LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN PRAKTIKUM  REKAYASA GENETIKA       

LAPORAN IV  (ISOLASI RNA DARI TANAMAN)   

                 

KHAIRUL ANAM  P051090031/BTK          BIOTEKNOLOGI  SEKOLAH PASCASARJANA  INSTITUT PERTANIAN BOGOR  2010  0   

ISOLASI RNA DARI TANAMAN      TUJUAN  Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui dan memahami prinsip bagaimana cara  mengisolasi suatu gen dari hasil ekspresinya (pada jaringan tanaman).  TINJAUAN PUSTAKA  Identifikasi  gen  yang  diekspresikan  pada  tahap  perkembangan  atau  kondisi  tertentu  suatu  tanaman  serta  pengujian  pola  ekspresinya  merupakan  tahapan  penting  untuk  mendapatkan  informasi  tentang  fungsi  gen,  baik  yang  berhubungan  dengan  proses  diferensiasi,  perubahan  morfologi  dan  metabolisme  serta  respons  terhadap  infeksi  patogen.  Salah  satu  cara  yang  dapat  ditempuh  untuk  mengidentifikasi  gen  atau  bagiannya  adalah  melalui  penapisan  (screening)  terhadap  pustaka  cDNA,  (complementary DNA) yaitu suatu pustaka yang  merepresentasikan gen‐gen yang diekspresikan dalam  suatu  jaringan,  waktu,  atau  kondisi  tertentu.  Pustaka  cDNA  diperoleh  melalui  proses  kloning  sehingga  ratusan gen berbeda dimungkinkan untuk dikoleksi dan diperbanyak secara terus menerus. Identifikasi  cDNA spesifik dapat dilakukan melalui proses hibridisasi ataupun melalui proses amplifikasi PCR dengan  menggunakan primer spesifik untuk gen tertentu (Haris et al, 2005).  Dalam konstruksi pustaka cDNA, DNA polimerase yang memerlukan RNA (RNA dependent DNA  polymerase)  yakni  reverse  transcriptase  (RT)  digunakan  untuk  mengcopy  messenger  RNA  (mRNA)  menjadi  molekul  cDNA  utas  ganda.  Berbeda  dengan  mRNA  yang  dengan  mudah  terdegradasi  dan  menggambarkan proses transkripsi dari gen‐gen yang aktif pada suatu jaringan atau sel tertentu, cDNA  merupakan  molekul  yang  lebih  stabil  sehingga  sesuai  untuk  disisipkan  ke  dalam  vektor  kloning,  baik  berupa  plasmid,  cosmid,  atau  bakteriofage.  Populasi  mRNA  yang  telah  di  copy  menjadi  cDNA  apabila  diklon  akan  menghasilkan  pustaka  cDNA  yang  bersifat  permanen.  Keuntungan  pustaka  cDNA  adalah  hanya  mengandung  sekuen  yang  terekspresi  dalam  bentuk  mRNA  dalam  suatu  kondisi  atau  waktu  tertentu (Kleinsmith & Kish, 1995).   

1   

BAHAN DAN METODE KERJA    Bahan  Bahan  yang  digunakan  dalam  praktikum  kali  ini  adalah  daun  tembakau,  nitrogen  cair,  CTAB,  DEPC,  LiCl,  PCI,  etanol  70%,  bufer  MOPS,  formaldehida,  dNTP,  reverse  transcriptase  dan  Taq  polymerase.  Metode  Isolasi RNA   1 gram daun tembakau segar ditimbang sambil di potong kecil dan dimasukkan ke dalam mortar  yang  telah  disteril.  Ke  dalam  mortar  yang  berisi  jaringan  daun,  ditambahkan  larutan  nitrogen  cair,  biarkan menguap hingga tinggal sedikit, kemudian digerus cepat hingga terbentuk serbuk kering.  Serbuk  kering  dimasukkan  ke  dalam  larutan  0,6  ml  buffer  CTAB  di  dalam  tabung  1,5  ml  dan  diinkubasi  pada  water bath dengan suhu 65°C selama 15 menit. Tabung dimasukkan ke dalam es lalu ditambah dengan  0,6  ml  CI  kemudian  kocok  dengan  kuat.  Larutan  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama  10  menit.  Supernatan  yang  terbentuk  diambil  dan  diukur  volumenya  lalu  ditambahkan  kedalamnya larutan LiCl 10 M, ¼ volume, kemudian diinkubasi di dalam lemari pembeku selama 2 jam.  Larutan disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit. Supernatan dibuang  dan pelet diresuspensi dengan 500 ul dH2O lalu diekstraksi menggunakan larutan fenol pH 9, 1x volume,  kemudian  di  vorteks  dan  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama  10  menit.  Supernatan diambil dan diekstraksi kembali menggunakan PCI  pH 9, 1x volume, kemudian di veorteks  dan  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama  10  menit.  Supernatan  yang  diperoleh  diambil  dan  dipindahkan  pada  tabung  baru  lalu  ditambah  dengan  LiCl  10  M  sebanyak  ¼  volume  yang  kemudian  diinkubasi  di  dalam  lemari  pembeku  selama  1  jam  agar  pengendapan  terjadi  lebih  cepat.  Larutan  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  pada  suhu  4°C  selama  15  menit  lalu  supernatan  dibuang  dan  ditambahkan  ke  dalam  tabung  sebanyak  500  ul  etanol  70%.  Sentrifugasi  kembali dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 5 menit lalu buang supernatan dan pelet  yang tersisa dikeringkan. Setelah kering, pelet dilarutkan menggunakan 30 ul air DEPC.   Identifikasi RNA   Identifikasi dilakukan dengan gel terdenaturasi menggunakan elektroforesis. Gel dibuat dengan  melarutkan  0,4  g  agarose  dengan  MOPS  (20x)  2  ml,  formaldehida  2,2  ml  dan  air  DEPC  0,1%  hingga  2   

volume  40  ml.  Untuk  larutannya  digunakan  premix  (12  ml/sampel;  komposisi:  5%  MOPS  20x,  50%  formamida, 17,5% formaldehida, 27,5% DEPC 0,1%)  dan larutan  RNA 5 ul (±  10 ug). Larutan dicampur  lalu dimasukkan ke dalam es selama 5 menit, kemudian ditambahkan ke dalamnya loading dye. Larutan  yang diperoleh di elektroforesis pada gel di dalam bufer MOPS 1x.   Reverse Transcriptase PCR  Tabung PCR diisi dengan larutan yang terdiri dari 2 ul first strand buffer 5x, 0,5 ul oligo (dt), 1 ul  dNTP  mix,  1  ul  RNA,  0,1  ul  superscript  TmRT,  5,4  ul  DTT  dan  ddH2O  hingga  10  ul.  PCR  dilakukan  pada  kondisi  annealing  (penempelan)  pada  suhu  30oC  selama  10  menit,  pemanjangan  dengan  suhu  42oC  selama 50 menit, inaktivasi RTase pada suhu 95oC selama 5 menit dan pasca PCR pada suhu 15 oC selama  15 menit.    PCR  Produk RT PCR yang diperoleh di PCR kembali. Komposis PCR terdiri dari 1 ul dNTP, 0,5 ul taq  polymerase,  1  ul  buffer  mix,  0,4  ul  DMSO,  1,5  ul  cDNA,  0,5  ul  primer  SOD  F,  0,5  ul  primer  SOD  R  dan  ddH2O hingga volume 10 ul. PCR dilakukan pada kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94oC selama  5 menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 58oC selama 30  detik, pemanjangan 72oC selama 1 menit, pasca PCR 72oC selama 5 menit, pendinginan pada suhu 15oC  selama  15  menit.  Semua  proses  di  atas  dilakukan  sebanyak  30  siklus.  Hasil  PCR  kemudian  di  elektroforesis selama 30 menit.    

3   

HASIL DAN PEMBAHASAN  Hasil  Dari hasil elektroforesis, dapat diketahui ada pita berbentuk smear dan pita lainnya yang  terbentuk. Pita ini merupakan pita dari RNA yang berhasil diisolasi. 

   

Gambar 8. Elusi mRNA dari tanaman 

  Pembahasan  Seperti halnya isolasi DNA, isolasi RNA pun juga memiliki prinsip yang sama yang terdiri dari tiga  tahap, yaitu 1. Lisis membran sel bakteri, 2. Ektraksi RNA, 3. Pengendapan RNA.  Proses  lisis  diawali  dengan  adanya  penggerusan  terhadap  jaringan  daun  yang  telah  diberi  nitrogen  cair.  Tujuan  dari  penggerusan  adalah  untuk  menghancurkan  dinding  sel  tanaman  dan  penambahan nitrogen cair bertujuan untuk menjaga RNA agar tidak mudah terdegradasi oleh protease  kuat seperti RNase dan menghilangkan kandungan air pada jaringan daun. Untuk lebih mengintensifkan  proses  lisis,  serbuk  atau  bubuk  yang  terbentuk  dimasukkan  ke  dalam  larutan  CTAB.  Larutan  CTAB  ini  berfungsi sebagai deterjen yang melisis membran sel dan dinding sel.  Setelah dilisis, larutan yang mengandung RNA kemudian diekstraksi dengan larutan CI. Larutan  CI  berfungsii  untuk  mengikat  lemak  dan  karbohidrat  yang  terkandung  di  dalam  larutan.  Dalam  proses  ekstraksi,  tabung  eppendorf  dimasukkan  ke  dalam  es  dengan  tujuan  agar  CI  yang  sudah  dimasukkan  tidak  mudah  menguap.  Karena  larutan  polar  yang  mengandung  RNA  lebih  ringan  berat  jenisnya  dibandingkan dengan CI , maka supernatan yang diperoleh dari proses sentrifugasi, dikoleksi.  

4   

Larutan  yang  diperoleh  kemudian  di  endapkan  dengan  menggunakan  LICl.  Larutan  LiCl  yang  diperlukan  adalah  larutan  dengan  konsentrasi  LiCl  mencapai  2,5  M.  karena  sifat  dari  RNA  yang  single  strand sehingga lebih mudah mengikat LiCl daripada DNA. Oleh karena itu, dalam persitiwa ini, endapan  yang  terbentuk  adalah  endapan  RNA  dimana  bobot  molekul  RNA  menjadi  lebih  besar  dibandingkan  dengan  DNA.  Penambahan  LiCl  jangan  berlebih  karena  bisa  RNA  telah  jenuh  sehingga  kemudian  LiCl  berikatan  dengan  DNA  dan  mengendapkan  DNA  juga.  Dengan  peristiwa  pengendapan,  RNA  dapat  dipisahkan dengan DNA.  Pelet  yang  diperoleh  lalu  diresuspensikan  dengan  dH2O  yang  kemudian  diekstraksi  kembali  dengan  menggunakan  PCI.  Penggunaan  PCI  dimaksudkan  untuk  kembali  mengekstraksi  senyawa‐ senyawa  organik  yang  ditakutkan  masih  terikut  di  dalam  larutan  RNA.  Dari  pelet  yang  terbentuk  kemudian  dilarutkan  dengan  dH2O  yang  mengandung  DEPC  (dietil  piro  carbonat)  0,01%.  Penggunaan  DEPC pada air yang digunakan dalam isolasi DNA atau pembilasan pada alat‐alat yang digunakan dalam  isolasi  RNA  diperuntukkan  untuk  menghindari  RNA  mengalami  denaturasi  akibat  RNase.  Adanya  DEPC  menghambat kerja RNase.   RNA  pada  jaringan  terdiri  dari  3  jenis  RNA,  yaitu  rRNA  (ribosomal),  tRNA  (transport),  mRNA  (messenger). rRNA memiliki konsentrasi yang paling besar diantara yang lain, yaitu sekitar 88%, sehingga  apabila terbentuk pita yang tebal pada hasil elektroforesis maka dapat diasumsikan pita tersebut adalah  tRNA  diaman  tRNA  dengan  bobot  molekul  yang  lebih  besar  berada  lebih  dekat  dengan  sumur.  mRNA  yang  hanya  sedikit  terkandung  di  dalam  jaringan  (sekitar  2%)  akan  membentuk  smear  pada  hasil  elektroforesis seperti yang terlihat pada gambar 1.   Untuk  mendapatkan  gen  yang  diinginkan,  maka  dari  RNA  yang  berhasil  diisolasi,  dilakukan  reverse transcriptase PCR untuk mendapatkan cDNA. Proses transkripsi terbalik meliputi pembentukan  hybrid RNA‐DNA yang kemudian diikuti dengan pembentukan cDNA diawali dengan penempelan primer  yang berupa  rantai poliT  (oligo dT)  dimana rantai ini secara spesifik akan  menempel  pada  mRNA yang  telah mengalami pasca transkripsi yaitu penempelan poliA pada ujung 3’.  Setelah  terbentuk  cDNA,  maka  dilakukan  PCR  untuk  mendapatkan  gen  SOD.  Untuk  mendapatkan gen  tersebut diperlukan primer spesifik yang dapat menempel  dan mengamplifikasi gen  tersebut  secara  spesifik  sehingga  cDNA  tersebut  dapat  diketahui  mengandung  gen  SOD  dan  dapat  dijadikan sebagai pustaka cDNA.  

5   

SIMPULAN  1. Dari  praktikum  ini  dapat  disimpulkan  bahwa  dalam  mengisolasi  RNA  sangat  diperlukan  kehati‐ hatian dalam bekerja karena sifat RNA yang single strand sangat rentan dan mudah terdegradasi  (RNase ada dimana‐mana).  2. Proses  isolasi  RNA  tahapannya  mirip  dengan  mengisolasi  DNA  akan  tetapi  proses  pemisahan  DNA dan RNA dilakukan dengan pengendapan menggunakan LiCl.  3. Pustaka cDNA dapat diperoleh dari mengisolasi mRNA dari suatu jaringan tanaman sebagai hasil  ekspresi dari sebuah gen target.    DAFTAR ACUAN  Kleinsmith, L.J. & V.M. Kish (1995). Principles of Cell and Molecular Biology. Second Edition. New York,  Harper Collins College Publish. 810 p.  Haris, N., Aswidinnoor, H., Suwanto A., Suhartono, M. T., Mathius, N. T., Purwantara, A. 2005. Konstruksi  pustaka cDNA dari daun klon karet AVROS 2037 yang diinfeksi patogen Corynespora cassiicola. Menara  Perkebunan, No. 73 (vol. 2), hal: 44‐62   

6