Princip a příklady využití demonstrované varianty in situ hybridizace

Ústav histologie a embryologie LF UK v Plzni

Princip a příklady využití demonstrované varianty in situ hybridizace příručka pro studenty

MUDr. Věra Křížková, Ph.D. RNDr. Marie Korabečná Doc. MUDr. Jitka Kočová, CSc. Mgr. Zbyněk Tonar leden 2003

Práce byla podporována grantem FRVŠ F3 2503: „Demonstrace možností in situ hybridizace v praktické výuce histologieÿ

Poděkování • Prof. MUDr. Vladislavu Třeškovi, DrSc., vedoucímu Chirurgické kliniky FN v Plzni, za spolupráci a poskytnutí angiologických vzorků • Doc. MUDr. Maruši Horákové, DrSc. z Flebologického Centra v Praze za poskytnutí flebologických vzorků • laborantům: panu Lukáši Nedorostovi, paní Haně Kantové*, paní Jaroslavě Beránkové a slečně Janě Sazimové z Ústavů histologie a embryologie a *Ústavu biologie LF UK v Plzni za zvládnutí přípravy materiálu a metodiky in situ hybridizace, pečlivou práci a též i fotodokumentaci laboratorní přípravy • fotografovi panu Antonínu Horákovi z Ústavu histologie a embryologie LF UK v Plzni za nafocení digitálních mikrofotografií • sekretářce paní Jaroslavě Hudečkové ze stejnojmenného Ústavu za pomoc s vedením dokumentace grantu

1

Obsah 1 Úvod

4

2 Literární přehled 2.1 Vývoj metody ISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Význam inhibitoru aktivátoru plasminogenu typu 1 (PAI-1) . . . . . . . . 2.3 Další doporučená literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5 5 5 6

3 Princip demonstrované varianty metody in situ hybridizace (ISH)

7

4 Protokol k metodě in situ hybridizace 4.1 Použité reagencie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.2 Histologický materiál . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3 Příprava preparátů pro metodu ISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.1 Odběr a fixace tkáně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.2 Zalití tkáně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.3 Krájení řezů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.4 Napínání řezů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.5 Odstranění zalévacího media z připraveného preparátu . . . . . . 4.3.6 Zavodnění tkáně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.7 Zpřístupnění cytoplazmatické mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3.8 Odvodnění tkáně . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4 Příprava oligoprób . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.5 Hybridizace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.6 Odmytí nehybridizovaných oligoprób z preparátu . . . . . . . . . . . . . 4.7 Vlastní detekce navázaných oligoprób v preparátu . . . . . . . . . . . . . 4.7.1 Blokace pozadí a užití protilátky proti fluoresceinu konjugované s alkalickou fosfatázou . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.7.2 Aplikace chromogenu a vznik precipitátu . . . . . . . . . . . . . . 4.8 Odvodnění a montování preparátů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.9 Kritické kroky metody a možné artefakty . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Příbuzné metody 5.1 Enzymová histochemie . . . . . . . . . 5.2 Lektinová histochemie . . . . . . . . . 5.3 Imunohistochemie (IHC) . . . . . . . . 5.3.1 Přímá metoda . . . . . . . . . . 5.3.2 Nepřímá dvojstupňová metoda 5.3.3 Nepřímé trojstupňové metody . 5.3.4 Protilátky užívané v IHC . . . . 5.4 Metoda PCR a její aplikace . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

6 Srovnání metody ISH a imunohistochemie

2

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . .

9 9 10 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 15

. . . .

16 17 18 19

. . . . . . . .

20 20 20 20 20 21 21 22 22 23

7 Demonstrace výsledků získaných využitím metody in situ hybridizace v komparaci s klasickými a imunohistochemickými preparáty 7.1 Klasické histologické preparáty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.1 Angiologické preparáty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.1.2 Preparáty z močového systému . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2 Demonstrace výsledků získaných užitím metody ISH . . . . . . . . . . . . . 7.2.1 Užití próby detekující PAI-1 mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.2 Angiologické preparáty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.3 Preparáty z močového systému . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3 Demonstrace výsledků získaných užitím imunohistochemie . . . . . . . . . 7.3.1 Užití protilátky k PAI-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3.2 Angiologické preparáty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.3.3 Preparáty z močového systému . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.4 Vysvětlivky a zkratky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

24 24 24 25 25 25 26 27 27 27 28 29 29

Reference

30

3

1

Úvod

Za cíl jsme si položili stručné seznámení studentů s principem metody in situ hybridizace (ISH) a její konkrétní aplikací v histologickém výzkumu. Pro tento účel jsme z řady možných metodických variant této metody zvolili postup založený na práci se směsí oligoprób značených fluoresceinem, který je pak detekován za pomoci protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou. Vzhledem k fyziologické důležitosti fibrinolytického systému jsme pro demonstraci vybrali detekci transkriptů genu PAI-1 (Plasminogen Activator InhibitorType 1). Dělo se tak v návaznosti na předchozí projekt (grant FRVŠ F3 2082), díky němuž se od předcházejícího roku 2001/2002 mohli studenti I. a II. ročníku všeobecného lékařství a stomatologie v předmětu „Histologie a embryologieÿ na LF UK v Plzni v rámci praktických cvičení seznamovat nejen s klasickými histologickými technikami, ale nově také s imunohistochemií. V nedávné minulosti byla ve spolupráci domovského Ústavu histologie a embryologie a Ústavu biologie LF UK v Plzni úspěšně zavedena námi zvolená modifikace metody in situ hybridizace. V návaznosti na předchozí studie jsme si dali za cíl demonstrovat užití této modifikace ISH v histologii a srovnat její výsledky na daných typech tkání s výsledky získanými pomocí klasických histologických technik a imunohistochemie (s poukázáním na výhody takto postavených komparativních studií). Studenti tak dostávají možnost seznámit se s vyhodnocením preparátů cévního a urogenitálního systému na příkladu detekce transkriptu genu inhibitoru aktivátoru plazminogenu typu 1 (o významu a důvodech naší volby uvedeného inhibitoru se zmiňujeme v následující kapitole) jak během pregraduální praktické výuky histologie, tak detailněji v rámci kreditního volitelného předmětu, a mohou pak uplatnit získané znalosti v rámci studentské vědecké činnosti.

4

2 2.1

Literární přehled Vývoj metody ISH

S dnes běžně užívanými histologickými technikami, jejichž základ byl položen již v předminulém století, je možné se seznámit již v klasických učebnicích [34, 32]. Přehled o zpracování histologického materiálu a základních histologických metodách je možné čerpat z těchto zdrojů [4, 5, 9, 22]. Základ molekulárně biologických metod resp. imunohistochemie byl položen v průběhu 40.–50. let (průkaz antigenu v tkáni pomocí fluoresceinem značené protilátky), v 70. letech se podařilo vyrobit monoklonální protilátky. Teoretický přehled o imunohistochemii je možné čerpat z publikace [3], zatímco základní imunologické termíny (důležité pro pochopení imunohistochemických základů) lze nalézt v dalších zdrojích [1, 11, 14]. O uplatnění IHC v soudním lékařství pojednává [31]. Metoda in situ hybridizace (ISH) byla vyvinuta již v roce 1969 dvěma skupinami odborníků (Pardue a Gall, John et al.), tehdy jako metoda užívající izolovanou a purifikovanou nukleovou kyselinu značenou radioizotopy. Až v roce 1985 však bylo pro detekci specifické sekvence mRNA poprvé použito syntetických oligonukleotidů komplementárních k hledané sekvenci. K většímu rozšíření této metody mimo specializované laboratoře došlo až po zavedení neradioaktivních způsobů značení oligonukleotidů.

2.2

Význam inhibitoru aktivátoru plasminogenu typu 1 (PAI-1)

Inhibitor aktivátoru plazminogenu typ 1 (PAI-1) jsme zvolili pro jeho významnou roli, již tato serinová proteáza hraje v regulaci fibrinolytického systému, a to po vazbě na vitronektin jako hlavní fyziologický inhibitor aktivátoru plasminogenu [33]. Představuje tedy jeden z nejvýznamnějších inhibitorů fibrinolytického systému. Je známo, že důležitost fibrinolytického systému spočívá nejen v jeho vztahu ke koagulaci, kdy zprostředkuje degradaci intravaskulárních fibrinových depozit [13], ale také v jeho úloze při remodelaci a přestavbě extracelulární matrix. V této souvislosti má tedy význam jeho účast při takových procesech, jakými jsou zánět, nádorová invaze [15] aj. Novější zdroje se zmiňují o 400–900 kopiích PAI-1 mRNA v buňce endotelu, prokázaných pomocí kvantitativní analýzy specifické mRNA, což potvrzuje, že endotelové buňky in vivo exprimují PAI-1 [28]. Tento inhibitor je přítomný v plazmě a je produktem zejména endotelových buněk, které mohou představovat jeho významný rezervoár in vivo [12]. Dále byla sledována přítomnost tohoto inhibitoru i v trombocytech, tukových buňkách a v monocytech-makrofázích [20]. Při patologických procesech, např. v intimě aterosklerotických arterií, mohou pěnové buňky stimulovat ve stěně cévy jak endotelové buňky, tak vaskulární leiomyocyty k produkci PAI-1 [30]. Pro výše uvedené důvody se zdá být demonstrace distribuce transkriptu genu PAI-1 ve vaskulární tkáni (kontrolní i patologicky změněné) velmi vhodná, jmenovitě v komparaci s výsledky získanými pomocí imunohistochemie a v porovnání s výsledky získanými klasickými histologickými technikami, kdy se zejména v angiologii osvědčilo námi modifikované barvení [17]. Zatímco k výzkumu fibrinolytického systému v cévní stěně existuje množství odkazů a studií, u močového sytému je situace opačná. Výzkum v urogenitálním traktu je zaměřen zejména na studium PAI-1, tPA a uPA v nádorově změněném přechodním epitelu (urotelu) v horních částech močového systému, kde se popisovala silná pozitivita v cytoplazmě nádorových buněk vycházejících z přechodního epitelu pro uPA a PAI-1 [10, 25], 5

proto se jevila detekce transkriptu genu PAI-1 kontrolní tkáně močového systému jako zajímavá.

2.3

Další doporučená literatura

V současné době dochází k velkému rozvoji molekulárně biologických metod, a to nejen ISH [7, 8, 21] (viz kapitola 3), ale také PCR (polymerase chain reaction) a její aplikace (jak bude zmíněno v kapitole 5). S výhodou se používá i kombinace těchto metod. Základní údaje a terminologie k pochopení metod molekulární biologie uvádí [26]. Princip a využití metod molekulární biologie přehledně zpracovává [2]. O ISH v souvislosti s cytogenetikou referuje [23], stejně jako o fluorescenční in situ hybridizaci – FISH [24]. Klinické využití molekulárně genetických metod a přehled diagnostických postupů popisuje [19]. O využití metod molekulární biologie v histopatologii i o některých klinických aplikacích pojednává [27], pohled na histologii a jevy na buněčné a subbuněčné úrovni zprostředkovává [16]. O těsném propojení a užití metod molekulární biologie, zejména ISH a PCR v souvislosti s patologií a také onkologií, pojednává i další práce [18]. Pro studium nejen histologické, ale také patologické struktury tkání a studium příčin těchto jevů na molekulární úrovni doporučujeme publikace [6, 29].

6

3

Princip demonstrované varianty metody in situ hybridizace (ISH)

In situ hybridizace (ISH) je metodou dovolující přesnou identifikaci a lokalizaci specifických sekvencí nukleových kyselin (DNA či RNA) pomocí komplementárních oligoči polynukleotidové označené sondy – próby. V histologii se často užívá na parafinových řezech, dále i na řezech z kryostatu či na buněčných nátěrech. Tato metoda má široké užití v histologii, histopatologii i v dalších oborech, např.: • identifikaci sekvencí DNA podmiňujících vznik jak nenádorových, tak nádorových onemocnění, • získání informací o funkcích genu (detekce specifické mRNA), • detekce a analýza virových infekcí (i detekce některých bakterií, zejm. mykobakterií), • studium infekčních agens, např. prionových proteinů (PrPC). Hybridizace nukleových kyselin in situ, v našem případě neradioaktivní (od radioaktivní se dnes již upouští), umožňuje detekci specifických nukleotidových sekvencí v jednotlivých chromozomech, buňkách a tkáňových řezech. Úspěšné zvládnutí ISH závisí na několika faktorech: a) b) c) d)

vhodná příprava tkáně dobře provedená a zvládnutá příprava próby hybridizace detekční systém.

Existují dva typy hybridizace nukleových kyselin: Přímá metoda – užívá sond, které jsou přímo konjugované se značkovací molekulou (radioizotopem, fluorochromem či enzymem) tak, že sonda po hybridizaci může být bezprostředně vizualizována. Nevýhodou je nízká senzitivita při užití neradioaktivního způsobu značení, při užití radioizotopů menší cílenost (a rizika vyplývající z práce s radioizotopy). Nepřímá metoda – na jedinou sondu se naváže větší množství značkovacích molekul, čímž se podstatně zvýší senzitivita. Sonda bývá konjugována se spojovači, které se napojí na molekuly nesoucí značkovače. Interakce mezi spojovačem a značkovačem jsou založeny na specifické vazbě mezi antigenem a protilátkou, nebo na vazbě biotinu s avidinem/streptavidinem, takže je zde podobnost s imunohistochemickými technikami. K amplifikaci (zesílení) signálu dochází díky aktivitě enzymu (např. alkalické fosfatázy), který se na sondu nenapojuje přímo, ale prostřednictvím protilátky (spojovače).

7

Schéma námi užité modifikace metody in situ hybridizace s vyznačením jejích výhod a nevýhod.

8

4

Protokol k metodě in situ hybridizace

4.1

Použité reagencie

Uvedený laboratorní protokol popisuje pouze konkrétní námi použitou modifikaci protokolu při použití specifických reagencií: oligopróby, jejichž sekvence (o délce 30 bp) byla navržena podle sekvence copy DNA (cDNA) genu PAI-1 dle databáze GenBank pomocí internetu (syntéza firmou Generi Bitech, Hradec Králové, ČR) Příprava ředění prób: základní roztok prób PAI-1 je o koncentraci 10 µg/100ml, ale v případě naředění použijeme roztok PAI-1 o koncentraci 0,1 µg/ml, tj musíme 100× naředit. Eventuální zbytek objemu prób je možné zmrazit a později znovu užít. Hybridizační roztok (100 ml): 30% Formamide; 10% Dextran Sulphate; 0,1% Tetrasodium Pyrophosphate; 0,2% Polyvinyl Pyrrolidone; 0,2% Ficoll; 600 mM NaCl; 2 mM EDTA; 50 mM Tris/HCl pH 7,5. Sekvence oligoprób

cDNA

Exony

5’FAM-TGGAGACATCTGCATCCTGAAGTTCTCAGA

61–91

0–1

5’FAM-GGGCGTGGTGAACTCAGTATAGTTGAACTT

764–794

3–4

5’FAM-GGAGAGGCTCTTGGTCTGAAAGACTCGTGA

1061–1091

5–6

5’FAM-CATGAAAAGGACTGTTCCTGTGGGGTTGTG

1234–1264

7–8

ISH Detection Kit (Novocastra Laboratories Ltd., Velká Británie). NCL-Control (Novocastra Laboratories Ltd., Velká Británie) Další užívané chemikálie: APES – 3-aminopropylethoxysilan (Sigma): Příprava skel potažených APES: Ponoříme sklíčka do 2% roztoku APES v acetonu na 20 s, pak je rychle opláchneme v koncentrovaném acetonu (max. 10 s) a v destilované vodě (max. 10 s). Pak znovu zopakujeme opláchnutí v acetonu i ve vodě a necháme oschnout při pokojové teplotě. Nakrájené řezy natáhneme na APES skla a před zahájením vlastního barvení je necháme schnout buď přes noc v termostatu (37 ◦ C) nebo při pokojové teplotě 48 hodin. Triton (Sigma): TBS s Tritonem do 100 ml si připravíme smícháním 99,5 ml TBS a 0,5 ml 5× ředěného Tritonu (10 ml 5× ředěného Tritonu dosáhneme smícháním 2 ml komerčně vyráběného Tritonu s 8 ml TBS pufru). BSA (Sigma): Příprava množství na 1 řez – 100 µl: 3 mg BSA, 0,5 µl Tritonu 5× ředěného, 99,5 µl TBS (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6). AP buffer – pH 9: 100 mM Tris/HCl, 50 mM MgCl2 .6H2 O, 100 mM NaCl.

9

Proteinase K (Sigma): Příprava pracovního roztoku proteinázy K 15 µg/ml: Přidáme k 500 µg lyofilizované proteinázy K roztok 50 mM Tris/HCl (Proteinase K buffer) v množství 1 ml, rozpipetujeme alikvoty (20×50 µl – stock solution a uchováme při −20 ◦ C): poté na 3 řezy použijeme 10 µl stock solution a 323 µl proteinase K buffer. Rabbit serum (získáno z Ústavu fyziologie LF UK v Plzni). Protokol slouží jako příklad pro demonstraci nejdůležitějších kroků této metody studentům. Nemůže být univerzální a je proto při použití odlišných chemikálií, jiných typů tkání (popř. i jiných fixativ) a rozdílných laboratorních zvyklostech zapotřebí jej přizpůsobit daným skutečnostem.

4.2

Histologický materiál

Vzorky aort (kontrolních i patologicky změněných) a vzorek kontrolní žíly byly získány (peroperačně) ve spolupráci s Chirurgickou klinikou FN v Plzni s laskavým svolením prof. MUDr. Vladislava Třešky, DrSc. Vzorky varikózně změněných vén dolních končetin (vena saphena magna a parva) byly získány při saphenektomii ve spolupráci s Flebologickým centrem v Praze s laskavým svolením doc. MUDr. Maruše Horákové, DrSc. Použit byl i archivní vzorek hluboké žilní trombózy (z lýtka), který byl autoptický.

4.3 4.3.1

Příprava preparátů pro metodu ISH Odběr a fixace tkáně

Biopticky odebrané tkáně se musí ihned zafixovat. Odebrané vzorky tkáně by měly být menších rozměrů (vzhledem k nutnému dobrému prosycení tkáně fixativem) než je například běžné u klasických histologických technik. Je známo, že DNA je odolnější vůči degradaci, zatímco RNA je rychle trávena RNázami a proto (jako v našem případě) je nezbytná rychlá fixace. V opačném případě by endogenní RNázy degradovaly cílovou RNA což by mělo za následek zeslabení či vymizení hybridizačního signálu. S přihlédnutím ke skutečnosti, že neexistuje dokonalá fixace (tj. taková, která by zcela zachovala morfologii, tkáňové antigeny a nukleové kyseliny), je třeba vyzkoušet a prověřit optimální způsob fixace k danému účelu. Pro toto testování jsme zvolili následující fixativa: 1. 2. 3. 4.

10% formol 10% pufrovaný formol (pH 7,0) 4% paraformaldehyd 10% pufrovaný paraformaldehyd

Materiál byl ihned po odebrání (převážně z biopsií) vložen do fixativ. Takto byl fixován v rozpětí 5–10 dnů v lednici při teplotě 4 ◦ C. Poté byl po důkladném vyprání pod tekoucí vodou převeden do roztoku 70% alkoholu. Nejvýhodnější se ukázala fixace s 10% pufrovaným formolem což je také v literatuře nejvíce doporučované fixativum pro daný typ hybridizace. Poté byly vzorky tkání standardním histologickým postupem převedeny do paraplastu.

10

4.3.2

Zalití tkáně

Nejprve je třeba tkáň odvodnit stoupající řadou alkoholů, prosytit rozpouštědlem zalévacího média, které tkáň projasní (methylsalicylát, methylbenzoát), a prosytit paraplastem (tj. směsí parafinu a plastických polymerů). Pak následuje vlastní zalití tkáně do rozpuštěného paraplastu (cca 56 ◦ C) v zalévací komůrce. Pokud jsou v chladnoucím paraplastu bubliny, je nutno je odstranit. Bloček se nechá ztuhnout ve formě vhodné pro upnutí do mikrotomu.

4.3.3

Krájení řezů

Z bločku upnutého do mikrotomu byly krájeny histologické řezy o tloušťce 4–5 µm. Tato síla řezů se jeví jako optimální pro další postup a vyhodnocování výsledků.

11

4.3.4

Napínání řezů

Řezy jsou přeneseny na teplou vodní hladinu, kde se rozepnou. Pak se přenesou na podložní sklíčko potažené 3-aminopropylethoxysilanem APES (Sigma) a nechají se dále rozpínat na temperované podložce. Poté skla s řezy zasychají v termostatu. Na předem připravená a očistěná silanizovaná skla jsme kladli vždy dva řezy o zmiňované tloušťce (pro případ eventuálního poškození jednoho z řezů či využití jako negativní kontroly).

Zde je nutné se zmínit o skutečnosti, že celý postup hybridizace nukleových kyselin in situ logicky do určité míry poškozuje povrchové struktury buněk, což může vést ke ztrátě buněk či tkáňových řezů a proto je nezbytné, aby uchycení tkáňových řezů bylo provedeno na dobře vyčištěná a odmaštěná podložní skla potažená jako v našem případě 3-aminopropylethoxysilanem či obdobnými substancemi. Běžné potažení poly-L-lysinem pro imunohistochemické účely zde nestačí a to zvláště v našem případě, kdy jsme prováděli RNA in situ hybridizaci. 4.3.5

Odstranění zalévacího media z připraveného preparátu

Nejprve je třeba řezy odparafinovat, tj. odstranit zalévací médium paraplast jeho rozpuštěním v xylolu (směs izomerů xylenu). Pro náš účel se osvědčila dvojí lázeň po 3 minutách.

12

4.3.6

Zavodnění tkáně

Preparáty hydratujeme procházením sestupnou alkoholovou řadou, tj. roztoky ethanolu o postupně klesající koncentraci (absolutní alkohol dvojí lázeň po 3 min, pak 95% alkohol po 3 min). Další kroky je totiž zapotřebí provádět ve fázi hydrofilní (vodné roztoky).

4.3.7

Zpřístupnění cytoplazmatické mRNA

Užití enzymu K permeabilizaci tkáně může být alternativně užito např. pepsinu či trypsinu. Koncentraci a dobu inkubace je nutno pro každý materiál určit experimentálně. Pro náš účel byla optimální 15–30minutová inkubace vzorku s proteinázou K o koncentraci 15 µg/ml při 37 ◦ C – volíme objem dle velikosti řezu od 50– 100 µl/řez – po různě dlouhou dobu, která závisí na použité fixaci a na typu tkáně či stupni tkáňových změn (u kontrolních cév po dobu cca 30 min a kratší u patologicky změněných cév). Inkubaci je třeba pečlivě sledovat, neboť přetrávení vede k setření morfologie tkáně až ztrátě hybridizačního signálu, zatímco nedostatečné narušení povrchových struktur k neodkrytí dané DNA či RNA a tedy k nepřítomnosti hybridizačního signálu. Inkubujeme ve vlhké komůrce a pod sklíčkem (event. použijeme lepidlo Fixogum1 ) při 37 ◦ C. Poté propíráme preparáty (sklíčka volně necháme sklouznout) v deionizované vodě ve dvojí lázni.

1

Obroubení sklíčka lepidlem Fixogum se používá k omezení vypařování nanesených roztoků během jednotlivých kroků metody.

13

Užití mikrovlnného záření V malé kulaté skleněné kádince s deionizovanou vodou rozmístíme po 3 sklíčkách s řezy (řezy otočeny od sebe). Kádinku umístíme do mikrovlnné trouby (v našem případě se třemi volitelnými stupni) a nastavíme na střední stupeň. Tento proces kontrolujeme a v případě úniku bublin ode dna přerušíme a nastavíme na dobu 10 minut. Poté vyjmeme a necháme kádinku i s řezy ochladit asi po dobu 20 minut. Ilustrační snímek je uveden v následujícím oddílu 4.3.8. 4.3.8

Odvodnění tkáně

Dehydratujeme postupně vzestupnou řadou alkoholů (roztoky ethanolu o stoupající koncentraci) tj. v 95% alkoholu ve dvojí lázni po 3 minutách a poté ve dvojí lázni absolutního alkoholu opět po 3 minutách. Necháme mírně oschnout na vzduchu, ovšem tkáň nesmí být zcela suchá.

4.4

Příprava oligoprób

Sekvence prób (zde oligoprób) byla navržena podle sekvence cDNA (tj. copy DNA komplementární DNA z RNA templátu vytvořené pomocí reverzní transkriptázy) genu PAI-1. Návrh sekvence vycházel z databáze GenBank pomocí Internetu (grant FRVŠ 1997 č. 1264 „Zavedení metody in situ hybridizace pro komparativní histologické studieÿ, hlavní řešitelka RNDr. Marie Korabečná), přičemž sekvence je volena tak, aby oligonukleotid mohl kompletně hybridizovat pouze s mRNA. Sekvence námi volených jednotlivých oligoprób totiž přemosťuje hranice exonů (tj. kódujících oblastí), a v důsledku toho může hybridizovat s molekulou RNA, která prodělala splicing, tedy nikoli s jadernou DNA. Firma Generi Biotech (Hradec Králové, ČR) nasyntetizovala dle našeho návrhu oligopróby o délce 30 bp označené fluoresceinem na 5’ konci. Optimálně se pro hybridizaci udává délka jednotlivých oligoprób v délce 20–40 bp a ideálně by měly obsahovat více nukleotidů guaninu a cytosinu, tvořících stabilnější hybrid. Koncentrace sondy v hybridizační směsi má vliv na hybridizaci několika prvních párů bází s cílovou sekvencí (tzv. nukleární reakce). Kinetika následující reakce je pak závislá na tom, v jakém rozsahu proběhla tato nukleární reakce. Obecně probíhá nukleární reakce snadněji při vyšší koncentraci sondy, je však třeba stanovit ji individuálně pro každou sondu. Příměs volných bazí, párů či oligonukleotidů má negativní vliv na stabilitu vznikajících hybridů. V našem případě se osvědčila koncentrace PAI-1 „probe hybridization solutionÿ v rozmezí 0,05–0,1 µg/ml. Všechny čtyři oligopróby byly naředěny na potřebnou koncentraci v hybridizačním roztoku (odkazujeme na kapitolu 4.1). 14

4.5

Hybridizace

Předem je nutné si dle doporučení připravit koncentraci oligoprób. V našem případě se osvědčila koncentrace PAI-1 „probe hybridization solutionÿ v rozmezí 0,05–0,1 µg/ml a dle velikosti řezu, jenž se musí daným objemem zcela pokrýt, volíme množství 20– 50 µl. V případě negativní kontroly volíme dodávanou směs náhodných oligonukleotidů NCL-kontrol o stejném objemu, již opět aplikujeme na celý řez. Řezy poté pokryjeme krycím sklíčkem (je možné okraje skla pokrýt lepidlem Fixogum pro zabránění vypařování roztoků) a vložíme do vlhké komůrky. Dáváme inkubovat na 2 hodiny při 37 ◦ C.

4.6

Odmytí nehybridizovaných oligoprób z preparátu

Předem si připravíme roztok TBS s Tritonem do tří kyvet (o objemu cca 100 ml). Krycí sklíčka ponořením do tří lázní TBS s Tritonem volně sklouznou. V každé lázni je nutné sklíčka s řezy ponechat po dobu tří minut.

4.7

Vlastní detekce navázaných oligoprób v preparátu

V následujícím postupu používáme tyto komponenty kitu ISH Detection Kit firmy Novocastra Laboratories Ltd.: • • • •

NCL-control Vial A – Rabbit anti FITC/AP Vial B – Enzyme Substrate Vial C – inhibitor Levamisole 15

4.7.1

Blokace pozadí a užití protilátky proti fluoresceinu konjugované s alkalickou fosfatázou

Nejprve je nutné si připravit „blocking solutionÿ o objemu okolo 50 µl na řez (podle jeho velikosti). Potřebný roztok vyrobíme smícháním 10 µl králičího séra a 40 µl roztoku bovinního sérového albuminu BSA a necháme inkubovat při pokojové teplotě 10 minut – není nutno skla s řezy vkládat do vlhké komůrky. Oligopróby jsou značené fluoresceinem, a protože protilátka proti fluoresceinu je králičí, přidáme tedy králičí sérum.

Vatou opatrně odsajeme „blocking solutionÿ okolo okrajů řezů a přidáme předem přichystaný roztok obsahující králičí protilátku proti fluoresceinu (0,5 µl Vial A a 49,5 µl roztoku BSA) opět dle velikosti cca 50 µl na řez. Pokryjeme řezy a necháme inkubovat 30 minut při pokojové teplotě ve vlhké komůrce.

Propereme ve dvojí lázni v TBS po 3 minutách. Ponořením do lázně krycí sklíčka sklouznou. Následuje lázeň v AP pufru o pH 9 po dobu 5 minut.

16

4.7.2

Aplikace chromogenu a vznik precipitátu

Užívá se chromogen 5-bromo-4chloro-3indolfosfát za přítomnosti NBT (nitroblue tetrazolium) – NBT/BCIP (Vial B z kitu). Barevný stabilní precipitát (tmavě modrý) je pak výsledkem reakce alkalické fosfatázy konjugované s protilátkou aplikovanou v předchozím kroku s tímto chromogenem. Předem si připravíme roztok o množství cca 100 µl na řez, obsahující 2 µl Vial B (chromogen), dále 98 µl AP pufru o pH 9 a 0,1 µl Vialu C (levamisol). Inkubujeme při pokojové teplotě přes noc ve vlhké komůrce. Přikrýváme krycím sklíčkem.

Druhý den ráno omýváme sklíčka s řezy v kádince pod volně tekoucím nepřímým proudem vody po dobu 5 minut a necháme krycí sklíčka volně sklouznout. Je možné řezy dobarvit Mayerovým (či jiným) hematoxylinem.

17

V případě výskytu endogenní intestinální alkalické fosfatázy ve studované tkáni je třeba zajistit denaturaci tohoto endogenního enzymu zahřátím preparátu před hybridizací s oligopróbami na 65 ◦ C po dobu 15 minut, ostatní endogenní savčí alkalické fosfatázy jsou účinně inhibovány levamisolem, který je přidáván k chromogennímu substrátu.

4.8

Odvodnění a montování preparátů

Odvodňujeme tak, že procházíme vzestupnou alkoholovou řadou, tj. koupeme řezy na sklíčkách ve dvojí lázni 95% alkoholu po dobu 3 minut, poté ve dvojí lázni absolutního alkoholu opět po dobu 3 minut a pak ještě necháme dvakrát projít lázní v xylenu, opět po 3 minutách. Ještě mokré řezy montujeme do Solakrylu, poté je necháme do dalšího dne zaschnout v termostatu při 37 ◦ C.

18

4.9

Kritické kroky metody a možné artefakty

Na některé důležité kroky jsme upozornili již při popisu jednotlivých kroků metody ISH: • • • •

nutnost profixování tkáně, užití vhodného fixativa (námi osvědčeného pufrovaného formolu), odmaštění a potažení sklíček APES, důležitý je jak výběr enzymu k digesci, tak jeho koncentrace a zejména pak experimentální určení doby trávení pro daný typ tkáně, • vhodné blokování endogenní aktivity enzymů, • navržení délky sondy, její značení a koncentrace, • užití promývacích pufrů k odstranění nespecifické hybridizace (hybridů mezi sondou a podobnými úseky NA) Vyvarujeme-li se chyb během jednotlivých (zvláště výše uvedených) kroků metody, měli bychom získat výsledky, které nám umožní detekovat ve tkáni pozitivní buňky, tj. obsahující danou mRNA (v našem případě PAI-1 mRNA), a dále porovnat distribuci jednotlivých buněk v daném typu tkáně. Pro ověření fungování metody in situ hybridizace (obdobně jako u imunohistochemie) užíváme pozitivní kontrolu – preparát o kterém z dostupných zdrojů předem víme, že danou mRNA obsahuje (resp. že obsahuje buňky, v jejichž cytoplazmě se daná mRNA vyskytuje). Jako negativní kontrolu použijeme preparát¸ u kterého používáme místo známých a definovaných oligoprób směs náhodných oligonukleotidů (NCL-control). Při hodnocení preparátu je nutné vyvarovat se možných artefaktů: • prohlédnout celý řez tkání (na okrajích bývá zpravidla zabarvení buněk intenzivnější), • vzít v úvahu možné potrhání tkáňových řezů a setření některých morfologických rysů při eventuálním nadměrném enzymatickém natrávení tkáně, • možné artefakty vzniklé při přípravě tkáně (stopy po mikrotomovém noži, zřasení a sklady preparátu, štěrbiny ve tkáních), • bubliny vzduchu, špína či prach a sraženiny barviva.

19

5

Příbuzné metody

5.1

Enzymová histochemie

Usuzuje na přítomnost a lokalizaci enzymu nepřímo z výsledku jeho činnosti, která může být zviditelněna různými srážecími reakcemi (precipitace s kationty kovů, azokopulační reakce za vzniku azobarviv, indigogenní reakce, tvorba formazanů), syntetickými reakcemi (produktem je málo rozpustný produkt o vyšší molekulové hmotnosti) či metodou substrátových filmů.

5.2

Lektinová histochemie

Lektiny (fytohemaglutininy) jsou proteiny a glykoproteiny neimunní povahy získávané z rostlin, živočichů či mikroorganismů. Lektiny jsou schopny selektivně rozpoznávat a obsazovat terminální mono- a oligosacharidové řetězce glykoproteinů, glykopeptidů a glykolipidů, a to s vysokou vazebnou specifitou obdobnou reakci antigen-protilátka, čehož se využívá k vizualizaci přítomnosti těchto látek (lektin je označen fluorochromem, enzymaticky či jiným markerem), resp. k aglutinaci buněk přemostěním oligosacharidů integrálních glykoproteinů jejich buněčné membrány. Využití lektinové histochemie je tak obdobné imunohistochemii. Průkaz některých konkrétních oligosacharidových sekvencí na buněčném povrchu může mít značný diagnostický význam (např. pro posouzení fáze vývoje a diferenciace buňky, přítomnost aglutinogenů atd.).

5.3

Imunohistochemie (IHC)

Metoda je v dílčích krocích podobná ISH, užili jsme ji k ověření výsledků metody ISH, proto ji uvádíme s podrobnějším popisem. Základním cílem imunohistochemických a imunocytologických metod je detekce specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, t.j. na principu vazby antigenu a protilátky. Tuto vazbu si můžeme obrazně představit jako vztah specifického klíče (protilátky, která je zpravidla volná) k zámku (tkáňovému antigenu, jenž je zpravidla pevně fixován na určitou strukturu, např. na povrch buňky2 ). Rozdělení typů imunohistochemických metod: • přímá metoda • nepřímá metoda dvojstupňová • nepřímé trojstupňové metody – metoda peroxidáza-anti-peroxidázového komplexu (PAP) – metoda avidin-biotin komplexu (ABC) 5.3.1

Přímá metoda

Jde o nejjednodušší způsob lokalizace antigenu v tkáni. Primární protilátka je přímo označena fluoresceinem, enzymem nebo kovem, jehož rozmístění v tkáni pak hodnotíme. 2

Existují ovšem i obrácené modifikace, kdy naopak protilátky nacházející se v tkáni můžeme detekovat tak, že k nim přidáme v roztoku příslušné antigeny.

20

Přímé metody lze užít, je-li antigen ve studované tkáni přítomen v dostatečně vysoké koncentraci. Konjugované protilátky jsou dostupné pro široké spektrum antigenů a mají využití zejména v nativních řezech. Při použití na parafinových řezech je tato metoda málo citlivá. 5.3.2

Nepřímá dvojstupňová metoda

Nepřímé IHC metody jsou ve srovnání s přímými sice komplikovanější, ale jejich výhodou je, že mohou být mnohem citlivější. Na tkáňové řezy se nejprve aplikuje neoznačená protilátka (imunoglobulin) nebo sérum, které jsou specifické proti prokazovanému antigenu a nazýváme je primární protilátkou. Ve druhé vrstvě nanášíme protilátku proti Fcfragmentu imunoglobulinů zvířete, které bylo dárcem primární protilátky. Druhá (sekundární) protilátka je značená fluorochromem nebo enzymem a imunologickou vazbou se váže na protilátku primární. 5.3.3

Nepřímé trojstupňové metody

Jedná se o amplifikační metody sloužící k zesílení signálu v případě, že množství molekul antigenu v tkáni je nízké. V první fázi reaguje primární specifické antisérum s antigenem prokazovaným v tkáni. Ve druhé fázi je aplikována neznačená specifická protilátka proti imunoglobulinům zvířete, jehož protilátky se používají v první a třetí fázi. Tato sekundární protilátka se také nazývá protilátka spojovací a tvoří „můstekÿ. Můstek je nutno přidávat v nadbytku, aby nebyla vazebně vysycena obě ramena (Fab-fragmenty3 ) jeho IgG molekuly, což by poskytlo falešně negativní výsledek. Ve třetí fázi nanášíme značený komplex, například PAP, tj. peroxidáza-anti-peroxidázový komplex. Metodika je citlivější než obě metody předešlé, avšak časově náročnější. Při nahrazení peroxidázy v komplexu alkalickou fosfatázou dostaneme metodu APAAP, tj. alkalická fosfatáza-anti-alkalická fosfatáza. Tento postup je vhodný pro vyšetřování preparátů, kde je velmi vysoká aktivita endogenní peroxidázy a nelze proto spolehlivě zaručit její úplnou inaktivaci. Další nepřímou trojstupňovou metodou je technika avidin-biotin komplexu (ABC metoda). Využívá schopnost velice pevné (prakticky ireverzibilní) neimunologické a druhově nespecifické vazby vaječného glykoproteinu bílku avidinu s vitaminem biotinem. Avidin má schopnost vázat čtyři molekuly biotinu. Některá vazebná místa avidinu jsou volná a některá jsou obsazena komplexem biotin-peroxidáza, resp. biotin-alkalická fosfatáza. Volná místa jsou připravena pro navázání biotinylované protilátkové molekuly (můstku). Při použití avidinu získaného z bakterie Streptomyces avidini, který dává lepší reakci, nazýváme tento komplex SABC, tj. streptavidin-biotin-komplex. K dispozici jsou velmi citlivé detekční soupravy, poskytující uspokojivé výsledky i při minimálním množství komplexu antigen-protilátka. ABC, resp. SABC metoda patří při správné metodice v současnosti k nejcitlivějším a je velmi rozšířená. Princip spočívá v označení sekundární protilátky biotinem a jeho následné vazbě se (strept)avidin-biotinovým komplexem označeným křenovou peroxidázou. Enzymatická aktivitu této peroxidázy nám pak indikuje ta místa v preparátu, na nichž došlo k primární specifické reakci. 3

Obsahují variabilní oblast, která je antigenně specifická.

21

5.3.4

Protilátky užívané v IHC

Polyklonální protilátky Jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů a proto jsou namířeny proti více epitopům určitého antigenu nebo směsi antigenů. Získávají se imunizací laboratorních zvířat antigenem (nebo jejich směsí). Při imunizaci organizmu dochází ke stimulaci různých B lymfocytů a k jejich proliferaci a diferenciaci na plazmatické buňky. Je produkováno spektrum protilátek proti různým epitopům příslušné bílkoviny s různou schopností se na ni vázat. Po úspěšné imunizaci se zvířeti odebere sérum či ascites obsahující protilátky proti původnímu imunogenu. Specifita polyklonálních protilátek velice závisí na imunizačním protokolu, resp. na tom, v jaké fázi imunitní odpovědi zvířete jsou z něj protilátky získávány. Monoklonální protilátky Jelikož jsou produktem jednoho klonu B lymfocytů, jsou specifické proti jediné antigenní determinantě. Fúzí normálních B lymfocytů pocházejících z imunizovaného živočicha a neoplastických myelomových buněk lze připravit tzv. hybridomy, což jsou klony buněk schopné produkce monoklonálních protilátek. Zatímco mateřský normální B lymfocyt (od imunizovaného dárce) je nositelem specifity produkované protilátky, myelomová buňka je nositelem vysokého až neomezeného proliferačního potenciálu, „nesmrtelnostiÿ. Hybridom tedy zdědí po myelomové buňce možnost nepřetržitého růstu a po aktivovaném B lymfocytu schopnost syntetizovat monoklonální protilátku namířenou proti jedné antigenní determinantě.

5.4

Metoda PCR a její aplikace

PCR – polymerase chain reaction – cyklicky amplifikuje definované sekvence DNA v podmínkách in vitro. Pomocí této metody může být rychle a vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená ve studované DNA. Výhodou metody je její vysoká sensitivita. To ji předurčuje k širokému použití např. v mikrobiologické a virologické diagnostice, při analýze genetických chorob či pro namnožení jakékoliv sekvence z malého vzorku DNA. PCR in situ – provedení PCR přímo na tkáňových řezech (např. ze vzorků tkání fixovaných formalinem a zpracovaných parafinovou technikou). Používá se hlavně ke studiu patogeneze chorob způsobených viry, bakteriemi a i jinými intrabuněčnými parazity. Real-Time PCR – dovoluje používat různé postupy kvantitativní analýzy. Pro přesnou a vysoce specifickou detekci templátu lze použít metodu TAqMan na bázi 5’exonukleázové reakce s použitím specifických fluorescenčně značených sond. Fluorochromy pro značení sondy jsou voleny tak, aby v intaktním stavu sondy jeden fluorochrom pohlcoval energii emitovanou druhým fluorochromem po excitaci. Tento efekt, tzv. zhášení, je zrušen po exonukleázovém rozštěpení sondy DNA, navázané na cílové místo, polymerázou postupující v průběhu elongace po amplifikovaném templátu. Rozdíl v intenzitě fluorescence obou fluorochromů je detekován pomocí citlivého optického systému.

22

6

Srovnání metody ISH a imunohistochemie

ISH je metoda dovolující přesnou identifikaci a lokalizaci specifických sekvencí DNA či mRNA pomocí komplementární oligo- či polynukleotidové označené sondy (próby). V histologii se užívá především parafinových řezů daných tkání. Naproti tomu v případě imunohistochemie se jedná o detekci specifických antigenních determinant (molekul či jejich částí) s využitím imunologické vazby, t.j. na principu vazby antigenu a protilátky – tedy často proteinů povrchových či cytoplazmatických. Uvedené metody můžeme s výhodou kombinovat. Užití ISH souběžně s metodou imunohistochemie IHC je výhodné např. u virových infekcí typu human papillomavirus (HPV), kdy ISH detekuje HPV v klinických vzorcích i u latentní fáze infekce, zatímco IHC umožní detekci kapsidových proteinů viru až u infekce propuknuté. Dále je to jako v našem případě souběžná detekce sekvencí nukleových kyselin (mRNA) a jejich proteinového produktu PAI-1. Záleží také na konformaci proteinu a na protilátce, která daný protein detekuje. V případě, kdy dosáhneme pozitivity např. pouze IHC, a ani při opakovaném užití ISH s vyloučením možných chyb pozitivity nedosáhneme, je tedy zřejmé, že buňky příslušný gen neexprimují, ale pouze vychytávají daný protein (např. hepatocyty PAI-1 u septických stavů). Dávají-li při provedení na dané tkáni obě metody pozitivní výsledky, jde o známku toho, že identické pozitivní buněčné typy danou sekvenci exprimují a obsahují v cytoplazmě daný protein – příkladem může být exprese PAI-1 a detekce PAI-1 proteinu v cytoplazmě u endotelu, buněk hladké svaloviny, makrofágů, pěnových buněk, trombocytů a adipocytů. V současnosti se ISH kombinuje s metodou in situ PCR, která je více senzitivní než ISH a dovoluje detekci i nízkého počtu kopií cílových sekvencí.

23

7

7.1

Demonstrace výsledků získaných využitím metody in situ hybridizace v komparaci s klasickými a imunohistochemickými preparáty Klasické histologické preparáty

Pro studium morfologie daných tkání a pro komparaci s výsledky získanými na daném typu tkáně s výsledky dosaženými pomocí metod in situ hybridizace a imunohistochemie je nutné použít klasické histologické techniky. Běžné barvení hematoxylinem-eosinem jsme zde nepoužili a zvolili jsme barvení modifikovaným trichromem (viz oddíl 7.4), vyvinuté na našem ústavu, jež nám barevně odliší jednotlivé strukturální složky, zejména na angiologických preparátech. 7.1.1

Angiologické preparáty

Obr. 1: kontrolní aorta – přehled medie s elastickými blankami a adventititie s vasa vasorum, člověk, M-TRI, 120×

Obr. 2: ruptura AAA – část medie s vasa vasorum a silně prokrvácenou adventitií, člověk, M-TRI, 120×

Obr. 3: kontrolní žíla, dolní končetina, převážně medie a adventicie se svazky buněk hladké svaloviny, člověk, M-TRI, 120×

Obr. 4: varikózní VSP, dolní končetina, intima balónovitě vyklenutá se světlými degenerativními formami buněk hladké svaloviny, media, člověk, M-TRI, 120× 24

Obr. 5: trombotizovaná hluboká lýtková žíla s nasedajícím trombem – přehledně stěna, člověk, M-TRI, 120×

7.1.2

Preparáty z močového systému

Obr. 6: ureter s přehledně zachycenou strukturou stěny: přechodní epitel a svazky hladké svaloviny, člověk, M-TRI, 120×

7.2 7.2.1

Demonstrace výsledků získaných užitím metody ISH Užití próby detekující PAI-1 mRNA

Sekvence oligoprób byla navržena podle sekvence cDNA genu PAI-1 z databáze GenBank pomocí Internetu tak, aby oligonukleotid mohl hybridizovat pouze k mRNA. Sekvence oligoprób přemosťuje hranice exonů a mohou hybridizovat pouze s molekulou RNA, která prodělala splicing (nikoli tedy s jadernou DNA).

25

7.2.2

Angiologické preparáty

Obr. 7: kontrolní aorta, medie s pozitivními buňkami hladké svaloviny mezi elastickými blankami a PAI-1 pozitivní vasa vasorum v adventicii (endotel i leiomyocyty), člověk, ISH, 120×

Obr. 8: kontrolní aorta, detailněji zachycené PAI-1 pozitivní vasa vasorum v medii mezi PAI-1 pozitivitu vykazujícími buňkami hladké svaloviny, člověk, ISH, 224×

Obr. 9: ruptura AAA, spodina plátu, redukovaná medie a adventicie s vasa vasorum – v jejich stěně buňky s transkriptem PAI-1 genu v cytoplazmě, člověk, ISH, 120×

Obr. 10: ruptura AAA, detail adventicie s PAI-1 pozitivními vasa vasorum, člověk, ISH, 224×

26

Obr. 11: kontrolní žíla, ve stěně PAI-1 pozitivní vasa vasorum a buňky hladké svaloviny, člověk, ISH, 120×

7.2.3

Obr. 12: kontrolní žíla, negativní kontrola, člověk, ISH, 60×

Preparáty z močového systému

Obr. 13: ureter, slizniční řasy s buňkami přechodního epitelu - PAI-1 slabě pozitivní, člověk, ISH, Mayer H dobarveno, 120×

7.3 7.3.1

Obr. 14: ureter, detail přechodního epitelu s PAI-1 slabou pozitivitu vykazujícími buňkami, člověk, ISH, Mayer H dobarveno, 240×

Demonstrace výsledků získaných užitím imunohistochemie Užití protilátky k PAI-1

Užili jsme kozí polyklonální protilátku k peptidu – mapující C-konec PAI-1 lidského původu (ředění 1:100) 200 µg/ml (firma Santa Cruz Biotechnology) a detekční Kit ABC Staining System (firma Santa Cruz Biotechnology) v souladu s pokyny výrobce.

27

7.3.2

Angiologické preparáty

Obr. 15: kontrolní aorta, stěna s intimou, medií, adventicií – endotel a buňky hladké svaloviny obsahující protein PAI-1 se barví hnědě, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 120×

Obr. 16: kontrolní aorta, detail intimy a medie s degenerativními formami i klasickými buňkami hladké svaloviny s PAI-1 pozitivitou, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 240×

Obr. 17: kontrolní žíla, přehled stěny s endotelem a buňkami hladké svaloviny obsahujícími v cytoplazmě PAI-1, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 120×

Obr. 18: varikózní žíla, intima s medií, detailně v těchto částech endotel, degenerativní i nezměněné buňky hladké svaloviny, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 240×

28

Obr. 19: varikózní žíla, negativní kontrola, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 120×

7.3.3

Preparáty z močového systému

Obr. 21: ureter, slizniční řasy s buňkami přechodního epitelu PAI-1 pozitivní, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 120×

7.4

Obr. 20: trombotizovaná hluboká lýtková žíla; buňky v trombu, leiomyocyty a vasa vasorum vykazující PAI-1 pozitivitu, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 120×

Obr. 22: ureter, detail přechodního epitelu s výrazně se barvícími povrchovými deštníčkovými buňkami, člověk, IHC, Gill H dobarveno, 240×

Vysvětlivky a zkratky

AAA – aneurysma abdominální aorty Gill H – Gillův hematoxylin užívaný k dobarvení imunohistochemických řezů IHC – metoda imunohistochemie ISH – metoda in situ hybridizace Mayer H – Mayerův hematoxylin užívaný k dobarvení řezů s provedenou in situ hybridizací M-TRI – modifikovaný trichrom; Verhoeffův hematoxylin a zelený trichrom (zeleně se barví kolagenní elementy, červeně buňky hladké svaloviny, černě elastika) PAI-1 – inhibitor aktivátoru plazminogenu, jeden z nejdůležitějších blokátorů fibrinolýzy VSP – vena saphena parva 29

Reference [1] Abbas A.K., Lichtman A.H., Pober J.S. (1997): Cellular and Molecular Immunology. W.B. Saunders Company, Philadelphia. ISBN 0-7216-4024-9. [2] Alberts B. et al. (1998): Základy buněčné biologie. Espero Publishing, Ústí nad Labem. ISBN 80-902906-0-4. [3] Ambrosius H., Luppa H. (1987): Immunhistochemie. Springer Verlag, Berlin. ISBN 3-05-500316-0. [4] Bancroft J.D., Stevens A. (1996): Theory and practice of histological techniques. Curchill Livingstone, New York. ISBN 0-443-04760-X. [5] Čech S., Horký D., Lauschová I., Sedláčková M., Šťastná J. (1998): Histologická praktika a metody vyšetřování tkání a orgánů. Masarykova univerzita, Brno. ISBN 80-210-1774-0. [6] Cotran R.S., Kumar V., Collins T. (1999): Robbins pathologic bases of disease. W.B. Saunders Company, USA. ISBN 0-7216-7335-X. [7] Filipe M.I., Lake B.D. (1983): Histochemistry in pathology. Churchill Livingstone, London. ISBN 0-443-02429-4. [8] Gomolčák P. (1997): Základy imunohistochémie v patológii. Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví v Brně, Brno. ISBN 80-7013-239-6. [9] Gomori G. (1953): Microscopic histochemistry. Principles and practice. The University of Chicago Press, Chicago. Vydavatelství DVPZ, Brno. ISBN 80-7013-239-6. [10] Hiti A.L., Rideout W.M., Laug W.E., Jones P.A. (1990): Plasminogen activator regulation by transforming growth factor in normal and neoplastic human urothelium. Cancer Commun., 2(3):123–128. [11] Hořejší V., Bartůňková J. (1998): Základy imunologie. Triton, Praha. ISBN 80-8587973-X. [12] Chomiki N., Henry M., Alessi M.C. (1994): PAI-1 Expression in Human Liver and Healthy and Atherosclerotic Vessel Wals. Thromb. and Heamostasis, 72:44–53. [13] Christ G., Hufnagl P., Kaun Ch. (1997): Antifibrinolytic Properties of Vascular wall. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biology,17:723–730. [14] Janeway C.A., Travers P., Walport M., Capra J.D. (1999): Immunobiology. 4th edition. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, London/New York. ISBN 0-81533217-3. [15] Johnsen M., Lund L.R., Romer J., Almholt K., Dano K. (1998): Cancer invasion and tissue remodeling: common themes in proteolytic matrix degradation. Current Opinion in Cell Biology 10:667–671.

30

[16] Kierszenbaum A.L. (2002): Histology and cell biology. Mosby, USA. ISBN 0-32301639-1. [17] Kočová J. (1970): Overall staining of connective tissue and the muscular layer of vessels. Folia Morphologica, 3:293–295. [18] Kolář Z. (1997): Úvod do molekulární patologie a onkologie. Vydavatelství Univerzity Palackého, Olomouc. ISBN 80-7067-721-X. [19] Korabečná M. (1999): Aplikace molekulární genetiky v klinické praxi. Karolinum, Praha. ISBN 80-7184-844-1. [20] Lalli M., Colli S., Mussoni L. et al. (1997): Lipid Laden Human Macrophages Synthesize and Secrete PAI-1. Suppl of Thromb. and Heamostasis, 1997:748. [21] Lukáš Z., Dráberová E., Feit J., Vojtěšek B. (1997): Imunohistochemické metody v biologii a v bioptické diagnostice. Acta Facultatis Medicae Universitatis Masarykianae Brunensis, Brno. ISBN 80-210-0620-X. [22] Maňáková E., Seichertová A. (2001): Metody v histologii. Karolinum, Praha. ISBN 80-246-0230-X. [23] Michalová K, J. Musilová (1988): Hybridizace in situ v cytogenetice, Čas. Lék. Čes., 127, No.30. [24] Michalová K. (1995): Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) v klinické cytogenetice, Čas. Lék. Čes., 134, No.3. [25] Nakanishi K., Kawai T., Torikata Ch. (1998): Urokinase-type Plasminogen Activator, its Inhibitor, and its Receptor in Patients with Upper Urinary Tract Carcinoma. Cancer, 82:724–732. [26] Nečas O. a kolektiv (2000): Obecná biologie pro lékařské fakulty. Nakladatelství H and H, Jinočany. ISBN 80-86022-46-3. [27] Rocker J. (1994): Molecular Biology in Histopathology. J.Wiley and Sons, England. ISBN 0-471-94093-3. [28] Stemme V., Rymo L., Risberg (2001): Quantitative analysis of specific mRNA species in minute cell samples by RT-PCR and flow cytometry. Journal of Immunohistological Methods, 249:223–233. [29] Stevens A., Lowe J. (2000): Pathology, Mosby, international edition. ISBN 0-72343160-4. [30] Tipping P.G., Davenport P., Gallicchio M. (1993): Atheromatous Plaque Produce PAI-1 and Stimulate its Production by Endothelial Cells and Vascular Sm. Muscle Cells. American Journal of Pathol., 143(3):875–885. [31] Toupalík P. (2001): Imunohistochemické diagnostické metody v soudnělékařské praxi. Karolinum, Praha. ISBN 80-246-0163-X.

31

[32] Vacek Z. (1988): Histologická technika. Avicenum, Praha. [33] Van Meijer M., Stoop A., Smilde A. (1997): The composition of complexes between PAI-1, vitronectin and either thrombin or tissue type Plasminogen Activator. Thromb. A Heamostasis, 77(3):516–521. [34] Wolf J. (1954): Mikroskopická technika optická i elektronová pro biologické účely. Státní zdravotnické nakladatelství, Praha.

32