LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

   

LAPORAN PRAKTIKUM  REKAYASA GENETIKA       

LAPORAN VI  (BIOINFORMATIKA)       

             

KHAIRUL ANAM  P051090031/BTK          BIOTEKNOLOGI  SEKOLAH PASCASARJANA  INSTITUT PERTANIAN BOGOR  2010  0   

   

BIOINFORMATIKA    TUJUAN  Tujuan praktikum ini adalah untuk :  1. Menentukan  jenis  fragmen  DNA  atau  gen  berdasarkan  urut‐urutan  nukleotida  hasil  sekuensing.  2. Membuat  analisis  situs  restriksi,  kesamaan,  kemiripan  dan  filogenetik  berdasarkan  urut‐ urutan nukleotida.  3. Menentukan ORF dan CDS (coding sequence) suatu fragmen DNA.  4. Membuat deduksi asam amino dan membuat analisis kesamaan, kemiripan dan filogenetik  tree berdasakan pada deduksi asam amino.  5. Menentukan domain deduksi asam amino dan menginterpretasikan peran metabolismenya.  6. Menentukan jenis protein/enzim berdasarkan pada nilai hidrofobisitasnya.  TINJAUAN PUSTAKA  Bioinformatika, sesuai dengan asal katanya yaitu "bio" dan "informatika", adalah gabungan  antara  ilmu  biologi  dan  ilmu  teknik  informasi  (TI).  Pada  umumnya,  Bioinformatika  didefenisikan  sebagai  aplikasi  dari  alat  komputasi  dan  analisa  untuk  menangkap  dan  menginterpretasikan  data‐ data  biologi.  Ilmu  ini  merupakan  ilmu  baru  yang  yang  merangkup  berbagai  disiplin  ilmu  termasuk  ilmu  komputer,  matematika  dan  fisika,  biologi,  dan  ilmu  kedokteran,  dimana  kesemuanya  saling  menunjang dan saling bermanfaat satu sama lainnya. Ilmu bioinformatika lahir atas insiatif para ahli  ilmu komputer berdasarkan artificial intelligence. Mereka berpikir bahwa semua gejala yang ada di  alam ini bisa dibuat secara artificial melalui simulasi dari gejala‐gejala tersebut. Untuk mewujudkan  hal  ini  diperlukan  data‐data  yang  yang  menjadi  kunci  penentu  tindak‐tanduk  gejala  alam  tersebut,  yaitu gen yang meliputi DNA atau RNA. Bioinformatika ini penting untuk manajemen data‐data dari  dunia  biologi  dan  kedokteran  modern.  Perangkat  utama  Bioinformatika  adalah  program  software  dan didukung oleh kesediaan internet (Utama, 2002).  Bioinformatika  adalah  organisasi  dan  analisis  komplek  data  yang  dihasilkan  dari  analisa  molekuler  dan  teknik  biokimia.  Disamping  itu  bioinformatika  merupakan  teknologi  untuk  koleksi,  peyimpanan analisis, interprestasi, pelepasan dan aplikasi untuk informasi biologi. Analisi dilakukan  dengan  cara  membandingkan  data  yang  masuk  dengan  ribuan  data  lain  yang  tersedia  di  dalam  pangkalan data (Nuswantara, 2000).  Seiring  dengan  perkembangan  bioinformatika  yang  amat  pesat,  informasi‐informasi  baru  dalam bidang ini terus bermunculan. Pangkalan data urutan DNA, RNA dan protein sangat berperan  untuk  mendukung  berbagai  kegiatan  penelitian  bioteknologi  termasuk  menggali  berbagai  potensi  biologis di tengah  beraneka ragamnya organisme (Nuswantara, 2000).  Secara rutin para peneliti mengirimkan urutan‐urutan DNA, RNA atau asam amino kepada bank data  dan  diolah  menurut  kebutuhan.  Hasil  yang  diperoleh  umumnya  berupa  analisis  kesamaan  dan  1   

    beberapa  jenis  statistik  dari  urutan  basanya  yang  dilakukan  secara  cepat  oleh  komputer  dengan  membandingkan data yang di input dengan data yang disimpan oleh bank data (Nuswantara, 2000).  Pada  suatu  proyek  penelitian  biology  molekuler  khususnya  yang  berkaitan  dengan  analisis  urutan  DNA, RNA atau asam amino, esensi keberadaan bank data DNA sangat besar sehingga keberhasilan  eksperiman  sangat  bergantung  pada  tersedianya  pangkalan‐pangkalan  data  ini.  Tanpa  pangkalan  data urutan‐urutan DNA tidak dapat disimpulkan (Lewitter, 1987).  Selain  analisa  kesamaan,  bank  data  biasanya  menyediakan  pula  fasilitas  perangkat  lunak  yang  dapat  mengolah  DNA,  RNA  atau  protein  menjadi  bentuk  dua  dimensi  hingga  struktur  tiga  dimensi yang dapat diputar dan dilihat dari berbagai sudut (Lewitter, 1987).  Analisis  keragaman  untuk  asam  nukleat  dan  protein  dalam  bentuk  dendogram  merupakan  salah satu fasilitas lain dari bank data. Perangkat analisis lainnya adalah untuk pembuatan harr plot,  peta  restriksi,  analisis  hidrofobisitas  suatu  protein  dan  masih  banyak  fasilitas  lain  yang  dapat  mempermudah kerja seorang peneliti (Nuswantara, 2000).  Sekuen sebagian digunakan untuk menemukan potensi homolog yang akan digunakan untuk  menduga  fungsi  dari  query  sekuen  yang  merupakan  target  sekuen  yang  dibutuhkan  untuk  menganalisis atau untuk membantu dalam permodelan pada struktur 3 dimensi (Rashidi and Lukas,  2000).  Setelah informasi terkumpul dalam database, langkah berikutnya adalah menganalisa data.  Pencarian  database  umumnya  berdasar  hasil  alignment/pensejajaran  sekuen,  baik  sekuen  DNA  maupun  protein.  Metode  ini  digunakan  berdasar  kenyataan  bahwa  sekuen  DNA/protein  bisa  berbeda sedikit tetapi memiliki fungsi yang sama. Misalnya protein hemoglobin dari manusia hanya  sedikit  berbeda  dengan  yang  berasal  dari  ikan  paus.  Kegunaan  dari  pencarian  ini  adalah  ketika  mendapatkan  suatu  sekuen  DNA/protein  yang  belum  diketahui  fungsinya  maka  dengan  membandingkannya  dengan  yang  ada  dalam  database  bisa  diperkirakan  fungsi  daripadanya.  Algoritma  untuk  pattern  recognition  seperti  Neural  Network,  Genetic  Algorithm  dll  telah  dipakai  dengan  sukses  untuk  pencarian  database  ini.    Salah  satu  perangkat  lunak  pencari  database  yang  paling  berhasil  dan  bisa  dikatakan  menjadi  standar  sekarang  adalah  BLAST  (Basic  Local  Alignment  Search  Tool).  Perangkat  lunak  ini  telah  diadaptasi  untuk  melakukan  alignment  terhadap  berbagai  sekuen  seperti  DNA  (blastn),  protein  (blastp),  dsb.  Baru‐baru  versi  yang  fleksibel  untuk  dapat  beradaptasi  dengan  database  yang  lebih  variatif  telah  dikembangkan  dan  disebut  Gapped  BLAST  serta  PSI  (Position  Specific  Iterated)‐BLAST.  Sementara  itu  perangkat  lunak  yang  digunakan  untuk  melakukan alignment terhadap sekuen terbatas di antaranya yang lazim digunakan adalah CLUSTAL  dan CLUSTAL W (Witarto, 2002).  

2   

    BAHAN DAN METODE KERJA  Bahan  Urut‐urutan DNA hasil sekuens, data urutan DNA dan protein di GenBank, perangkat lunak di  GenBank dan beberapa website, BioEdit versi 7.0.0 dan Treecon.  Metode  Penyiapan Data Format FastA  1. Notepad dibuka melalui ”Start” Æ “All Program” Æ “Accessories” Æ “Notepad”   2. Data urutan DNA hasil sekuensing dipindahkan ke program “Notepad” tersebut dengan cara  mengkopi dan paste.  3. Data diatur dalam format fastA sebagai berikut :    > nama urutan DNA   

  ATGC...dst (urutan hasil sekuensing DNA) 

4. File disimpan dan diberi nama.  Penyejajaran DNA dengan data DNA di GenBank   1. Ketik 

http://www.ebi.ac.uk 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov 

untuk  untuk 

website 

GenBank 

UniEropa 

(EMBL), 

website 

GenBank 

Amerika 

Serikat, 

http://www.ddbj.nig.ac.jp untuk website GenBank Jepang (DDBJ).   2. Pada website EMBL, diklik ”tools” Æ klik ”similarity and homology” Æ klik Blast2‐NCBI  3. Pada opsi ”DATABASE” diubah dari ”protein” menjadi ”nucleic acid”.  4. Urutan  DNA  hasil  sekuensing  dimasukkan  ke  form  dalam  program  tersebut  dengan  cara  memblok data sekuens (dalam format fastA) dan dicopy paste pada form yang tersedia, atau  dengan meng‐upload file sekuens DNA (dalam notepad file) dengan mengklik “choose”.  5. Setelah data berhasil diupload, klik “RUN Blast” dan ditunggu hasilnya.  6. Hasil menunjukkan kesejajaran DNA hasil sekuens kita dengan jenis atau gen pada GenBank.   7. Identitas  hasil  kesejajaran  dicatat  sebagai  kata  kunci  (keyword)  pada  tahap  analisis  kekerabatan urutan DNA maupun pembuatan pohon filogenetik.    Analisis Kekerabatan Urutan DNA dan Pembuatan Pohon Filogenetik   1. Ketik http://www.ebi.ac.uk/srs enter.  2. Klik ”library page” dan pada window library page ini dipilih database yang diperlukan, contoh  EMBL (coding sequence) ditandai (√) pada menu ”nucleotida sequence”   3. Klik ”Query Form” dan tunggu.  3   

    4. Pada  kolom  yang  disediakan  dimasukkan  kata  kunci  hasil  blast  dan  kata  kunci  lain  seperti  nama tingkatan taksonomi yang akan dibandingkan dengan hasil sekuens kita. Klik ”search”.  5. Ditampilkan data urutan‐urutan DNA sesuai dengan kata kunci yang kita masukkan. Jumlah  tampilan yang sesuai dengan sekuens DNA kita ditunjukkan dengan angka yang terlihat pada  bagian  atas  hasil.  Jumlah  tampilan  yang  dapat  dilihat  dalam  satu  tampilan  dapat  dirubah  dengan mengubah jumlah angka ”show” pada ”Display Option”  6. Dipilih beberapa aksesi sesuai dengan tujuan analisis. Pada DNA yang dipilih ditandai dengan  (√).   7. Untuk  menampilkan  format  FastA  pada  hasil,  pada  opsi  ”Display  Option”  diganti  dari  ”EMBLCDSSeqSimpleView” menjadi ”FastaSeqs” kemudian klik ”Apply Display Option”.  8. Semua aksesi yang muncul diblock, dicopi dan dipaste di bawah urutan DNA kita.  9. Format  fastA  DNA  kita  dan  sekuens‐sekuens  DNA  yang  berkerabat  dengannya  diatur  agar  rapi, komunikatif dan dapat dibaca oleh program filogenetik tree.    Pembuatan Pohon Filogenetik dengan MAFFT version 6.0   1. Diketik website : http://align.bmr.kyushu‐u.ac.jp/mafft/online/server/   2. Data aksesi urutan DNA kita dan kerabatnya dimasukkan ke dalam form yang tersedia dalam  format fasta.  3. Diklik “submit” dan ditunggu.  4. Diklik “phylogenetic tree”   5. Diklik “GO”  6. Ditandai (√) pada ”NJ Åconserved sites (61 nuc)”  7. Diklik (√) ON pada ”Bootstrap” dan diklik ”GO”  8. Filogenetic Tree tampil jika pada PC atau laptop telah diinstal “java”.    Analisis Urutan DNA dan Enzim Restriksi yang berperan  1. Diketik website : http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php   2. Dimasukkan data hasil sekuens DNA kita dengan namanya.  3. Diklik “submit” dan ditunggu.  4. Ditampilkan  peta  situs  enzim  restriksi  yang  dapat  digunakan  untuk  memotong  urutan  DNA  kita.  Analisis Deduksi Protein dari urutan DNA  1. Diketik website : http://www.expasy.org/tools/   4   

    2. Pada opsi “DNA Æ Protein” diklik “Translate”   3. Urutan  DNA  dalam  format  fastA  dimasukkan  ke  dalam  form  dengan  cara  copi  dan  paste   atau upload.   4. Diklik ”Translate”   5. Dimasukkan  urutan  DNA  hasil  sekuens  kita  (tanpa  nomor  dan  nama  urutan  DNA)  dan  klik  ”Translate Sequence”  6. Terdapat  beberapa  frame  hasil  translasi  (urutan  asam  amino).  Dipilih  hasil  translasi  yang  mempunyai  kesejajaran  yang  tinggi  dengan  database  protein,  biasanya  yang  mempunyai  urutan asam amino panjang diawali dengan ”Met” dan diakhiri dengan ”Stop”.  7. Dilakukan analisis kekerabatan dan pembuatan pohon filogenetik pada urutan asam amino  seperti pada asam nukleat.    Analisis Domain Protein pada Program Prosite   1. Diketik website : http://www.expasy.org/tools/   2. Diklik “PROSITE” pada bagian atas website.  3. Dimasukkan urutan asam amino yang diperoleh dari hasil translate urutan sekuens DNA kita  dengan cara copi dan paste ke form yang tersedia, dimulai dari “Met” dan diakhiri dengan  “Stop”.  4. Unklik (√) “Exclude” sehingga tanda (√) hilang.  5. Diklik “Scan” dan ditunggu hasilnya.   6. Diperoleh hasil yang siap untuk dianalisis.     Analisis Hidrofobisitas Protein Menggunakan Metode Kyte‐Doolittle  1. Diketik website : http://gcat.davidson.edu/rakarnik/KD.html (Kyte Doolittle Homepage)  2. Diklik ”perform a Kyte‐Doolittle for hydropathy plot on your sequence”.  3. Dimasukkan urutan asam amino yang kita miliki ke dalam form yang telah disediakan.  4. Diklik “Submit” dan ditunggu hasilnya.  5. Diperoleh hasil yang siap untuk dianalisis.   

5   

    HASIL DAN PEMBAHASAN    Hasil  Dari  hasil  praktikum  yang  telah  diacarkan  maka  kami  diberikan  tugas  untuk  mencari  salah  satu jenis sekuen dan membuat primernya. Berdasarkan hal tersebut diatas maka pada laporan ini  saya  menggunakan  sekuen  dari  enzim  hydrogenase  yang  diambil  dari  Eschercia  coli  sejumlah  1740  bp  dan  membandingkannya  dengan  3  jenis  enzim  hydrogenase  pada  E.  coli  dengan  strain  yang  berbeda yang data sekuennya terdapat di bankdata dengan maksud untuk tujuan tersebut diatas.   Dengan  memasukkan  kata  kunci  hydrogenase  pada  http://www.ebi.ac.uk  maka  akan  didapatkan  14.435 sekuen yang berkenaan dengan hydrogenase. Kemudian dipilih salah satu untuk  diakses  sekuensnya.  Pada  praktikum  ini  dipilih  M28369:  E.  coli.  sebagai  ‘unknown  sequence’,  tampilan http://www.ebi.ac.uk dapat dilihat pada gambar 1.     >ENA|M28369|M28369  Escherichia  coli  hydHG  operon  regulating  labile  hydrogenase  activity.  :  Location:1..1000  ggtaagtcaggatgcaaacagccgggagatccagttacgctttaccgccaacgacacatt  accggaaattcaggccgacccggacaggctgactcaggtcgtgttgaatctctatctcaa  tgctattcaggcgattggtcagcatggcgtgattagcgtgacggccacgaaagccggcgg  ggtaaaaatcagcgttaccgacagcggtaagggaattgcggcagatcagcttgatgccat  cttcactccgtacttcaccactaaagccgaaggcaccggattggggctggcggtcgtgca  taatattgttgaacaacacggtggtacaattcaggtcgcaagccaggagggaaaaggctc  aacgttcaccctctggcttccggtcaatattacgcgtaaggacccacaaggatgacgcac  gataatatcgatattctggtggtggatgatgacattagccactgcactattttgcaggct  ttactgcgcggctggggctataacgtcgcgctggcgaacagcgggcgacaggcgttggag  caggtgcgggaacaggtttttgatcttgtgctttgcgatgtgcgaatggcggagatggac  ggcatcgccacgctgaaagagatcaaagcgttaaacccggcaattccggtgctgattatg  actgcgtactccagcgtcgagacggcggtagaggcactgaaaactggggcgctggattat  ctcatcaagccgctggatttcgataacctacaggcgacgtggaaaaagcgctcgcatacg  cacagtattgatgctgaaacacctgcggtgactgccagccagttcggtatggtcggtaaa  agcccggcgatgcaacacctgctcagtgaaatcgccctcgtcgcgccatgcgaagccacg  gtactgatccacggcgattcggcacgtaaagagctggtcgccaggggacttcacgccagt  agcgcacgtagcgaaaaaccgctggtaacgctcaactgtg    Gambar 1.  Sekuens  dari dipilih M28369 sebagai ‘unknown sequence’ yang akan dibandingkan    Kemudian sekuen ini dikopi dari http://www.ebi.ac.uk ke notepad. Lalu dicari sekuen lainnya  dengan  memanfaatkan  NCBI  blast.  Dari  situs  tersebut  diperoleh  kode‐kode  sekuen  yang  memiliki  kemiripan dengan M28369 yang juga berasal dari E. coli. Maka dipilihlah tiga kode yang sama‐sama  berasal dari E. coli.    6   

    Dari kode‐kode tersebut, dimasukkan ke dalam sistem pencari di http://www.ebi.ac.uk maka  diperoleh  sekuen‐sekuen  yang  dibutuhkan.  Sekuen‐sekuen  tersebut  dikopi  lalu  dipasta  di  notepad.  Dengan  program  bioedit  maka  diperoleh  bahwa  data  tersebut  tidaklah  conserve  terhadap  sesamanya. Oleh karena itu perlu dilakukan desain primer dengan memperhatikan hal‐hal berikut:  ‐  Tm‐nya  ‐  %GC lebih baik kalo sekitar 50%, karena kalau terlalu banyak AT maka Tm akan turun/rendah  ‐  Dimer, antara primer F dan R tidak boleh komplemen, bisa saling menempel, sehingga  primer tidak  efektif. Selain itu, di dalam primernya sendiri tidak boleh ada dimer  ‐  Komplemen antar primer dan intra primer    Apabila  dipilih  sekuen  berikut  sebagai  primer  Forward  yaitu  GCWATTSCGGTGCTGAYTAT,  sekuen  yang  berasal  dari    daerah  bp  600‐an,  maka  dari  sekuen  tersebut  akan  dihasilkan  mRNA.sedangkan  untuk  sekuen  reversenya  merupakan  komplemen  dari  mRNA,  sehingga  dibuat  komplemennya  agar  diperoleh  sekuen  sebagai  mRNA.  Maka  urutanya  dari  urutan  (daerah  bp  800‐ an)  TTTCACTGAGCAGGTGTTGC  diperoleh  primer  reversenya  adalah  AAWGTGACTSGTCCACWACG.  Primer‐primer  ini  didesain  karena  daerah  dalam  gen  antara  organism  yang  satu  dengan  yang  lain  tidak conserve.    Pembahasan  Maka  untuk  mengisolasi  gen  hydrogenase  dari  E.  Oli  dapat  digunakan  primer  sebagai  berikut,  dimana  primer  F  adalah  GCWATTSCGGTGCTGAYTAT  dan  primer  R  adalah  AAWGTGACTSGTCCACWACG. Apabila dianalisa %GCnya maka akan diperoleh Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)  = 2 (4+7) + 4 (5+4) = 22 + 36 = 58 sedangkan untuk reversenya diperoleh Tm = 2 (7+3) + 4 (4+6) = 20  + 40 = 60. Maka diperoleh suhu annealing dari primer‐primer tersebut adalah antara 58‐60°C.   Ketika  akan  melakukan  isolasi  gen  hydrogenase  yang  berasal  dari  E.  coli,  maka  bahan  dan  kondisi  PCR  nya  dapat  dilakukan  sebagai  berikut:  Komposisi  PCR  terdiri  dari  1  ul  dNTP,  0,5  ul  taq  polymerase,  1  ul  buffer  mix,  0,4  ul  DMSO,  1,5  ul  cDNA,  0,5  ul  primer  hyd  F  GCWATTSCGGTGCTGAYTAT,  0,5  ul  primer  hyd  R  AAWGTGACTSGTCCACWACG  dan  ddH2O  hingga  volume 10 ul. PCR dilakukan pada kondisi Pra PCR (predenaturasi) pada suhu 94oC selama 5 menit,  denaturasi  pada  suhu  94oC  selama  30  detik,  annealing  (penempelan)  pada  suhu  58oC  selama  30  detik, pemanjangan 72oC selama 1 menit, pasca PCR 72oC selama 5 menit, pendinginan pada suhu  15oC selama 15 menit. Semua proses di atas dilakukan sebanyak 30 siklus.     7   

    SIMPULAN  1. Dengan memahami bagaimana mendesain primer maka dapat diketahui bagaimana cara  untuk mengisolasi sebuah gen dari suatu organisme yang sekuennya belum kita ketahui  dengan memanfaatkan bank data yang sudah ada di internet.   2. Setelah  mengetahui  primer  yang  dibutuhkan,  maka  dicari  pula  suhu  annealing  yang  tepat untuk proses penempelan primer pada gen target.  3. Untuk  sekuen  yang  informasinya  masih  kurang  pada  suatu  organism,  maka  untuk  mengisolasinya perlu menggunakan primer yang tidak terlalu spesifik.    DAFTAR ACUAN  Lewitter F1 1987 Online use of the GenBank Genetik Seguence Data Bank. Development in Industrial  Microbiology. Vol. 27 Journal of Industrial Microbiology Suppl. No. 1   

Nuswantara S. 2000. Internet untuk biologi molekuler. Warta Biotek Vol.14 No 2 Juni 2000.   

Rashidi,  H.H.  &  L.K.  Buehler.    2000.    Bioinformatics  Basics.    Applications  in  Biological  Science  and  Medicine. CRC Press.  London.  pp 173.    

Utama, A. 2003. Peran Bioinformatika dalam Dunia Kedokteran. Ilmu Komputer. Jakarta.   

Witarto,  AB.  2003.  Bioinformatika  Mengawinkan  Teknologi  Informasi  dengan  Bioteknologi.  Ilmu  Komputer, Jakarta.    

8   

    LAMPIRAN 

     

  9   

   

   

     

10   

   

     

   

11   

   

   

     

12   

   

   

     

13   

   

   

   

14   

   

   

     

  15