5. Mikrobiális poliszacharidok

Pécs Miklós: Biotermék technológia 2

5. Mikrobiális poliszacharidok


Poliszacharidok

Az ipari léptékben termelt/használt poliszacharidok túlnyomó része növényi eredetű: keményítő, cellulóz, pektin, agar-agar, inulin, guar gum De egyes speciális célokra terjednek a mikrobiális poliszacharidok is: gélképzés viszkozitás növelés (pszeudoplasztikus, tixotróp, viszkoelasztikus oldatok)

2

BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék

1



Poliszacharidok

Ipari léptékben termelt extracelluláris mikrobiális poliszacharidok: xantán, dextrán, leván, pullulán, szkleroglükán, kurdlán, (ciklodextrinek) Sőt újabban már az alginátot és a heparint is inkább mikrobiológiai úton termelik.

3

Reológiai tulajdonságok Viszkozitás: függ a hőmérséklettől és a nyírástól „Olvadáspont”: egy jellemző hőmérséklet (Tm) felett hirtelen csökkenés – szerkezeti viszkozitás

Nyírás: pszeudoplasztikus jelleg: kis nyíróerő – nagy viszkozitás; nagy nyíróerő – kis viszkozitás

4


2



Reológiai tulajdonságok

5

Reológiai alapok

viszkozitás =

nyírófeszültség nyírósebesség

µ=

τ γɺ

6


3



Reológiai alaptípusok

7

Pszeudoplasztikus folyadék kis nyíróerő – nagy viszkozitás; nagy nyíróerő – kis viszkozitás

8


4



Poliszacharidok A poliszacharidok biológiai funkciója: Védelem kiszáradás ellen Védelem fagocitózis, fágok ellen Tartalék tápanyag (xantán nem) Immunológiai determináns Lokalizáció: extracelluláris (oldat, nyálka) sejtfalhoz kötve sejtmembránhoz kötve

9

Exopoliszacharidok szerkezete Homopolimerek: egyféle monomerből épülnek fel dextrán (glükóz) leván (fruktóz) kurdlán (glükóz) pullulán (glükóz) alginátok (guluronsav, mannuronsav) szkleroglükán (glükóz) Heteropolimerek: ismétlődő egységei többféle molekulából tevődnek össze xantán (glükóz, mannóz, glükuronsav, ecetsav, piruvát)

10


5



Homopoliszacharidok

11

Homopoliszacharidok

Pullulán: glükóz monomerek statisztikusan (1-4) és (1-6) kötésekkel összekötve

12


6



Heteropoliszacharid: xantán

13

Poliszacharidok bioszintézise

Templát: UDP, GDP 14


7



A xantán bioszintézise 12 lépés 12 gén egy operonban = xantán cluster 1. az öt szénhidrát a sejten belül épül össze (lipid karrieren) 2. ezeket az alegységeket egy enzim exportálja 3. a sejten kívül történik a polimerizáció és a származékképzés (+acetát, +piruvát) 15

Poliszacharidok fermentációja Közös jellemzők: Tápközeg: normál, C-forrás: glükóz, speciálisan szacharóz (dextrán, leván) bőséges C-ellátás kell (C/N arány > 10) pH=6-7,5 (baktériumok) Levegőztetés: igen intenzív, mert a viszkózus közegben nehéz megfelelő anyagátadást elérni különleges keverők Downstream műveletek: szerves oldószeres kicsapás: metanol, etanol, aceton, propan2-ol, n-propanol (porlasztva) szárítás

16


8



Dextrán Szerkezete: elágazó láncú glükóz polimer, mint az amilopektin, de: a kötések túlnyomó része (1-6), mellette kevés (1-4), (1-2) és (1-3) A lánc elején egyetlen fruktóz van.

17

Dextrán előállítása Bioszintézise:

Egylépéses biokonverzió: transzglikozilálás (ld. BIM) Irreverzibilis reakció: ~100% konverzió Lehetne az enzimet tiszta formában kinyerni (extracelluláris), de a fermentlében végrehajtani gazdaságosabb. Cukorgyárakban: léfertőződés - dugulások

18


9



Dextrán fermentációja BIOGAL technológia: – L. mesenteroides – tejsavbaktérium, anaerob – előbb a sejtszaporítás, aztán a termékképzés – tápoldat: 10-20% szacharóz + 2% CSL + foszfát – levegőztetés nem kell, csak keverés – pH szabályozás: 5,0–5,2 a képződő tejsavat közömbösíteni kell – 0,5 g/l baktérium ~80 g/l dextránt (átlagos móltömeg: ~500.000) termel, + esetleg a fruktóz is hasznosítható – Kinyerés: kicsapás alkoholokkal, szűrés

19

Dextrán felhasználása Vérplazma pótlásra: csak a 40-60.000 Daltonos frakció felel meg (6%-os oldat), ezért hidrolízissel aprítani kell: - sósavas hidrolízis 100 °C-on, vagy - enzimes hidrolízis: dextranáz (P. funiculosum) azután: frakcionált kicsapás alkoholokkal: a kis molekulatömegű (40-60 kDa) frakció vérplazma pótló nagy molekulatömegű frakció vissza a hidrolízisbe Sephadex gélek (gélkromatográfia): térhálósított dextrán

20


10



Leván Fruktóz polimer (2-3 fruktozid kötés) Bioszintézis: analóg a dextránnal: transzglikozilálás

– Sokféle törzs termeli – Konverzió: ~62% – Felhasználás:

élelmiszeripar gyógyszeripar kozmetikai és festékipar (gumiarábikum helyett)

21

Xantán Szerkezete még egyszer:

Móltömeg: 2-15 millió

2-3 lánc spirált alkothat

22


11



Xantán termelés Bioszintézise: már volt Gyártás: ~30.000 t/év (erősen ingadozik) Törzs: Xanthomonas campestris – növénypatogén (káposzta, gyümölcsfák) – a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utópasztőrözése) A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel növekszik, más törzsek könnyen túlnövik

lassan

Törzsfenntartás, inokulum készítés: Papírcsík inokulum technika

23

Xantán fermentáció C-forrás: glükóz (4-5 %), N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05 - 0,1%) Hőmérséklet: 28-31 °C pH: 7 ± 0,3 , a képződő savakat közömbösíteni kell, pH = 5 körül a termelés már lelassul. Fermentációs idő: 40-48 óra Konverzió: 68-70 %, azaz 25-30 g/l A (látszólagos) viszkozitás 10-30.000 cP (= milliPa.s) -ig emelkedhet

24


12



Xantán fermentáció levegőztetése Levegőztetés: a viszkózus lé miatt rossz a tömegátadás, speciális, nagy átmérőjű keverők, ne legyenek holt terek. A buborékok nehezen szállnak fel.

25

26


13



A xantán feldolgozása Hőkezelés: 90°C-on – pasztőrözés, a mikrobák elölése Kicsapás: valamelyik alkohollal (metanol – izopropanol) Elválasztás: ülepítő centrifugával Szárítás: max. 50°C-on, tálcás vagy vákuum szárító Őrlés

27

Xantán felhasználása

60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, saláta-dresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textilipar 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett), fúróöblítő folyadék

28


14



Xantán felhasználása Fúróöblítő folyadék: olajfúrásnál a fúrófej körül erős nyírás érvényesül – kicsi a viszkozitás, jó a hűtés. A felszálló áramlásban kicsi a nyírás – nagy a viszkozitás, lassítja a kőtörmelék ülepedését.

29

Egyéb mikrobiális poliszacharidok Pullulán törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba a-1,4- és a-1,6 glükán szerkezet Változó molekulatömeg Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus Jó adhéziós tulajdonság Nem toxikus Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam Felhasználás: filmek, fóliák készítése

30


15



Egyéb mikrobiális poliszacharidok Szkleroglükán Törzs: (Sclerotium rolfsii, S. glucanicum) β-glükán: nagyrészt β1-3 és kevés β 1-6 kötés Vízoldható Pszeudoplasztikus tulajdonság Felhasználás: kőolajfúrási iszapok stabilizálására festékek, tinták készítésére növényi magbevonat ragasztójaként

31

Egyéb mikrobiális poliszacharidok Alginát, alginsav Mannuronsav β(1-4) polimer, α-guluronsavval, homopolimer blokkok váltják egymást anionos jellegű (vö. pektin) Barnamoszatok sejtfalában fordul elő (Laminaria fajok), innen nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii).

32


16



Alginát Viszkózus, gumiszerű anyag, vízben nem oldódik, de sok vizet köt meg. Kationkötő, kationcserélő, Ca2+ ionokkal gélt képez (sejtek bezárása) Felhasználása: a gyógyszeriparban széles körben alkalmazzák égési sérülések esetén elősegíti a sérült rész gyógyulását fémmérgezés esetén fémek megkötésére használják élelmiszerekben sűrítőanyagként, stabilizálószerként, zselésítő anyagként, valamint emulgeálószerként használják E400 néven.

33

HIALURONSAV Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav + 1-4 glükózamin) álló polimer. Polfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban a kakastaréjban.

Gyógyszerként: Zn-hialuronát Curiosin

34


17



HIALURONSAV 2. Szerepe többféle: – Kenőanyag izületi felszíneken – Sejtek mechanikai védelme – Sebgyógyulás folyamata – Magzati fejlődés, differenciálódás Alkalmazásai: – Égések, forrázások, sebgyógyulás – Izületi súrlódások kezelése injekcióval – Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum – Kozmetikumok

35

HIALURONSAV GYÁRTÁSA Kétféle eljárást használnak: - szervextrakció - fermentáció A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el (endotoxinok, mikrobák) 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (pH= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal.

36


18



HEPARIN Majdnem minden szervben előfordul → szervextrakció. Többféleképpen szulfonált mukopoliszacharid, Ca-só formájában hozzák forgalomba.

Antikoaguláns = véralvadásgátló

37

Egyéb mikrobiális poliszacharidok Foszfomannán (Hansenula, Pichia, Pachyselon nemzetség egyes fajai) Mikrobiológiai lebontással szemben ellenálló Jó viszkozitásnövelő Stabilizáló Diszpergáló hatású Kitozán (Mucor rouxii, Absidia coerulea) Nitrogéntartalmú poliszacharid Felhasználás: flokkuláló szerként, papíripari ragasztóként, kelátképzőként

38


19



Ciklodextrinek (CD, Schardinger dextrinek)

39

A ciklodextrinek méretei

40


20



Ciklodextrinek előállítása

Egylépéses biokonverzió: ciklodextrin-glikozil-transzferázzal (CGTáz) Több törzs is termeli: 1. Bacillus macerans 2. Alkalofil bakt. № 38-2 3. Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. 4. Bacillus circulans Izolált, oldott enzimet használnak.

41

Ciklodextrinek előállítása

42


21



Ciklodextrinek előállítása Mindig többféle CD keveréke keletkezik + lineáris melléktermékek. Termék-inhibíció: a keletkező CD gátolja az enzimet. α-, β -, γ - CD arány szabályozása:

Mikrobától is függ: 1.,3. kezdetben α -t termel 2. kezdetben β -t termel Toluol adagolás: β-val zárványkomplex, eltolja az egyensúlyt (α → β), végén ~90% β -CD Dekanol adagolás: α irányába tolja el, 36% α-CD, mellette csak 3.7% β -CD 43

Mercian eljárás (J) Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: pH=6, T=55 °C, 8,3 % elfolyósított keményítő Nem használnak zárvány molekulát. α, β és γ keverék képződik, hozam: α - 22,3%, β - 10,8%, γ - 5,1% Elválasztás szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30 °C-ra, majd vissza 55 °C-ra) α megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás: ~100%. β megkötés: ciklohexán–propánamid–n-kapronsav ligandon 44


22



Mercian eljárás (J)

45

Irányított gyártások: α-CD előállítás

Komplexáló vegyület: dekanol (vízgőzzel eltávolítható) Csak α-CD képződik: jól oldódik (140 mg/ml), nehéz kristályosítani Hozam: ~50%

46


23



Irányított gyártások: β-CD előállítás Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás α-amilázzal, 80°C-on, 1h, pH=7.2, Ca2+ kell Enzim inaktiválás: 100-120 °C-on 30 percig Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 °C, 100-105 h, keverés Komplexáló vegyület: toluol A komplex szűrése, vákuum bepárlás/stripelés (toluol elávolítása), kristályosítás Hozam: ~90% 47

γ-CD előállítás

A β-CD gyártás mellékterméke Konverzió CGT-ázzal Komplexáló szer: metil-etilketon - α-naftol keverék Vízben oldhatatlan komplex, mely metanolban feloldódik Ioncsere, aktív szenes tisztítás Hozam: ~20%

48


24



A ciklodextrinek alkalmazásai: molekuláris csomagolás

Az inklúziós komplexek képződésének vázlata Az apoláris molekulák beilleszkedése az apoláris gyűrűbe energiacsökkenéssel jár. 49

Ciklodextrinek alkalmazása Gyógyszerek formulázása: Oldhatóság nő (felszívódás): vízben nem oldható vegyületek is adhatók injekciókban A hozzáférhetőség nő Stabilizál: kevésbé párolog, véd az oxidálás ellen, a hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin)

50


25



Ciklodextrinek alkalmazása Példák: Prostaglandin E2- β-CD: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-CD: injekció (érszűkület) Benexate- β-CD: gyomorfekély („kiékelő” molekula: Arg) Fokhagymaolaj β-CD: koleszterin csökkentés Szteroidok

51

Ösztradiol

Progeszteron

Ampicillin

Prosztaglandin F

52


26



Ciklodextrinek alkalmazása Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület, stabilizál, oxidálás ellen véd hagyma - β-CD: élelmiszeraromák Alacsony koleszterin tartalmú vaj előállítása: olvadt vaj + β-CD = bezárja a koleszterint Kellemetlen íz, illat eltávolítása: kávé, tea keserű íze; Kávé oldószermentes koffein-mentesítése Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad

53

Ciklodextrinek alkalmazása

Biotechnológia: Mikrobiológiai konverziók – szteránvázas vegyületek Lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinná dimetil-β-CD – zsírsav komplex Szennyvíz detoxifikálás Biospecifikus elválasztás

54


27



Mikrobiológiai konverziók

55

Toxikus anyagok megkötése

Szennyvíztisztításban, talajmeliorációban. 56


28



Biospecifikus elválasztás

A keményítő szerkezetanalógja, lásd a BIM gyakorlatot.

57


29

5. Mikrobiális poliszacharidok

Recommend Documents