CLAUDINOK ÉS PROGNOSZTIKAI FAKTOROK VIZSGÁLATA EGYES GASTROINTESTINALIS BETEGSÉGEKBEN Doktori tézisek
Dr. Gyırffy Hajnalka Semmelweis Egyetem Patológiai Doktori Iskola
Témavezetı: Dr. Kiss András, PhD, Egyetemi docens Hivatalos bírálók: Dr. Simon Károly, PhD, Osztályvezetı fıorvos Dr. Szeberényi Júlia, PhD, Egyetemi tanársegéd Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Kovalszky Ilona, PhD, Egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Lengyel Gabriella, PhD, Egyetemi adjunktus Dr. Jäckel Márta, PhD, Osztályvezetı fıorvos
Budapest 2009
1. BEVEZETÉS A daganatos halálozások között, sajnálatosan, elıkelı helyet foglalnak el a gastrointestinum daganatai a világon, így az elsı tíz hely között – a vezetı tüdı-, ill. emlırák után – az emésztırendszeri tumorok állnak. Magyarországon a daganatok incidenciája és mortalitása különösen magas. Évente kb. 140 ezer rosszindulatú daganatot fedeznek fel, amely lényegesen több a nyugat-európai, de a környezı országok eseteinél is. 2007-ben, hazánkban több mint 260 ezer ember halálát okozta valamilyen daganatos betegség. A nyelıcsı adenocarcinoma praemalignus elváltozása a Barrett-metaplasia (BE), morbiditása 18 megbetegedés 100 ezer lakosra vetítve. A nyelıcsı rákok elsısorban férfiakat betegítenek meg, a nemzetközi halálozási statisztikák 11. helyén állnak. A nyelıcsı daganatainak mintegy 26%-a adenocarcinoma (ACC), amely a fejlett országokban az utóbbi évtizedekben növekvı incidenciát mutat. A gyomor intestinalis metaplasiája ugyancsak rákelıtti elváltozás. A vékonybelek hám-tumorai igen ritkák, csakúgy, mint a gastrointestinum falából kiinduló stroma daganatok (GIST). A coeliakia elıfordulása világszinten 1/200-300 fı, hazánkban 1%-ra tehetı, mely betegség sok éves fennállása során a béldaganatok, köztük lymphomák elıfordulási valószínőségét növelheti. Az emésztırendszer betegségeinek kialakulásával, progressziójával a hámsejtek morfológiája mellett a funkció is megváltozik. A kóros folyamatok során a sejtkapcsolatok is megváltoznak, így a tight junction (TJ), ill. az azt felépítı struktúrfehérjék eltérései mutathatók ki. A TJ gerincét alkotó claudin-fehérjék (CLDN) a különféle szövetekben, elsısorban a hámsejtekben, eltérı összetételben és eloszlásban helyezkednek el, ahogy azt az adott sejt elektromos rezisztenciában és paracelluláris transzportban felvállalt szerepük igényli. Jelenleg 24 CLDN típust különítenek el emberben, de bizonyos élılényekben akár 50 eltérı CLDN is elıfordulhat. A különféle funkciót ellátó hámokban eltérı a TJ CLDN összetétele. A sejtkapcsoló fehérjéknek igen fontos szerepük van a gyomor-bélrendszer hámsejtjeinek alapvetı mőködésében. Több kutatási eredmény utal arra – más szervrendszerekben is -, hogy bizonyos betegségekben, így daganatokban is különbözı típusú CLDN-ok eltérései láthatóak. A CLDN3 és 4 a receptora a Clostridium perfringens enterotoxinjának (CPE), mely a
2
sejteke lízisét okozhatja. Kísérletes eredmények arra engednek következtetni, hogy a CPE a daganatok célzott (target) terápiájában is szerephez juthat, sıt már bíztató klinikai kutatások is folynak ez irányban. Bizonyos betegségek, különösen a daganatok képzıdésének patomechanizmusa – az intenzív kutatások ellenére - sajnálatos módon számos részletében nem tisztázott. A karcinogenezisben a sejtkapcsolatoknak jelentıs szerepe van, melyre a számos adat utal. Különösen jelentıs lehet a sejtkapcsolatok megváltozása a gastrointestinalis rendszerben, ahol mind a barrier-képzésben, mind a permeabilitásban szerephez jutnak. A lágyrészek szöveteiben, daganataiban a sejtkapcsoló fehérjék kevéssé vizsgáltak. Erekben és éreredető tumorokban kimutatták a CLDN5 jelenlétét. Alacsonyan differenciált sarcomákban a claudin fehérjék jelenlétét, az epithelialis irányú differenciációval magyarázták. Mindezek alapján kezdtük vizsgálni az egyes TJ-fehérjéket, elsısorban a gerincet alkotó claudinok expressziójának változását a gastrointestinalis traktus hám és mesenchymalis lézióiban.
3
2. CÉLKITŐZÉS A
gastrintestinalis
rendszer
sejtkapcsolatainak
változása
döntı
az
egyes
megbetegedések kialakulásában és progressziójában. Feltételeztük, hogy a sejtkapcsolatok, kiemelten a tight junction gerincét képezı claudinok egyes típusai változó mértékben expresszálódnak az egyes nem daganatos és daganatos gastrointestinalis megbetegedésekben. Hipotézisünk szerint a claudin expresszió
változása
összefügg
a
megbetegedés
elırehaladott
voltával,
így
prognosztikus értékő. A fentiek igazolására a következı kérdésekre kerestük a válaszokat, ill. a következıket terveztük vizsgálni. 2.1. Barrett metaplasia (BE) és adenocarcinoma (ACC) 2.1.1. A különbözı claudinok expressziós mintázatát kívántuk meghatározni és ezek változásait BE-ban és ACC-ban, összehasonlítva azokat a normális foveoláris mirigyhámmal. 2.1.2. Claudinok expressziójának vizsgálata laphámcarcinomában (SQCC) és normális laphámban (SQ).
2.2. Intestinalis metaplasia (IM), vékony és vastagbél tumorok 2.2.1. Vizsgálni kívántuk, hogy az intestinalis irányú differenciálódásra (kehelysejtek megjelenése: intestinalis metaplasia, bélhám) milyen claudin fehérjék jellegzetesek, ezek milyen változásait találjuk a daganatokban a normál szövetekhez képest. 2.2.2. A dignitás terén eltérı tumorok összehasonlítása a vastagbélben.
2.3. Coeliakia 2.3.1. Claudinok expressziójának változása coeliakiában, normális vékonybélhámmal összehasonlítva. 2.3.2. A vékonybél biopsziás mintavétele helyének optimális meghatározása, a vizsgálati idı és a psychés terhelés csökkentésére. 2.3.2.1. A claudin expresszió jellegzetességeinek összehasonlítása a duodenum bulbusából és distalis területérıl származó minták esetén. 2.3.2.2. CD3-pozitív intraepithelialis lymphocyták számának meghatározása.
4
2.4. Gastrointestinalis stromális tumorok 2.4.1. Meg kívántuk határozni, hogy kimutathatóak-e claudinok a GIST-ban? Összehasonlításul bizonyos szövettani, ill. immunhisztokémiai jellemzıkben hasonlító angiosarcomát és leiomyosarcomát, valamint ezek jóindulatú formáit vizsgáltuk. 2.4.2. Vizsgálni kívántuk, hogy a különbözı dignitású daganatok különböznek-e egymástól claudin expresszió alapján? 2.4.3. Az Amerikai Hadsereg Pathológiai Intézetével (AFIP) kooperációban a duodenalis elhelyezkedéső lágyrész-daganatokat vizsgáltuk. A korábbi mőtéti preparátumoknál nem volt mindig egyértelmően eldönthetı, hogy leiomiogén daganatokról vagy valódi GIST-ekrıl van-e szó. Amióta a thyrozin kináz inhibitor gyógyszer, az Imatinib (Gleevec, Glivec, Novartis, Basel, Svájc) elérhetı a terápia részére, fontosnak tartották újraértékelni a már egyszer diagnosztizált gastrointestinalis „stromalis” daganatokat. Az anyag-győjtésben, feldolgozásban és az adatok kiértékelésében vettünk részt. 2.4.3.1.GIST-ek elıfordulási arányának, prognózisának meghatározása. 2.4.3.2. c-Kit mutáció kimutatása.
5
3. ANYAG ÉS MÓDSZER 3.1. Vizsgálati anyag A felhasznált vizsgálati anyagokat az alábbi táblázatban összesítettük. Minta
Esetszám
életévek
Átlagéletkor (év)
SQCC3,4,6
25
48-75
60,6
ACC3,4,6
25
46-63
52
BE3,4,6
25
58-67
63,2
Kontroll3,4,6
25+25
15-75
55,4
IM3,4,6
5
61-84
70,6
5
48-78
60,8
15
51-80
65,3
20
49-84
66,7
Coeliakia5
33
2-17
6,4
Kontroll
14
17-29
22,6
GIST1,2
13
46-80
67,6
LS1
12
27-49
48,2
(n=35)
AS1
10
27-95
65,8
GIST (AFIP)
GIST7
156
10-88
56
Tanulmány Barrett oesophagus – adenocarcinoma – laphámcarcinoma (n=125)
Intestinalis metaplasia – vékony és vastagbéldaganatok (n=45)
Coeliakia (n=47)
GIST, angiosarcoma, leiomyosarcoma
(n=156)
Vékonybél ACC3,4,6 Vastagbél ACC3,4,6 Vastagbél adenoma3,4,6
SQCC=laphámcarcinoma, ACC=adenocarcinoma, BE= Barrett-oesophagus, IM=intestinalis metaplasia, GIST=Gastrointestinalis stromalis tumor, LS=leiomyosarcoma, AS= angiosarcoma Mintáinkat a Semmelweis Egyetem II. Pathológiai Intézetének archívuma, a Országos Onkológiai Intézet1 és az Állami Egészségügyi Központ Pathológiai Osztálya2 szolgáltatta. Együttmőködı partnereink a SE, I. Belgyógyászati Klinika3, I. Sebészeti Klinika4, SE, I.sz Gyermekgyógyászati Klinikája5, Ferencvárosi Egészségügyi Központ6, az AFIP Lágyrészpathológiai Osztálya7 voltak.
6
3.2. Módszerek
3.2.1. Hisztológia, hisztokémia Az eltávolított szövetmintákat 4%-os pufferolt formalinban fixáltuk 24 órán át, majd paraffinba ágyaztuk. A 3-4 µm vékonyságú metszeteken haematoxylin-eosin (HE) festést, és bizonyos esetekben (BE és IM) alciánkék - perjódsav-Schiff (PAS) reakciót végeztünk. GIST-oknál az AFIP szövettani laboratóriumában elkészült HE metszeteken a morfológia, kiterjedés, metasztázisok mellett a 50 nagy nagyítású látótérben (HPF) a mitózisok számát értékelték. A tumor méret és a mitózisok száma alapján 6 prognosztikai csoportba kerültek a GIST-ek.
3.2.2. Immunhisztokémia Az immunhisztokémiai vizsgálatokra paraffinos mintákat használtunk. Az CLDN 2, 4 és 5 ellenes antitestek monoklonálisak, a CLDN 1, 3 és 7 elleni antitestek poliklonálisak, nyúl szérumból kerültek izolálásra. Az immunhisztokémiai vizsgálatokat 3-5 µm vastag metszeteken végeztük. Antigén feltárás után a metszeteket különbözı hígítású elsıdleges antitesttel inkubáltuk. A reakció láthatóvá tétele standard avidinbiotin peroxidáz technikán alapult (ABC rendszer), kromogénként diaminobenzidint (DAB) használtunk. Valamennyi immunhisztokémiai vizsgálatot a Ventana ES immunfestı automatájával végeztük (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, AZ, USA). A pozitív sejteket 10 véletlenszerően kiválasztott látótérben számoltuk, 100-100 sejtet vizsgáltunk 20x-os nagyítású objektívvel. A standard értékeléshez pontrendszert készítettünk: 5 = 80-100%, 4 = 60-80%, 3 = 40-60%, 2 = 20-40%, 1 = 5-20%, 0 = <5%-nyi sejtet találtunk pozitívnak. A CD3 ellenes antitest reakció esetén az antigén-feltárás megegyezik a fentebb leírtakkal, az elsıdleges antitest eltérı gyártmány. A pozitív sejtek százalékos arányát határoztuk meg három látótérben, ezeknek számtani átlagát vettük számításba. Az értékelés a bolyhok felszínén látható sejtek között történt, olyan módon, hogy a bolyhokat fordított „U”-ként felfogva, a számolást csupán az összekötı száron végeztük. Statisztikai értékelés: Shapiro-Wilk W-teszt, Mann-Withney féle U-teszt, KruskalWallis teszt.
7
CD117 (c-Kit). A feltárás után az elsıdleges antitest hígítás 1:600 volt. A láthatóvá tétel a claudinoknál részletezettekkel egyezik. Csak olyan GIST-okat vettünk figyelembe, ahol a c-Kit reakció pozitív volt. Jelen vizsgálatban a leiomyosarcoma és angiosarcoma c-Kit immunhisztokémiai vizsgálata történt meg. GIST-oknál az AFIP laboratóriumában az immunhisztokémiai vizsgálat 113 GISTbıl és 10 simaizom-daganatból készült. C-Kit (CD117), CD34, α-simaizom aktin, desmin, CK7, CK18, CK19, neurofilament 68 (NF68), glialis fibrillaris savanyú protein (GFAP) és S100 reakciók kerültek elvégzésre. A statisztikai analízis a Statview statistical software (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA) segítségével készült.
3.2.3. Immunfluoreszcens vizsgálat GIST, AS, LS esetén a reakció helyének pontos megjelenítésére CLDN2 és CLDN5 immunfluoreszcens vizsgálatot végeztünk 10 µm vastag paraffinos blokkokból származó metszeteken. Az antigén-feltárást a fentebb leírtakkal egyezik meg. A metszeteket
az
elsıdleges
monoklonális
antitesttel
inkubáltuk.
Másodlagos
ellenanyagként IgG-konjugált, anti-egér Alexafluor 488-t használtunk. A magok háttérfestését és fedését DAPI-t tartalmazó fedı médiummal végeztük. Az így elkészített lemezeket lézer scanning konfokális mikroszkóppal értékeltük (Nikon Eclipse E800 mikroszkóp; BioRad Radiance 100 Laser scanning System és BioRad Lasersharp 2000 szoftver).
3.2.4. mRNS expresszió vizsgálata BE, ACC és FOV esetén CLDN 2, CLDN 3, CLDN 4, CLDN5 és GAPDH mRNS kimutatás valós idejő RT-PCR vizsgálattal: 1. Szövetminták: 10-10 paraffinba ágyazott ACC, BE, és FOV mintát választottunk ki. 2. RNS izolálás: A formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetmintákból a teljes RNSizolálása a High Pure RNA Paraffin Kit-tel (Roche, Indianapolis, IN, USA) történt. A kivágott minták méretétıl függıen 2-5 darab 5-5 µm vastag metszeteket tettünk Eppendorf-csıbe minden egyes blokkból. BE és FOV esetében mikrodisszekció is történt a specializált intestinalis metaplasia ill. a hengerhámsejtek pontosabb kimutatására. 16 órán át Proteinase K-val emésztettük a mintákat. Valamennyi tisztítás a gyártói protokoll szerint zajlott. Felhasználásig az RNS-t mínusz 80oC-on tároltunk.
8
3. Ahhoz, hogy a paraffinos mintákon megbízhatóan PCR vizsgálatokat végezzünk, egy korábbi vizsgálat során 6 különbözı hosszúságú amplikont elemeztünk 6 primer-pár segítségével. Az optimális méret 100-200 bázispár között mozgott. 4. Az RNS átírása cDNS-re: A teljes RNS mennyiséget (500ng) 42oC-on 50 perc alatt írtuk át cDNS-sé random hexamereket felhasználva a MulV reverse transcriptase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével, RNase-inhibitor (Applied Biosystems) jelenlétében. 5. Kvantitatív valósidejő RT-PCR: A reakciót 2 µl cDNS-templáttal (teljes volumen 25 µl) végeztük ABI Prism 7000 szekvencia detektáló rendszerrel (Applied Biosystems). Az összes PCR SYBRGreen alapú Mastermix-ben (Bio-Rad, Hercules, CA, USA, 1708851) zajlott. A primer szekvenciákat az alábbi táblázatban részleteztük.
CLDN2 GI:9966780 CLDN3 GI:21536298 CLDN4 GI:14790131 CLDN5 GI: 38570041 GAPDH GI:7669491 β-actin GI:15928802
forward 5'-CTCCCTGGCCTGCATTATCTC-3' (273-293)
reverse 5'-ACCTGCTACCGCCACTCTGT-3' (344-363)
5'-CTGCTCTGCTGCTCGTGTCC-3' (732-751) 5'-GGCTGCTTTGCTGCAACTGTC-3' (741-761)
5'-TTAGACGTAGTCCTTGCGTCGTAG-3' (836860) 5'-GAGCCGTGGCACCTTACACG-3' (829-848)
5’-TTCCTGAAGTGGTGTCACCTGAAC-3’ (93116) 5' -CATTGACCTCAACTACATGG-3' (186-205)
5’-TGGCAGCTCTCAATCTTCACAG-3’ (169190) 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (287-306)
5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’ (1031-1048)
5’-GGGCCGGACTCGTCATAC-3’ (1157-1174)
Kvantitatív valósidejő RT-PCR-hoz felhasznált primer szekvenciák. CLDN=claudin, GAPDH= gliceril-aldehid 3-foszfát dehiderogenáz.
A munkamenet a következı volt: Kezdeti denaturálás 95°C – 2’; denaturálás 95°C – 20”; primer kötıdés 63°C - 30”; szintézis 72°C - 60”. Az utóbbi három folyamatot 40szer ismételtük. A termék homogenitásának ellenırzésére olvadáspont analízist végeztünk 55°C - 95°C-on, mely a termékek homogenitását és a primer specifikus kötıdését is alátámasztotta. A mérések 96-os plate-ekben, duplikátumokban történtek a kontroll génekkel párhuzamosan futtatott reakcióban. A PCR termékek méretének ellenırzésére a reakció termékekbıl 10 µl-t futtattunk 2%-os agaróz gélen, majd etídium-bromidos festéssel tettük láthatóvá az amplikonokat. A valós idejő PCR adatok értékelése
és
statisztikai
elemzése
REST
expressziós
szoftverrel
készült
(www.wzw.tum.de/gene-quantification), a GAPDH és ß-actin volt a referenciagén.
9
A GIST-angiosarcoma-leiomyosarcoma mintáinkon a RT-PCR hasonlóan zajlott; CLDN2 és a CLDN5 mRNS expresszióját vizsgáltuk. Referenciagénként GAPDH-t (amplikonhossz 97) használtunk. A primer szekvenciák a fenti táblázatban láthatóak. GIST (AFIP). Molekulár-genetikai vizsgálat történt az AFIP laboratóriumában 30 olyan esetbıl, ahol a c-Kit (CD117) reakció pozitív volt. A c-Kit exon 9, 11, 13 és 17 mutációk kimutatása történt PCR reakcióval és direkt szekvenálással.
10
4. EREDMÉNYEK 4.1. Barrett oesophagus 4.1.1. A BE claudin expressziós mintázata a kontrollként alkalmazott foveoláris hámtól (FOV) eltér, mivel a FOV sejtjei nem adtak CLDN2 és 3 immunhisztokémiai reakciót. A BE mRNS szinten tartalmazott CLDN2-t, mely fehérjeszinten nem volt kimutatható. A CLDN3 már fehérjeszinten is detektálható volt. A nyelıcsı ACC-ja viszont mind CLDN2-t, mind CLDN3-at expresszált fehérjeszinten is. A CLDN1 és 7 immunhisztokémiai reakció pozitív volt, de nem mutatott szignifikáns különbséget a FOV, BE és ACC között. 4.1.2. A laphám szöveteket összehasonlítva a laphámcarcinoma szignifikánsan magasabb CLDN1 expressziót mutatott. CLDN2 és 3 expresszió alig, ill. nem mutatható ki; CLDN4 és 7 azonban kifejezetten expresszálódott, de nem volt statisztikai különbség a normális laphám és carcinoma között.
4.2. Intestinalis metaplasia (IM), vékony és vastagbél tumorok 4.2.1. A CLDN2 mutatta a legmarkánsabb eredményeket. Az IM, a vékonybél kontroll-szövetek - a korábban vizsgált BE-hoz hasonlóan - alacsony mértékben expresszáltak CLDN2-t, míg a vékonybél ACC-k, ill. vastagbél daganatai esetén kifejezett CLDN2-expressziót találtunk. A vastagbél normál hámja nagyobb mennyiségő CLDN2-t és 3-at expresszál, mint az IM, ill. a vékonybél normális hámja, de nem olyan mértékben, mint a bél-tumorok. A CLDN3-eredmények követik a CLDN2-vel találtakat. CLDN4, 7 esetén nem volt szignifikáns különbség a vizsgált minták közt. Az antrum FOV, pedig - a már korábban értékelt - cardialis foveolaris hámmal megegyezı claudin-mintázatot mutatott. 4.2.2. A normál vékonybélhámmal összehasonlítva a vékonybél adenocarcinomát, fokozott CLDN2 és 3 expressziót kaptunk. A vastagbél adenoma és adenocarcinoma csak CLDN2 expresszióban mutatott szignifikáns eltérést a kontrollhoz képest. Az vastagbél adenoma és a ACC-k között nem tehetı különbség a claudin expressziójuk alapján.
11
4.3. Coeliakia 4.3.1. A claudinok expressziós mintázata eltérı volt a coeliakiában a kontroll szövetekhez képest. Szignifikánsan emelkedett CLDN2 és CLDN3 expressziót találtunk coeliakiában, míg a CLDN4 nem változott érdemben. 4.3.2. Eredményeinket a lokalizáció szempontjából kiértékelve, azt találtunk, hogy a distalis duodenum a megfelelı hely a biopsziás mintavételre. 4.3.2.1. A CLDN2 és 3 expresszió valamennyi coaliakiás esetben a distalis duodenumban mutatott szignifikánsan fokozott expressziót a kontroll esetekhez hasonlítva. 4.3.2.2. A CD3 pozitív intraepithelialis lymphocyták (IEL) számának szignifikáns
emelkedését
találtuk
coeliakiás
betegekben.
Az
intraepithelialis
lymphocyták számát tekintve szignifikáns eltérést nem találtunk a két mintvételi hely között, de a lymphocyták számának emelkedı tendenciáját észleltük a distalis duodenumban.
4.4. Gastrointestinalis stromalis tumorok 4.4.1. Az összehasonlított lágyrész-daganatok több féle claudint expresszáltak. CLDN1 kizárólag leiomyosarcomában volt kimutatható. CLDN2 valamennyi tumorban megjelent. A leiomyomák csupán CLDN2-t expresszálnak. CLDN5 expresszió legkifejezettebben az érdaganatokban jelent meg, szignifikáns különbséget találtunk az angiosarcoma és leiomyosarcoma, ill. GIST között. A leiomyosarcomában és GIST-ban CLDN2, 3, 4, 5 és 7 is elıfordult. CLDN2 immunfluoreszcens reakcióval intracelluláris elhelyezkedést mutattuk ki a GIST-ban és leiomyosarcomában, de angiosarcomában a granuláris jelleg mellett a plasma membrán közelébe lokalizálódó reakciót kaptunk. CLDN5 reakció minden tumorban a sejmembránhoz kötött, lineáris volt. CLDN2 és 5 esetében mRNS-expressziót is kimutattunk. 4.4.2. A különbözı dignitású daganatoknál a leiomiogén tumorok mutattak eltérést, mely szerint a jóindulatú formában csupán CLDN2-t tudtunk kimutatni, míg a sarcoma CLDN1, 2, 3 , 4, 5 és 7 expressziót is mutat. Az angiogén daganatoknál dignitástól függetlenül CLDN2-t és 5-öt expresszáltak. Az angiosarcomában a CLDN5 erıteljes expressziót mutatott, a haemangiomában
12
alacsonyabbat, de nem szignifikánsan különbözıt. CLDN2 expresszió viszont az angiosarcomában volt gyengébb, mint a haemangiomában. 4.4.3. GIST (AFIP) 4.4.3.1. A vizsgált 167 tumor közül 156 GIST-nek bizonyult a c-Kit reakció pozitivitásra alapozva. A méreteket és az osztódási potenciált figyelembe véve rosszabb prognózisúak, így kedvezıtlen túlélési adatokat mutatnak azok a stroma-tumorok, ahol a méretek nagyobbak és 5/50hpf (=nagy nagyítású látótér) feletti osztódó alakot találtunk. Szignifikáns rizikófaktor a fentiek mellett a koagulációs nekrózis, az epitheloid sejtalakok, a hyalinos ér-occlusio és a mucosa infiltrációja is. 4.4.3.2. Az értékelt GIST-ek 43%-ában c-Kit – exon 9 és 11 - mutációt igazoltak az AFIP laboratóriumában.
13
5. ÚJ MEGÁLLAPÍTÁSOK 5.1. Barrett oesophagus – Adenocarcinoma: 5.1.1. A normál foveoláris hámhoz képest a Barrett-metaplasia fokozott CLDN2 és CLDN3 expressziót mutatott. A Barrett-metaplasiában a CLDN2 csupán mRNS szinten expresszálódott. 5.1.2. A nyelıcsı adenocarcinomája mind a foveoláris hámhoz, mind a Barrettmetaplasiához képest emelkedett CLDN2-t és CLDN3-at expresszált fehérje és mRNS szinten.
5.2. Coeliakia 5.2.1.
Coeliakiás
betegek
vékonybél
hámjában,
melyben
gyulladásos
és
regenerációs kórfolyamatok is jelen vannak, a kontroll szövetekhez képest szignifikánsan emelkedett a CLDN2 expressziót detektáltunk. 5.2.2. Immunhisztokémiai eredményeink alapján meghatároztuk, hogy a disztális duodenumban szignifikánsan magasabb a CLDN2 és 3 expressziója, mint a bulbusban. Ez arra enged következtetni, hogy a vékonybél boholyatrophiákban a distalis duodenum a megfelelıbb célpont a mintavételezésre, a biztos diagnózis és súlyosság meghatározására.
5.3. Gastrointestinalis stromalis tumorok 5.3.1. A vizsgált lágyrész-daganatok több claudint változó erısséggel expresszálnak. 5.3.2. CLDN2 a jó és rosszindulatú ér és simaizom-tumorokban és a GIST-ben is jelen van. 5.3.3. A GIST-ok CLDN 2, 3, 4, 5 és 7 is elıfordult. 5.3.4. Az angiogén tumorok dignitástól függetlenül CLDN2-t és 5-öt expresszálnak. 5.3.5. Leiomyomában csupán CLDN2-t tudtunk kimutatni, a leiomyosarcoma ellenben CLDN1, 2, 3, 4, 5 és 7-et is expresszált, ha kis mennyiségben is. 5.3.6. Immunfluoreszcens reakcióval a CLDN2 intracelluláris elhelyezkedést mutattuk ki a GIST-ban és leiomyosarcomában, de angiosarcomában a granuláris jelleg mellett a plasma membrán közelébe lokalizálódó reakciót kaptunk. CLDN5 reakció minden tumorban a sejmembránhoz kötött, lineáris volt.
14
6. KÖVETKEZTETÉSEK 6.1. Barrett metaplasiában és nyelıcsı adenocarcinomában – elsıként kimutatott fokozott CLDN2 mRNS- és CLDN3 fehérje és mRNS expresszió a két elváltozás közötti összefüggésérıl szóló elméletet támasztja alá. Az eredmények demonstrálják, hogy a Barrett metaplasia és a foveolaris hám eltérései a TJ molekuláris megváltozásával járnak és feltételezhetıen a hám dysplasiás, daganatos elváltozásaiban szerepük van.
6.2. Elsıként igazoltuk, hogy coeliakiában a CLDN2 expressziója fokozott a normális hámhoz képest. A disztális duodenumban szignifikánsan fokozottabbak a CLDN2 és 3 expresszió eltérései a bulbushoz és a normális kontrollhoz képest. Ennek és a disztális duodenumban az hámon belüli lymphocyták számának emelkedı tendenciája alapján biopszia vételének optimális helye is a mély duodenumban jelölhetı ki.
6.3. Az antrum és a korábban vizsgált cardia foveolaris hámjának CLDN mintázata hasonló, nem expresszál CLDN2-t. A gyomor intestinalis metaplasiája és a vékonybél hámja hasonlóan viselkedik a Barrett oesophagus intestinalis metaplasiájához, miszerint a foveoláris hámhoz képest fokozott CLDN2-t és 3-at expresszál. Az intestinalis metaplasiákban és a vékonybél normális hámjában észlelt claudin expressziós jellegzetességek felvetik a CLDN 2 és
3 szerepét az intestinalis irányú
differenciálódásban.
6.4. A lágyrésztumorok és GIST több féle claudin-fehérjét tartalmaznak és ezen claudin rajzolat jellemzı a vizsgált lágyrész tumorokra. A GIST és LS CLDN expressziós mintázatának hasonlósága a két daganat közötti hisztogenetikai kapcsolatot veti fel. A különbözı dignitású angiogén és leiomyogén daganatok között különbség tehetı a claudin-expressziós mintázatuk alapján is.
15
7. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
Megjelent közlemények impakt faktora összesen: 11,962 Független idézettségük: 87 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke: IF: 8,031 Független idézettségük: 86
Gyırffy H*, Holczbauer Á*, Nagy P, Szabó Zs, Kupcsulik P, Páska Cs, Papp J, Schaff Zs, Kiss A. Claudin expression in Barrett’s esophagus and adenocarcinoma. Virchows Arch (2005) 447: 961–968 IF: 2,224 Miettinen M, Kopczynski J, Markhlouf HR, Sarlomo-Rikala M, Gyırffy H, Burke A, Sobin L, Lasota J. Gastrointestinal stromal tumors, intramural leiomyomas, and leiomyosarcomas in the duodenum: A clinicopathologic, immunohistochemical, and molecular genetic study of 167 cases. Am J Surg Pathol 27(5): 625-641, 2003 IF: 4,535 Hritz I, Gyorffy H, Molnar B, Lakatos G, Sipos F, Pregun I, Juhasz M, Pronai L, Schaff Z, Tulassay Z, Herszenyi L. Increased p53 Expression in the Malignant Transformation of Barrett's Esophagus is Accompanied by an Upward Shift of the Proliferative Compartment. Pathol Oncol Res. 2008 Aug 28. [Epub ahead of print] IF: 1,272 Nagy Szakal D, Gyırffy H, Tokes AM, Arato A, Dezsofi A, Veres G. Claudin 2, 3 és 4 expressziója coeliakiás gyermekek proximális és disztális duodenumában. Gyermekgyógyászat 2008; 59: 5. szám 272-276 Buzás Gy, Gyırffy H, Csörget T. Barrett-nyelıcsı és colonadenoma kapcsolata. Orv Hetil 2002 Jun 9;143(23):1423-5.
16
Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: IF: 3,931 Buzás GyM, Illyés Gy, Gyırffy H, Jeney Cs, Herold L, Tóth B. A Controloc gyorsteszt és a polimeráz láncreakció értékelése a Helicobacter pylori fertızés eradikáció elıtti diagnózisában. Magyar Belorvosi Archivum 53, 2000, 156-160. Buzas GyM, Gyorffy H, Szeles I, Szentmihályi A. Second-Line and Third-Line Trial for Helicobacter pylori Infection in Patients with Duodenal Ulcers: A Prospective, Crossover, Controlled Study. Current Therapeutic Research. 2004; Vol 65, No1, 13-25 IF: 0.324 Gyırffy H, Zsirka-Klein A, Gyökeres T, Kádár P, Kaszás I, Kovács M. Pancreas pseudocyst vagy metasztázis? Orv Hetil. 2005 Oct 23;146(43):2223-6. Lukovich P, Papp A, Fuszek P, Glasz T, Gyorffy H, Lakatos LP, Harsányi L. A duodenum Crohn-betegsége, klinikai jelek, diagnosztika, gyógyszeres és sebészi kezelés. Orv Hetil. 2008 Mar 16;149(11):505-8. Pintér VP, Gyırffy H, Arató A, Dezsıfi A, Molnár K, Veres G. Eosinophil – és allergiás colitises csecsemık laboratóriumi és kolonoszkópiás jellemzıi. Gyermekgyógyászat 2008; 59: 5. szám 291-295 Németh Z, Szász AM, Tátrai P, Németh J, Gyorffy H, Somorácz A, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z. Claudin-1, -2, -3, -4, -7, -8, and -10 Protein Expression in Biliary Tract Cancers. J Histochem Cytochem. 2009 Feb;57(2):113-21. IF: 2,335 Németh Z, Szász AM, Somorácz A, Tátrai P, Németh J, Gyırffy H, Szíjártó A, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z. Zonula Occludens-1, Occludin, and E-cadherin Protein Expression in Biliary Tract Cancers. Pathol Oncol Res. 2009 Feb 2. [Epub ahead of print] IF: 1,272 Az értekezéssel összefüggı, lektorált folyóiratban megjelent, idézhetı abstractok: GyorffyH, Holczbauer A, Kiss A, Nagy P, Kupcsulik P, Paska Cs, Szabo Zs, Schaff Zs. Claudins in esophageal neoplasms and Barrett’s esophagus. 20th European Congress of Pathology, Paris, France. Abstract in Virchows Arch. (2005) 447: O-73
17
Az értekezéssel összefüggı, nem idézhetı abstractok: GyorffyH, Holczbauer A, Kiss A, Nagy P, Kupcsulik P, Paska Cs, Szabo Zs, Schaff Zs. Claudins in esophageal neoplasms and Barrett’s esophagus.149. FALK symposium Berlin 2005. Gyorffy H, Holczbauer A, Kiss A, Nagy P, Kupcsulik P, Paska Cs, Szabo Zs, Schaff Zs. Claudinok vizsgálata nyelıcsı-daganatokban és Barrett metapláziában. 65. MPT Kongresszus, Pécs, 2005. Gyorffy H, Nagy Szakal D, Tokes AM, Arato A, Dezsofi A, Veres G Claudin 2, 3 és 4 expressziója coeliakiás gyermekek proximális és disztális duodenumában. 67. MPT kongresszus, Keszthely, 2008.
Egyéb kutatási témákból, lektorált folyóiratban megjelent, idézhetı abstractok: Sipos B, Járay B, Gyırffy H, Harsányi L. Immunohistochemical detection of p53, c-erb-B2 and Ki67 in cystic mucinous tumours of pancreas. XXIst. World Congress of the IAP, presentation. Cit in Pathology International Vol 46 Suppl 1, 1996, A522. Gyırffy H, Jäckel M, Várkonyi I: Idiopathic arterial and mesenchymal calcification of infancy (poster). XXII Congress of the International Academy of Pathology and 13th World Congress of Academic and Enviromental Pathology. Cit in Arch Anat Cytol Path Clin Exp Path Vol 46, 1998, No.5-6, A188 Gyırffy H., Járay B., Harsányi L. Morphological and immunohistochemical examination of preblastomatic lesions of the pancreas (poster). European Congress of the International Hepato-Pancreato-Biliary Association. Cit in Dig Surg 1999; 16 (suppl):107 Buzás Gy, Illyés Gy, Gyırffy H, Tóth B. Performance of controloc rapid urease test in the pre-treatment diagnosis of Helicobacter pylori infection. XIIIth International Workshop on Gastroduodenal Pathology and Helicobacter pylori. Cit in Gut, 44, 2000. S1, A Gyırffy H, Lukovich P, Lódi Cs, Illyés Gy. Prognostic markers in bile duct and gallbladder cancer. XXIV. International Congress of IAP. Cit in Histopathology, 2002, 41, Supplement 1, O.08.324 Lukovich P, Gyırffy H, Kárteszi H, Illyés Gy, Kupcsulik P. Survival of the patients with resectable hilar cholangiocarcinoma. The 102nd Annual Congress of Japan Surgical Society. Cit in Nippon Geka Gakkai Zasshi. 2002 Mar;3 Suppl:1-732. J. Kulka, E. Szekely, H. Gyırffy, M. Kovacs, Z. Rusz, F. Perner, P. Lukovich and M. Dank. Angiosarcoma of the breast: a propos three cases.
18
Cit in European Journal of Cancer Supplements, Volume 2, Issue 3, March 2004, Page 144 Lukovits P, Gyırffy H, Kárteszi H, Kupcsulik P. Pitfalls of the diagnosis of the Klatskin tumour. Congress of the Society of Hungarian Gastroenterologists. Cit in Z Gastroenterol 2001; 39: 106 Lukovich P, Bodoky Gy, Kupcsulik P, Gyırffy H. Oncology of hilar chloangiocellular carcinoma. Magyar onkológusok Társasága II. Kongresszusa. Magyar Onkológia 2002; 46(1):12 Buzás GyM, Illyés Gy, Gyırffy H, Széles I. Second line treatment of H. Pylory infection (Hp) in duodenal ulcer (DU) patients. 44th Annual meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology. Cit in Z Gastroenterol 2002; 40: 327-369
Egyéb kutatási témákból, nem idézhetı abstractok: Gyırffy H, Zsikla V, Járay B. A pancreas kevert exocrin-endocrin tumora. MPT Kongresszus. Lillafüred, 1997. Gyırffy H: A pancreas praecancerosus elváltozásainak morphologiája és histochaemiája. Fiatal Pathológusok Fóruma. Budapest, 1998. Gyırffy H, Jäckel M, Várkonyi I: Idiopathiás csecsemıkori arteriás mesenchymalis calcificatio. MPT Kongresszus, Gyula, 1998. Gyırffy H, Jackel M, Várkonyi I. Idiopathic arterial and mesenchymal calcification of infancy (poster). 2nd Conference of the International Group for Prevention of Atherosclerosis in Childhood, Budapest, 1998. Gyırffy H., Illyés Gy., Buzás Gy., Singer J. A gyulladás fokozza a hámproliferációt, a Helicobacter pylori az apoptosist. MPT Kongresszus, Sopron, 1999. Buzás GyM, Gyırffy H, Janka M. Blastocystis hominis fertızés. MGT Kongresszus. Endoscopos szekció. Szeged, 2000. Gyırffy H, Lukovits P, Lódi Cs, Illyés Gy. Epeúti tumorok. Öt év tapasztalatai. Fiatal Onkológusok Találkozója, Pécs, 2001. Gyırffy H, Lukovits P, Lódi Cs, Illyés Gy. Epeúti tumorok. MPT Kongresszus. Kaposvár, 2001. Lukovich P, Kupcsulik P, Gyırffy H, Kárteszi H, Illyés Gy. Age and late complications of patients underwent resection of Klatskin tumour. Society of Hungarian Surgeons. 56th International Congress, Budapest, 2002.
19
Gyırffy H, Járay B, Székely E. Cytopathology of pancreatic intraepithelial neoplasias. European Congress of Cytology, Prague, 2003. Halász J, Gyırffy H, Illyés Gy, Kálmán A, Verebély T, Kulka J. Újszülöttek gyomor teratómája. MPT Kongresszus, Balatonfüred, 2007 Gyırffy H. Sebaceous carcinoma, aggressive periocular variant. 47th EOPS meeting, June 2008, Besancon, France
20
