5. Mikrobiális poliszacharidok

Pécs Miklós: Biotermék technológia 2

5. Mikrobiális poliszacharidok

Reológiai tulajdonságok Viszkozitás: függ a hőmérséklettől és a nyírástól „Olvadáspont”: egy jellemző hőmérséklet (Tm) felett hirtelen csökkenés – szerkezeti viszkozitás


Nyírás: pszeudoplasztikus jelleg: kis nyíróerő – nagy viszkozitás; nagy nyíróerő – kis viszkozitás

4

Poliszacharidok

Reológiai tulajdonságok

Az ipari léptékben termelt/használt poliszacharidok túlnyomó része növényi eredetű: keményítő, cellulóz, pektin, agar-agar, inulin, guar gum De egyes speciális célokra terjednek a mikrobiális poliszacharidok is: gélképzés viszkozitás növelés (pszeudoplasztikus, tixotróp, viszkoelasztikus oldatok)

2

5

Poliszacharidok

Reológiai alapok

Ipari léptékben termelt extracelluláris mikrobiális poliszacharidok: xantán, dextrán, leván, pullulán, szkleroglükán, kurdlán, (ciklodextrinek)

viszkozitás =

nyírófeszültség nyírósebesség

µ=

τ γɺ

Sőt újabban már az alginátot és a heparint is inkább mikrobiológiai úton termelik.

3

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék

6

1



Reológiai alaptípusok

Exopoliszacharidok szerkezete Homopolimerek: egyféle monomerből épülnek fel dextrán (glükóz) leván (fruktóz) kurdlán (glükóz) pullulán (glükóz) alginátok (guluronsav, mannuronsav) szkleroglükán (glükóz) Heteropolimerek: ismétlődő egységei többféle molekulából tevődnek össze xantán (glükóz, mannóz, glükuronsav, ecetsav, piruvát)

7

Pszeudoplasztikus folyadék

10

Homopoliszacharidok

kis nyíróerő – nagy viszkozitás; nagy nyíróerő – kis viszkozitás

8

Poliszacharidok

11

Homopoliszacharidok

A poliszacharidok biológiai funkciója: Védelem kiszáradás ellen Védelem fagocitózis, fágok ellen Tartalék tápanyag (xantán nem) Immunológiai determináns Lokalizáció: extracelluláris (oldat, nyálka) sejtfalhoz kötve sejtmembránhoz kötve

Pullulán: glükóz monomerek statisztikusan (1-4) és (1-6) kötésekkel összekötve

9


12

2



Heteropoliszacharid: xantán

Poliszacharidok fermentációja Közös jellemzők: Tápközeg: normál, C-forrás: glükóz, speciálisan szacharóz (dextrán, leván) bőséges C-ellátás kell (C/N arány > 10) pH=6-7,5 (baktériumok) Levegőztetés: igen intenzív, mert a viszkózus közegben nehéz megfelelő anyagátadást elérni különleges keverők Downstream műveletek: szerves oldószeres kicsapás: metanol, etanol, aceton, propan2-ol, n-propanol (porlasztva) szárítás

13

16

Poliszacharidok bioszintézise

Dextrán Szerkezete: elágazó láncú glükóz polimer, mint az amilopektin, de: a kötések túlnyomó része (1-6), mellette kevés (1-4), (1-2) és (1-3) A lánc elején egyetlen fruktóz van.

Templát: UDP, GDP 14

17

A xantán bioszintézise

Dextrán előállítása Bioszintézise:

12 lépés 12 gén egy operonban = xantán cluster 1. az öt szénhidrát a sejten belül épül össze (lipid karrieren) 2. ezeket az alegységeket egy enzim exportálja 3. a sejten kívül történik a polimerizáció és a származékképzés (+acetát, +piruvát)

Egylépéses biokonverzió: transzglikozilálás (ld. BIM) Irreverzibilis reakció: ~100% konverzió Lehetne az enzimet tiszta formában kinyerni (extracelluláris), de a fermentlében végrehajtani gazdaságosabb. Cukorgyárakban: léfertőződés - dugulások

15


18

3



Dextrán fermentációja

Xantán

BIOGAL technológia:

Szerkezete még egyszer:

– L. mesenteroides – tejsavbaktérium, anaerob – előbb a sejtszaporítás, aztán a termékképzés – tápoldat: 10-20% szacharóz + 2% CSL + foszfát – levegőztetés nem kell, csak keverés – pH szabályozás: 5,0–5,2 a képződő tejsavat közömbösíteni kell – 0,5 g/l baktérium ~80 g/l dextránt (átlagos móltömeg: ~500.000) termel, + esetleg a fruktóz is hasznosítható Móltömeg: 2-15 millió

– Kinyerés: kicsapás alkoholokkal, szűrés

2-3 lánc spirált alkothat

19

22

Xantán termelés

Dextrán felhasználása Bioszintézise: már volt

Vérplazma pótlásra: csak a 40-60.000 Daltonos frakció felel meg (6%-os oldat), ezért hidrolízissel aprítani kell: - sósavas hidrolízis 100 °C-on, vagy - enzimes hidrolízis: dextranáz (P. funiculosum) azután: frakcionált kicsapás alkoholokkal: a kis molekulatömegű (40-60 kDa) frakció vérplazma pótló nagy molekulatömegű frakció vissza a hidrolízisbe

Gyártás: ~30.000 t/év (erősen ingadozik) Törzs: Xanthomonas campestris – növénypatogén (káposzta, gyümölcsfák) – a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utópasztőrözése) A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel növekszik, más törzsek könnyen túlnövik

lassan

Törzsfenntartás, inokulum készítés:

Sephadex gélek (gélkromatográfia): térhálósított dextrán

Papírcsík inokulum technika

20

23

Xantán fermentáció

Leván Fruktóz polimer (2-3 fruktozid kötés) Bioszintézis: analóg a dextránnal: transzglikozilálás

C-forrás: glükóz (4-5 %), N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05 - 0,1%) Hőmérséklet: 28-31 °C pH: 7 ± 0,3 , a képződő savakat közömbösíteni kell, pH = 5 körül a termelés már lelassul.

– Sokféle törzs termeli – Konverzió: ~62%

Fermentációs idő: 40-48 óra

– Felhasználás:

Konverzió: 68-70 %, azaz 25-30 g/l

élelmiszeripar gyógyszeripar kozmetikai és festékipar (gumiarábikum helyett)

A (látszólagos) viszkozitás 10-30.000 cP (= milliPa.s) -ig emelkedhet

21


24

4



Xantán felhasználása

Xantán fermentáció levegőztetése Levegőztetés: a viszkózus lé miatt rossz a tömegátadás, speciális, nagy átmérőjű keverők, ne legyenek holt terek. A buborékok nehezen szállnak fel.

60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, saláta-dresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textilipar 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett), fúróöblítő folyadék

25

28

Xantán felhasználása Fúróöblítő folyadék: olajfúrásnál a fúrófej körül erős nyírás érvényesül – kicsi a viszkozitás, jó a hűtés. A felszálló áramlásban kicsi a nyírás – nagy a viszkozitás, lassítja a kőtörmelék ülepedését.

26

A xantán feldolgozása

29

Egyéb mikrobiális poliszacharidok Pullulán

Hőkezelés: 90°C-on – pasztőrözés, a mikrobák elölése törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba Kicsapás: valamelyik alkohollal (metanol – izopropanol)

a-1,4- és a-1,6 glükán szerkezet Változó molekulatömeg

Elválasztás: ülepítő centrifugával

Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus Jó adhéziós tulajdonság

Szárítás: max. 50°C-on, tálcás vagy vákuum szárító

Nem toxikus Őrlés

Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam Felhasználás: filmek, fóliák készítése

27


30

5



Egyéb mikrobiális poliszacharidok Szkleroglükán

HIALURONSAV Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav + 1-4 glükózamin) álló polimer. Polfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban a kakastaréjban.

Törzs: (Sclerotium rolfsii, S. glucanicum) β-glükán: nagyrészt β1-3 és kevés β 1-6 kötés Vízoldható Pszeudoplasztikus tulajdonság Felhasználás: kőolajfúrási iszapok stabilizálására festékek, tinták készítésére növényi magbevonat ragasztójaként

Gyógyszerként: Zn-hialuronát Curiosin

31

Egyéb mikrobiális poliszacharidok Alginát, alginsav

34

HIALURONSAV 2. Szerepe többféle: – Kenőanyag izületi felszíneken – Sejtek mechanikai védelme – Sebgyógyulás folyamata – Magzati fejlődés, differenciálódás

Mannuronsav β(1-4) polimer, α-guluronsavval, homopolimer blokkok váltják egymást anionos jellegű (vö. pektin) Barnamoszatok sejtfalában fordul elő (Laminaria fajok), innen nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii).

Alkalmazásai: – Égések, forrázások, sebgyógyulás – Izületi súrlódások kezelése injekcióval – Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum – Kozmetikumok

32

35

Alginát

HIALURONSAV GYÁRTÁSA

Viszkózus, gumiszerű anyag, vízben nem oldódik, de sok vizet köt meg. Kationkötő, kationcserélő, Ca2+ ionokkal gélt képez (sejtek bezárása) Felhasználása: a gyógyszeriparban széles körben alkalmazzák égési sérülések esetén elősegíti a sérült rész gyógyulását fémmérgezés esetén fémek megkötésére használják élelmiszerekben sűrítőanyagként, stabilizálószerként, zselésítő anyagként, valamint emulgeálószerként használják E400 néven.

Kétféle eljárást használnak: - szervextrakció - fermentáció A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el (endotoxinok, mikrobák) 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (pH= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal.

33


36

6



HEPARIN Majdnem minden szervben előfordul → szervextrakció. Többféleképpen szulfonált mukopoliszacharid, Ca-só formájában hozzák forgalomba.

A ciklodextrinek méretei

Antikoaguláns = véralvadásgátló

37

Egyéb mikrobiális poliszacharidok

40

Ciklodextrinek előállítása

Foszfomannán (Hansenula, Pichia, Pachyselon nemzetség egyes fajai) Mikrobiológiai lebontással szemben ellenálló Jó viszkozitásnövelő Stabilizáló Diszpergáló hatású

Egylépéses biokonverzió: ciklodextrin-glikozil-transzferázzal (CGTáz) Több törzs is termeli: 1. Bacillus macerans 2. Alkalofil bakt. № 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. 4. Bacillus circulans

Kitozán (Mucor rouxii, Absidia coerulea) Nitrogéntartalmú poliszacharid Felhasználás: flokkuláló szerként, papíripari ragasztóként, kelátképzőként

Izolált, oldott enzimet használnak.

38

Ciklodextrinek (CD, Schardinger dextrinek)

41


39


42

7




Irányított gyártások: α-CD előállítás

Mindig többféle CD keveréke keletkezik + lineáris melléktermékek. Termék-inhibíció: a keletkező CD gátolja az enzimet.

Komplexáló vegyület: dekanol (vízgőzzel eltávolítható) α-, β -, γ - CD arány szabályozása:

Csak α-CD képződik: jól oldódik (140 mg/ml),

Mikrobától is függ: 1.,3. kezdetben α -t termel 2. kezdetben β -t termel Toluol adagolás: β-val zárványkomplex, eltolja az egyensúlyt (α → β), végén ~90% β -CD Dekanol adagolás: α irányába tolja el, 36% α-CD, mellette csak 3.7% β -CD

nehéz kristályosítani Hozam: ~50%

43

46

Mercian eljárás (J)

Irányított gyártások: β-CD előállítás

Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: pH=6, T=55 °C, 8,3 % elfolyósított keményítő

Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás α-amilázzal, 80°C-on, 1h,

Nem használnak zárvány molekulát.

pH=7.2, Ca2+ kell

α, β és γ keverék képződik, hozam: α - 22,3%, β - 10,8%, γ - 5,1%

Enzim inaktiválás: 100-120 °C-on 30 percig

Elválasztás szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30 °C-ra, majd vissza 55 °C-ra)

Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 °C, 100-105 h, keverés

α megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás:

Komplexáló vegyület: toluol A komplex szűrése, vákuum bepárlás/stripelés (toluol elávolítása),

~100%.

kristályosítás

β megkötés: ciklohexán–propánamid–n-kapronsav ligandon

Hozam: ~90% 44

47

Mercian eljárás (J)

γ-CD előállítás

A β-CD gyártás mellékterméke Konverzió CGT-ázzal Komplexáló szer: metil-etilketon - α-naftol keverék Vízben oldhatatlan komplex, mely metanolban feloldódik Ioncsere, aktív szenes tisztítás Hozam: ~20%

45


48

8



A ciklodextrinek alkalmazásai: molekuláris csomagolás

Ösztradiol

Progeszteron

Ampicillin

Prosztaglandin F

Az inklúziós komplexek képződésének vázlata Az apoláris molekulák beilleszkedése az apoláris gyűrűbe energiacsökkenéssel jár. 49

Ciklodextrinek alkalmazása

52


Gyógyszerek formulázása:

Élelmiszer, kozmetikum:

Oldhatóság nő (felszívódás): vízben nem oldható vegyü-

Íz, zamat: illó vegyület, stabilizál, oxidálás ellen véd

letek is adhatók injekciókban

hagyma - β-CD: élelmiszeraromák

A hozzáférhetőség nő

Alacsony koleszterin tartalmú vaj előállítása: olvadt vaj + β-CD = bezárja a koleszterint

Stabilizál: kevésbé párolog, véd az oxidálás ellen, a hősta-

Kellemetlen íz, illat eltávolítása: kávé, tea keserű íze;

bilitás nő

Kávé oldószermentes koffein-mentesítése

Irritáló hatás csökken (indometacin)

Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad

50

53


Ciklodextrinek alkalmazása Példák: Prostaglandin E2- β-CD: szublingualis (szülés indítás)

Biotechnológia: Mikrobiológiai konverziók – szteránvázas vegyületek

Prostaglandin E1- α-CD: injekció (érszűkület)

Lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinná Benexate- β-CD: gyomorfekély („kiékelő” molekula: Arg)

dimetil-β-CD – zsírsav komplex

Fokhagymaolaj β-CD: koleszterin csökkentés

Szennyvíz detoxifikálás Biospecifikus elválasztás

Szteroidok

51


54

9



Mikrobiológiai konverziók

55

Toxikus anyagok megkötése

Szennyvíztisztításban, talajmeliorációban. 56

Biospecifikus elválasztás

A keményítő szerkezetanalógja, lásd a BIM gyakorlatot.

57


10

5. Mikrobiális poliszacharidok

Recommend Documents