POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA

Biotermék technológia 2.

Mikrobiális poliszacharidok

POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA

A növényi poliszacharidokat régen alkalmazzák: keményítı, cellulóz, agar-agar, alginát, pektin, inulin (ß(2→1)…. A mikróbiális poliszacharidokat csak néhány évtizede használják, pedig sokféle van belılük: dextrán, xantán, pullulán, szkleroglukán, leván, ciklodextrin Funkció a természetben:

Lokalizáció a sejtekben:

kiszáradás ellen fagocitózis, fágok ellen tartalék tápanyag immunológiai determináns sejtfal komponens (felületi makromolekulához kapcsolódik) Extracelluláris komponens: nyálkahártya: zselés kolónia, viszkózus tenyészoldat

Felhasználás: Egyedülálló kolloidikai tulajdonságok: Viszkozitás-növelés, állag javítás Pszeudoplasztikus tulajdonságok: kis nyíróerı: nagy viszkozitás nagy nyíróerı: kis viszkozitás Jó szivattyúzhatóság, porlaszthatóság, festékek Szerkezeti viszkozitás: áramlás xantán Folyási hımérséklet: a viszkozitás függ a hımérséklettıl és a nyírástól „Olvadáspont”

A Tm feletti hımérsékleten már viszonylag kicsi a viszkozitás változása



Más polimereknél is fellép a jelenség, csak magasabb hımérsékleten: Polimer xantán szukcinoglikán szkleroglikán velán

Tm (kb.) ºC 120 70 150 150

Gélképzés: (gélek: ld. Fiz-kém) általános poliszacharid tulajdonság: agar gél, pektin gél, alginát (Ca-ot igényel, poliglükuronát)

2. Exopoliszacharidok szerkezete: Alkotó komponensek: nagy változatosság, a szénhidrátok mellett szerves savak Cukorsavak: -on-savak, -uron-savak, -ár-savak…. Ecetsav, propionsav, piroszılısav, glicerinsav, borostyánkısav…. Aminosavak: szerin, glutaminsav… Felépítés szerint: Homo-poliszacharidok – Hetero-poliszacharidok - Homo poliszacharidok: egyféle monoszacharid egység polimerjei: Ábrázolási módok

(LINEÁRIS) CURDLÁN

(OLDALLÁNC) SZKLEROGLIKÁN

(ELÁGAZÓ) DEXTRÁN

2



A pullulán szerkezete:

- Hetero poliszacharidok: különbözı cukrokat tartalmazó, több tagból álló, ismétlıdı „alegységekbıl” épülnek fel. példa: a xantán szerkezete háromféleképpen ábrázolva

3



A poliszacharidok közé sorolhatók még: Poli-hidroxi-butirát: 3-OH vajsav észterkötéses polimer (lehet 4-OH vajsav is)

3. A poliszacharidok bioszintézise általában: a bioszintézis a citoplazmában történik, ezután (közben) kijut a külsı térbe dextrán, leván: extracelluláris szintézis: transzglükozilálás Fontos anyagcsereutak:

- energiatermelés a poliszacharid szintézishez - cukor és cukor-foszfát interkonverziók (ábra):

A monomer-bioszintézis tipikus templátja: UDP, GDP + Acetil CoA: ecetsav transzfer

4



Példa: xantán bioszintézise:

A bioszintézis genetikai háttere: a Xanthomonas campestrisben egy operonban található a 12 gén: a Xantán cluster nagy operon: 16 Kb DNS szekvencia: 12 gén

hasítás BAM H1 restrikciós enzimmel

1→Az egyes gének biokémiai funkciói: I-V: transzferáz, I-V. Acy: acetiláz, I-II Ket: ketáláz, Pol: polimeráz, Exp: export 2→Xantán gének, gumB-M 3→BAM H1 restrikciós térkép, amely megadja a 16 Kb-os xantán cluster fragmenseinek hozzávetıleges méretét (Kb)

4. POLISZACHARID FERMENTÁCIÓ (általános elvek) Tápközeg: szénforrás: szacharóz (dextrán, leván), glükóz (többi poliszacharid) + a szokásos kiegészítık Fermentor: 50 – 200 m3, különleges keverıvel (a nagy viszkozitás miatt problémás a megfelelı levegıztetés) Feldolgozás: - betöményítés (pl. ultraszőréssel) - oldószeres kicsapás

5



TERMÉKEK, TECHNOLÓGIÁK XANTÁN A legnagyobb mennyiségben termelt poliszacharid: 10 000 t/év 408 M USD/év Törzs: Xanthomonas campestris növénypatogén: káposzta, gyümölcsfák → Minden kimenı anyagot sterilezni! Könnyen befertızıdik: xantán burok miatt tg =nagy, lassan növekszik Glükóz + NH3 : N-forrás szabja meg a végsı %-ot (N-limit) (a glutamátot helyettesítheti) Törzsfenntartás, inokulum-készítés: Cseppfolyós N2 (t < - 80 ˚C), liofilezett törzstenyészet „Papírcsík inokulum”: 1 évig stabil 4 °C - on

Oxigen transfer rate – OTR

Fermentáció: pH: 6 – 7,5 (xantán opt. pH: 7; pH: 5 alatt a folyamat lelassul!) Hımérséklet: az elviselhetı maximumig emelik: viszkozitás csökken, OTR: nı OTR: lásd alábbi ábra 3% xantán viszkozitása: 10 000 cP felett! Elmenı levegı: szőrés. Növénypatogén!

6



Kinetikája: I típusú fermentáció:

Ábra: xantán gumi batch fermentációja X. campestris-szel 4 – 5 % glükóz → 25 – 30 g xantán/l; konverzió: 70 % -os. pH szabályozás: 7 ± 0,3 . (Savképzıdés: termékképzés lelassul, leáll.) Oxigénátadás: ne legyenek holt terek → Nagy átmérıjő keverı (kavaró). Buborékok: ha nagy: gyorsan felszáll és kis relatív felület: OTR kicsi ha kicsi: stabil diszperzió (áll a buborék) → egyensúlyi gázösszetétellel: OTR kicsi

SZUKCINOGLIKÁN: III. típusú fermentáció, N-limit.

Ábra: Szukcinoglikán batch fermentációja Pseudomonas fajjal

7



DEXTRÁN glükóz polimer: lineáris rész: α(1-6), elágazás α(1-4) kötéssel Bioszintézis: transzglikozilálás Szacharóz

Leuconostoc mesenteroides Dextrán – szacharáz

dextrán +(n-1) fruktóz

Irreverzibilis 100 %-os konverzió. Molekulatömeg: 15 000 – 500 000 Cukorgyárakban: léfertızıdés Fermentáció: 10 – 20 % szacharóz + 2% CSL. Elıbb a sejtnövekedés, aztán a termékképzıdés. A dextránképzéshez nem kell levegıztetés, csak keverés = O2 limit (2 nap) 0,5 g/l baktérium 80 g/l dextránt termel Gyakorlatilag nyugvósejtes technológia. Elvileg lehetne enzimesen is, de nem gazdaságos Tejsavképzıdés: a pH szabályozás közönbösíti Feldolgozás: kicsapás metil-alkohollal, szőrés, oldás pirogénmentes vízben, újabb metilalkoholos kicsapás. Felhasználás: Vérplazma-pótló: a) részleges sósavas hidrolízis 100 °C-on. lebontás (viszkozitás csökkenés.) Frakcionált kicsapás – kis molekulatömegő – vérplazma, – nagy molekulatömegő: visszavezetés a hidrolízisre b) Enzimes hidrolízis: dextranáz P. funiculosum Dextrán gél (kromatográfiás töltet): térhálósítani kell, vízoldhatatlan, inert, hidrofil szemcsék c) vizes kétfázisú extrakciónál fázisképzı LEVÁN: Szacharóz

Leván szacharáz Aerobacter levanicum Bacillus subtilis 2 3 fruktozid kötés

leván +fruktóz+glukóz Konverzió: 62 % : fruktóz polimer

Polihidroxibutirát (PHB) (3-OH vajsav polimer): észter (lehet 4-OH polimer is) Polihidrroxi-alkanoát (PHA): (5 – 15 szénatomos sav) Alcaligenes enthrophus ICI 1982 Szabadalom: 11 – 16 ipari törzs: BIOPOL A sejt 80 %-a PHB: granulumban: tartalék tápanyag Biodegradábilis, biokompatibilis polimer 100 – 30 000 monomer.

1. DOWN STREAM mőveletek a.) Ultraszőrés (+porlasztva szárítás) 5 – 10 szeres koncentrálás (xantán). - dezinficiálni az oldatot (biol. Lebontás) – hátrány!

8



-

Kis molekulatömegő komponensek (tápoldatból) eltávoznak – elıny. Olcsóbb, nincs oldószervisszanyerés

b.) Szerves oldószeres kicsapás: Metanol, Etanol, aceton, propan -2-ol Xantán: oldószer mennyisége csökkenthetı (4x-re): Ca, K adagolásával. (Melegítés: 100 – 130 ˚C, 1 – 15 ’) Szárításnál vigyázni: robbanásveszély. Szárazon tárolandó: biológiai lebontás. Élelmiszer célra (FDA): 10 000 sejt/g max! Propilén-oxidos dezinficiálás + hı : megöli a sejteket. Kicsapás: Metanol; pH=5,6; 25% MeOH: viszkozitás csökkenés: centrifugálással: a sejt és a lebegı részek eltávolíthatók + 2 % KCl + 70 % MeOH: csapadék, szőrés 2. ALKALMAZÁS - Por (élelmiszer célra: dezinficiálás) - Oldat 8 % ( + dezinficiáló anyag – eltartás) Xantán: 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, salátadresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelı 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textil 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett) (Ca alginát sejt enzim immobilizálás: enyhe körülmények!) Dextrán: Vérplazma pótló: 6 %-os oldat, 50 – 100 000 Molekulatömeg Sephadex: gélkromatográfia Vizes kétfázisú rendszer elválasztás: kis felületi feszültség Liganddal: Enzimek PEG-Dextrán: növelni a megoszlást PEG-hez kapcsolt … 3. CIKLODEXTRINEK (CD) (Schardinger dextrinek) (Szejtli J.) α - amilázzal hidrolizált (burgonya) keményítı

ciklodextrin-glikoziltranszferáz (CGT-áz)

(lineáris és) győrős dextrinek

CD izolálás

CGT-áz: 1. Bac. macerans 2. Alkalofil Bakt. № 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. CGT-áz gyártás: mikroba tenyésztés, CGT-áz izolálás CD gyártás:

1. Elıhidrolízis: α – amilázzal 5 % keményítı 10DE értékig 2. Konverzió: CGT-ázzal 34 ˚C-on. 58 % konverzió 3. α-, β-, γ- CD arány szabályozása (6,7,8 glükóz)

9



Ábra: a ciklodextrinek szerkezete n = glükopiranóz egységek száma. n = 0: α-CD, 1: β-CD, 2: γ-CD a.) Mikrobától is függ: 1,3 kezdetben elsısorban α-t 2. Kezdetben elsısorban β-t. b.) Toluol adagolás: β-val zárványkomplex (αβ), a végén: 90 % β – CD, 1 % αCD. c.) 1-dekanol adagolás: 36 % αCD és 3,7 % β CD d.) Enzim mennyiség 15 E CGT-áz/g keményítı : 24 % CD 90 E CGT-áz/g keményítı : 56 % CD β – CD termelés: 33 %-os Keményítı. pH=7,2 (HCl), Ca(OH)2 + B. subtilis α-amiláz 80 ˚C, 10’ hidrolízis. E. inaktiválása: 120 ˚C, 30’ Konverzió: 50 ˚C CGT-áz, 5 % toluol + keverés 105 h! Komplex szőrés, vákuum bepárlás (toluol elmegy), szőrés, krist. α – CD termelés: jól oldódik, kristályosítani nehéz. Komplexáló vegyület: decanol Konverzió. Oldékonyság 140 mg/ml. Nincs β és γ Kitermelés: 50 %. Dekanol vízgızzel eltávolítható γ – CD termelés: β – CD gyártás mellékterméke. 750 g keményítıbıl 14 g γ – CD nyerhetı ioncserélı oszlopon. Komplexáló szerrel: metil-etilketon-α-naftol keveréknél Konverzió CGT-ázzal. Oldhatatlan komplex. Metanolban oldódik. Ioncsere, aktívszenes tisztítás. Kitermelés: 20 % Elágazó CD: az 1,6 kötés beépülésekor 1,2,3 glükóz lehet a győrőn CD származékok: OH-hoz köthetı. Legnagyobb mennyiség: metil, hidroxipropil CD. (Fig.4) Ilyenkor az oldhatóság, a komplexképzı tulajdonság, és a vendégmolekula reaktivitása is módosul A CD „gazda molekula” adduktot, inklúziós komplexet képez a „vendégmolekulával” (Fig.3.) α, β, γ és származékok: gazdamolekula választék: különbözı vendéget köt. Így növelni lehet az oldhatóságot: terfenadin (antiallergikum): 60 mg/6 l víz 60 mg komplex/1 ml víz. A reaktivitás is változik: ált. csökken (Fig.6.) + Gyógyszerek

10



Ábra: Az inklúziós komplexek képzıdésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje fıként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula – CD-üreg) való kicserélıdése jelenti.

11


Alkalmazás 1. Gyógyszer: oldhatóság nı, felszívódás Biohozzáférhetıség nı


Gyors oszcilláció

Injekciók: vízben nem oldható vegyületek

üreg méret:

1 mol: 1 g:

Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetıleges üregméretei Stabilizál: nem párolog el, oxidálás ellen, hıstabilitás nı Irritáló hatás csökken (indometacin) Prostaglandin E2- β-CD: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-CD: injekció (érszőkület) Benexate- β-CD: gyomorfekély Fokhagymaolaj β-CD: koleszterin csökkentés Prognózis: néhány 100 t/év felhasználás 2. Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület – stabilizál. Oxidálás ellen véd. Hagyma β-CD: Élelmiszeraromák (Magyarországon 1983 óta) Alacsony koleszterint tartalmazó vaj elıállítása (Belgium): olvadt vaj + β-CD, 1 lépésben a koleszterin 90 %-a eltávolítható

12



Kellemetlen íz, illat eltávolítás: kávé, tea, keserő íz. Kávé oldószermentes koffeinmentesítése Kozmetikumok: hosszú ideig megtartják az illatot 3. Biotechnológia: Mikrobiológiai konverzió Hidrokortizon – β-CD prednisolon (Udvardyné 1983) aciláz digoxin Hozam:20 %50-60 % Lanatozid C – dimetil CD Β-glükozidáz

Ábra: a lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinné. D = digitoxóz, G = D-glükopiranóz, Ac = acetil csoport Bordatella pertussis: zsírsav inhibeálja a növekedédt. + β-CD zsírsav komplex: jó szaporodás Mycobacterium leprae: nem szaporodott fermenterben, mivel az esszenciális palmitin és sztearinsavat nem tudta a vizes fázisból felvenni + dimetil β-CD: növekedés A dimetil – β-CD – zsírsav komplex helyettesíti a szérumot állat szövettenyészetekben: interferon, MCAB termelés Szennyvíz detoxifikálás. Klórozott aromás vegyületeknél: β-CD kis konc.

nagy konc.

nagy konc.

szennyvíz

eleveniszap nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy

toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus leáll

nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy

Ábra: a mérgezı vegyületek tolerálható szintjét növeli a CD hozzáadása a mérgezı szennyvízhez

13



Biospecifikus elválasztás: amilázok megkötése Mátrix

CD

E

D

CD D

CD D

S’E- komplex

CYCLODEXTRIN GLIKOZILTRANSFERÁZ (Bac. Circulans) EC. 2.4.1.19. Klebsiella pneumoniae: E. klónozás B. subtilis-be α- amilázzal hidrolizált keményítı 10 DE-ig

E

Lineáris és győrős dextrinek

CD izolálás

β-CD elıállítás 1.) 33 %-os keményítı: pH: 7,2, Ca++, α- amiláz, 80 ˚C, 1 h: hidrolízis 2.) 100 ˚C, 30’, E, inaktiválás 3.) 50 ˚C, 100 h, 5 % toluol, E2, konverzió 4.) Bepárlás: toluol elmegy Kristályosítás: Hozam: 90 % β-CD α-CD elıállítás Konverzió: dekanol. Csak α-CD képzıdik Hozam: 50 % Dekanol vízgızzel eltávolítható

14



Ciclodextrin (CD): α(6c), β(7c), γ(8c). Származékok

Ábra: A kristályos heptakisz(2,6-di-O-metil)-β-ciklodextrin (DIMEB) és a véletlenszerően hidroxipropilált β-ciklodextrin szerkezete. Az iparilag elıállított nem kristályosítható, véletlenszerően metilezett β-ciklodextrin (RAMEB) ugyancsak kb. 14 metoxi csoportot tartalmaz, de véletlenszerő eloszlással.

15



Oldott enzim, vizes fázis: α, β és γ keverék képzıdik pH: 6, T= 55 ˚C Hozam: α=23 %, β=11 % A ciklodextrin inhibitálja az enzimet. α megkötés: sztearinsav ligandon – kitozán hordozón. Szelektivitás: 100 %. β megkötés: ciklohexán – propánamid és n-kapronsavval. Toluol. αβ (90 %) Az adszorbciós kolonnába vezetés elıtt hőtés 30 ˚C-ra és 3 5 NaCl adagolás: megakadályozza az E. adszorpcióját a kolonnán MARCIAN Co. Japan termelés A CD gazdamolekula – vendégmolekula. Addukt inklúziós komplex

Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetıleges üregméretei

16



Ábra: A „gazda-vendég” kölcsönhatás vázlatosan. Az inkúziós komplex egy igen mozgékony „tároló”, amely az egyébként lassan oldódó „szabad” vendégmolekulát konstans koncentrációban tartalmazza.

Ábra: A megfelelı vendégmolekulákkal alkotott „duplex” CD szerkezetekkel létrejöhetnek akár Kdis ≈ 106-109 dm3 /mol inklúziós komplexek is

17



Ösztradiol

Progesztreron

ampicillin

prosztaglandin F

Ábra: hatóanyag-ciklodextrin komplexek

18

POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA

Recommend Documents