DASAR REKAYASA GENETIKA Rekayasa = manipulasi = modifikasi = perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen) Cara: 1. Persilangan seksual (perkawinan) 2. Hibridisasi somatik 3. Mutasi 4. Teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetika) Tujuannya sama: perbaikan genetik dari suatu sifat PERSILANGAN SEKSUAL •Kelemahan: Waktu lama, Kurang presisi •Keuntungan: Mudah, murah HIBRIDISASI SOMATIK •Penggabungan sel somatic (protoplast) •Simetrik: kontribusi bahan genetic kedua tetua sama •Asimetrik: kontribusi bahan genetic kedua tetua berbeda •Kelemahan: Regenerasi sulit (tanaman) •Keuntungan: Menggabungkan bahan genetic dari spesies berbeda PemuliaanTanaman Konvensional (Persilangan seksual)
REKAYASA GENETIKA • Teknologi DNA rekombinan → GMO • Cara: penyisipan DNA asing (transgen) ke dalam genom sehingga diekspresikan, dan diwariskan • Transgenesis: proses perakitan organism transgenik • Keuntungan: Presisi, cepat, gen dari berbagai organisme • Kelemahan: Teknologi, mahal
Ekspresi transgen • Elemen pengontrol: promoter dan terminator - organisme: eukaryot/prokaryot - tujuan: kuantitas, tempat, waktu • (+enhancer, intron) • Promoter: tepat sasaran (waktu dan tempat) - konstitutif (ekspresi terus menerus): 35S CaMV - waktu dan tempat spesifik Cara introduksi transgen kedalam sel inang •Transformasi (plasmid) •Transfeksi (fage, virus) → sel hewan, serangga, bakteri Penanda seleksi •Tujuan: untuk menapis sehingga sasaran dapat diindentifikasi dan diisolasi •Reaksi biokimia sehingga terbentuk warna: X-gal (seleksi biru-putih) •Reaksi resistensi terhadap antibiotika: ampisilin, kanamisin Metode transformasi • Agrobacterium tumefaciens • Biolistik • Mikroinjeksi • Elektroporasi • Transfer langsung dengan PEG • Liposom
Agrobacterium: • Khusus untuk tanaman • tumefaciens: tumor (pTi) • rhizogenes: akar berambut (hairy root) (pRi) Plasmid pTi dari A. tumefaciens • Transfer: T-DNA (12-24 kb) • Gen-genvir: pindah & integrasi • Ori: replikasi • Katabolisme opin Biolistik • Banyak untuk tanaman tetapi tidak banyak untuk hewan • Jaringan, penggunaan luas • Khimera sehingga seleksi harus ketat • Tekanan udara: He • Partikel(<10 μm): emas atau tungsten • Pengaturan: jarak dan lama tembak Elektroporasi • Kejutan listrik: membrane protoplast • Bakteri, tanaman, hewan Transfer langsung • Mg2+, Ca2+, PEG • Heat shock • Tanaman: regenerasi dari protoplast ke sel ke tanaman utuh Mikroinjeksi •Banyak untuk hewan, Jarang untuk tanaman • Injeksi di inti sel (kloroplast atau mitokondria) • Sel hewan: injeksi di sel telur terbuahi
Transfeksi
DASAR PENGKLONAN GEN TahapanPengklonanGen 1. Isolasi DNA (gen) 2. Penyisipan DNA kedalam vektor 3. Introduksi vector (rekombinan) kedalam sel inang (bakteri)
ENZIM YANG TERLIBAT 1. Enzimrestriksi endonuklease •Memotong DNA pada situs spesifik •TipeII: situs pengenalan dan pemotongan spesifik •Situs pengenalan: palindrome (simetri)
Hasilpemotongan • Ditentukan oleh situs pemotongan • Pusat simetri: ujung rata (blunt end) • Diluar pusat simetri: ujung tidak rata/kohesif (sticky end) ContohEnzimRestriksiEndonuklease
2. Enzim Ligase •Untuk menyambung potongan DNA • 5P dari nukleotida 1 dengan 3OH nukleotida 2 • 2 tipe: DNA ligase dariE.coli DNA ligasedarifageT4
ISOLASI GEN 1. PemotonganDNA dengan enzim restriksi endonuklease
2. Isolasi cDNA • cDNA: DNA yang disintesis berdasarkan mRNA • RNA total = mRNA + rRNA+ tRNA • RNA total + Oligo(dT) →(Oligo(dT)+ mRNA) + (rRNA+tRNA)
3. Transposon • Dapat berpindah tempat di kromosom • Bila menyisip ke gen, gennya mengalami mutasi • Mutan dapat dilacak dengan transposon sebagai pelacaknya • Perlu: konstruksi pustaka genom VEKTOR PENGKLONAN • Pembawa molekul DNA 1. Plasmid Karakteristik: • Replikasi (autonom) • Ekstra kromosom • Stabil • Ukuran 1-300 kb
Jenis: • F (fertilitas→konjugasi) • R (resistensi→antibiotika) • Toksin (ColE1 dari E.coli) • Degradatif (TOL dari Pseudomonas putida) • Patogenesitas(pTi dari A. tumefaciens) Cloning gene by RT-PCR: pGEM-T Easy (Promega) Host: E. coli DH5α
Keadaan plasmid di dalam bakteri: • Non-integratif (tidak menyisip di kromosom inang) • Episom (menyisip di kromosom inang) Syarat menjadi vektor: • Ukuran kecil • Punya situs penyisipan • Gen penanda seleksi 2. Fage • Virus yang menyerang bakteri Fage λ • Bentuk: kepala dan ekor • Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni • Ukuran genom: 49 kb, utas ganda • Kedua ujung: situs cos→(1) sirkuler, (2) situs pemotongan
FageM13 • Bentuk: batang/filamen • Ukuran genom: 6,407 kb, linier • Perbanyakan: tanpa lisis sel inang
Cloning vector & host E. coli strain ER1647 Host: BM25.8, DH5α
3. Cosmid • DNA hibrid: λ dan plasmid • Ukuran: 5 kb sehingga dapat membawa 40 kb DNA • Dapat digunakan sebagai vector dengan karakteristik: - Mempunyai titik asal replikasi - Mempunyai situs cos - Mempunyai gen penanda seleksi
4. Kromosom buatan dari khamir (Yeast Artificial Chromosome= YAC) • Dapat membawa sisipan → DNA berukuranbesar • Konstruksipustakagenom • Karakteristik sebagai vektor: - Mempunyai sentromer - Mempunyai telomere (menghindari ligasi dengan kromosom lainnya - Mempunyai titik asal replikasi
5. Kromosom buatan dari bakteri (Bacterial Artificial Chromosome= BAC) • Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar • Konstruksi pustaka genom
