Produkce alergenů a přenos mikroorganismů skladištními roztoči – riziko pro spotřebitele Výzkumný ústav rostlinné výroby Oddělení ochrany zásob a bezpečnosti skladovaných produktů Jan Hubert, Ph.D. Tel: +420 233 022 265 E-mail:
[email protected]
Roztoči • 45,000 druhů popsáno; 540,000-1,132,000 odhadováno • Astigmata 28 miliónů let, příbuznost Oribatida (373-379 mil.) • Synantropní roztoči (skladištní a prachoví) nadčeledi Glycipahgoidea (asociovaný se savci), Acaroidea (asociovaný savci/ptáci) a Analgoidea (ptáci).
Cesta k synantropii • Oribatida – půdní pancířníci – dekompoziční procesy v půdě • Pyroglyphidae asociace s hnízdy ptáků, Afrika vysoká diverzita druhů, • Glycypahgoidea (asociovaný se savci), Acaroidea (asociovaný savci/ptáci)
Půda/rostlinný opad
Hnízda ptáků/savců
Hnízda člověka
Prach domácností Skladované zásoby
Prachoví versus skladištní Glycyphagoidea
Chortoglyphidae Echimyopodida Glycyphagidae
Acaroidea
Lardoglyphidae Suidasiidae Acaridae
Hemisarcoptoidea Analgoidea
Carpoglyphidae Pyroglyphidae
Chortoglyphus Blomia Goiheria, Glycyphagus, Lepidoglyphus Lardoglyphus Suidasia Acarus, Tyrophagus, Aleuroglyphus, Sancassania Carpoglyphus Dermatophagoides, Euroglyphus
Sušené ovoce Sušené ovoce
n
Kontam. (%)
N (jedinci)
Meruňky
30
36
Datle
30
Fíky
N (jedinci.g-1) Prů.
Max.
Min.
93,440
104
650
0
0
nd.
nd.
nd.
nd.
30
12
2,926
28
89
0
Švestky
30
16
23,163
100
663
0
Ananas
30
2
57
3
nd.
nd.
Hrozinky
30
6
6
0
0
0
Konzumujeme roztoče v rozporu s legislativou Codex Alimentarius
Laboratorní pokus s růstem roztočů na sušeném ovoci v optimálních podmínkách 1,000,000
Fíky Sušený ananas
log N (jedinci)
100,000
Datle Švestky Meruňky
10,000
Hrozinky 1,000
100
10 0
21
28
35
42
49
56
63
70
Doba růstu roztočů (dny)
77
84
91
Počet napadených balení
Pronikání roztočů do nenapadeného a zabaleného sušeného ovoce 4
plastikový obal polypropylénový obal
3
celofánový obal 2
polypropylénový obal s hliníkovou folií
1 0 1
3
Doba experimentu (měsíce)
6
Sýry - v bývalém Československu 60 léta: 70% napadených provozů (N=36), nejčastější druhy Acarus siro a Tyrophgaus putrescentiae, další doprovodné druhy Glycyphagus domesticus, Carpoglyphus lactis and Tyrolichus casei (Pulpan and Verner 1965). -v současné době nejsou známo v ČR napadení - problém speciálních dlouho zrajících sýrů v Turecku (cheese Surk) , Španělsku (Asturian Cabrales Cheese), (Sanchez-Ramos et al. 2007; Sanchez-Ramos and Castanera 2007, Aygun et al. 2007).
Masné výrobky - Bývalé Československo, cca 5% roztoči napadenýchvzorků z mastného průmyslu (Verner 1986), dominatní druhy Lepidoglyphus destructor a Gohieria fusca. - V současnosti, žádné informace o infestacích roztoči, výjimka „španělské“ šunka –napadená roztočem Tyrophagus putrescentiae. Napadení způsobuje změnu vůně šunky – asociace s bakteriemi?
Sušené ryby
Prokázáno v Polsku, v ČR?
Lardoglyphus konoi
Mouka - Rostock (Německo) – kazuistika -průjmové onemocnění dětí –průzkum potravin v kuchyni – napadení mouky Acarus siro (Steinbrink & Boer 1984). - Nová Zéland 7% roztoči napadených vzorků mouky (N=54), vzorky byly skladovány v domácnosti (Cotter et al. 2011), napadeno Thyreophagus entomophagus a Tyrophagus communis. - Japonsko (viz. tabulka) (Matsumoto et al. 2001) Druh Tyrophagus putrerscentiae Dermatophagoides fariane Suidasia nesbiti Ascidae spp.
N (30) 2 2 1 1
Pochází napadení ze zpracovatelského průmyslu nebo je mouka napadena v domácnostech ?
Potrava domácích mazlíčků
velikost populace (jedinci)
Růst Tyrophagus putrescentiae na krmivu pro domácí mazlíčky 100,000,000 10,000,000 1,000,000 100,000 10,000 1,000 100
chovná dieta krmivo
10 1 0
20
40
60
Čas (dny) krmivo pro domácí mazlíčky může být zdrojem roztočů
80
Alergeny a alergie na roztoče
Proč se o tom bavit • Alergické onemocnění, jako je astma, rhinitis, ekzémy a potravní alergie dosahují epidemického výskytu ve vyvinutých i rozvojových zemích. • Klíčovými faktory jsou vzrůst expozice a vnímatelnosti na alergeny a pokles stimulačních podnětů imunitního systému během kritického období v ontogenezi člověka. • Buněčné a molekulární mechanismy vzniku a příčin alergií nejsou dosud uspokojivě vysvětleny. • V zemích jako je Velká Británie nebo Austrálie, 1 ze 4 dětí do věku 14 let má astma a 1 z 5 dětí ekzém. Nature , 402: b2-b4, 1999 The epidemic of allergy and asthma Stephen T. Holgate
Proč synantropní členovci? ALLERGEN NOMENCLATURE IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committee
Arthorpoda 28% Magnoliopsida 34%
http://www.allergen.org/ This website is the official site for the systematic allergen nomenclature that is approved by the World Health Organization and International Union of Immunological Societies (WHO/IUIS) .
Chordata 8% Cnidaria 0%
Liliopsida 11% Coniferopsida 2% Basidiomycota 3%
Ascomycota 12%
Mollusca 0% Nemata 2%
Proč synantropní členovci? Thysanura Siphonaptera Pscoptera Lepidoptera Ixodida Hymenoptera Hemiptera Diptera Decapoda Coleptera Blattaria Astigmata 0
10
20
30
40
50
60
70
Anafylaktický šok • Anafylaxe – prudká imunitní reakce způsobená vniknutím cizorodé bílkoviny (alergenu) do organizmu. • Anafylaktický šok – okamžitá reakce, pacient zbledne a ztrácí vědomí, zvracení, k úmrtí dochází nejčastěji v první hodině po reakci; oslabená reakce vede ke kašli a dušnosti, případně průjmu. Druh D. farinae T. putrescentiae D. farinae T. entomophagus D. farinae D. pteronyssinus Suidasia spp. A. ovatus T.putrescentiae D.pteronyssinus D. farinae D. farinae D. farinae
Počet /g ?? 11,000-14,000 5,000-50,000
Potravina Beignets Hot-cake powder pšen.mouka
Původ USA Japan Spain
Citace Erben et al. 1993 Matsumoto et al. 1996 Blanco et al. 1997
up to 5,000
pšen. mouka
Venezuela Sanchez-Borges et al. 1997
Brazil
Guerra-Bernd et al. 2001
5,000 7,115
Kukuřičná mouka (tepelně upravená) pšen. mouka Beihnets
USA
Castillio et al. 1995 Spiegel et al. 1995
Přehled alergenů, biochemická funkce, lokalizace Skupina
MW kDa
Druhy roztočů
1 2 3 4 5 6 7 8
25 14-18 30 60 14 25 22-28 26
Bt, Df, Dm,Dp, Em Bt, Df, Dp,Em, Gl, Ld, Tp Bt, Df, Dp, Em, Tp Bt, Dp, Em,As Bt, Dp, Ld Bt, Df, Dp, Df, Dp, Ld, Dp
Skupina proteinů/odhadovaná biochemická funkce cysteinová proteáza NPC2 rodina proteinů trypsin amyláza ??? chymotrypsín ??? glutathion-S-transferáza
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
24 36 98 14 15 80-100 98 53 53 60 7 ??? ??? ??? 14 18
Dp Bt,Df, Dp, Ld, Tp Bt, Df, Dp, Bt, As, Bt, Df, Ld, Tp Df, Dp, Em Df, Df, Df, Df, Bt, Dp, Bt, Dp Df, Dp Tp
kolegenolytická serinová proteáza tropomyozin paramyozin ??? tukové kyseliny vážící protein apolipophorin chitináza gelsolin/villin vápník vázající protein chtináza antibakteriální protein arginin kináza strukturální protein ??? ??? Troponin C
Lokalizace střevo/exkrementy parenychmální tkáň střevo/exkrementy střevo/exkrementy střevo/exkrementy střevo/exkrementy parenychmální tkáň střevo/exkrementy svaly svaly parenychmální tkáň parenychmální tkáň parenychmální tkáň parenychmální tkáň parenychmální tkáň parenychmální tkáň parenychmální tkáň střevo/exkrementy parenychmální tkáň střevo/exkrementy
Střevo –místo produkce alergenů
Od střeva k exkrementu
Enzymy a tedy alergeny jsou v exkrementech
•
Rozpadem exkrementů a nebo přímo s exkrementy, se alergeny dostávají do respirabilní frakce vzduchu a jsou vdechovány. • Bronchiální astma – záchvatovitá dušnost způsobená křečí průduškových svalů. • Exogenní alergická alveolitis – zánět plicních sklípků, viditelných na RTG, hypoxie, nemoc farmářů a chovatelů.
Tropomyozin a paramyozin (grp 10 a 11) Tropomyozin a paramyozin: odpovědné za vznik alergií na mořské bezobratlé (korýši: garnáti, humři, atd..). Tyto alergeny jsou konzervativní proteiny, které se vyskytují u bezobratlých. Existují křížové reakce, tj. nemocní pacienti, kteří jsou citliví na korýše jsou citliví na roztoče. Izolace těchto proteinů může vést k detekčním nebo immunomodulačním nástrojům. Izolace provedená na skladištních roztočích (Erban 2011).
Degradace alergenů v exkrementech Jaká je stabilita vybraných proteinů? Existuje vliv mikroorganismů na degradaci alergenů? Exkrementy po defekaci (kontrola) Expozice v bytě (alternativně potravinářský provoz)
Odběr po 3, 6 a 9 měsících
Celkové proteiny Bla g 1 (ELISA) Bla g 2 (ELISA) specifické proteázy
Exkrementy Blattella germanica v různých stadiích degradace SEM Start
Kontrolovaná teplota 15oC, 3 měsíce, konídia (šipky)
9 měsíců, 15oC
3 měsíce, 15oC
9 měsíců, 30oC
Exkrementy švábů obsahují extrémně stabilní alergeny Degradace %
100
Celkové proteiny Bla g 1
75
Bla g 2 50
Bla g 1 není ovlivněn během 9 měsíců expozice v bytě, Bla g 2 klesá cca na 70%.
25
0 0
90
183
Doba expozice (dny)
276
Jestliže odstraníme členovce, nemusíme zlikvidovat rizika spojená s jejich alergeny, které se vyskytují v exkrementech.
Transport a ovlivnění mikroorganismů
Proč roztoči vstupují do interakcí s mikroorganismy
Lysozym a proteázy – trávení bakterií G+ A G-
v
ca pc
Bakterie a kvasinky
Mohou bakterie zabíjet roztoče? Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, produkující Cry3A toxín komerčně dostupný jako přípravek Novodor FC (Valent Biosciences, Libertyville, IL, USA). tN
tN
50
50
40
Acarus siro
30
30
20
20
10
10
0
0
-10
0
20
40
60
80
100 -
tN 50
-10
0
20
40
60
80
100
tN
Dermatophagoides farinae
30
Lepidoglyphus destructor
40
Tyrophagus putrescentiae
40
20
30 10
20 10
0
0 -10
0
20
40
60
80
100
-10 -1
0
20
Koncentrace Bt mg g-1 diety
40
60
80
100
-
houba Ascomycetes
Produkce čpavku
The adaptive function of ammonia and guanine in the biocoenotic association between ascomycetes and flour mites (Acarus siro L.) H. Z. Levinson, A. R. Levinson and K. Müller Naturwissenschaften Volume 78, Number 4, 174-176,
roztoč Acarus siro Atraktivní pro samce, samice Konzumace, ascospór, konídí Exkrece guaninu (feromón) Agregace, páření Disperze reprodukce
Rozšiřování kultury
Rozšiřování spór
Mohou ovlivnit výskyt toxigenních plísní? •
Houby asociované s roztoči v silně infestovaných skladech obilí
Species
Allergen-hazards
Mycotoxin-hazards
Alternaria alternata
(9) Alt a 1-4, Alt a 6-7, Alt a 10-12
tenuazonic acid, alternariol, altertoxins
Aspergillus flavus
(1) Asp fl 13
aflatoxin B1, cyclopiazonic acid, kojic acid, 3-nitropropionic acid
Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Aspergillus versicolor Cladosporium herbarum Epicoccum nigrum Eurotium spp. Penicillium aurantiogriseum
(19) Asp f 1-18, Asp f 22w (3) Asp n 14, Asp n 18, Asp n?
Penicillium brevicompactum
(1) Pen b 13
malformins, naphtopyrones sterigmatocystin, nidulotoxin
(7) Cla h1 -6, Cla h12 (1) Epi p 1 physcion, echinulin penicillic acid, verrucosidin, viomellein, nephrotoxic glycopeptides botryodiploidin, mycophenolic acid
Penicillium crustosum
penitrem A, roquefortine C, terrestric acid
Penicillium griseofulvum
cyclopiazonic acid, patulin, roquefortine C, griseofulvin roquefortine C, meleagrin, penicillin ochratoxin A, citrinin
Penicillium chrysogenum Penicillium verrucosum
(3) Pen ch 13, Pen ch 18, Pen ch20
vnitřní rychlost růstu
Houby rodu Fusarium potrava pro roztoče Tyrophagus putrescentiae 0.60
b
bc
bc
c
bc
0.00
-0.60 -1.00 Acarus siro
e a p u ů s lo h c itříry n V
a
Lepidoglyphus destructor
Mikroskopické houby rodu Fusarium
Pro růst populace T. putrescentiae je Fusarium spp. stejně vhodná potrava jako kontrolní dieta používaná k chovu tohoto roztoče.
Tyrophagus putrescentiae
Kontrolní potrava
Mohou ovlivnit výskyt toxigenních plísní?
Roztoč Tyrophagus putrescentiae Fusarium Vyčištěný ječmen
Kontaminovaný ječmen Fusarium
Detekce Fusarium PCR DON -ELISA
Úspěšnost přenosu hub rodu Fusarium pomocí roztočů 5.0
b
c
a průměr
DON mikrog na g
4.0 3.0
medián
2.0 1.0
kontrola
T. putrescentiae
A.siro
0.0
Přenos Fusarium poa a F. culmorum pomocí roztočů do klíčícího ječmene je úspěšný, jak ukazuje nárůst koncentrace DON.
Problematika s infestací roztoči
Proč roztoče příliš neřešíme?
Detekční metody
Většinou vyvíjeno pro detekci roztočů v obilí (konveční fyzikálně chemické) nebo prachu (ELISA) obtížně aplikovatelné do potravin. http://www.inbio.com/EU/
Závěr • Infestace potravin roztoči představuje rizika spojená s kontaminací alergeny a přenosem mikroorganismů • Tato rizika by měla být zkoumána a kvantifikována. • Chybí detekční nástroje, nebo jejich optimalizace pro využití v potravinách
