DASAR REKAYASA GENETIKA Rekayasa = manipulasi = modifikasi= perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen) Cara: 1. Persilangan seksual (perkawinan) 2. Hibridisasi somatik 3. Mutasi 4. Teknologi DNA rekombinan (rekayasa genetika) Tujuannya sama: perbaikan genetik dari suatu sifat
PERSILANGAN SEKSUAL •Kelemahan: Waktu lama, Kurang presisi •Keuntungan: Mudah, murah HIBRIDISASI SOMATIK • Penggabungan sel somatik (protoplast) • Simetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetua sama • Asimetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetua berbeda • Kelemahan: Regenerasi sulit (tanaman) • Keuntungan: Menggabungkan bahan genetik dari spesies berbeda
Pemuliaan Tanaman Konvensional (Persilangan seksual) gen yang tidak diinginkan
gen yang diinginkan
Rantai gen, seperti untaian mutiara. Pemuliaan konvensional menggabungkan banyak gen dalam sekali penyilangan. Penyilangan balik (back-cross) harus dilakukan untuk menghilangkan gen-gen yang tidak diinginkan
varietas komersial Dikawinkan (disilangkan)
varietas baru
Dikawinkan beberapa kali (silang balik)
donor (spesies sama atau kerabat dekat)
Hibridisasi Somatik gen yang tidak diinginkan
gen yang diinginkan
Fusi sel
donor (spesies sama atau lain)
Rantai gen, seperti untaian mutiara. Fusi sel menggabungkan banyak gen dari 2 individu atau lebih. Penapisan yang intensif harus dilakukan untuk menghilangkan gen-gen yang tidak diinginkan dan mempertahankan fertilitas
varietas komersial
Penapisan dan seleksi intensif
varietas baru
Mutasi gen yang tidak diinginkan
•Fisik: radiasi UV, X, gamma, suhu •Kimia: kolkisin, EMS, 5-BrU
Penapisan dan seleksi intensif
varietas baru Mutasi terhadap gen dapat mengubah struktur dan fungsi protein yang disandinya. Mutasi bersifat acak sehingga penapisan yang intensif terhadap mutan harus dilakukan untuk memilih individu mutan yang diinginkan
REKAYASA GENETIKA •Teknologi DNA rekombinan Æ GMO •Cara: penyisipan DNA asing (transgen) kedalam genom sehingga diekspresikan, dan diwariskan •Transgenesis: proses perakitan organisme transgenik •Keuntungan: Presisi, cepat, gen dari berbagai organisme
•Kelemahan:
Teknologi, mahal
Teknologi DNA rekombinan (Bioteknologi) gen yang tidak diinginkan gen yang diinginkan
donor (berasal dari spesies yang sama atau lain)
varietas komersial pemindahan gen
Dengan teknologi DNA rekombinan, hanya satu gen saja yang dipindahkan. Pemindahan hanya terjadi pada gen yang diinginkan varietas baru
Ekspresi transgen •Elemen pengontrol: promoter dan terminator •organisme: eukaryot/prokaryot •tujuan: kuantitas, tempat, waktu •(+enhancer, intron) •Promoter: tepat sasaran (waktu dan tempat) •konstitutif (ekspresi terus menerus): 35S CaMV •waktu dan tempat spesifik
Cara introduksi transgen kedalam sel inang • Transformasi (plasmid) • Transfeksi (fage, virus) Æ sel hewan, serangga, bakteri Penanda seleksi • Tujuan: untuk menapis sehingga sasaran dapat diindentifikasi dan diisolasi • Reaksi biokimia sehingga terbentuk warna: X-gal (seleksi biru-putih) • Reaksi resistensi terhadap antibiotika: ampisilin, kanamisin
Metode transformasi •Agrobacterium tumefaciens •Biolistik •Mikroinjeksi •Elektroporasi •Transfer langsung dengan PEG •Liposom
Agrobacterium: •Khusus untuk tanaman •tumefaciens: tumor (pTi) •rhizogenes: akar berambut (hairy root) (pRi) Plasmid pTi dari A. tumefaciens •Transfer: T-DNA (12-24 kb) •Gen-gen vir: pindah & integrasi •Ori: replikasi •Katabolisme opin
Biolistik •Banyak untuk tanaman tetapi tidak banyak untuk hewan •Jaringan, penggunaan luas •Khimera sehingga seleksi harus ketat •Tekanan udara: He •Partikel (<10 μm): emas atau tungsten •Pengaturan: jarak dan lama tembak
Elektroporasi •Kejutan listrik: membran protoplast •Bakteri, tanaman, hewan
Transfer langsung • Mg2+, Ca2+, PEG • Heat shock • Tanaman: regenerasi dari protoplast ke sel ke tanaman utuh
Mikroinjeksi • Banyak untuk hewan, jarang untuk tanaman • Injeksi di inti sel (kloroplast atau mitokondria) • Sel hewan: injeksi di sel telur terbuahi
Transfeksi
DASAR PENGKLONAN GEN Tahapan Pengklonan Gen 1. Isolasi DNA (gen) 2. Penyisipan DNA kedalam vektor 3. Introduksi vektor (rekombinan) kedalam sel inang (bakteri)
ENZIM YANG TERLIBAT 1. Enzim restriksi endonuklease •Memotong DNA pada situs spesifik •Tipe II: situs pengenalan dan pemotongan spesifik •Situs pengenalan: palindrom (simetri) 5’-N-N-G-G-C-C-N-N-3’ HaeIII 3’-N-N-C-C-G-G-N-N-5’ 5’-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-3’ 3’-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-3’
EcoRI
5’-N-N-G-G 3’-N-N-C-C
C-C-N-N-3’ G-G-N-N-5’
5’-N-N-G A-A-T-T-C-N-N-3’ 3’-N-N-C-T-T-A-A G-N-N-3’
•Hasil pemotongan •Ditentukan oleh situs pemotongan •Pusat simetri: ujung rata (blunt end) •Di luar pusat simetri: ujung tidak rata/kohesif (sticky end)
Contoh Enzim Restriksi Endonuklease Enzim restriksi
Organisme asal
Situs pengenalan Ujung potongan (arah 5’-3’) yang dihasilkan
EcoRI
Escherichia coli
GÈAATTC
kohesif
BamHI
Bacillus amyloliquefaciens
GÈGATCC
kohesif
BglII
B. globigii
AÈGATCT
kohesif
PvuI
Proteus vulgaris
CGATCG
kohesif
PvuII
P. vulgaris
CAGCTG
rata
HindIII
Haemophilus influenzae Rd AÈAGCTT
kohesif
HinfI
H. influenzae Rf
GANTC
kohesif
Sau3A
Staphylococcus aureus
ÈGATC
kohesif
AluI
Arthrobacter luteus
AGÈCT
rata
TaqI
Thermus aquaticua
TCGA
kohesif
HaeIII
H. aegyptius
GGÈCC
rata
HpaII
H.parainfluenzae
CÈCGG
kohesif
NotI
Nocardia otitidis-caviarum
GCGGCCGC
kohesif
2. Enzim Ligase •Untuk menyambung potongan DNA •5P dari nukleotida 1 dengan 3OH nukleotida 2 •2 tipe:DNA ligase dari E.coli DNA ligase dari fage T4
ISOLASI GEN 1. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease
Pemotongan DNA
Pustaka Genom
Construction of genomic library DNA total
Partial digestion 7-20 kb DNA fragment
Ligation
Packaging
Transvection
λBlueSTAR
2. Isolasi cDNA •cDNA: DNA yang disintesis berdasarkan mRNA •RNA total = mRNA + rRNA + tRNA •RNA total + Oligo (dT) → (Oligo (dT)+ mRNA) + (rRNA+tRNA)
Pengklonan gen melalui RT-PCR mRNA RT
PCR cDNA
Transformasi
Ligasi
3. Transposon •Dapat berpindah tempat di kromosom •Bila menyisip ke gen, gennya mengalami mutasi •Mutan dapat dilacak dengan transposon sebagai pelacaknya •Perlu: konstruksi pustaka genom
VEKTOR PENGKLONAN • Pembawa molekul DNA 1. Plasmid Karakteristik: •Replikasi (autonom) •Ekstra kromosom •Stabil •Ukuran 1-300 kb Jenis: •F (fertilitas → konjugasi) •R (resistensi → antibiotika) •Toksin (ColE1 dari E.coli) •Degradatif (TOL dari Pseudomonas putida) •Patogenesitas (pTi dari A. tumefaciens)
Cloning vector & host
Cloning gene by RT-PCR: pGEM-T Easy (Promega) Host: E. coli DH5α
Keadaan plasmid di dalam bakteri: • Non-integratif (tidak menyisip di kromosom inang) • Episom (menyisip di kromosom inang) Syarat menjadi vektor: •Ukuran kecil •Punya situs penyisipan •Gen penanda seleksi
2. Fage •Virus yang menyerang bakteri Fage λ •Bentuk: kepala dan ekor •Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni •Ukuran genom: 49 kb, utas ganda •Kedua ujung: situs cos → (1) sirkuler, (2) situs pemotongan
Fage M13 •Bentuk: batang/filamen •Ukuran genom: 6,407 kb, linier •Perbanyakan: tanpa lisis sel inang
Cloning vector & host
E. coli strain ER1647 Host:, BM25.8, DH5α
3. Cosmid •DNA hibrid: λ dan plasmid •Ukuran: 5 kb sehingga dapat membawa 40 kb DNA •Dapat digunakan sebagai vektor dengan karakteristik: •Mempunyai titik asal replikasi •Mempunyai situs cos •Mempunyai gen penanda seleksi
4. Kromosom buatan dari khamir (Yeast Artificial Chromosome = YAC) • Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar •Konstruksi pustaka genom • Karakteristik sebagai vektor: •Mempunyai sentromer •Mempunyai telomer (menghindari ligasi dengan kromosom lainnya) •Mempunyai titik asal replikasi
5. Kromosom buatan dari bakteri (Bacterial Artificial Chromosome = BAC) • Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar •Konstruksi pustaka genom
