LAPORAN PRAKTIKUM REKAYASA GENETIKA

LAPORAN PRAKTIKUM  REKAYASA GENETIKA           

LAPORAN III  (DNA REKOMBINAN)   

                         

    KHAIRUL ANAM  P051090031/BTK                BIOTEKNOLOGI  SEKOLAH PASCASARJANA  INSTITUT PERTANIAN BOGOR  2010  0   

DNA REKOMBINAN 

TUJUAN  Praktikum  ini  bertujuan  untuk  mengetahui  dan  memahami  prinsip  teknik  teknologi  DNA  rekombinan.  TINJAUAN PUSTAKA  Elusi   

Elusi  atau  isolasi  fragmen  tunggal  DNA  adalah  proses  pemisahan  fragmen  DNA  target  dari 

campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen  tersebut  dapat  digunakan  untuk  pelacak  dalam  mendeteksi  gen  DNA  lain  dan  dapat  dicangkokkan  ke  fragmen  DNA  lainnya.  Fragmen  DNA  yang  tidak  tercampur  dengan  fragmen  DNA  lainnya  diperoleh  melalui  beberapa  tahap.  Tahap  pertama  adalah  pemisahan  fragmen  yang  ingin  diisolasi  dari  fragmen  lainnya  dengan  pemotongan  menggunakan  enzim  restriksi  atau  hasil  PCR,  yang  dilanjutkan  dengan  elektroforesis  menggunakan  gel  agarose.  Tahap  selanjutnya  adalah  mendeteksi  fragmen  yang  akan  diisolasi  dan  memotong  gel  agarose  yang  mengandung  fragment  tersebut.  Tahap  terakhir  adalah  mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral  dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat.     

Sekarang telah banyak perangkat (kit) yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari gel agarose, 

antara  lain:  GFXTM  PCR  DNA  dan  Gel  Band  Purification  Kit  dari  Amersham  Pharmacia  Biotech.  Pada  praktikum  ini  dilakukan  isolasi  DNA  dari  gel  agarose  dengan  menggunakan  metode  yang  relatif  sederhana dan murah. Selain itu juga akan digunakan kit dari gel agarose dengan GFXTM PCR DNA dan  Gel  Band  Purification  Kit  dari  Amersham  Pharmacia  Biotech  untuk  memberi  gambaran  tentang  penggunaan  kit,  walaupun  dalam  pelaksanaan  praktikum  ini  kit  yang  digunakan  adalah  produk  lain,  namun prosedurnya memiliki kemiripan.  Ligasi  Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di  dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis  vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain  yang  digunakan  untuk  organisme  selain  bakteri,  yaitu  Yeast  Artificial  Chromosomes  (YAC),  Bacterial  Artificial Chromosomes (BAC), Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors (Barnum, 2005).  

1   

 

Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Enzim ligase adalah enzim 

yang  berfungsi  menggabungkan  fragmen  DNA  yang  telah  dipotong  dengan  enzim  restriksi  dengan  fragmen DNA vector. DNA insert (fragmen DNA asing) dipotong pada bagian yang sesuai dengan bagian  pemotongan  DNA  vector,  sehingga  keduanya  dapat  saling  berkomplemen.  Terdapat  dua  jenis  enzim  ligase  yang  dihasilkan  oleh  Escherichia  coli,  diantaranya  T4  DNA  Ligase    yaitu  enzim  ligase  yang  dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 dan E.coli DNA Ligase yaitu enzim ligase yang  dihasilkan oleh E.coli sendiri. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi mensintesis pembentukan ikatan  phosphodiester  yang  menghubungkan  nukleotida  yang  satu  dengan  nukleotida  di  sebelahnya.  Perbedaan dari kedua enzim tersebut hanya terletak pada kofaktornya, pada T4 DNA Ligase adalah ATP  sedangkan pada E.coli DNA Ligase adalah NAD+ (Muladno, 2002).   

Enzim  ligase  hanya  dapat  menggabungkan  fragmen  DNA  yang  mempunyai  ujung  tidak  rata 

(sticky  end)  yang  saling  berkomplemen  dan  ujung  rata  (blunt  end).  Enzim  ligase  mengkatalisasi  pembentukan  ikatan  kovalen  antara  gula  dengan  phosphate  dari  nukleotida  yang  berdekatan,  yang  menghendaki  satu  nukleotida  mempunyai  ujung  5’  phosphate  bebas  dan  nukleotida  yang  berdekatan  mempunyai  ujung  3’gugus  hidroksil.  Enzim  ligase  tidak  membedakan  DNA‐DNA  dari  organisme  yang  berbeda. Oleh karena itu, dua fragmen DNA dari organisme yang berbeda pun dapat digabungkan oleh  enzim  ini.  Kedua  fragmen  ini  kemudian  menjadi  satu  molekul  DNA  yang  disebut  sebagai  DNA  rekombinan. DNA rekombinan ini tidak dapat dilihat keberhasilannya kecuali dengan memperbanyaknya  di dalam sel inang. Proses ini disebut sebagai transformasi atau cloning gen (Barnum, 2005).   

Ligasi  berhasil  bila  kedua  ujung  yang  akan  disambungkan  berkomplemen.  Kecocokan  yang 

sangat  spesifik  dibutuhkan  bila  fragmen  DNA  yang  akan  disambungkan  mempunyai  ujung  tidak  rata  (sticky end), karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A  dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata (blunt end) dapat  disambungkan  dengan  sembarang  fragmen  DNA  lain  yang  berujung  rata.  Oleh  karena  itu  untuk  mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA  yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata (Suharsono dan Widyastuti, 2006).     Transformasi  Transformasi adalah penyisipan materi genetik eksternal yang berupa fragmen DNA, baik DNA  kromosom  maupun  DNA  plasmid  ke  dalam  sel.  Transformasi  bakteri  mula‐mula  diperkenalkan  oleh  Frederick  Griffith  pada  tahun  1982,  berdasarkan  kenyataan  bahwa  suatu  bakteri  dapat  melepaskan  fragmen  DNA‐nya  ke  dalam  suatu  medium  yang  kemudian  akan  masuk  ke  dalam  sel  bakteri  yang  lain  2   

dalam  kultur  tersebut.  Di  alam,  fragmen  DNA  tersebut  biasanya  dilepaskan  oleh  sel  bakteri  yang  mati  atau  mengalami  autolisis.  Namun,  terdapat  sel  lain  yang  ternyata  memang  melepaskan  fragmen  DNA  pada saat pertumbuhan karena adanya gen tra.   Pada  percobaan  ini,  akan  dilakukan  transformasi  pada  E.  coli  yang  sensitif  terhadap  ampisilin  dengan  plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin. Jika transformasi yang dilakukan berhasil dengan baik,  maka E. coli tersebut akan mengekspresikan gen resisten ampisilin sehingga dapat bertahan hidup pada  media yang mengandung ampisilin.      Polimerase Chain Reaction (PCR)  PCR  adalah suatu reaksi invitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu  dengan  cara  mensintesis  molekul  DNA  baru  yang  berkomplemen  dengan  molekul  DNA  target  dengan  bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer, dan dilakukan di dalam thermocycler. Panjang target  DNA  berkisar  antara  puluhan  sampai  ribuan  nukleotida  yang  posisinya  diapit  sepasang  primer.  Primer  yang  berada  sebelum  target  disebut  primer  forward  dan  primer  yang  berada  setelah  target  disebut  primer  reverse.  Enzim  yang  digunakan  sebagai  pencetak  rangkaian  molekul  DNA  baru  disebut  sebagai  enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga dNTPs  yang  mencakup  dATP  (nukleotida  berbasa  Adenine),  dCTP  (nukleotida  berbasa  Cytosine)  dan  dTTP  (nukleotida berbasa Thymine) (Muladno, 2002).  PCR  adalah  suatu  metode  yang  menggunakan  komponen‐komponen  replikasi  DNA  untuk  mereplikasi suatu fragmen DNA yang spesifik di dalam tabung reaksi. Metode ini dikembangkan untuk  mempercepat  isolasi  DNA  spesifik  tanpa  membuat  dan  melakukan  pustaka  genom.  Dua  primer  oligonukleotida  pendek  digunakan  untuk  mengapit  daerah  DNA  yang  akan  diamplifikasi.  Primer  menguatkan dan mencangkok target sequens, satu dari setiap strand dari double strand DNA molekul.  Primer menetapkan limit daerah yang akan diamplifikasi dan DNA polymerase mereplikasi DNA diantara  primer  menggunakan  empat  deoksiribonukelotida  (dGTP,  dATP,  dCTP,  dTTP)  yang  disediakan  di  dalam  tabung reaksi dengan penambahan dNTPs. Di dalam sebuah siklus amplifikasi (=replikasi), DNA template  didenaturasi  pada  temperature  tinggi,  annealing  primer  dilakukan  dengan  menurunkan  temperature  dan  DNA  polymerase  memperpanjang  DNA  dari  primer.  Pengulangan  siklus  denaturasi,  annealing  primer, dan sintesis DNA menghasilkan DNA melalui amplifikasi secara eksponensial. Sekitar 25 sampai  40  siklus  pada  umumnya  digunakan  di  dalam  thermalcycler,  yaitu  sebuah  instrumen  yang  secara  otomatis  mengontrol  temperature  dan  waktu.  Suatu  DNA  polymerase  khusus  –  Taq  polymerase,  yang  diisolasi dari suatu bakteri thermofilik, Thermus aquaticus, yang hidup di hot spring – yang stabil pada  3   

temperature  tinggi  digunakan  untuk  mendenaturasi  DNA  template.  Produk  yang  dihasilkan  dari  PCR  dianalisa menggunakan elektroforesis gel agarose (Barnum, 2005).   Beberapa  komponen  yang  penting  yang  dibutuhkan  dalam  reaksi  PCR  adalah  :  DNA  target,  primer,  enzim  Taq  DNA  polymerase,  deoksinukleoside  triphosphat  dan  larutan  penyangga  (buffer).  Molekul  DNA  yang  targetnya  akan  dilipatgandakan  jumlahnya  dapat  berupa  untai  tunggal  atau  untai  ganda. Jumlah yang digunakan dalam proses PCR tidak terlalu berpengaruh terhadap kualitas hasil PCR,  tetapi jumlah dalam ukuran pikogram sudah cukup. DAlam menentukan jumlah ini, dapat pula dilakukan  ujicoba dengan berbagai ukuran, misalnya 10, 100, atau 1000 pikogram sehingga diperoleh kualitas PCR  yang  paling  baik.  Apabila  target  yang  digunakan  berupa  total  DNA  genom,  sebaiknya  DNA  tersebut  dipotong  terlebih  dahulu  dengan  enzim  tertentu  sehingga  potongan  DNA  yang  dihasilkan  masih  berukuran  cukup  besar,  misalnya  enzim  Sal  I  atau  Not  I  yang  mempunyai  sedikit  situs  pemotongan  di  dalam total  DNA genom.  Primer atau oligonukleotida sebaiknya berukuran  paling pendek 16 basa dan  biasanya berkisar antara 18 – 24 basa (Muladno, 2002).    Restriksi  Enzim  restriksi  adalah  enzim  yang  bekerja  untuk  memotong  fragmen  DNA  pada  situs  spesifik.  Seperti  diketahui,  di  dalam  Bioteknologi  terdapat  dua  kategori  enzim  yang  berperan  dalam  proses  rekombinasi  DNA,  yaitu  enzim  yang  berperan  dalam  isolasi  DNA  dan  penyiapan  DNA  rekombinan  (di  mana  dua  molekul  DNA  dikombinasikan).  DNA  spesifik  atau  gen  diisolasi/diambil  dari  DNA  dengan  memotong sugar–phosphat backbone DNA asalnya, dan DNA dari dua sumber yang berbeda dicampur  dan dikombinasi. Molekul DNA rekombinan  tidak dapat dibuat  dengan mudah tanpa adanya dua jenis  enzim, yaitu: enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada  situs  spesifik  dan  DNA  ligase  yang  berperan  sebagai  lem  yang  merekatkan  dua  molekul  DNA  di  dalam  tabung  reaksi.  Restriksi  endonuklase  memotong  sugar–phosphat  backbone  DNA  pada  kedua  utasnya.  Restriksi endonuklease mengenali urutan spesifik di dalam molekul DNA. Urutan yang spesifik tersebut  pada  umumnya  terdiri  dari  4  –  6  pasang  basa  dan  bersifat  palindromik  (palindrom).  Palindrom  merupakan daerah yang memiliki urutan basa yang sama dengan utas pasangannya jika dibaca dari arah  yang sama yaitu 5’ – 3’ (Suharsono dan Widyastuti, 2006).  Setiap  enzim  restriksi  mengenali  urutan  spesifik  dan  memotong  hanya  di  tempat‐tempat  tertentu  dari  urutan  basa  tersebut.  Enzim  restriksi  memotong  DNA  double  strands  dengan  memutus  ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida  yang  berbatasan  dengannya.  Terdapat  dua  tipe  hasil  pemotongan,  ujung  rata  (blunt  end)  dan  ujung  4   

kohesif (sticky end). Ujung rata (blunt end) dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang  sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif (sticky end)  dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas (5’  atau  3’)  menggantung  dengan  beberapa  nukleotida.  Akhiran  single  strand  yang  tidak  rata  ini  dapat  berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut “sticky” (mudah lengket) atau  kohesif (Suharsono dan Widyastuti, 2006).    Protolas   

Sel tanaman atau fungi pada umumnya dilindungi oleh dinding sel dari selulosa yang keras untuk 

menopang  struktur  tanaman  atau  fungi.  Sel  tanaman  atau  fungi  yang  telah  kehilangan  dinding  selnya  disebut dengan istilah protoplas. Protoplas dapat diisolasi dari berbagai macam jaringan ataupun organ  tanaman seperti daun, tunas, akar, buah dan miselia fungi (Wikipedia, 2010). Transformasi DNA asing ke  berbagai  kapang  berfilamen  juga  dapat  dilakukan  melalui  transformasi  protoplas  yang  ke  dalamnya  dimasukkan plasmid yang dapat memproduksi protein yang diinginkan.    Gen gfp  Tujuan  dari  pembuatan  organisme  transgenik  yang  dapat  berpendar  pada  dasarnya  adalah  untuk pemantauan suatu proses eksperimen atau biokimia di dalam sel tubuh makhluk hidup.   Untuk  proses  eksperimen  rekayasa  genetika  misalnya,  konfirmasi  transformasi  dan  ekspresi  suatu  gen  asing  ke  dalam  sel  inang  sangatlah  penting.  Transformasi  adalah  proses  memasukkan  atau  mencangkokkan  gen  asing  ke  dalam  sel  makhuk  hidup  lain,  dapat  berupa  sel  bakteri,  ragi,  tumbuhan,  ataupun mamalia.   Bagi  para  peneliti,  sangatlah  penting  untuk  dapat  mengetahui  dengan  cepat,  apakah  proses  transformasi  itu  telah  berlangsung  baik  atau  tidak,  dan  apakah  gen  target  dapat  diekspresikan  tanpa  masalah.  Dari  itu,  di  dalam  molekuler  biologi  dikenal  reporter  gene  atau  gen  pewarta.  Yaitu  gen  yang  dapat  memberitahukan  dengan  jelas  pada  para  peneliti  bahwa  proses  transformasi  telah  berjalan  dengan  sukses.  Gen  yang  menghasilkan  protein  yang  dapat  berpendar  hijau  atau  Green  Fluorosceint  Protein  (gfp)    inilah  yang  banyak  dipakai  oleh  para  ilmuwan  sebagai  gen  pewarta  yang  aslinya  berasal  dari ubur‐ubur laut.   Gen asing target yang ingin dicangkokkan ke dalam suatu sel organisme biasanya digabungkan  dengan  gen  gfp  dalam  bentuk  gen  kimera  atau  gen  gabungan,  sehingga  nanti  akan  dihasilkan  protein  baru  fungsional  (yang  menjadi  sifat  baru  organism  tersebut)  dalam  bentuk  protein  gabungan  dengan  5   

gfp. Jadi, jika gen yang digabung dengan gen pewarta berhasil masuk dan fungsional di dalam sel bakteri  E.  coli  misalnya,  maka  sel  E.  coli  yang  berpendar  hijau  di  kegelapan  adalah  bakteri  transgenik  yang  fungsional yang membawa sifat baru. Proses penapisan klon transgenik yang positif menjadi lebih cepat  dan mudah.   Dibandingkan  dengan  gen  pewarta  lain  yang  kebanyakan  enzim  yang  memerlukan  substrat  untuk menghasilkan warna atau pendar cahaya, gfp adalah gen pewarta yang menarik sekaligus mudah  dalam  hal  visualisasi,  karena  untuk  berpendar  gfp  sama  sekali  tak  memerlukan  substrat.  gfp  menghasilkan  sinar  hijau  fluoresens  secara  instrinsik,  ketika  diberi  sinar  eksitasi  pada  panjang  gelombang biru sekitar 395 nanometer. Jadi hanya dibutuhkan lampu UV gelombang panjang atau sinar  biru untuk dapat mendeteksinya dalam kegelapan.   gfp  juga  menjadi  gen  pewarta  idola  dalam  hal  pencitraan  proses tracking  atau  lokalisasi  suatu  protein.  Karena  tidak  perlu  penambahan  substrat  dan  mudah  divisualisasi,  GFP  dapat  diaplikasikan  untuk  memantau  jejak  protein,  kapan  dan  dimana  suatu  gen  terinduksi  menjadi  suatu  protein,  dalam  kondisi sel masih hidup.   Pada  tumbuhan  tembakau  yang  berpendar  hijau  misalnya.  Gen  gfp  diekspresikan  pada  virus  mosaik  yang  biasa  menyerang  tumbuhan  tembakau.  Banyak  hal  yang  masih  belum  diketahui  tentang  interaksi  virus  ini  dengan  tembakau.  Dalam  proses  terinfeksinya  tembakau  dengan  virus  ini  sampai  tembakau menjadi sakit lalu mati, para peneliti tanaman tidak mengetahui lokasi awal timbulnya virus  dan  penyebarannya.  Dengan  memasukkan  virus  mosaik  yang  mengekspresikan  gfp,  maka  tempat  penyebaran virus dapat terpantau hanya dengan membawa tanaman tembakau ini ke ruang gelap dan  menyinarinya dengan lampu UV secara periodik. (Dr. Is Helianti, MSc)    Mikroinjeksi   Upaya  meningkatkan  laju  pertumbuhan  ikan  dengan  metode  selective  breeding  telah  berhasil  dilakukan  pada  beberapa  spesies  ikan  budidaya,  namun  diperlukan  waktu  yang  lama  untuk  mendapatkan  laju  pertumbuhan  yang  diharapkan.  Saat  ini  telah  dikembangkan  metode  baru  yang  berpotensi menggantikan metode selective breeding, yaitu transgenesis, dengan mengintroduksikan gen  ke  embrio  makhluk  hidup  dengan  harapan  bahwa  gen  tersebut  akan  diwariskan  pada  generasi  berikutnya.  Teknik  yang  umum  digunakan  dalam  transgenesis  adalah  mikroinjeksi.  Teknik  mikroinjeksi  dilakukan  dengan  cara  menyuntikkan  konstruksi  gen  ke  dalam  blastodisk  telur  yang  sudah  dibuahi  dengan bantuan micromanipulator. Dengan teknik ini, gen diinjeksikan ke dalam embrio ikan pada fase  1 sel.   6   

BAHAN DAN METODE KERJA  Bahan  Bahan  yang  digunakan  adalah  bakteri  rekombinan  hasil  transformasi,  X‐gal,  IPTG,  primer  forward, primer reverse dan enzim restriksi.  Metode  Isolasi (Elusi) fragmen DNA plasmid dari gel agarosa  Gel hasil elektroforesis plasmid dipotong pada bagian yang mengandung pita DNA yang sesuai  dengan  yang  diinginkan,  pemotongan  dilakukan  di  atas  transilluminator  UV.  Potongan  gel  dimasukkan  ke  dalam  cawan  petri  kemudian  dipotong–potong  atau  dicacah.  Buat  corong  yang  terbuat  dari  bagian  eppendorf  yang  dasarnya  telah  dilubangi  dan  kemudian  dilapisi  membran  nylon  hybond  untuk  menyaring  gel.  Membran  nylon  dibasahi  dengan  50  ul  larutan  penyangga  elusi.  Hasil  cacahan  gel  dimasukkan ke dalam corong yang telah dilapisi membran nylon hybond. 150 ul larutan penyangga elusi  ditambahkan  melalui  membran.  Eppendorf  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  selama  1  menit  pada  suhu  4°C.  150  ul  larutan  penyangga  elusi  ditambahkan  lagi  lalu  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  selama  1  menit  pada  suhu  4°C.  150  ul  larutan  penyangga  elusi  ditambahkan  lagi  lalu  diekstraksi cairannya dengan PCI sebanyak 1x volume supernatan. Larutan divorteks selama 1 menit lalu  disentrifugasi  pada  kecepatan  10.000  rpm  selama  1  menit  pada  suhu  4°C.  supernatan  (fase  atas  dari  hasil sentrifugasi) diambil, lalu larutan diendapkan dengan menambahkan 0,1 volume sodium asetat 3  M,  pH  5  dan  2‐3  volume  etanol  absolut).  Pelet  yang  dihasilkan  dibilas  dengan  etanol  70%  lalu  dikeringkan dengan vakum. Endapan disuspensikan dengan menambahkan 15 – 20 ul dH20.  Ligasi fragmen DNA (insert) dengan vektor  6  ul  vektor  P  Gem  T  easy  dengan  Gen  6α  sebanyak  7  ul,  T4  ligase  sebanyak  0,4  ul,  buffer  T4  ligase  sebanyak  1,5  ul,  dan  dH2O  hingga  volume  akhir  mencapai  15  ul  lalu    diinkubasi  pada  suhu  4  0C  hingga akan dilakukan transformasi.  Pembuatan bakteri kompeten  Satu koloni bakteri E. coli (DH5α) diinokulasikan dengan menggunakan tusuk gigi steril ke dalam  tabung  reaksi  berisi  2  ml  media  LB  cair  yang  mengandung  ampisilin.  Bakteri  diinkubasi  selama  satu  malam pada suhu 37°C di dalam penggoyang (environmental shaker) pada 200‐250 rpm, kemudian 100  ul biakan bakteri ditumbuhkan di dalam 10 ml LB atau SOB pada kondisi lingkungan yang sama dengan  sebelumnya selama 2‐3 jam hingga OD600 = 0,4‐0,5. Sebanyak 1,5 ml biakan bakteri lalu dipindahkan ke  dalam  tabung  sentrifugasi  dan  diinkubasikan  di  dalam  es  selama  10  menit.  Lalu  dilakukan  sentrifugasi  7   

pada kecepatan 4000 g (3000 rpm) dengan swinging bucket rotor, 4°C, selama 10 menit. Cairan dibuang  dan endapan bakteri disuspensikan dengan hati‐hati dalam 16,5 ml TB (transformation buffer; 3 g Pipes  10  mM,  2,2  g  CaCl2.2H2O,  18,2  g  KCl  250  mM,  10,9  g  MnCl2.4H2O  55  mM,  950  ml  H2O,  pH  diatur  6.7  dengan  KOH  dan  ditambah  H2O  hingga  1  l).  Suspensi  bakteri  disimpan  dalam  es  selama  10  menit  kemudian disentrifus pada 3000 rpm (swinging bucket rotor), 4°C, selama 10 menit. Cairan dibuang, lalu  endapannya disuspensikan dengan hati‐hati dalam 1,4 ml TB. Kemudian ditambahkan 100 ul DMSO dan  segera  disimpan  dalam  es  selama  10  menit.  Dalam  keadaan  dingin  (4°C),  50  ul  suspensi  bakteri  dimasukkan  ke  eppendorf  dan  disimpan  dalam  nitrogen  cair.  Setelah  beku,  disimpan  dalam  freezer  ‐ 70°C.   Pengecekan hasil ligasi dengan transformasi    Sebanyak 10 ul (50‐100 ng) DNA plasmid dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang berisi 50  ul sel bakteri kompeten yang tepat mencair. Setelah dihomogenkan, suspensi bakteri dipanaskan pada  42°C  (heat  shock)  selama  45  detik  dan  segera  dimasukkan  kembali  ke  dalam  es.  Suspensi  didiamkan  dalam  es  selama  5  menit.  Tabung  eppendorf  dipindahkan  ke  suhu  ruang  lalu  ditambah  dengan  100  ul  media cair 2xYT. Eppendorf diinkubasikan di alat penggoyang pada 250 rpm, suhu 37C selama 30 menit‐ 1  jam.  Setelah  inkubasi,  suspensi  bakteri  diinokulasikan  secara  merata  di  atas  media  LB  padat  yang  mengandung  ampisilin.  Sterilisasi  batang  kaca  dilakukan  dengan  mencelupkan  ke  dalam  alkohol  kemudian membakarnya dengan api Bunsen dan didinginkan. Untuk menyeleksi adanya sisipan di dalam  plasmid yang mengandung gen lacZ, ditambahkan 0,1 M IPTG (10 ul/cawan) dan 2% X‐gal (50 ul/cawan)  pada permukaan medium. Cawan diinkubasi pada incubator pada suhu 37°C dengan meletakkan cawan  petri  pada  posisi  terbalik  (media  di  bagian  atas).  Bakteri  yang  mengandung  plasmid  yang  tersisipi  fragmen pada situs pengklonan di daerah lacZ akan membentuk koloni berwarna putih, sedang bakteri  yang mengandung plasmid yang tidak tersisipi fragmen akan menghasilkan koloni berwarna biru. Bakteri  yang tidak mengandung plasmid tidak akan membentuk koloni.         Polimerase Chain Reaction  Satu  koloni  putih  yang  tumbuh  pada  media  LA,  ampicilin,  X‐gal,  IPTG  disuspensikan  ke  dalam  tabung  PCR  yang  telah  berisi  8,5  µl  ddH2O  kemudian  di  kocok.  Tusuk  gigi  yang  digunakan  untuk  memindahkan  bakteri  ke  dalam  tabung  PCR  kemudian  di  goreskan  kembali  pada  media  baru  sebagai  stok.  Tabung  PCR  kemudian  diisi  dengan  campuran  PCR  yang  terdiri  dari  1  ul  dNTPrimer  2  µM,  0,5  ul  Primer F 10 µM, 0,5 ul Primer R 10 µM, 0,4 ul DMSO, 1 ul 10x Buffer Tag, 0,1 ul Tag DNA pol sehingga  total larutan yang diperoleh adalah 3,5 ul. Lakukan PCR dengan kondisi Pra PCR pada suhu 94oC selama 5 

8   

menit, denaturasi pada suhu 94oC selama 30 detik, annealing (penempelan) pada suhu 56oC selama 30  detik,  pemanjangan  72oC  selama  1,5  menit,  pasca  PCR  72oC  selama  5  menit,  semua  proses  di  atas  dilakukan sebanyak 30 siklus selama 2,5 jam. Hasil PCR kemudian di elektroforesis selama 30 menit.    Restriksi  Restriksi dilakukan dengan menggunakan 2 ul plasmid (50 µg/ml), 2 ul 10x buffer Eco RI, 0,5 ul  enzim EcoRI 10 U/ul dan 15,5 ul ddH2O, sehingga larutan sampel yang diperoleh adalah 20 ul di dalam  masing‐masing  tabung.  Kemudian,  larutan  diinkubasi  pada  suhu  37oC  selama  2  jam,  kemudian  di  elektroforesis selama 30 menit.    Transformasi gen gfp pada cendawan  Isolasi protoplas Aspergillus niger (A. niger)  Kultur miselia dari A. niger yang berumur 6 hari di saring dan masukkan ke dalam larutan enzim  yang dan diinkubasi di dalam shkare berkecepatan 80 rpm pada suhu 37°C selama 5 jam. Larutan enzim  berfungsi untuk memecah dinding sel fungi sehingga protoplas dari fungi dapat bebas.   Purifikasi protoplas  Kultur  miselia  dalam  enzim  disaring  lalu  dimasukkan  ke  dalam  falkon,  kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  1.500  rpm  pada  suhu  4°C  selama  20  menit.  Supernatan  yang  diperoleh  dibuang  dan  ditambahkan manitol ke dalam falkon sampai dengan 2 ml. Larutan disentrifugasi pada kecepatan 1.500  rpm  pada  suhu  4°C  selama  5  menit,  setelah  itu  supernatan  dibuang.  Ke  dalam  falkon  ditambahkan  larutan  HEPES‐KOH  hingga  volume  2  ml  lalu  disentrifugasi  pada  kecepatan  1.500  rpm  pada  suhu  4°C  selama 5 menit. Pemberian HEPES‐KOH dilakukan 2 kali lalu disentrifugasi kembali dengan kondisi yang  sama.  Supernatant  yang  diperoleh  dibuang  lalu  ke  dalamnya  ditambahkan  larutan  manitol  2  ml  kemudian  disentrifugasi  pada  kecepatan  1.500  rpm  pada  suhu  4°C  selama  5  menit.  Supernatant  yang  diperoleh  dibuang  lalu  ditambahkan  manitol  lagi  hingga  volume  2  ml,  pelet  diresuspensi  dengan  tips  secara perlahan.  Membuat Layer  Masukkan  ke  dalam  falkon  sebanyak  4  ml  larutan  sukrosa  0,6  M  dalam  HEPES‐KOH.  Secara  perlahan‐lahan,  sebanyak  2  ml  suspensi  protoplas‐manitol  ditambahkan  ke  dalam  larutan  sukrosa.  Falkon  disentrifugasi  pada  kecepatan  500  rpm  pada  suhu  4°C  selama  20  menit.  Setelah  disentrifugasi  akan terbentuk dua bagian diaman bagian bawah adalah larutan sukrosa yang ditandai dengan adanya 

9   

buih atau gelembung pada dinding falkon dan bagian atas adalah manitol. Sebanyak kurang lebih 500 ul  larutan  diambil  sebagai  larutan  yang  mengandung  protoplas  pada  bagian  tengah  dua  layer  yang  terbentuk. Larutan protoplas kemudian  ditambahkan manitol sebanyak 1x volume kemudian disimpan  di dalam lemari es. Konsentrasi protoplas pada larutan manitol dhitung menggunakan hemositometer di  bawah mikoskop cahaya.  Transformasi  200ul protoplas (1,9 x 105 sel/ml) dimasukkan ke dalam falkon lalu ditambahkan ke dalamnya  plasmid PCaMgfp sebanyak kurang lebih 10 ng/sel dan ditambahkan juga ke dalamnya sebanyak 50 ul  PEG.  Larutan  diinkubasi  di  dalam  es  selama  20  menit,  kemudian  setelah  itu  ditambahkan  lagi  larutan  PEG hingga mencapai volume 2 ml lalu larutan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sebanyak 4  ml  larutan  yang  mengandung  KCl  0,7  M  dan  CaCl2  0,05  M  ditambahkan  ke  dalam  falkon  lalu  disentrifugasi  pada  kecepatan  3.000  rpm  pada  suhu  25°C  selama  5  menit.  Supernatant  dibuang,  lalu  pelet diresuspensi menggunakan larutan yang mengandung KCl 0,7 M dan CaCl2 0,05 M sebanyak 400  ul. Larutan disebar pada media padat yang mengandung penanda seleksi hygromicin dengan konsentrasi  200 ug/ml. Hasil transformasi dilihat di bawah mikroskop fluorescence. Digunakan kontrol negative dan  positif untuk mengetahui hasil transformasi.    Introduksi gen gfp pada telur ikan (mikro injeksi)  Prosedur kerja terdiri atas 4 tahap. Pertama adalah pemijahan buatan untuk mendapatkan telur  yang  dibuahi.  Tahap  kedua  adalah  proses  mikroinjeksi  dengan  konsentrasi  DNA  gen  gfp  yang  diinjeksikan  sebesar  50  μg/ml  KCl  0,1  M.  Tahap  ketiga  adalah  pemeliharaan  benih  hasil  mikroinjeksi  dalam  akuarium.  Tahap  terakhir  adalah  analisa  DNA  dari  ikan  yang  hidup  hasil  mikroinjeksi  dan  perlakuan  kontrol,  dengan  melakukan  ekstraksi  DNA  dari  jaringan  sirip  ekor,  dorsal,  dan  ventral  menggunakan  kit  (Pure  gene,  USA).  Hasil  ekstraksi  DNA  digunakan  sebagai  cetakan  dalam  proses  amplifikasi  PCR  (Polymerase  Chain  Reaction)  menggunakan  primer  Forward  dari  promoter  ßactin  ikan  medaka dan primer tiGH Reverse. Hasil PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%.  Setelah  proses  elektroforesis  selesai,  kemudian  gel  agarosa  dipotret  di  bawah  cahaya  ultraviolet.  Parameter  yang  diamati  adalah  derajat  kelangsungan  hidup  embrio  (DKHe)  yang  diamati  pada  saat  embrio berumur 20 jam, derajat penetasan (DP), serta derajat  kelangsungan hidup benih ikan pada hari  ke 21 (DKH21). 

10   

HASIL DAN PEMBAHASAN    Hasil  Setelah  dilakukan  restriksi  untuk  memotong  gen  dan  vektor  agar  mempunyai  ujung  yang  spesifik,  dilakukanlah  elektroforesis  agar  gen  atau  vektor  yang  diperoleh  dapat  diisolasi  yang  akan  digunakan dalam proses ligasi. Gambar 1 adalah hasil dari elektroforesis proses restriksi yang nantinya  pita tersebut akan dipotong untuk isolasi fragmen. 

A

  Gambar 1. Restriksi plasmid (A: vektor)  Dari isolasi fragmen, dilakukan elusi agar DNA yang berupa vektor atau gen target yang sudah  terpotong  secara  spesifik  dapat  dipisahkan  dari  gel  agarose.  Setelah  dipisahkan,  larutan  hasil  elusi  kemudian kembali dielektroforesis untuk mengukur agar perbandingan vektor dan gen yang dibutuhkan  tepat. 

11   

  Gambar 2. Elusi plasmid    Pada gambar 2 dapat diketahui bahwa gen yang terpotong ataupun vektor tidak terlihat, dalam  arti elusi yang dilakukan tidak berhasil, gen target atau vektor masih banyak terikat pada gel.   Dengan  menggunakan  vektor  dan  gen  target  yang  telah  disediakan  oleh  pihak  laboratorium  maka dilakukanlah ligasi dan transformasi. Dari hasil transformasi terbentuk koloni putih dan koloni biru.  Seperti yang terlihat pada gambar 3. 

  Gambar 3. Hasil transformasi  Dari hasil transformasi, dilakukan cek untuk mengetahui apakah gen target terkandung di dalam  plasmid yang ada pada bakteri yang tumbuh pada proses transformasi. 

12   

  Gambar 4. Cek Transformasi  Dilakukan cek terhadap hasil transformasi dengan menggunakan metode restriksi atau dengan  metode PCR. Maka diperoleh tidak ada gen target yang tersisipi pada vektor (plasmid).   

  Gambar 5. Cek Transformasi ulangan    Pada  praktikum  dengan  menggunakan  protoplas  sebagai  sel  inang  dalam  transformasi  menggunakan  plasmid  yang  telah  disisipi  oleh  gen  gfp  (CaM  gfp),  dilakukan  isolasi  protoplas  yang  berasal dari miselia fungi, protoplas yang diperoleh seperti yang terlihat pada gambar 6.   

13   

  Gambar 6. Protoplas  Pada praktikum Introduksi gen gfp pada telur ikan dengan metode mikroinjeksi, diperoleh hasil  proses introduksi dengan bantuan mikroskop pada perbesaran 100 kali. 

B  A

  Gambar 6. Mikroinjeksi. A: blstodisk, B: mikromanipulator  

14   

Pembahasan  Elusi   

Dari elusi yang dilakukan terhadap potongan vektor, dari hasil yang diperoleh tidak ada pita 

yang  terbentuk  sehingga  vektor  yang  telah  diisolasi  dan  kemudian  dielusi  tidak  terlarutkan  dan  masih  terikat pada gel. Hal ini mungkin disebabkan terlalu banyaknya gel yang terpotong ataupun banyak DNA  dari  vektor  yang  rusak  akibat  terlalu  lama  terkena  sinar  UV  keika  akan  dipotong.  Hal  ini  dapat  diatasi  dengan meminimalkan waktu pemotongan di atas transuliminator dan juga kuantitas gel dikurangi agar  ketika dielusi dengan bufer, banyak dari gen yang ikut terelusi.                                                        Ligasi   

  Untuk  melakukan  ligasi,  pada  umumnya  dilakukan  kuantifikasi  terhadap  gen  yang  diperoleh 

dari proses elusi untuk dapat mengoptimalkan proses ligasi dimana perbandingan antara vektor dan gen  target adalah 1:3. Proses ligasi ini juga ditentukan oleh proses sebelumnya yaitu prose restriksi dengan  enzim spesisfik. Pada praktikum kali ini digunakan enzim Eco RI yang bersifat sticky end sehingga vektor  dan gen target dapat secara spesifik berikatan meskipun tetap ada peluang antara vektor dengan vektor  berikatan, akan tetapi peluang tersebut tidaklah besar daripada ikatan vektor dengan gen target, karena  ikatan vektor dengan vektor akan menghasilkan suatu plasmid yang besar dan akan sulit bila dilakukan  transformasi.  Penambahan  gen  target  yang  lebih  banyak  untuk  memperbesar  peluang  gen  target  berikatan dengan vektor.   Transformasi  Proses transformasi terjadi ketika terjadi perubahan suhu yang amat mendadak, heat shock (dari  suhu  rendah,  4°C  ke  suhu  yang  lebih  tinggi,  42°C)  dengan  bantuan  ion  kalsium.  Ion  kalsium  berfungsi  sebagai  ion  yang  membantu  terbukanya  protein  integral  sebagai  kanal  ion  yang  dimanfaatkan  sebagai  tempat keluar masuknya plasmid ke dalam sel inang (bakteri E. coli). Waktu yang dibutuhkan adalah 45  detik, karena apabila terlalu lama ada kemungkinan plasmid yang telah masuk dapat keluar kembali. Hal  ini tergantung dari prosedur tiap lab.    Sel  inang  yang  digunakan  adalah  sel  inang  yang  diperoleh  pada  tahap  logaritmik  (log  phase)  karena pada  tahap ini  masih ada kesempatan  bagi  sel inang untuk membelah dan  memperbanyak diri  sehingga ada peluang bagi plasmid yang diperoleh menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media.         15   

                  Gambar 7.   Kurva yang menggambarkan fase‐fase pertumbuhan bakteri; lag phase, log phase,  stationary phase dan death phase.    Dari hasil transformasi dapat dilihat dengan munculnya koloni putih dan biru pada media padat  LA (Luria Bertani Agar) + 100 ug/ml ampisilin + 100 ul 0,1 M IPTG + 20 ul 50 mg/ml X‐Gal. Kontrol positif  yang berupa sel kompeten yang diinokulasikan pada media LA saja ditumbuhi dengan koloni E. coli DH5α  yang  menunjukkan  bahwa  sel  kompeten  mampu  tumbuh  di  media  LA  dan  tidak  terjadi  kontaminasi.  Sedangkan  pada  kontrol  negatif  yang  berupa  sel  kompeten  yang  diinokulasikan  pada  media  LA  +  ampisilin  tidak  ditumbuhi  bakteri  menunjukkan  bahwa  antibiotik  yang  digunakan  masih  berfungsi  dengan  baik.  Hal  ini  terjadi  karena  E.  coli  DH5α  tipe  asli  tidak  mempunyai  gen  resisten  terhadap  ampisilin.   Pada  gambar  3  terlihat  jelas  terdapat  koloni  putih  dan  koloni  biru.  Koloni  putih  merupakan  koloni E. coli DH5α yang tersisipi vektor PGEM T‐Easy + insert  gen G α dari kedelai, sedangkan koloni  biru  merupakan  koloni  E.  coli  DH5α  yang  mungkin  tersisipi  oleh  vektor  PGEM  T‐Easy  namun  tidak  tersisipi insert  gen G α dari kedelai, bisa terjadi karena kemungkinan‐kemungkinan yang terjadi pada  proses  ligasi,  seperti  vektor  menyambung  pada  vektor  itu  sendiri  atau  vektor  menyambung  dengan  vektor lain (terjadi ligasi antar vektor).  Terbentuknya  koloni  putih‐biru  menggunakan  prinsip  kerja  gen  LacZ  yang  mengekspresikan  β‐ galaktosidase.  Pada  vektor  PGEM  T‐Easy  terdapat  Multiple  Cloning  Site  (MCS)  yang  di  antaranya  terdapat gen LacZ. Pada gen LacZ terdapat lokasi pemotongan enzim‐enzim restriksi tertentu. Insert gen 

G α dari kedelai, jika dapat tersisipkan pada vektor, akan merusak gen LacZ sehingga gen tersebut tidak  dapat  terekspresikan.  Ekspresi  gen  LacZ  ditunjukkan  dengan  terbentuknya  enzim  β‐galaktosidase  yang  dengan  adanya  inducer  IPTG  akan  mengurai  substrat  X‐Gal  sehingga  terbentuk  indol  yang  merubah  warna  koloni  menjadi  biru.  Rusaknya  LacZ  akibat  tersisipi  oleh  insert  gen  G  α  dari  kedelai 

16   

menyebabkan tidak terbentuknya enzim β‐galaktosidase, sehingga X‐Gal tidak dapat terurai, indol tidak  terbentuk, dan koloni tetap berwarna putih.     

Koloni  putih  yang  tumbuh  di  dalam  media  kemudian  disiolasi  dan  di  cek  keberhasilan 

transformasinya. Dengan menggunakan metode koloni PCR seperti yang terlihat pada gambar 4 dan 5,  tidak  terbentuk  pita.  Hal  ini  menandakan  koloni  putih  yang  terbentuk  tidak  atau  hanya  sedikit  sekali  mengandung  plasmid  yang  tersisipi  gen  target.  Dengan  koloni  PCR  seharusnya  pita  yang  menandakan   gen  target  dapat  terbentuk  karena  dalam  proses  amplifikasi  dengan  PCR  menggunakan  primer  yang  spesifik terhadap gen target sehingga apabila tidak terbentuk pita, maka dapat diasumsikan gen target  yang tersisip di dalam plasmid berjumlah sedikit.   Transformasi gen gfp pada cendawan  Transformasi  Pada  media  PDA  +  Hyg  tidak  ditumbuhi  oleh  koloni,  yang  seharusnya  pada  media  ini  A.  niger,  yang  berasal  dari  protoplas  yang  telah  dimasuki  oleh  plasmid  target  yang  mengandung  gen  resisten  terhadap  antibiotik  hygromicin,  dapat  tumbuh  dan  dapat  memendarkan  cahaya  pada  mikroskop  fluorescence.   Pada media PDA tanpa hygromicin juga tidak ditumbuhi koloni, yang seharusnya pada media ini  dapat ditumbuhi koloni karena tersedianya nutrien untuk pertumbuhan bakteri dan media ini juga tidak  ditambahkan  agen  seleksi  antibiotik  hygromicin  sehingga  fungi  dapat  tumbuh,  meskipun  fungi  tidak  memiliki  plasmid.  Tidak  tumbuhnya  fungi  bisa  dikarenakan  jumlah  protoplas  yang  terlalu  sedikit  sehingga peluang A. niger untuk tumbuh kecil, selain itu kemungkinan protoplas yang dimasuki plasmid  juga semakin kecil sehingga kemungkinan tumbuhnya fungi yang mengandung gen gfp akan lebih kecil  lagi.  Kegagalan  praktikum  bisa  dikarenakan  kurang  banyaknya  miselia  yang  digunakan  atau  belum  cukupnya umur kapang yang digunakan ketika mengisolasi protoplas.  Introduksi gen gfp pada telur ikan (mikro injeksi)  Dari praktikum ini diharapkan diperoleh sel telur yang terintroduksi oleh gen gfp. Introduksi gen  gfp ini adalah tahap orientasi untuk mengetahui tingkat keberhasilan metode. Apabila sel telur berhasil  berpendar ketika diperiksa di bawah mikroskop fluorescence, maka ada kemungkinan apabila sel telur  diintroduksi menggunakan gen target lain, dapat berhasil dan ikut terbawa dalam genom ikan.      

17   

SIMPULAN 

 

Teknologi  DNA  rekombinan  tidak  hanya  dilakukan  pada  sel  prokariot  akan  tetapi  bisa 

juga dilakukan pada sel eukariot bahkan dapat dilakukan pada organisme di tingkat yang lebih  tinggi  seperti  hewan  atau  tumbuhan.  Ada  keuntungan  dan  tujuan  tersendiri  dalam  memanfaatkan teknologi DNA rekombinan pada masing‐masing tipe sel dan organisme.    DAFTAR ACUAN    Barnum,  Susan  R.  2005.  Biotechnology  an  Introduction,  2nd  edition.  Thomson  Brooks/Cole,  USA.  323  pages.    Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation,  Bogor. 123 halaman.    Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Pusat Penelitian  Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi – Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan  DIKTI – DIKNAS, Bogor.     Gunawan, B. K. 2008. Skripsi: Introduksi dan Persentase Ikan Yang Membawa Gen Gh Growth Hormone  Ikan Nila Oreochromis Niloticus Pada Ikan Lele Dumbo Clarias Sp. Generasi F0. Program Studi Teknologi  Dan Manajemen Akuakultur, Fakultas Perikanan Dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor    ishelianti.files.wordpress.com/2008/05/gfp.pdf  http://id.wikipedia.org/wiki/Protoplas   

18