PRINSIP REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN
Suharsono - Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB - Departemen Biologi, IPB E-mail:
[email protected];
[email protected]
Transformasi Tanaman dengan
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens:
- gram negatif - fitopatogen - mentransformasi sel tanaman Æ tumor Tumor: transfer, integrasi dan ekspresi gen yang terdapat di T-DNA ke dalam genom sel tanaman
Proses pembentukan tumor Tanaman luka Æ acetosyringone, hydroxyacetosyringone Æ induksi gen vir
Vir:
•25 gen di dalam 7 operon •di luar T-DNA •fungsi: transfer & integrasi T-DNA di genom tanaman
Plasmid Ti T-DNA 1. iaaM (tms1) 2. iaaH (tms2) 3. tmr (ipt) 4. gen-gen penyandi opine •diekspresikan setelah terintegrasi ke genom tanaman •ditransfer dalam bentuk utas tunggal linier, ujung 5’ membawa RB dan ujung 3’ LB sekuen spesifik RB: 25 pb
Sintesis auxin dan sitokinine iaaH (tms2)
trp 2-monooxygenase
i-3-a hydrolase
iaaM (tms1)
tmr (ipt)
isopentenyl diphosphate
isopentenyl transferase
isopentenyl adenosine monophosphate
Opine
• Sumber N dan C bagi A.
tumefaciens
• Beberapa jenis • Tidak bermanfaat bagi tanaman
Kendala pemanfaatan pTi alami 1. Sel tidak dapat diregenerasi Æ gen fitohormon harus dibuang 2. Regenerasi sel terhambat karena N, dan C digunakan untuk membentuk opine Æ gen opine harus dibuang 3. Ukuran pTi terlalu besar Æ segmen DNA yang tidak penting harus dibuang 4. Tidak dapat melakukan replikasi di E. coli Æ Ori dari E. coli harus disisipkan ke pTi
Vektor derivatif dari pTi Mengandung 1. gen penanda seleksi (hpt, npt) 2. Ori di E. coli (kadang: + Ori di A. t) 3. RB dari T-DNA (sering: + LB) 4. Situs pengklonan (MCS) Vektor ekspresi pTi -tidak mempunyai vir 1. Vektor biner 2. vektor kointegrasi
Vektor ekspresi pTi 1. Vektor biner •Ori E. coli, A.t •Tidak ada vir •A.t resipien: -disarmed pTi: tidak ada T-DNA, ada vir
2. Vektor kointegrasi Rekombinasi vektor pengklonan + disarmed pTi Æ vektor (vir, T-DNA)
Transfer gen dengan A. tumefaciens
Metode fisik untuk mentransfer gen ke tanaman
Tanaman yang telah ditransformasi secara genetik
Biolistik
•partikel diselimuti DNA+ CaCl, spermidine/PEG •efisiensi: DNA linier>sirkuler; besar
Tanaman transgenik menggunakan biolistik
Biolistik dengan YAC
GOI= 150 kb (beberapa gen) dapat diintegrasikan ke genom tanaman
GEN REPORTER • menyeleksi sel yang tertransformasi • kuantifikasi ekspresi gen 2 macam: • gen penanda seleksi dominan • gen yang produknya dapat dideteksi: #β-D-glucuronidase: *5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide acid Æ biru *4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide Æ fluorescent (fluorometer) #GFP (green fluorescent protein): penanda in vivo; sinar UV atau biru (tanpa substrat) Æ fluorescent hijau (tanaman tipe liar Æ fluorescent merah keunguan)
Gen reporter dan penanda seleksi di tanaman
Manipulasi ekspresi gen di tanaman •Pilih Promoter 9Promoter 35S CaMV: konstitutif kuat, di seluruh jaringan, sepanjang hidup 9Promoter SSU rubisco: aktif di daun (jaringan fotosintetik) 9Pathogenesis-related promoter
Faktor penentu tingkat ekspresi lainnya •enhancer: terletak di hulu promoter (1-ratusan bp) •intron: stabilitas mRNA •terminator
Perbandingan promoter 35S dengan promoter komposit
Promoter komposit: p35S+7 enhancer+ Ω TMV+tnos Gen reporter: β-glucuronase
Produksi protein di kloroplast/mitokondria Strategi: •Gen penyandi fusi protein sasaran+peptida signal Æ inti sel •Gen penyandi protein sasaran Æ kloroplast/mitokondria Sel daun: 50-100 kloroplast @ 10-100 kopi DNA ¾insersi gen di kloroplast Æ produksi protein > insersi di kromosom ¾Cara: GOI+marker diapit oleh sekuen DNA kloroplast Æ
microprojectile bombardment. Rekombinasi Æ GOI terintegrasi ke genom kloroplat
Sekresi protein Produksi protein di tanaman mahal 9untuk purifikasi (90%) ÎTanaman sebagai bioreaktor Æ eksudasi protein lewat (apoplast) akar
APLIKASI REKAYASA GENETIKA TANAMAN Tujuan utama bioteknologi tanaman: merakit kultivar baru Perakitan tanaman resisten terhadap serangga Strategi: •insektisidal protoksin oleh Bacillus thuringiensis •inhibitor α-amilase •inhibitor protease •lektin
Contoh sifat yang diperbaiki
Ulat menyerang tongkol jagung
Kapas biasa
Penggerek batang
Kapas-Bt
Kapas
Non Bt
Bt
Pepaya resisten Vs peka Ring Spot Virus
Meningkatkan ekspresi •memotong gen (tersisa N-terminal yang mengandung toksin) •menggunakan promoter kuat Perbandingan aa protoksin dari berbagai strain B.t: 98% ujung N Æ terkonservasi; ujung C bervariasi aktivitas: 646 aa pertama dari ujung N (protoxin: 1156 aa) Æ Gen protoxin yang dipotong Æ tomat
Ekspresi toxin Bt
Manduca sexta Heliothis zea Keiferia lycopersicella
Usaha menaikkan ekspresi protoksin 1. Mutagenesis situs terarah: mengubah sekuen yang menghambat transkripsi dan translasi Æ 95.6% smdg WT Æ 10 x produk WT 2. Modifikasi sekuen Æ sintesis secara kimia Æ kodon yang biasa di tanaman Æ 78.9% smdg WT Æ 100 x produk WT 3. Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida transit + sekuen termodifikasi Æ over produksi di kloroplast Æ produk sangat tinggi (1% protein daun) 4. Introduksi gen protoksin ke kloroplast Æ 2-3% protein daun
Keuntungan ekspresi protoksin di kloroplast 1. Jumlah kloroplast tiap sel banyak Æ multi kopi gen protoksin Æ produk tinggi 2. Tidak ada resiko penyebaran gen ke lingkungannya melalui polen
Kerugian: Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang tidak mempunyai kloroplast
Ekspresi gen penyandi protoksin B. thuringiensis di tanaman
Strategi lain mencegah serangan serangga - Cowpea trypsin inhibitor •menghambat H. virescens - Potato proteinase inhibitor II •penggerek batang merah muda (Sesamia inferens) - Inhibitor α-amylase •kumbang Callosobruchus maculatus, C. chinensis -Cholesterol oxidase • Anthonomus grandis grandis (coleoptera) -Lektin -Tryptophan decarboxylase •kupu putih (Bemisia tabaci) -Avidin
Strategi lainnya untuk mencegah serangan serangga
Pencegahan resistensi serangga terhadap B.t B.t. sebagai agen seleksi Æ serangga resisten Cara pencegahan: •Ekspresi protoksin Bt dibatasi pada waktu singkat Æpromoter PR-1a Æ Bt diinduksi oleh pathogen atau asam salisilat atau asam poliakrilat •Fusi 2 gen toksin Æ protein toksin hibrid •Kombinasi: Bt + insektisida lain (inhibitor α-amilase) •Kombinasi: Bt + insektisida kimiawi dosis rendah •Strategi pengungsian (refuge). 20% area non-Bt. Serangga yang tahan di area Bt (80%) jumlahnya sedikit (99.9% mati) Æ kawin dengan serangga sensitif di area 20% non-Bt Æ dilusi ketahanan
Tanaman resisten terhadap virus Resistensi alami: •mencegah transmisi virus •mencegah terbentuknya virus •mengatasi gejala virus
Proteksi dengan protein mantel virus
Ekspresi protein mantel
Tanaman transgenik: •mengekspresikan protein mantel (RNA sense) Æ resisten •dengan antisense Æ resisten pada dosis virus rendah
Resistensi terhadap banyak virus Protein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus, WMV2 Æ Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga virus
Tanaman resisten terhadap herbisida Tanaman resisten herbisida: 1. Menghambat penyerapan herbisida 2. Produksi protein sasaran herbisida secara berlebihan Æ protein aktif masih ada 3. Mengurangi kemampuan protein sasaran mengikat herbisida 4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme 2-4: melalui perakitan tanaman transgenik EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) Æ aa aromatik; sasaran glyphosate EPSPS mutan E. coli Æ tanaman Æ tanaman resisten terhadap glyphosate
Perakitan tanaman resisten terhadap herbisida
Resisten herbisida bromoxynil •Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi herbisida bromoxynile Æ tanaman resisten •Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4hydroxybenzonitrile) Æ menghambat fotosintesis
Tanaman resisten terhadap fungi dan bakteri Æ ekspresi pathogenesis-related (PR) protein: β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein, protease inhibitor, asam salisilat
•chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin Nacetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)
Ekspresi asam salisilat di tanaman •Resisten terhadap fungi dan bakteri •Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate synthase dan isochorismate lyase
Tanaman toleran terhadap cekaman dan senesen Ekspresi SOD: •tahan panas, herbisida methyl viologen (paraquat), layu (bunga potong) Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase): •tahan garam, beku
Toleran terhadap cekaman garam/kering •perlu osmoprotectant: ¾gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol, mannitol, sorbitol, glisin betain, 3methylsulfoniopropionate •ekspresi choline dehydrogenase (betA) Æ betain
Penundaan buah masak dan bunga layu Buah masak: •ekspresi polygalacturonase dan cellulase •diinduksi Æ dihambat: masak buah tertunda (layu bunga, gugur daun tertunda) Bagaimana menghambat ekspresi? •RNA antisense thd gen penyandi •mengalihkan jalur sintesis
Mengalihkan jalur sintesis etilen untuk menghambat sintesis etilen
Degradasi ACCÆ sintesis etilen dihambat
Manipulasi genetik pigmentasi bunga Antosianin (flavonoid) Æ pigmen bunga Chrysanthemum + cDNA CHS sense/antisense Î bunga putih Astaxanthin: •pink (salmon, udang) •dari bakteri & mikroalga •mencegah telur rusak karena UV •meningkatkan daya hidup & laju tumbuh Æ antioksidan Produksi astaxanthin: -ekspresi cDNA β-caroten ketolase (β-C-4 oxygenase) alga hijau (Haematococcus pluvialis)
Modifikasi kandungan nutrisi tanaman memperbaiki: -kualitas nutrisi: jagung, kacang polong (kandungan aa di biji) -komposisi asam lemak dari tanaman penghasil minyak -rasa buah dan sayuran
Meningkatkan kandungan lisin Over produksi lisin: menghentikan feedback inhibition oleh aspartokinase & dihydrodipicolinic acid synthase Æekspresi gen DHDPS lysinfeedback-insensitive dari Corynebacterium & AK lysinfeedback-insensitive dari E. coli dikendalikan promoter biji Æ biji mengandung 2-5 x lisin
Kandungan lipid Kanola transgenik: antisense gen stearate desaturase dari Brasicca Æ akumulasi asam stearat (tidak menjadi asam oleat)
Mengganggu RNA tanaman Modifikasi fenotipe: downregulation dari ekspresi gen Æ menghambat mRNA Cara: •ekspresi kopi tambahan (cosuppression) •ekspresi antisens •ribozim Æ molekul kecil RNA Æ endoribonuklease spesifik stearoyl-ACP U9 desaturase: asam stearat Æ asam oleat; stearat meningkat Æ margarin dan minyak goreng
+ ribozim: asam oleat dihambat Æ akumulasi asam stearat
Vitamin A Mamalia: β-carotene (provitamin A) Æ vitamin A β-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman fotosintetik Ekspresi β-carotene di beras via A. t: 1: Phytoene synthase (psy) (pglutellin) & phytoene desaturase (crt) (p35S) tanpa smg + peptida transit plastid 2: Lycopene b-cyclase (lcy) (pglutellin) + peptida transit plastid 1+2 Æ padi Æ beras mengandung βcarotene shg berwarna kuning/emas Æ golden rice
Modifikasi rasa dan tampilan tanaman Mencegah perubahan warna Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/o-difenol Æ o-quinon Æ perubahan warna buah/sayuran Perubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis polifenol oksidase
(Granule-bound starch synthase)
Kentang: Æ antisense polifenol oksidase +p35S/pGBSSÆ resisten thd black spot Æ Sense polifenol oksidase Æ tidak tahan
Pemanis Monellin: -Dioscoreophyllum cumminsii -3000 x lebih manis darpd sukrosa -Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan ikatan lemah nonkovalen -Rusak oleh: panas, asam
Pemanis rendah kalori
Kandungan pati Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin (rantai bercabang) Æ rasio keduanya: perubahan sifat fisik & kimia pati
Amilosa: ikatan α-1,4
Amilopektin: ikatan α-1,4 dan α-1,6
Biosintesis pati
Glukan+glukan Æ α-1,6 Æ amilopektin
p35S + antisense startch branching enzyme Æ amilosa naik: 28% Æ 60-80%
Tanaman sebagai bioreaktor Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)
Antibodi Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah (produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000, tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang
Produksi biopolimer Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA
Alcaligenes eutrophus Acetyl Co-A 3-ketothiolase
Acetoacetyl Co-A
D-3-Hydroxybutyryl co-A
Acetoacetyl Co-A reductase
PHA
Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase
PHA: bioplastik, di A. eutrophus Æ 1 operon Æ tidak dikenal tanaman Æ ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana Æ target ke kloroplast @ gen + peptida transit di kloroplast ssu rubisco + p35S Æ pTi biner 1 x 2 Æ tanaman (1+2) Æ x 3 Æ tanaman (1+2+3) Æ 1 mg /g daun segar PHA
Mengubah kandungan lignin Lignin: tinggi Æ mutu pulp dan hijauan pakan rendah rendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase
PERKEMBANGAN REKAYASA GENETIKA TANAMAN • Adopsi tanaman transgenik pesat – 1996: 2.8 jt ha (AS, Kanada, Argentina, Brasil, Afsel, China) Æ 2003: 67.7 jt ha (18 negara) – 4 komoditas penting: kedelai, jagung, kapas, kanola – 2 sifat: resisten herbisida, resisten hama (penggerek) • 2006: + negara, + komoditas (pepaya, padi, alfalfa, labu), + sifat (toleran virus
Jumlah negara dan luas tanaman transgenik
(James 1996-2006) Tahun 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006
Jumlah negara 6 8 8 14 13 13 16 18 20 21 22
Luas (juta ha) 1.7 11.0 27.8 39.9 44.2 52.6 58.7 67.7 81.0 90.0 102.0
Melibatkan > 10 jt petani (90% petani kecil)
Luas tanaman transgenik di dunia, berdasarkan jenis tanaman 2002 (%)
2005 (million ha)
%
2006 (million ha)
%
1 Soybean
62
54.4
50
58.6
57
2 Maize
21
21.2
24
25.2
25
3 Cotton
12
9.8
11
13.4
13
4 Canola
5
4.6
5
4.8
5
5 Alfalfa
-
-
-
<0.1
<1
6 Rice
-
<0.1
<1
<0.1
<1
7 Others
-
<0.1
<1
<0.1
<1
100
90.0
100
102.0
100
No
Crop
TOTAL
Luas tanaman transgenik dunia, berdasarkan sifat 2005 (million ha)
%
2006 (million ha)
%
1
Herbicide Tolerance (HT)
63.7
71
69.9
68
2
Insect Resistance (Bt)
16.2
18
19.0
19
3
Bt/HT
10.1
11
13.1
13
4
Virus Resistance
<0.1
<1
<0.1
<1
90.0
100
102.0
100
No
Trait
TOTAL James 2006
