és dózisának meghatározására, terápiás protokoll kidolgozására. A különböző kezelési módokat követően a p53 és a Rb fehérje szintjében bekövetkező növekedés arra enged következtetni, hogy mindkettőnek szerepe lehet mind a besugárzás, mind a DBD kemoterápia által indukált apoptózis szabályozásában, és a proliferáció-gátlásban laphámrák sejtekben. A PCNA expresszió - kezeléseket követően tapasztalt - fokozódása valószínűleg kompenzatórikus túlemelkedés eredménye lehet, és/vagy a DNS-károsodást követően tapasztalható megnövekedett repair funkciót jelezheti.

117

5. Eredmények és következtetések összefoglalása ·

Primer sugárkezelésen átesett fej-nyaki laphámkarcinómás betegek vizsgálata során úgy tapasztaltuk, hogy a magas kiindulási mitózis-index, az alacsony apoptózis-index és S-fázis arány, valamint az aneuploid DNS-tartalom kedvezően befolyásolhatják a radioterápia sikerét.

·

Ugyanebben a betegcsoportban a magasabb kiindulási mitózis-index érték nagyobb esélyt jelenthet a relatíve hosszabb túlélésre is.

·

Ugyanakkor nem találtunk összefüggést sem az apoptózis-index nagysága, az apoptózis indukálhatósága és a túlélési időtartam között, sem a DNS-hisztogram paraméterek és a túlélés között.

·

Fenti eredmények alapján valószínű, hogy fej-nyaki laphámrákok sugárterápiája esetén

a

terápiás

válaszkészséget

megjósoló,

prediktív

paraméterek

különbözhetnek a prognózist meghatározóktól. ·

Nagyobb létszámú, nem (illetve nem csak) sugárterápiával kezelt fej-nyaki laphámkarcinómás betegcsoport adatainak elemzésekor szignifikáns korrelációt találtunk a nyaki nyirokcsomó-státusz és a teljes túlélési idő között: a nyaki nyirokcsomók érintettsége jelentősen lerövidíti a túlélést. A többi klinikai paraméter és a túlélési idő között azonban nem tudtunk összefüggést kimutatni. Ennek alapján azt mondhatjuk, hogy a klinikai paraméterek közül az N-státusz a legjelentősebb prognosztikai faktor.

·

A szignifikancia határán lévő korrelációt tapasztaltunk a p53 pozitivitás, és a késői nyaki nyirokcsomó-metasztázis megjelenési ideje között. A p53 gén mutációja,

illetve

a

génmutációt

mutató

daganatsejtek

magas

aránya

egyértelműen csökkenti a metasztázis-mentes időtartamot, de a teljes túlélés időt nem befolyásolja. ·

Az utóbbi betegcsoportnál a DNS-hisztogramok analízise során mind az S-fázis arány, mind a poliploid frakció jelentős prognosztikai faktornak bizonyult. Alacsony S-fázis érték esetén mind a teljes túlélési idő, mind a regionális metasztázis-mentes idő szignifikánsan hosszabb volt, mint magas S-fázis értéknél. Alacsony poliploid frakció mellett szignifikánsan hosszabb teljes- és metasztázis-mentes túlélési időt tapasztaltunk, mint magas poliploid frakció esetén. 118

·

A fenti eredmények megteremtik annak gyakorlati lehetőségét, hogy a primer biopsziás anyagban a kóros p53-fehérje kimutatásával és a DNS-hisztogram paramétereinek (S-fázis arány és poliploid frakció) mérésével a klinikus felmérje a tumor agresszivitását, és ennek ismeretében a lehető legpontosabban tervezze meg a terápiát: a műtét kiterjesztését, az elektív nyaki blokk-disszekció, vagy a posztoperatív sugárkezelés szükségességét.

·

In vitro körülmények között, laphámrák sejttenyészeten a Co60 γ-besugárzás és a citosztatikus kezelés (DBD) együttes hatásának vizsgálatakor úgy találtuk, hogy a kettő kombinációja szignifikánsan hatásosabb volt az önmagában alkalmazott besugárzásnál

mind

sejtszám-csökkentés,

mind

apoptózis-index

növelés

szempontjából. Mitózis-index változás tekintetében nem tapasztaltunk lényeges különbséget a különféle kezelési módok között. Eredményeink azt sugallják, hogy DBD-vel

kiegészítve

eredményesebbé

lehetne

tenni

a

fej-nyaki

laphámrákok sugárterápiáját, további vizsgálatok szükségesek azonban a DBD kezelés optimális idejének és dózisának meghatározására. ·

Bármely általunk alkalmazott kezelés után a p53 és a Rb fehérje szintjében megfigyelhető növekedés arra enged következtetni, hogy mindkettőnek szerepe lehet mind a besugárzás, mind a DBD kemoterápia által indukált apoptózis szabályozásában laphámrák sejtekben. A PCNA expresszió - kezeléseket követően tapasztalt - fokozódása valószínűleg kompenzatórikus túlemelkedés eredménye

lehet,

és/vagy

a

DNS-károsodást

megnövekedett repair funkciót jelezheti.

119

követően

tapasztalható

6. Köszönetnyilvánítás Hálás köszönettel tartozom témavezetőmnek, Szende Béla Professzor úrnak, aki elindította, és szakmai tudásával mindvégig segítette, felügyelte tudományos munkámat. Professzor úr támogatásával vehettem részt több külföldi kongresszuson, tanulmányúton. Köszönettel tartozom Ribári Ottó Professzor úrnak, aki tudományos munkám klinikai részének elindításában volt segítségemre. Az Ő vezetése mellett sajátíthattam el a klinikai munka napi feladatait, bevont onkológiai kutatásaiba, létrehozhattuk az onkológiai rendelést. Külön köszönöm Répássy Gábor Professzor úrnak, hogy 1997-től a Klinika igazgatójaként támogatja tudományos és klinikai tevékenységem folytatását, lehetővé teszi részvételemet hazai és külföldi tudományos rendezvényeken. Köszönöm Jeney András Professzor úrnak, a Doktori Iskola Onkológiai Alprogram vezetőjének, hogy PhD éveim alatt végig érezhettem támogatását. Emellett köszönettel tartozom az onkoproteinek vizsgálatában nyújtott segítségéért is. Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet Dr. Szentirmay Zoltán Tanár úrnak a p53 meghatározásban és a DNS-hisztogram analízisben nyújtott technikai segítségéért, szakmai tanácsaiért. Hálával tartozom Tamás László főorvos úrnak, aki kollégaként mindvégig támogatta, szakmai tudásával és lelkesedésével segítette munkám mind klinikai, mind patológiai részét. Köszönöm Hidvégi Egon Professzor úrnak, hogy lehetővé tette számomra a besugárzással kapcsolatos in vitro kísérletek elvégzését az Országos Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Intézetben, valamint értékes kritikai észrevételeivel segítette munkámat.

120

Külön köszönettel tartozom Dr. Sáfrány Gézának, a sejttenyészetek besugárzásában nyújtott aktív segítségéért. Ezúton szeretném kifejezni hálámat Csorba Gézánénak és Oláh Júliának, a sejttenyésztésben és a biokémiai vizsgálatokban nyújtott technikai segítségéért, valamint Dr. Tímár Ferencnek, aki a statisztikai analízisek elvégzésében volt segítségemre. Köszönöm Farkas Andrásnak az értekezés végleges formába öntésében, az ábraanyag és a táblázatok összeállításában nyújtott nélkülözhetetlen segítségét. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Fül-, orr-, gégészeti és Fej-, Nyaksebészeti Klinika összes dolgozójának, akiknek végig érezhettem támogatását. Köszönöm szeretteim türelmét és támogatását, amellyel hozzásegítettek dolgozatom elkészítéséhez.

121

7. Irodalomjegyzék

1. Adams V., Schmid S., Zariwala M., Schmid M., Kleihues P., Briner J., Schafer R.: Prevalence of human papilloma virus DNA in head and neck cancers carrying wildtype or mutant p53 tumor suppressor genes. Abstract. Anticancer Research 19, 1-6 (1999) 2. Áfra D., Kocsis B., Dobay J., Eckhardt S.: Combined radiotherapy and chemotherapy with dibromodulcitol and CCNU in the postoperative treatment of malignant gliomas. Journal of Neurosurgery 59, 106-110 (1983) 3. Áfra D., Kocsis B., Kerpel-Frónius S., Eckhardt S.: Dibromodulcitol-based combined postoperative chemotherapy of malignant astrocytomas and glioblastomas. Abstract. Journal of Neurooncology 4, 65-70 (1986) 4. Aihara M., Scardino P.T., Truong L.D., Wheeler T.M., Goad J.R., Yang G., Thompson T.C.: The frequency of apoptosis correlates with the prognosis of Gleason Grade 3 adenocarcinoma of the prostate. Cancer 75, 522-529 (1995) 5. Akashi-Tanaka S., Tsuda H., Fukuda H., Watanabe T., Fukutomi T.: Prognostic value of histopathological therapeutic effects and mitotic index in locally advanced breast cancers after neoadjuvant chemotherapy. Abstract. Japanese Journal of Clinical Oncology 26, 201-206 (1996) 6. Althaus F.R., Kleczkowska H.E., Malanga M., Muentener C.R., Pleschke J.M., Ebner M., Auer B.: Poly ADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism. Molecular and Cellular Biochemistry 193, 5-11 (1999) 7. Apop TagTM In Situ Apoptosis Detection Kit-Peroxidase, Catalog #: S7100-KIT (Ed. 1.1), Oncor, Gaithersburg, MD, USA (1993) 8. Ashwell J.D., Schwartz R.H., Mitchell J.B., Russo A.: Effect of gamma radiation on resting B lymphocytes. I. Oxygen-dependent damage to the plasma membrane results in increased permeability and cell enlargement. Journal of Immunology 136, 36493655 (1986)

122

9. Barendsen G.W., Beusker T.L.J., Vergroesen A.J., Budke L.: Effects of different ionizing radiations on human cells in tissue culture: 11. Biological experiments. Radiation Research, 13, 841-849 (1960) 10.Baskaran R., Wood L.D., Whitaker L.L., Camman C.E., Morgan S.E., Xu Y., Barlow C., Baltimore D., Wynshaw-Boris A., Kastan M.B., Wang J.Y.J.: Ataxia teleangiectasia mutant protein activates c-Abl tyrosine kinase in response to ionizing radiation. Nature 387, 516-520 (1997) 11. Billis W., Fuks Z., Kolesnick R.: Signalling in and regulation of ionising radiationinduced apoptosis in endothelial cells. Recent Progress in Hormone Research 53, 8593 (1998) 12. Björk-Eriksson T., West C.M., Cvetskovska E., Svensson M., Karlsson E., Magnusson B., Slevin N.J., Edström S., Mercke C.: The lack of correlation between proliferation (Ki-67, PCNA, LI, Tpot), p53 expression and radiosensitivity for head and neck cancers. British Journal of Cancer 80, 1400-1404 (1999) 13. Björk-Eriksson T., West C.M., Karlsson E., Slevin N.J., Davidson S.E., James R.D., Mercke C.: The in vitro radiosensitivity of human head and neck cancers. British Journal of Cancer 77, 2371-2375 (1998) 14. Blum RH., Cooper J., Schmidt AM., Ashinoff R., Collins A., Wernz JC., Speyer JL., Boyd A., Muggia FM.: Cisplatin and vinblastine chemotherapy for metastatic nonsmall cell carcinoma followed by irradiation in patients with regional disease. Cancer Treatment Reports 70, 333-337 (1986) 15. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D.: Involvement of MACH, a novel MORT/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF-receptor-induced cell death. Cell 85, 803-815 (1996) 16. Bowen C., Spiegel S., Gelmann E.P.: Radiation-induced apoptosis mediated by retinoblastoma protein. Cancer Research 58, 3275-3281 (1998) 17. Brachman D.G.., Graves D., Vokes E., Beckett M., Haraf D., Montag A., Dunphy E., Mick R., Yandell D., Weichselbaum R.R.: Occurrence of p53 gene deletions and

123

human papilloma virus infection in human head and neck cancer. Cancer Research 62, 4832-4836 (1992) 18. Bradford C.R., Wolf G.T., Carey T.E., Zhu S., Beals T.F., Truelson J.M., McClatchey K.D., Fisher S.G.: Predictive markers for response to chemotherapy, organ preservation, and survival of patients with advanced laryngeal carcinoma. Otolaryngology-Head and Neck Surgery 121, 534-538 (1999) 19. Brauneis J.W., Laskawi R., Schroder M., Gohde W.: Results of impulse cytophotometry in malignant tumours of head and neck. A prognostic parameter? HNO -Hals-, Nasen-, Ohren-Heilkunden 37, 369-372 (1989) 20. Bunz, F., Dutriaux A., Lengauer C., Waldman T., Zhou S., Brown J.P., Sedivy J.M., Kinzler K.W., Vogelstein B.: Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science 282, 1497-1501 (1998) 21. Calais G., Reynaud-Bougnoux A., Garand G., Beutter P., Le Floch O.: Oropharynx carcinoma: irradiation alone versus induction chemotherapy plus irradiation - 5 year results. British Journal of Radiology 63, 340-345 (1990) 22. Caminero M.J., Nunez F., Suarez C., Ablanedo P., Riera J.R., Dominguez F.: Detection of p53 protein in oropharyngeal carcinoma. Prognostic implications. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery 122, 769-772 (1996) 23. Cattoretti G., Rilke F., Androealo S., D’Amato L., Delia D.: p53 expression in breast cancer. International Journal of Cancer 41, 178-183 (1988) 24. Cavalli, F., Brunner, K.W.: Neue Subtanzen in der onkologischen Therapie. Deutsche Medizinische Wochenschrift 103, 1087-1092 (1978) 25. Chang E.H., Jang Y., Hao Z., Murphy G., Rait A., Fee W.E., Sussman H.H., Ryan P., Chiang Y., Pirollo K.F.: Restoration of the G1 checkpoint and the apoptotic pathway mediated by wild-type p53 sensitizes squamous cell carcinoma of the head and neck to radiotherapy. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery 123, 507-512 (1997)

124

26. Chmura S.J., Mauceri H.J., Advani S., Heimann R., Beckett M.A., Nodzenski E., Quintans J., Kufe D.W., Weichselbaum R.R.: Decreasing in apoptotic threshold of tumor cells through protein kinase C inhibition and sphingomyelinase activation increases tumor killing by ionizing radiation. Cancer Research 57, 4340-4347 (1997) 27. Cichy, A., Grobarcikova, E., Klimo, J., Jurga, E., Pivonka, M.: Preliminary experience with mitolactol in advanced tumors of the orofacial region and the larynx. Neoplasma 23, 427-434 (1976) 28. Cohen G.M.: Caspases: The executioners of apoptosis. Biochemical Journal 326, 116 (1997) 29. Cooke L.D., Cooke T.G., Bootz F. Forster G., Helliwell T.R., Spiller D., Stell P.M.: Ploidy as a prognostic indicator in end stage squamous cell carcinoma of the head and neck region treated with cisplatinum. British Journal of Cancer 61, 759-762 (1990) 30. Cooke L.D., Cooke T.G., Forster G., MacDonald D.G., Robertson A.G., Soutar D.S.: Flow cytometric analysis of DNA content in squamous cell carcinoma of the tongue: the relationship to host and tumour factors and survival. Abstract. Clinical Otolaryngology 19, 131-134 (1994) 31. Cuvillier O., Pirianov G., Kleuser B., Vanek P.G., Coso O.A., Gutkind J.S., Spiegel S.: Suppression of ceramid mediated programmed cell death by sphingosine-1phosphate. Nature 381, 800-803 (1996) 32. Dbaibo G.S., Pushkareva M.Y., Rachid R.A., Alter N., Smyth M.J., Obeid L.M., Hannun Y.A.: p53-dependent ceramide response to genotoxic stress. The Journal of Clinical Investigation 102/2, 329-339 (1998) 33. Decaestecker C., van Velthoven R., Petein M., Janssen T., Salmon I., Pasteels J.L., van Ham P., Schulman C., Kiss R.: The use of the decision tree technique and image cytometry to characterize aggressiveness in World Health Organization (WHO) grade II superficial transitional cell carcinomas of the bladder. Journal of Pathology 178, 274-283 (1996)

125

34. Dijkema I.M., Struikmans H., Dullens H.F., Kal H.B., van der Tweel I., Battermann J.J.: Influence of p53 and bcl2 on proliferative activity and treatment outcome in head and neck cancer patients. Oral Oncology 36, 54-60 (2000) 35. Dunphy C.H., Dunphy F.R., Boyd J.H., Varvares M.A., Kim H.J., Lowe V., Dunleavy TL., Rodriguez J., McDonough EM., Minster J.: Expression of p53 protein in advanced head and neck squamous cell carcinoma before and after chemotherapy. Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery 123, 1223-1225 (1997) 36. Eby M.T., Jasmin A., Kumar A., Sharma K., Chaudhary P.M.: TAJ, a novel member of the tumor necrosis factor receptor family, activates the c-Jun N-terminal kinase pathway and mediates caspase-independent cell death. Journal of Biological Chemistry, 275(20), 15336-15342 (2000) 37. Eckhardt S.: 10 éves nemzetközi tapasztalatok DBD-vel rosszindulatú daganatos megbetegedésekben. A gyógyszer adagolása. Elobromol (szerk.: Eckhardt Sándor) 167-170, Medicina, Budapest, 1982 38. Eckschlager T., Pilat D., Kodet R., Dahbiova R., Stankova J., Jasinska J., Hrusak O.: DNA ploidy in neuroblastoma. Neoplasma 43, 23-26 (1996) 39. Elliot T.E., Dinapoli R.P., O'Fallon J.R., Krook J.E., Earle J.D., Morton R.F., Levitt R., Tschetter L.K., Scheithauer B.W., Pfeifle D.M., Twito D.I., Nelimark R.A.: Randomized trial of radiation therapy (RT) plus dibromodulcitol (DBD) versus RT plus BCNU in high grade astrocytoma. Journal of Neurooncology 33(3), 239-250 (1997) 40.Ellis H.M., Horvitz H.R.: Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell 44, 817-829 (1986) 41. Esteban F., de Vega D.S., Garcia R., Rodriguez R., Manzanares J., Almeida A., Tamames S.: DNA content by flow cytometry in gastric carcinoma: pathology, ploidy and prognosis. Hepato-gastroenterology 46, 2039-2043 (1999) 42. Élő J.: Relationship between „dynamic histology” and metastases of laryngeal tumors. Acta Otolaryngologica (Stockh) 112, 383-386 (1992)

126

43. Élő J., Sebők J., Varga L.: A gégedaganatok proliferációs aktivitása és a metasztázisai közti összefüggés. Fül-orr-gégegyógyászat 37, 24-29 (1991) 44. Fónagy A., Jeney A., Szamos J., Institóris L., Hidvégi E.: The effect of dibromodulcitol and dianhydrodulcitol (galacticol) on RNA synthesis in ascites tumor cells. Acta Biochimica et Biophysica Academiae Scientiarium Hungariae 16, 151-162 (1981) 45. Frank J.L., Bur M.E., Garb J.L., Kay S., Ware J.S., Sismanis A.: p53

tumor

suppressor oncogene expression in squamous cell carcinoma of the hypopharynx. Cancer 73, 181-186 (1994) 46. Fuks Z., Persaud R.S., Alfieri A., McLoughlin M., Schwartz J.L., Seddon A., Cordon-Cardo C., Haimovitz-Friedman A.: Basic fibroblast growth factor protects endothelial cells from radiation induced programmed cell death in vitro and in vivo. Cancer Research 54, 2591-2597 (1994) 47. Fül-orr-gégészet, fej-nyak sebészet (szerk. Ribári Ottó) 309-318, 365-371, Medicina Könyvkiadó RT. Budapest (1997) 48. Gallo O., Boddi V., Calzolari A., Simonetti L., Trovati M., Bianchi S.: bcl-2 protein expression correlates with recurrence and survival in early stage head and neck cancer treated by radiotherapy. Clinical Cancer Research 2, 261-267 (1996) 49. Gasparini G., Bevilacqua P., Bonoldi E., Testolin A., Galassi A., Verderio P., Boracchi P., Guglielmi R.B., Pezzella F.: Predictive and prognostic markers in a series of patients with head and neck squamous cell invasive carcinoma treated with concurrent chemoradiation therapy. Clinical Cancer Research 1, 1375-1383 (1995) 50. Gáti E., Pokorny E., Somfai-Relle S., Szentirmay Z.: Cytochemical characterisation of Yoshida sarcoma cells resistant to dibromodulcitol. Abstract. International Journal of Tissue Reactions 6, 43-51 (1984) 51. Gerard JP., Morignat E., Romestaing P., Mornex F., Ardiet J.M., Ayzac L., Roy P.: Radiotherapy of cancer of the anal canal. 15 year experience at the Lyon civil

127

hospices and brief review of the literature. Abstract. Annales de Chirurgie 52,17-23 (1998) 52. Giaretti W., Danova M., Geido E., Mazzini G., Sciallero S., Aste H., Scivetti P., Riccardi A., Marsano B., Merlo F.: Flow cytometric DNA index in the prognosis of colorectal cancer. Cancer 67, 1921-1927 (1991) 53. Giatromanolaki A., Koukourakis M., Zaramboukas T., Skordalaki A., Arapantoni P., Georgoulias V., Fountzilas G.: p53 and bcl-2 expression in locally advanced squamous cell head-neck cancer treated with platinum based chemotherapy and radiotherapy. Anticancer Research 18, 4685-4692 (1998) 54. Goh H.S., Yao J., Smith D.R.: p53 point mutation and survival in colorectal cancer patients. Cancer Research 55, 5217-5221 (1995) 55. Goldsmith M.M., Cresson D.H., Arnold L.A., Postma D.S., Askin F.B., Pillsbury H.C.: DNA flow cytometry as a prognostic indicator in head and neck cancer. Otolaryngology-Head and Neck Surgery 96, 307-318 (1987) 56. Guo C.Y., Wang Y., Brautigan D.L. Larner J.M.: Histone H1 dephosphorylation is mediated through a radiation-induced signal transduction pathway dependent on ATM. The Journal of Biological Chemistry 274 (26), 18715-18720 (1999) 57. Haimovitz-Friedman A., Balaban N.A., McLoughlin M., Ehleiter D., Michaeli J., Vlodavsky I., Fuks Z.: Protein kinase C mediates basic fibroblast growth factor protection of endothelial cells against radiation induced apoptosis. Cancer Research 54, 2591-2597 (1994) 58. Haimovitz-Friedman A., Kan C., Ehleiter D., Persaud R.S., McLoughlin M., Fuks Z., Kolesnick R.S.: Ionising radiation acts on cellular membranes in human leukemia cells to generate ceramide and induce apoptosis. Journal of Experimental Medicine 180, 525-535 (1994) 59. Haimovitz-Friedman A.: Radiation induced signal transduction and stress response. Radiation Research 150, 102-108 (1998)

128

60. Hallahan D.E., Sukhatme V.P., Sherman M.L., Virudachalam S., Kufe D., Weichselbaum R.R.: Protein kinase C mediates x-ray inducibility of nuclear signal transducers EGR1 and JUN. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 88, 2156-2160 (1991) 61. Hallahan D.E., Virudachalam S., Schwartz J.L., Panje N., Mustafi R., Weichselbaum R.R.: Inhibition of protein kinases sensitises human tumour cells to ionising radiation. Radiation Research 129, 345-350 (1992) 62. Hamada M., Naomoto Y., Fujiwara T., Kamikawa Y., Tanaka N.: Suppressed apoptotic induction in oesophageal squamous cell carcinomas expressing extensive p53 protein. Abstract. Japanese Journal of Clinical Oncology 26, 398-404 (1996) 63. Hamazaki K., Kato T., Yunoki Y., Mori M., Gochi A., Mimura H., Orita K.: An analysis of DNA ploidy pattern of hepatocellular carcinoma. Abstract. Acta Medica Okayama, 47, 413-416 (1993) 64. Hamelin R., Laurent-Puig P., Olschwang S., Jego N., Asselain B., Remvikos Y., Girodet J., Salmon R.J., Thomas G.: Association of p53 mutation with short survival in colorectal cancer. Gastroenterology 106, 42-48 (1994) 65. Haupt Y., Maya R., Oren M.: Mdm2 promotes the rapid degradation of p53. Nature 387, 296-299 (1997) 66.Hedley D.W., Rugg C.A., Gelber R.D.: Association of DNA index and S-phase fraction with prognosis of nodes positive early breast cancer. Cancer Research 47, 4729-4735 (1987) 67. Hiddemann W., Schumann J., Andreef M. és mtsai.: Convention on nomenclature for DNA cytometry. Cancer Genetics and Cytogenetics 13, 181-183 (1984) 68. Hidvégi E. J., Lónai P., Holland J., Antoni F., Institóris L., Horváth I. P.: The effect of mannitol-myleran and two new dibromohexitols on the metabolic activities of nucleic acids and proteins. I. Biochemical Pharmacology 16, 2143-2153 (1967) 69. Hidvégi E.J., Sebestyén J., Szabó, L.D., Köteles G.J., Institóris L.: The effect of dibromodulcitol, diepoxy-dulcitol and various new cytostatic hexitol derivates on the 129

metabolic activities of nucleic acids and proteins. II. Biochemical Pharmacology 25, 1705-1710 (1976) 70. Hildebrand J., Sahmoud T., Mignolet F., Brucher J.M., Áfra D. and the EORTC Brain Tumor Group: Adjuvant therapy with dibromodulcitol and BCNU increases survival of adults with malignant gliomas. Neurology 44, 1479-1483 (1994) 71. Hindy I.: DBD monoterápiával nyert tapasztalatok Magyarországon. Elobromol (szerk.: Eckhardt Sándor) 161-167, Medicina, Budapest (1982) 72. Hindy I., Szántó J., Bodrogi I., Farkas E., Eckhardt S.: Forms and results of mitolactol therapy. Oncology 37 (Suppl.), 115-117 (1980) 73. Hirose T., Scheithauer B.W, Lopes M.B, Gerber H.A, Altermatt H.J, Harner S.G, VandenBerg S.R: Olfactory neuroblastoma. An immunohistochemical, ultrastructural and flow cytometric study. Cancer 76, 4-19 (1995) 74. Homma A., Furuta Y., Oridate N., Nakano Y., Kohashi G., Yagi K., Nagahashi T., Fukuda S., Inoue K., Inuyama Y.: Prognostic significance of clinical parameters and biological markers in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck treated with concurrent chemoradiotherapy. Clinical Cancer Research 5, 801-806 (1999) 75. Hwang A., Muschel R.J.: Radiation and the G2 phase of the cell cycle. Radiation Research (Suppl.), 150, 52-59 (1998) 76. Inoue T., Nasu M., Kai Y, Furumoto K.: Change on the cell proliferation kinetics of the central and peripheral regions of DMBA induced hamster tongue cancer following irradiation. Abstract. Shigaku-Odontology 77, 343-354 (1989) 77. Institóris E.: Biokémiai vizsgálatok. Elobromol (szerk.: Eckhardt Sándor) 116-127, Medicina, Budapest (1982) 78. Institóris E., Fox B.W.: The interaction of dianhydrogalactitol with DNA in cultured Yoshida sarcoma cells. Abstract. Chemico Biological Interactions 22, 99-107 (1978)

130

79. Institóris E., Holczinger L., Bánfi D.: The binding of in vivo administrated dibromodulcitol to the DNA, histone and non-histone Yoshida ascites tumour cells. Zeitschrift für Krebsforschung und Klinische Onkologie 82, 101-107 (1974) 80. Institóris E., Tamás J.: Alkylation of deoxyribonucleic acid and guanosine by 1,25,6-dianhydrogalactitol. Biochemical Journal 185, 659-666 (1980) 81. Institóris E., Tamás J.: Identification of guanine and adenine adducts in DNA alkylated by dibromodulcitol in vitro and in vivo. Abstract. Chemico Biological Interactions 47, 133-144 (1983) 82. Institóris L.: A DBD kutatás kémiai alapjai. Elobromol (szerk.: Eckhardt Sándor) 915, Medicina, Budapest (1982) 83. Institóris L., Kaczmarek J., Jeney A.: Mode of action. Binding to chromatin components. Mitolactol (Ed.: Rudolf Szebeni) 45-46, Medicina, Budapest (1986) 84. Institóris L., Kaczmarek J., Jeney A.: Mode of Action. Interaction with DNA. Mitolactol (Ed.: Rudolf Szebeni) 47-50, Medicina, Budapest (1986) 85. Ito T., Fujieda S., Tsuzuki H., Sunaga H., Fan G., Sugimoto C., Fukuda M., Saito H.: Decreased expression of Bax is correlated with poor prognosis in oral and oropharyngeal carcinoma. Cancer Letters 140, 81-91 (1999) 86. Jeney A., Dzurillay É., Lapis K., Valkó É.: Chromatin proteins as a possible target for antitumour agents: Alterations of chromatin proteins in dibromodulcitol treated Yoshida tumours. Abstract. Chemico Biological Interactions 26, 349-361 (1979) 87. Jeney A., Fox B.W., Garrett J.W., Fox M., Holland J.: The effect of dibromodulcitol on resting and dividing lymphoid cells. Chemico Biological Interactions 15, 299-307 (1976) 88. Jeney A.,

Kopper

L.,

Lapis

K.:

A sejtproliferáció vegyszeres gátlása.

Citosztatikumok szubcelluláris támadási pontja. A sejtosztódás szabályozása és befolyásolása (szerk.: Lapis Károly, Jeney András) 395-419, Akadémiai Kiadó, Budapest (1981)

131

89. Jeney A., Kovalszky I., Rásó E., Durand R.E., Fürész J., Lapis K.: The biological activity of cisplatin and dibromodulcitol in combination therapy. British Journal of Cancer 71, 317-321 (1995) 90. Jeney A., Szabó I., Vályi-Nagy T., Institóris L., Szabó J.: Pharmaco-biochemical studies on cytotoxic polyol derivates. II. The effect of biological alkylating agents on the thermaldenaturation properties of DNA. European Journal of Cancer 6, 297-302 (1970) 91. Kaur J., Srivastava A., Ralhan R.: Prognostic significance of p53 protein overexpression in betel- and tobacco-related oral oncogenesis. International Journal of Cancer 79, 370-375 (1998) 92. Kawasaki H., Altieri D.C., Lu C.D., Toyoda M., Tenjo T., Tanigawa N.: Inhibition of apoptosis by survivin predicts shorter survival rates in colorectal cancer. Cancer Research 58, 5071-5074 (1998) 93. Kearsley J.H., Bryson G., Battistutta D., Collins R.J.: Prognostic importance of cellular DNA content in head-and-neck squamous-cell cancers. A comparison of retro-spective and prospective series. International Journal of Cancer 47, 31-37 (1991) 94. Kerr J.F.R., Harmon B.V.: Definition and incidence of apoptosis: an historical perspective. In: Apoptosis, the Molecular Basis of Cell Death. Current Communications 3 in Cell and Molecular Biology (ed.: Tomei L., Cope F.O.) pp. 530, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1991) 95. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R.: Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British Journal of Cancer 26, 239257 (1972) 96. Kharbanda S., Pandey P., Jin S., Inou S., Bharti A., Yuan Z., Weichselbaum R.R., Weawer D., Kufe D.: Functional interaction between DNA-PK and c-Abl in response to DNA damage. Nature 386, 732-735 (1997)

132

97. Kimura H., Yonemura Y., Kadoya N., Kosaka T., Miwa K., Miyazaki I., Sawa T., Yosimitsu S., Nishida Y., Kamata T.: Correlation between DNA ploidy and clinical features in smooth muscle tumors of the gastrointestinal tract. Abstract. Analytical Cellular Pathology 5, 331-338 (1993) 98. Kinugasa S, Tachibana M., Hishikawa Y., Abe S., Yoshimura H., Monden N., Dhar D.K., Nagasue N.: Prognostic significance of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in squamous cell carcinoma of the esophagus. Abstract. Japanese Journal of Clinical Oncology 26, 405-410 (1996) 99. Komaki R., Fujii T., Perkins P., Ro J.Y., Allen P.K., Mason K.A., Mountain C.F., Milas L.: Apoptosis and mitosis as prognostic factors in pathologically staged N1 nonsmall cell lung cancer. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics 36, 601-605 (1996) 100. Kopper L.: A szabályozás elemei és zavarai. Szuppresszor gének. Az onkológia alapjai. (Szerk.: Ádány R., Kásler M., Ember J., Thurzó L., Kopper L.) 7-10, Medicina Könyvkiadó RT. Budapest (1997) 101. Kopper L., Jeney A., Lapis K., Török M.: Studies of the growth of an ascitic tumour. II. A system to study the tumour-age dependent effect of antitumour agents. European Journal of Cancer 14, 75-82 (1978) 102. Kopper L., Jeney A., Takács J., Benedeczky I., Dzurillay É., Lapis K.: Studies of the growth of an ascitic tumour. I. Cellular and subcellular changes during the tumour growth. European Journal of Cancer 14, 59-73 (1978) 103. Kopper L., Lapis K., Institóris L.: Incorporation of 3H-dibromodulcitol and 3Hdianhydrodulcitol into ascites tumour cells. Autoradiographic study. Neoplasma 23, 47-52 (1976) 104. Kopper L., Sebestyén A.: p53 (egy molekula, amely „végigsöpört” a daganatkutatáson). Magyar Onkológia, 39/4, 159-165 (1995) 105. Krecicki T., Jelen M.: Proliferating cell nuclear antigen in laryngeal cancer. Journal of Laryngology and Otology 112, 310-313 (1998)

133

106. Kubbutat M.H.G., Jones S.N., Vousden K.H.: Regulation of p53 stability by mdm2. Nature 387, 299-303 (1997) 107. Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-688 (1970) 108. Lampe H.B.: DNA analysis of head and neck squamous cell carcinoma by flow cytometry. Laryngoscope 103, 637-644 (1993) 109. Lane D. P.: p53, guardian of the genome. Nature 358, 15-16 (1992) 110. Lanigan D., McLean P.A., Murphy D.M., Donovan M.G., Curran B., Leader M.: Ploidy and prognosis in renal carcinoma. British Journal of Urology 71, 21-24 (1993) 111. Lee J.Y., Hannun Y.A., Obeid L.M.: Ceramid inactivates cellular protein kinase C alpha. Journal of Biological Chemistry 271/22, 13169-13174 (1996) 112. Lee N.K., Ye Y.W., Chen J., Li X., Waber P.G., Nisen P.D.: p53, retinoblastoma and human papillomavirus in squamous cell carcinoma and adjacent normal mucosa of the upper aerodigestive tract. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery 119, 1125-1131 (1993) 113. Lera J., Lara P.C., Perez S., Cabrera J.L., Santana C: Tumour proliferation, p53 expression, and apoptosis in laryngeal carcinoma. Relation to the results of radiotherapy. Cancer 83, 2493-2501 (1998) 114. Lin X.Y., Choi M.S., Porter A.G.: Expression analysis of the human caspase-1 subfamily reveals specific regulation of the CASP5 gene by lipopolysaccharide and interferon-gamma. Journal of Biological Chemistry 275(51), 39920-39926 (2000) 115. Liu T., El-Naggar A.K., McDonnel T.J., Steck K.D.,Wang M., Taylor D.L., Clayman G.L.: Apoptosis induction mediated by wild-type p53 adenoviral gene transfer in squamous cell carcinoma of the head and neck. Cancer Research 55, 31173122 (1995)

134

116. Liu X., Kim C. N., Pohl J., Wang X.: Purification and characterisation of an interleukin-1 beta-converting ezyme family protease that activates cysteine protease P32 (CPP32). Journal of Biological Chemistry 271/23, 13371-13376 (1996) 117. Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V., Karin M.: Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kB activation prevents cell death. Cell 87, 565-576 (1996) 118. Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks T., Housman D.E.: p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents. Cell 74, 957-967 (1993) 119. Mangel L.C., Hidvégi E.J.: Combined radiotherapy and DBD treatment of murine brain tumours increases survival. Abstract. In: 1. Deutscher Kongress für Radioonkologie, Strahlenbiologie und Medizinische Physik, Baden-Baden, Germany, 18-21 Nov, 1995 120. Marcial V.A., Pajak T.F., Kramer S., Davis L.W., Stetz J., Laramore G.E., Jacobs J.R., Al-Sarraf M., Brady L.W.: Radiation Therapy Oncology Group (RTOG) studies in head and neck cancer. Seminars in Oncology 15, 39-60 (1988) 121. Martin R.F., Haseltine W.A.: Range of radiochemical damage to DNA with decay of iodine-125. Science 213, 896-898 (1981) 122. Matsuoka S., Huang M., Elledge S.J.: Linkage of ATM to cell cycle regulation by the chk2 protein kinase. Science 28, 1893-1897 (1998) 123. McCluggage W.G., Cameron C.H., Arthur K., Toner P.G.: Atypical carcinoid tumor of the larynx: an immunohistochemical, ultrastructural and flow cytometric analysis. Ultrastructural Pathology 21, 431-438 (1997) 124. McIlwrath A.J., Vasey P.A., Ross G.M., Brown R.: Cell cycle arrest and radiosensitivity of human tumor cell lines: dependence on wild-type p53 for radiosensitivity. Cancer Research 54, 3718-3722 (1994) 125. McKaig R.G., Baric R.S., Olshan A.F.: Human papillomavirus and head and neck cancer: epidemiology and molecular biology. Review. Head and Neck 20, 250-265 (1998) 135

126. Meyn M.S.: Ataxia teleangiectasia and cellular responses to DNA damage. Cancer Research 55, 5991-6001 (1995) 127. Minu A.R., Endo M., Sunagawa M: Role of DNA ploidy patterns in esophageal squamous cell carcinoma. An ultraviolet microspectrophotometry study. Cancer 74, 578-585 (1994) 128. Mishra R.C., Mohanty S.: Study of tumour ploidy in early stages of buccal mucosa cancer. European Journal of Surgical Oncology 22, 58-60 (1996) 129. Mundle S.D.: Prognostic significance of apoptosis assessed in vivo in relation to proliferation and mutational status of p53 gene in various cancers. Abstract. In: Prognostic Factors in Cancer, Cambridge Healthtech Institute's Conference, Arlington, Virginia, USA, 7-8 June, 1995 130. Muzio M., Chinnaiyan A.M., Kischkel F.C., O’Rourke K., Shevchenko A., Ni J., Scaffidi C., Bretz J.D., Zhang M., Gentz R., Mann M., Krammer P.H., Peter M.E., Dixit V.M.: FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the CD95 (Fas/APO-1) death-inducing signalling complex. Cell 85, 817827 (1996) 131. Naresh K.N., Lakshminarayanan K., Pai S.A., Borges A.M.: Apoptosis index is a predictor factor of metastatic phenotype in patient with early stage squamous carcinoma of the tongue: a hypothesis to support this paradoxical association. Cancer 91, 578-584 (2001) 132. Nylander K., Stenling R., Gustafsson H., Zackrisson B., Roos G.: p53 expression and cell proliferation in squamous cell carcinomas of head and neck. Cancer 75, 8793 (1995) 133. Obeid L.M., Linardic C.M., Kalorak L.A., Hannun Y.A.: Programmed cell death by ceramide. Science 259, 1769-1771 (1993) 134. O'Brien C.J., Castle G.K., Stevens G.N., MacHalliday G., Donovan J.K., Lee K.K., Packham N.A., Peat M.J.: Limitations of radiotherapy in the definitive treatment of

136

squamous carcinoma of the tonsillar fossa. Abstract. Australian and New-Zealand Journal of Surgery 62, 709-13 (1992) 135. Ohnuma T., Holland J.D., Sako K., Shedd P.D.: Effects of combination therapy with bleomycin (NSC-125066) and dibromodulcitol (NSC-104800) on squamous cell carcinoma in man. Cancer Chemotherapy Reports - Part 1 56, 625-633 (1972) 136. Okuno Y., Nishimura Y., Kashu I., Ono K., Hiraoka M.: Prognostic values of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Ki-67 for radiotherapy of oesophageal squamous cell carcinomas. British Journal of Cancer 80, 387-395 (1999) 137. Olasz L., Kwashie F., Herczegh P., Bruncsics Z., Horváth A., Királyfalvi L.: A comperative study of preoperative B-V-M-M chemotherapy and irradiation in advanced squamous cell carcinoma of the oral cavity. Neoplasma 43, 51-56 (1996) 138. Olasz L., Szabó I., Horváth A.: An effective therapy for advanced squamous cell carcinoma of the oral cavity: Preoperative BVMM (bleomycin, vincristine, mitolactol plus methotrexate and leucovorin) chemotherapy followed by surgery. Neoplasma 35, 591-596 (1988) 139. Oláh E.: A sejtproliferáció szabályozási zavarai. Sejtciklus gének. Az onkológia alapjai. (Szerk.: Ádány R., Kásler M., Ember J., Thurzó L., Kopper L.) 18-20, Medicina Könyvkiadó RT. Budapest (1997) 140. Oláh E., Pályi I., Sugár J.: Effects of cytostatics on proliferating and stationary cultures of mammalian cells. European Journal of Cancer 14, 895-900 (1978) 141. Olofsson J., Golusinski W.: Prognostic factors in squamous cell neoplasias of the upper aero-digestive tract. In Head and Neck Cancer - Advances in Basic Research (ed.: J.A. Werner, B.M. Lippert and H.H. Rudert) pp. 511-520, Elsevier Science B.V., Amsterdam (1996) 142. Osaki T., Kimura T., Tatemoto Y., Dapeng L., Yoneda K., Yamamoto T.: Diffuse mode of tumor cell invasion and expression of mutant p53 protein but not of p21 protein are correlated with treatment failure in oral carcinomas and their metastatic foci. Oncology 59, 36-43 (2000)

137

143. Pályi I.: Sejtszinten végzett vizsgálatok. Elobromol (szerk.: Eckhardt Sándor) 105115, Medicina, Budapest (1982) 144. Peng CY., Graves P.R., Thoma R.S., Wu Z., Shaw A.S., Piwnica-Worms H.: Mitotic and G2 Checkpoint control: Regulation of 14-3-3 protein binding by phosphorylation of cdc25c on serine-216. Science 277, 1501-1505 (1997) 145. Pezzella F., Gasparini G., Harris A.L., Gatter K.C.: Apoptosis as a predictive factor for cancer therapy. In: Apoptosis in Normal Development and Cancer (ed.: Mels Sluyser) pp. 265-276, Taylor & Francis, London (UK), Bristol, PA (USA) 1996 146. Pulkkinen J.O., Klemi P., Martikainen P., Grénman R.: Apoptosis in situ, p53,bcl-2 and AgNOR counts as prognostic factors in laryngeal carcinoma. Anticancer Research 19, 703-708 (1999) 147. Radford I.R., Murphy T.K.: Radiation response of mouse lymphoid and myeloid cell lines. Part III. Different signals can lead to apoptosis and may influence sensitivity to killing by DNA double-strand breakage. International Journal of Radiation Biology 65/2, 229-239 (1994) 148. Reed J.C.: Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. Journal of Cell Biology 124, 1-6 (1994) 149. Reed J.C.: Citochrome c: Can’t live with it - can’t live without it. Cell 91, 559-562 (1997) 150. Reinke V., Lozano G.: The p53 targets mdm2 and Fas are not required as mediators of apoptosis in vivo. Oncogene 15, 1527-1534 (1997) 151. Resnick J.M., Uhlman D., Niehans G.A., Adams G., Knapp D.: Cervical lymph node status and survival in laryngeal carcinoma: prognostic factors. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology 104, 685-694 (1996) 152. Riccardi A., Danova M., Dionigi P., Gaetani P., Cebrelli T., Butti G., Mazzini G., Wilson G.: Cell kinetics in leukaemia and solid tumours studied with in vivo bromodeoxyuridine and flow cytometry. British Journal of Cancer 59, 898-903 (1989) 138

153. Ropka M.E., Goodwin W.J., Levine P.A., Sasaki C.T., Kirchner J.C., Cantrell R.W.: Effective head and neck tumor markers. The continuing quest. Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery 117, 1011-1014 (1991) 154. Ruá S., Comino A., Fruttero A., Cera G., Semeria C., Lanzillotta L., Boffetta P.: Relationship between histologic features, DNA flow cytometry, and clinical behaviour of squamous cell carcinomas of the larynx. Cancer 67, 141-149 (1991) 155. Rugge M., Sonego F., Panozzo M., Baffa R., Rubio J. Jr., Farinati F., Nitti D., Ninfo V., Ming SC.: Pathology and ploidy in the prognosis of gastric cancer with no extranodal metastasis. Cancer 73, 1127-1133 (1994) 156. Sahin A.A., Ro J.Y., el-Naggar A.K., Lee J. S., Ayala A.G., Teague K., Hong W.K.: Flow cytometric analysis of the DNA content of non-small cell lung cancer. Ploidy as a significant prognostic indicator in squamous cell carcinoma of the lung. Cancer 65, 530-537 (1990) 157. Salesiotis A.N., Cullen K.J.: Molecular markers predictive of response and prognosis in the patient with advanced squamous cell carcinoma of the head and neck: evolution of a model beyond TNM staging. [Review] Current Opinion in Oncology 12, 229-239 (2000) 158. Salo A., Servomaa K., Kiuru A., Pulkkinen J., Grénman R., Pekkola-Heino K., Rytömaa T.: The bcl-2 gene status of human head and neck cancer cell lines. Acta Otolaryngologica (Stockholm) Suppl. 529, 233-236 (1997) 159. Santana P., Pena L.A., Haimovitz-Friedman A., Martin S., Green D., McLoughlin M., Cordo-Cordo C., Schuchman E.H., Fuks Z., Kolesnick R.S.: Acid sphyngomyelinase deficient human lymphoblasts and mice are defective in radiationinduced apoptosis. Cell 86, 189-199 (1996) 160. Sarela A.I., Macadam R.C.A., Farmery S.M., Guillou P.J.: Survivin, a novel inhibitor of apoptosis, and prognosis in colorectal carcinoma. British Journal of Surgery 85, 1566 (1998)

139

161. Satoh M.S., Poirier G.G., Lindahl T.: Dual function for poly(ADP-ribose) synthesis in response to DNA strand breakage. Biochemistry 33, 7099-7106 (1994) 162. Schiffer D., Dutto A., Cavalla P., Chio A., Migheli A., Piva R.: Role of apoptosis in the prognosis of oligodendrogliomas. Abstract. Neurochemistry International 31, 245-250 (1997) 163. Schuler D., Kardos G., Révész T.: Dibromodulcitol containing chemotherapeutic regimen in the treatment of childhood Hodgkin's disease. Neoplasma 35, 599-603 (1988) 164. Schuler D., Somló P., Koós R., Kalmanchey R., Paraicz E.: Treatment of malignant scala posterior brain tumors in children: the chemotherapy of relapsed medulloblastoma with a dibromodulcitol containing drug regime and pharmacokinetic studies of dibromodulcitol in children. Medical and Pediatric Oncology 20, 312-314 (1992) 165. Schwartz J.L.: The role of constitutive and inducible processes in the response of human squamous cell carcinoma cell lines to ionising radiation. Radiation Research 138, 37-39 (1994) 166. Servomaa K., Kiuru A., Grénman R., Pekkola-Heino K., Pulkkinen J.O., Rytömaa T.: p53 mutations associated with increased sensitivity to ionizing radiation in human head and neck cancer cell lines. Cell Proliferation 29, 219-230 (1996) 167. Shafman T., Khanna K.K., Kedar P., Spring K., Kozlov S., Yen T., Hobson K., Gatel M., Zhang N., Wattera D., Egerton M., Shiloh Y., Kharbanda S., Kufe D., Lavin M.F.: Interaction between ATM protein and c-Abl in response to DNA damage. Nature 387, 520-523 (1997) 168. Sheu L.F., Chen A., Tseng H., Leu F., Lin J.K., Ho K., Meng C.: Assessment of p53 expression in nasopharyngeal carcinoma. Human Pathology 26, 380-386 (1995) 169. Shintani S., Mihara M., Nakahara Y., Terakado N., Yoshihama Y., Kiyota A., Ueyama Y., Matsumura T.: Apoptosis and p53 are associated with effect of

140

preoperative radiation in oral squamous cell carcinomas. Cancer Letters 154, 71-77 (2000) 170. Silvestrini R.T., Benini E., Daidone M.G., Veneroni S., Boracchi P., Cappelletti V., Di Fronso G., Veronesi U.: p53 as an independent prognostic marker in lymph node negative breast cancer patients. Abstract. Journal of the National Cancer Institute 85, 965-970 (1993) 171. Sitarz A.L., Albo V., Movassagi N., Karon M., Hammond D., Weiner J., Reed A.: Dibromodulcitol (NSC-104800) compared with cyclophosphamide (NSC-26271) as remission maintenance therapy in previously treated children with acute lymphoblastic leukemia or acute undifferentiated leukemia: possible effectiveness in reducing the incidence of central nervous system leukemia. Cancer Chemotherapy Reports – Part 1. 59, 989-994 (1975) 172. Sorensen F.B., Braendgaard H., Christiansen A.O., Bojsen-Moller M., ReskeNielsen E.: Stereological estimates of nuclear volume and other quantitative variables in supratentorial brain tumors. Practical technique and use in prognostic evaluation. Abstract. Journal of Neuro-Oncology 10, 253-262 (1991) 173. Soussi T., Lubin R., Lavielle J.P.: Clinical utility of p53 analysis in human neoplasia: application to head and neck cancer. In Head and Neck Cancer - Advances in Basic Research (ed.: J.A. Werner, B.M. Lippert and H.H. Rudert) pp. 279-289, Elsevier Science B.V., Amsterdam (1996) 174. Spitz M.R.: Epidemiology and Risk Factors for Head and Neck Cancer. Seminars in Oncology 21, 281-288 (1994) 175. Srinivasula S.M., Fernandes-Alnemri T., Zangrilli J., Robertson N., Armstrong R.O., Wang L., Trapani J.A., Tomaselli K.J., Litwack G., Alnemri E.S.: The Ced3/interleukin 1 beta converting enzyme-like homolog Mch6 and the lamin-cleavig enzyme Mch2alpha are substrates for apoptotic mediator CPP32. Journal of Biological Chemistry 271, 27099-27106 (1996)

141

176. Stary J., Hrodek O. Hausner P., Petrakova A., Goetz P., Kreuger A.: The importance of blast cell DNA content for prognosis of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Neoplasma 37, 293-299 (1990) 177. Stell

PM.:

Prognosis

in laryngeal carcinoma: tumour factors. Clinical

Otolaryngology 15, 69-81 (1990) 178. Struikmans H., Rutgers D.H., Hordijk G.J., Slootweg P.J., van der Tweel I., Battermann J.J.: Prognostic significance of cell proliferation markers and DNA-ploidy in head and neck tumors. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics 40, 27-34 (1998) 179. Sudbo J., Bryne M., Johannessen A.C., Kildal W., Danielsen H.E., Reith A.: Comparison of histological grading and large-scale genomic status (DNA ploidy) as prognostic tools in oral dysplasia. Journal of Pathology 194, 303-310 (2001) 180. Sundfor K., Trope C.G., Hogberg T., Onsrud M., Koern J., Simonsen E., Bertelsen K., Westberg R.: Radiotherapy and neoadjuvant chemotherapy for cervical carcinoma. A randomized multicenter study of sequential cisplatin and 5-fluorouracil and radiotherapy in advanced cervical carcinoma 3B and 4A. Cancer 77, 2371-2378 (1996) 181. Szende B.: Az aktív sejthalál és zavarai. Az onkológia alapjai. (Szerk.: Ádány R., Kásler M., Ember J., Thurzó L., Kopper L.) 20-25, Medicina Könyvkiadó RT. Budapest (1997) 182. Szumiel I.: Monitoring and signalling of radiation-induced damage in mammalian cells. Radiation Research (Suppl.) 150, 92-101 (1998) 183. Tamás L, Kraxner H., Mechtler L., Répássy G., Ribári O., Hirschberg A., Szentkúti G., Járay B., Szentirmay Z.: Prognostic significance of p53 histochemistry and DNA histogram parameters in head and neck malignancies. Anticancer research 20, 40314038 (2000) 184. Tamás L, Péter Z., Kiefer G.: Adatok a fej-nyaki daganatok epidemiológiájához Magyarországon. Orvosi Hetilap 139/7, 355-359 (1998)

142

185. Tanaka K. Iwamoto S., Gon G., Nohara T., Iwamoto M., Tanigawa N.: Expression of survivin and its relationship to loss of apoptosis in breast carcinomas. Clinical Cancer Research 6, 127-134 (2000) 186. Tannapfel A., Geissler F., Kockerling F., Katalinic A., Hauss J., Wittekind C.: Apoptosis and proliferation in relation to histopathological variables and prognosis in hepatocellular carcinoma. Journal of Pathology 187, 439-445 (1999) 187. Thor A.D., Moore D.H., Edgerton S.M., Kawasaki E.S., Reihsaus E., Lynch H.T., Marcus J.N., Schwartz L., Chen L.C., Mayall B.H.: Accumulation of p53 tumour suppressor gene protein: an independent marker of prognosis in breast cancers. Journal of the National Cancer Institute 84, 845-855 (1992) 188. Tomasino R.M., Daniele E., Bazan V., Morello V., Tralongo V., Nuara R., Nagar C., Salvato M., Ingria F., Restivo S.: Prognostic significance of cell kinetics in laryngeal squamous cell carcinoma: clinicopathological associations. Cancer Research 55, 6103-6108 (1995) 189. Tormey D.C., Falkson G., Perlin E., Bull J., Blom J., Lippman M.E.: Evaluation of an intermittent schedule of dibromodulcitol in breast cancer. Cancer Treatment Reports 60, 1593- 1596 (1976) 190. Tormey D.C., Simon R., Falkson G., Bull J., Band P., Perlin E., Blom J.: Evaluation of adriamycin and dibromodulcitol in metastatic breast carcinoma. Cancer Research 37, 529-534 (1977) 191. Tytor M., Wingren S., Olofsson J.: Heterogeneity of squamous cell carcinomas of the oral cavity studied by flow cytometry. Pathology, Research and Practice 187, 3035 (1991) 192. Unger E.: Histological examination of combined effects of chemotherapeutic agents and differently fractioned irradiations in transplanted solid Ehrlich carcinoma of mice. Strahlentherapie und Onkologie 163, 557-560 (1987) 193. Vályi-Nagy T., Jeney A., Szabó J., Szabó I., Institóris L.: Pharmaco-biochemical studies on cytotoxic polyol derivates I. Effects of 1,6-dibromo-1,6-dideoxydulcitol on

143

sensitive, resistant and refractory tumours. European Journal of Cancer 5, 403-414 (1969) 194. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Williamson N.K., Schumacker P.T., Thompson C.B.: Bcl-xL regulates the membrane potential and volume homeostasis of mitochondria. Cell 91, 627-637 (1997) 195. Vidair C.A., Chen C.H., Ling C.C., Dewey W.C.: Apoptosis induced by Xirradiation of rec-myc cells is postmitotic and not predicted by the time after irradiation or behaviour of sister cells. Cancer Research 56, 4116-4118 (1996) 196. von Rosen A.: Aneuploidy as a prognostic factor in breast cancer. Abstract. Medical Oncology and Tumor Pharmacotherapy 6, 117-120 (1989) 197. Wallace S.S.: Enzymatic processing of radiation-induced free radical damage in DNA. Radiation Research (Suppl.) 150, 60-79 (1998) 198. Ward J.F.: Biochemistry of DNA lesions. Radiation Research (Suppl.) 104, 103111 (1985) 199. Watters D.: Molecular mechanisms of ionising radiation-induced apoptosis. Immunology and Cell Biology 77, 263-271 (1999) 200. Wennerberg J., Baldetorp B., Äkervall J.: The efficacy of DNA flow cytometry in squamous cell carcinoma of the head and neck. In: Head and Neck Cancer - Advances in Basic Research (ed.: J.A. Werner, B.M. Lippert and H.H. Rudert) pp. 599-605, Elsevier Science B.V., Amsterdam (1996) 201. Wenz F., Azzam E.I., Little J.B.: The response of proliferating cell nuclear antigen to ionising radiation in human lymphoblastoid cell lines is dependent on p53. Radiation Research 149, 32-40 (1998) 202. WHO Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment. World Health Organization, Geneva, Switzerland (1987)

144

203. Wilson W.L., Van Ryzin J., Weiss A.J., Frelick R.W., Mors S.E.: A phase III study in lung carcinoma comparing hexamethylmelamine (NSC-13875) to dibromodulcitol (NSC-104800). Oncology 31, 293-309 (1975) 204. Witzigmann H., Sagasser J., Meyer FM., Witte J.: Therapy of anal cancer. Abstract. Chirurgie 65, 344-351 (1994) 205. Wollenberg B., Jan V., Schmit U.M., Hofmann K., Stieber P., Fateh-Moghadam A.: CYFRA 21-1 is not superior to SCC antigen and CEA in head and neck squamous cell cancer. Anticancer Research 16, 3117-3124 (1996) 206. Xin Xie: Cancer development. Apoptosis. In: Prognostic factors in squamous cell carcinomas of the head and neck. A study with particular emphasis on proliferation and apoptosis (Norwegian Cancer Society) pp. 6-11, Lobo Grafiskas, Oslo (1999) 207. Yang B., Rice T.W., Adelstein D.J., Rybicki L.A., Goldblum J.R.: Overexpression of p53 protein associates decreased response to chemoradiotherapy in patients with esophageal carcinoma. Abstract. Modern Pathology 12, 251-256 (1999) 208. Zhang Z.F., Morgenstern H., Spitz M.R., Tashkin D.P., Yu G.P., Hsu T.C., Schantz S.P.: Environmental tobacco smoking, mutagen sensitivity, and head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 9, 10431049 (2000) 209. Zsindely A., Szabó J., Hutay J., Jeney A. Vályi-Nagy T., Institóris L.: Investigation on the mode of action of the cytotoxic hexitols IV. The effect of dibromodulcitol on RNA synthesis in Yoshida sarcoma and rat liver. Neoplasma 19, 89-94 (1972)

145

8. A szerző értekezéssel kapcsolatos közleményei és előadásai

Közlemények 1. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Search for Prognostic Factors in Head and Neck Cancer.

Acta Otolaryngologica

(Stockholm), Suppl. 527, 145-149 (1997) 2. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Prognosztikai faktorok vizsgálata fej-nyaki daganatokban. Fül-orr-gégegyógyászat, 43, 162-167 (1997) 3. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Changes in Apoptotic and Mitotic Activity in Squamous Cell Carcinoma After Irradiation and/or Chemotherapy. Abstract. Pathol. Res. Pract. 193/5-6, 352 (1997) 4. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Változások az apoptotikus és mitotikus aktivitásban fej-nyaki laphámcarcinomában sugárkezelés és/vagy kemoterápia után. Abstract. Magyar Onkológia, 41, 313-314 (1997) 5. Tamás L., Kraxner H., Szentkúti G., Ribári O., Répássy G., Járay B., Szentirmay Z.: Kapcsolat a fej-nyaki daganatok metasztatizáló képessége és a sejtenkénti DNStartalom között. Fül-orr-gégegyógyászat, 44, 184-190 (1998) 6. Tamás L., Kraxner H., Járay B., Ribári O., Répássy G., Szentirmay Z.: Relationship between the Cellular DNA Content, p53 Protein Overexpression and Metastatic Potential of Head and Neck Cancer. Abstract. British Journal of Cancer, 77 (Suppl.1), 7 (1998) 7. Tamás L., Kraxner H., Mechtler L. Répássy G., Ribári O., Hirschberg A., Szentkúti G., Járay B., Szentirmay Z.: Prognostic Significance of p53 Histochemistry and DNA Histogram Parameters in Head and Neck Malignancies. Anticancer Research, 20, 4031-4038 (2000).

146

8. Kraxner H., Tamás L., Sáfrány G., Ribári O., Oláh J., Hidvégi E., Répássy G., Szende B.: Apoptotic and Mitotic Activity in Squamous Cell Carcinoma Cells after Combined Modality Treatment with g-irradiation and Dibromodulcitol. Cell Biology International,25, 599-606 (2001) 9. Kraxner H., Tamás L., Sáfrány G., Hidvégi E., Jeney A., Répássy G., Szende B.: Kombinált kezelés hatásosságának vizsgálata laphámrák sejtvonalon. Abstract. Magyar Onkológia, 45/3, 277 (2001)

Előadások

1. Kraxner H., Tamás L., Járay B., Ribári O., Szentirmay Z., Szende B.: Search for Prognostic Factors in Head and Neck Cancer.

International Conference on

epithelial Hyperplastic Lesion of the Larynx, Ljubljana, Slovenia. October 28-29. 1996 2. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Changes in apoptotic and mitotic activity in squamous cell carcinoma after irradiation and /or chemotherapy. XVIth European Congress of Pathology, Maastricht, The Netherlands. Aug. 31-Sept. 4., 1997 3. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Változások az apoptotikus és mitotikus aktivitásban fej-nyaki laphámcarcinomában sugárkezelés és/vagy kemoterápia után. Magyar Onkológusok Társaságának XXII. Nemzeti Kongresszusa, Budapest, nov. 10-12, 1997 4. Tamás L., Kraxner H., Járay B., Ribári O., Répássy G., Szentirmay Z.: Relationship between the Cellular DNA Content, p53 Protein Overexpression and Metastatic Potential of Head and Neck Cancer. Int. Symp. on Metastases in Head and Neck Cancer, Kiel, Germany. 15-18 Jan. 1998

147

5. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Kombinációs kezelés lehetősége fej-nyaki laphámrákoknál. Magyar Fül-orrgégeorvosok Egyesületének 35. Kongresszusa, Pécs, jún. 17-20, 1998 6. Tamás László, Kraxner Helga, Ribári Ottó, Répássy Gábor, Járay Balázs, Szentirmay Zoltán: Kapcsolat a fej-nyaki daganatok metasztatizáló potenciálja és a p53 génmutáció, illetve a sejtenkénti DNS-tartalom között. Magyar Fül-orrgégeorvosok Egyesületének 35. Kongresszusa, Pécs, jún. 17-20, 1998 7. Kraxner H., Sáfrány G., Hidvégi E., Tamás L., Ribári O., Szende B.: Changes in Apoptotic and Mitotic Activity after Irradiation and/or Chemotherapy. 4th Internatinal Congress of the WHMA, Budapest, Hungary. Aug. 27-29, 1998 8. Kraxner H., Tamás L., Szende B., Répássy G.: Combined Modality Treatment with g-irradiation and Dibromo-dulcitol is Squamous Cell Carcinoma Cells. 4th European Congress of Oto-Rhino-Laryngology, Head and Neck Surgery, Berlin, Germany. May 13-18, 2000 9. Kraxner H., Tamás L., Sáfrány G., Hidvégi E., Jeney A., Répássy G., Szende B.: Kombinált kezelés hatásosságának vizsgálata laphámrák sejtvonalon. Magyar Onkológusok Társaságának 24. Kongresszusa, Budapest, nov. 22-24, 2001

148

9. Az értekezésben előforduló rövidítések jegyzéke ABC:

avidin-biotin komplex

ABC-AP:

avidin-biotin komplex – alkalikus foszfatáz

AI:

apoptózis-index

Apaf-1:

apoptotic protease activating factor

ATM:

ataxia teleangiectasia mutated

BAEC:

bovine aortic endothelial cells

BCIP:

bromo-chloro-indolil foszfát

BCNU:

1,3-bis(2-chloroethyl)-3-cyclohexil-1-nitrosourea

BER:

base excision repair

BRCA:

breast cancer susceptibility antigen

BSA:

bovine serum albumin

CAK:

Cyclin-dependent inase Activating Kinase

CCNU:

1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexil-1-nitrosourea

cdc25:

cell division cycle 25

cdk:

ciklin-dependens kináz

CEA:

Carcinoembrionalis Antigen

chk1:

checkpoint kinase 1

chk2:

checkpoint kinase 2

CrmA:

citokine response modifier antigen

DAB:

diamino-benzidin

DAG:

1,2-diacilglicerol

DBD:

1,6-dibróm-1,6-didezoxi-dulcit

DED:

death effector domain

DI:

DNS-index

DISC:

death inducing signalling complex

DNA-PK:

DNS-dependens protein kináz

EDTA:

etilén-diamin-tetraacetát

FADD:

Fas Associated Death Domain

FAN:

Factor Associated with N-sphingomyelinase activation

FGF2:

Bazális fibroblaszt növekedési faktor

GADD 45:

growth arrest DNA-damage 45

HE:

hematoxilin-eozin

149

ICE :

interleukin-1b-konvertáló enzim

IL-1b:

interleukin-1b

IRF-1:

interferon regulatory factor-1

LASA:

Lipid Associated Sialic Acid

MAPK:

Mitogen Activated Protein Kinase

mdm2:

murine double minute 2

MI:

mitózis-index

NBS:

Nijmegen breakage syndrome

NBT:

iodonitroblue-tetrasolium só

NF-kB:

nuclear regulatory factor – kappaB

NP-40:

Nonidet P-40

NSE:

Neuronspecifikus Enoláz

PARP:

poli(ADP-ribóz) polimeráz

PBS:

phosphate buffered saline

PCNA:

Proliferating Cell Nuclear Antigen

PF:

polyploid frakció

PKC:

protein kináz C

PMSF:

phenil-metil-sulfonil-fluorid

Rb:

retinoblastoma

RIP:

receptor-interacting protein

RTOG:

Radiation Therapy Oncology Group

SAPK:

Stress Activated Protein Kinase

SCCA:

Squamous Cell Carcinoma Antigen

SDS:

sodium dodecyl sulphate (Na-lauril-szulfát)

SPF:

S-fázis frakció

TBST puffer: 20 mmól TRIS/HCl (pH 7,5), 150 mmól NaCl, 0.05% TWEEN20 TdT:

terminális deoxinukleotidil transzferáz

TNF:

tumornekrózis faktor

TNFR-1:

tumornekrózis faktor receptor 1

TPA:

12-O-tetradekanoil-phorbol-13-acetát

TRADD:

TNF Receptor Associated Death Domain

TRIS:

trihidro-amino-metán

XRCC4:

X-ray repair cross-complementing gene 4

150

Összefoglaló A fej-nyaki (gége, algarat, középgarat és szájüregi) régió laphámrákjai rossz prognózisú daganatok, különösen, ha előrehaladott állapotban kerülnek felfedezésre. Jelentőségüket mutatja, hogy e tumorok miatti halálozás szempontjából Magyarország áll az első helyen Európában. Munkám során két humán klinikopatológiai, valamint egy in vitro vizsgálatsorozatban különböző faktorok prognosztikai és terápiás jelentőségének kutatásával foglalkoztam fej-nyaki karcinómák esetében. I. humán klinikopatológiai vizsgálat. A fej-nyaki laphámrákok primer terápiája a műtéti eltávolítás. Amennyiben műtét nem végezhető, a következő választandó terápiás lehetőség a sugárkezelés. Az egyes tumorok sugárérzékenysége azonban nagyon eltérő lehet. Célkitűzés: Primer sugárterápiával kezelt betegeknél a kezelés megkezdése előtt vett biopsziás anyagban meghatározott apoptózis-index (AI), mitózis-index (MI), mutáns p53 expresszió, ploidia és S-fázis arány (SPF) prognosztikai értékének vizsgálata. Lehete a kapott értékek alapján már a kezelés megkezdése előtt következtetni a radioterápiás válaszkészségre? Az irradiáció első frakcióját (2Gy) követően vett biopsziás anyagban szintén meghatároztuk az AI-t és MI-t, valamint a p53 státuszt. A kezelés előtti értékekkel összevetve vizsgáltuk, hogy történt-e változás, ha igen, van-e annak prognosztikai vagy terápiás szempontból jelentősége. Eredmények: Hosszabb túlélési idővel párosulhat a magas kiindulási MI érték és annak csökkenése az első kezelés hatására. A radioterápia sikere szempontjából kedvező lehet a magas kiindulási MI- és az alacsony AI érték, az MI csökkenése 2 Gy besugárzást követően, az alacsony SPF és az aneuploidia. Így e paraméterek meghatározása értékes információt jelenthet egy daganat sugárterápiás válaszkészségének megítélése szempontjából már az első kezelés előtt, vagy röviddel azt követően. II. humán klinikopatológiai vizsgálat. Célja: Nagyobb létszámú beteganyagon (51 beteg) - a terápia módjára való tekintet nélkül - a klinikai paraméterek, mutáns p53 expresszió és sejtenkénti DNS tartalom prognosztikai értékének vizsgálata. Eredmények: A teljes túlélési időt szignifikánsan hosszabbnak találtuk N0 nyaki státusz, alacsony SPF és PF (poliploid frakció) esetén. Az áttét-mentes időt szintén alacsony SPF és PF érték mellett, valamint p53 negativitás esetén találtuk hosszabbnak. E faktorok vizsgálata a kezelés megkezdése előtt tehát hozzájárulhat egy tumor agresszivitásának megítéléséhez, így a megfelelő terápia megválasztásához.

151

A-431 laphámrák sejttenyészeten végzett in vitro kísérletek. Célkitűzés: annak vizsgálata, hogy a radio-monoterápia eredményességét lehet-e citosztatikummal (dibrómdulcit: DBD) kombinációban adva fokozni. Emellett vizsgáltuk az egyes kezelések hatását különböző onkoproteinek (p53, Rb, bcl-2, PCNA) expressziójára. Eredmények: A kezelések hatására tapasztalt sejtszám, AI és MI változások alapján úgy tűnik, a kombinált kezelések az önmagában alkalmazott irradiációnál hatékonyabbak voltak. Minden kezelési módot követően mind a p53, mind a Rb szintje megemelkedett, ami e fehérjék szerepét jelezheti besugárzás, valamint DBD által indukált apoptózisban és proliferáció gátlásban. A bcl-2 szintje nem változott kezelések hatására, a PCNA-szint nőtt. A fokozódás kompenzatórikus túlemelkedés eredménye lehet, és/vagy a megnövekedett repair funkciót jelezheti.

152

Summary The prognosis of squamous cell carcinoma of the head and neck region (larynx, hypopharynx, mesopharynx and oral cavity) is poor, especially when detected at an advanced stage. During the last few decades the incidence of these tumours is steadily increasing, mainly in Hungary. The prognostic and therapeutic importance of different pathological parameters was examined in head and neck cancers in the two following human clinicopathological and one in vitro studies. 1st human clinicopathological study. The primary therapy of head and neck cancers is surgery. If it cannot be done the second optional treatment is radiotherapy, but big individual differences may be in radiosensitivity of these tumours. Purpose of the study: Tissue samples were taken from head and neck cancer patients who got irradiation as the primary therapy. The first biopsy was performed before starting the treatment and apoptotic-index (AI), mitotic-index (MI), mutant p53 expression, ploidy and S-phase fraction (SPF) were determined in order to examine the prognostic value of these factors. An effort was made to find out whether it was possible to predict the radiosensitivity of individual tumours before starting any treatment. Re-biopsy was taken after the first 2 Gy fraction of irradiation, AI, MI and p53 positivity were re-determined. The prognostic and therapeutic importance of the inducibility of apoptosis, changes of mitosis-index and p53 expression were examined. Results: Higher MI value in the first tissue sample and its decrease after the first 2 Gy irradiation may point to a better response to therapy and relatively longer survival. Lower AI in the first tissue material, lower SPF and aneuploidy may be also favourable in terms of radiosensitivity of head and neck tumours. 2nd human clinicopathological study. Purpose of the study: Analysis of the prognostic significance of DNA-histogram parameters, mutant p53 expression and clinical parameters in patients with head and neck cancer regardless of mode of the therapy. Results: Significantly longer overall survival was found in patients with N0 neck status, low SPF and PF (polyploid fraction) values. The metastasis-free survival times were also longer in the cases of low SPF and PF and in p53-negative cases. In vitro study in A-431 squamous cell carcinoma cells. Purpose of the study was to examine the possibility of enhancing the cytostatic effect of irradiation in combination with a cytostatic drug (dibromodulcitol: DBD). The effect of different treatments on

153

expression of oncoproteins (p53, Rb, bcl-2, PCNA) was also determined. Results: Our data suggest that DBD may be considered a useful tool in combination therapy. The elevation of p53 and Rb expressions after different treatments may indicate the role of these proteins in apoptosis induced by irradiation or DBD treatment and in the inhibition of cell proliferation. The level of bcl-2 did not change, while the PCNA-level was increased after every therapeutic method comparing to control. It may represent a compensatory overshoot and/or indicate an elevated DNA repair function.

154