Semmelweis Egyetem, Gyógyszerészi Kémiai Intézet „Műszeres gyógyszeranalízis” speciálkollégium (2012)
Kapilláris elektroforézis a gyógyszeranalízisben II. dr. Szakács Zoltán Richter Gedeon Nyrt. Fizikai-kémiai alapok, a CE berendezés felépítése Ionok elválasztására alkalmas CE módszerek Biopolimerek és fragmenseik elválasztására alkalmas technikák Semleges molekulák elválasztására is alkalmas technikák Királis analízis kapilláris elektroforézissel Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben
III. Biopolimerek és fragmenseik elválasztása
3.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás Capillary Isoelectric focusing (CIEF) Makromolekulák (fehérjék, huminsavak...) elválasztása izoelektromos pontjuk (pI) szerint (S. Hjertén, 1985)
Q̄
1 0,5
pI
0 -0,5 -1 -1,5 -2 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
pH
4.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I.
Amfolit: több, különböző pK-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) pH
A
B
C
C A
C
A B
borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaOH kapilláris az EOF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kV): pH-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás
anód(+) H3PO4
3
4
5
6
7
8
9 pH
5.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve I.
Amfolit: több, különböző pK-jú csoportot tartalmazó molekula ( ikerion) 1. A teljes kapilláris megtöltése amfolitkeverékkel és mintával (A, B, C) pH
borított falú (pl. keresztkötött poliakrilamid) vagy géllel töltött katód (-) NaOH kapilláris az EOF elnyomására 2. Nagyfeszültség (4-6 kV): pH-gradiens kialakulása és izoelektromos fókuszálás
anód(+) H3PO4
A
4
3
B
C
5
6
7
9 pH
8
kialakul a pH-gradiens („steady state” ), az áram minimális értékre csökken, a mintakomponensek izoelektromos pontjuk (pI) szerint fókuszálódnak
6.
Kapilláris izoelektromos fókuszálás (CIEF) elve II.
3. A pH-gradiens katódos mobilizálása: a fókuszált mintazónák áthajtása a detektoron
A
anód(+) H3PO4
4
3
A
B
B
5
C pH 6 katód(-) H3PO4+NaCl
C
4 5 6 7 8 9 pH 3 elektroforetikus mobilizálás: pl. katód-elektrolitot ellentétes pH-jú pufferre cseréljük [ H ]+ ∑ c NH + =[ OH ]+ ∑ c COO− +
−
3
+ − [ H ]+ ∑ c NH + =[ OH ]+ ∑ c COO− +c 3
Cl−
7.
Hemoglobin-rendellenességek klinikai szűrése 25 m id borított kapilláris 2% amfolitkev. pH 3-10 fókuszálás 10 kV, 5 min mobilizálás 10 kV
A0: normál humán Hb
C, G, G2: mutáns hemoglobinok
Kapilláris gélelektroforézis Capillary Gel Electrophoresis (CGE) Nagymolekulák (biopolimerek) méret szerinti elválasztása
Fehérjék analízise: pl. SDS-PA-CGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gél gélelektroforézis)
Oligonukleotidok, DNS: pl. agaróz gélen és lineáris poliakrilamidon
9.
Kapilláris gélelektroforézis (CGE)
• Gél töltet a kapillárisban kusza, térhálós szerkezet, pórusokkal - kis méretű ionok (pl. pufferalkotók) zavartalanul átmennek a pórusokon - nagyobb ionok hidrodinamikai sugara összemérhető a pórusok méretével: a pórusok molekulaszűrőként viselkednek (Ogston-modell) méret szerinti elválasztás (oligonukleotidok) - nagyobb biopolimerek (denaturált DNS vagy fehérje) „kígyózó, hüllőszerű” mozgással (reptation) préselik át magukat a pórusokon méret (molekulatömeg) szerinti elválasztás - gél: antikonvektív közeg (diffúzió lecsökken) - kapillárisfal borítása (coating) EOF is minimális • kémiai gélek (térhálós polimerek, kémiai keresztkötésekkel, cross-links) - bele vannak polimerizálva a kapillárisba, jól definiált méretű pórusok - hőérzékeny, buborékképződés veszélye! pl. térhálósított poliakrilamid • fizikai gélek (lineáris polimerek hálózata, polymer networks) - kisebb viszkozitás, bepumpálható a kapillárisba, majd eltávolítható, megújítható - pórusméret változtatható pl. a hőmérséklettel, nem hőérzékeny pl. lineáris poliakrilamid, alkilezett cellulóz, agarózgél, dextrán, polietilén-oxid, PEG…
10.
Kémiai gél: poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) H2C
CH
H2C
CO NH2
AA (akrilamid)
CH
CO NH
H2C
CH
CO
BIS • Gél összetételének jellemzése (AA = akrilamid) T% = (AA + bis) / 100 teljes gélképző anyag tömeg%-a, 3-10 % C% = bis / (AA + bis) · 100% bifunkciós akrilamid %-a, 0-5 % • C% határozza meg a térhálósodás fokát, a gél keménységét C% = 0 fizikai, lineáris gél (kapillárisba pumpálható, megújítható) • gyakori az elektrokinetikus injektálás • kereskedelemben kapható kész, géllel töltött kapillárisok: Beckman, ABI, Bio-Rad, J&W, Supelco, ... • • • •
Oligonukleotidok, DNS szakaszok szekvenálása: PAGE kétszálú DNS (dsDNA) denaturálása: 7 M karbamid vagy formamid, hő, Hg-vegy. töltés/méret arány azonos, elválasztás méret szerint! nagyobb DNS-re jobb a lineáris poliakrilamid-gél vagy agarózgél (nagyobb pórusok)
• Fehérjék, glikoproteinek elválasztása: SDS-PAGE • a (globuláris) fehérjéket denaturálni kell pl. a következő anyagokkal: nátrium-dodecil-szulfát (SDS): be is burkolja a fehérjét, mozgékonys. arányos log Mt béta-merkaptoetanol, DTT = ditiotreitol (diszulfidhidak hasítása)
11.
Humán fehérjék méret szerinti elválasztása: SDS-PAGE • (A) cerebrospinális folyadék minta (B) szérumminta • minta + puffer, hevítés (feh. denatur.) 120 mM Tris, pH 6.6, 1% SDS, merkaptoetanol • lineáris PAG kapilláris, inj. 3.4 kPa 60 sec • elfo 14 kV, UV detektálás 254 nm • marker fehérjék (ismert Mt): Ferguson plot
OG: Orange G (front marker, elsőként jut át) a: transthyretin c: -trace protein Alb: albumin f: 2-makroglobulin
12.
b: IgG könnyű lánc d: IgG nehéz lánc e: transzferrin A. Hiraoka et al. J. Chromatogr. A 895 (2000) 339-344
A Human Genome projekt
• 1986. Smith, Hood: automata szekvenátor (nem kapilláris PAGE, de fluoreszc.) • 1990. indul a Human Genome Project (US kormány, 3 milliárd USD) az emberi genom szekvenálása: 30 000 gén, 3 billió bázispár (bp) • International Human Genome Sequencing Consortium alakul • 150 M$ / év (fő szponzorok: NIH, Wellcome Foundation, Department of Energy) 1999- Celera Genomics (C.Venter): privát cégek is bekapcsolódtak kompetitorként • 1990. Zagurski, McCormick: első Capillary Array Electrophoresis berendezés 1993- az előző ábrákon bemutatott hatékony detektálási technika (Applied Biosystem licensze: „3700 DNA Sequencer”, 96 kapillárissal) 2001- első összegző publikációk (Nature, Science) • a szekvenálási sebesség 10x növekedése az automatizált géllap-elfohoz képest • a CAE-nek nagy szerepe volt abban, hogy a teljes emberi genom szekvenálása a tervezett 2005. helyett 2003. április 14-én elkészült ! • 2002-2005. Single Nucleotide Polymorphism (SNP-k) teljes feltérképezése http://www.genome.gov
13.
14.
Capillary Array Electrophoresis készülék:
• 384-mintás szekvenáló mikroelektroforetikus „chip” • injektálás a kerületen, elfo során befelé haladnak a fragmensek forgó konfokális fluoreszcens szkenner detektálja a csúcsokat
Dovichi, Zhang, Angew. Chem. 112 (2000) 4635-4640
IV. Semleges molekulák elválasztására is alkalmas CE technikák
Micelláris elektrokinetikus kromatográfia Micellar Elektrokinetic Chromatography (MEKC) Micellar Elektrokinetic Capillary Chromatography (MECC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő micella / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján Ionok esetén vegyes mechanizmus, mozgékonyság szerinti is történik elválasztás
(Terabe, 1984)
17.
Micelláris elektrokinetikai kromatográfia (MEKC, MECC)
1 k' ⋅μ ep + ⋅μ 1+k ' 1+k ' mc ez a tag csak ionokra! elválasztás:
injektálás:
k’: kapacitás faktor (micella – oldatfázis megoszlás) detektor
μ tot =μeo +
EOF
teo detektorjel
MEKC elúciós ablak
tmc MEKC retenciós idő
18.
Retenciós indexek a hidrofobicitás jellemzésére teo
MEKC elúciós ablak
tm tmc
• MEKC kapacitás faktor (Terabe, 1984)
ionokra (Vindevogel, Sandra, 1990)
tm teo n szolubilizált teo .(1 tm / tmc ) nvízben V k ' Pm/w víz Pm/w Vmono/mic ( ctenzid CMC ) Vmicella k'
• Normált retenciós faktor
k"
k'
tm tion tion .(1 tm / tmc )
fázistartózkodási idők (taq, tmic)
micelláris megoszlás:
tm teo (0 < k” < 1) tm taq tmic teo (1 k " ) tmck " tmc teo
Idei M, Győrffy E, Kiss E, Őrfi L, et al. Electrophoresis 1999, 20, 15611567. Dobos Zs, Kiss E, Hallgas B, Kéri Gy, Idei M Electrophoresis 2005, 26, 849857.
tprop,mic =
t mic tm
A MEKC-ben leggyakrabban anionos tenzidek
19. tenzid
CMC [mM] aggr. szám
anionos: Na dodecil-szulfát, SDS: CH3(CH2)11OSO3
8,2
62
nátrium tetradecil-szulfát
2,1
62
N-lauroil-N-metil--alaninát (ALE)
9,8
lítium-perfluorooktánszulfonát (LIPFOS)
6,7
epesavsók:
R1 nátrium-kolát (SC)
R2
20.
R
OH OH OH CH2CH2COO
-dezoxikolát (SDC) OH H -taurokolát (TC) -taurodezoxikolát
R3
OH CH2CH2COO
OH OH OH OH H OH
CH2CH2CONHCH2CH2SO3
CH2CH2CONHCH2CH2SO3
13
2-4
10
4-10
10 6
4
A MEKC-ben gyakran használt egyéb pszeudofázisok
tenzid
CMC [mM] aggr. szám
kationos: dodecil-trimetil-ammónium-bromid (DTAB)
nemionos:
15
50
tetradecil-trimetil-ammónium-bromid (TTAB)
3,6
hexadecil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB)
1
78
0,1
40
polioxoetilén(23)-dodecil éter (Brij 35)
polioxoetilén(20)-szorbinát monooleát (Tween 80)
0,01
polioxoetilén(20)-szorbinát monolaurát (Tween 20)
0,059
oktilglükozid dodecil--D-maltozid
0,16
TRITON X-100
0,24
140
21.
Gyakran használt micella-markerek • teljesen szolubilizált festékmolekula – a micellákkal együtt vándorol tmc meghatározása
22.
A felbontás optimálásának lehetőségei
1−t eo /t mc
N α −1 k ' R s= √ ⋅ ⋅ ⋅ 4 α 1+k ' 1−(t eo /t mc )k ' • ha tmc ,
szelektivitás:
α=
k'1 k'2
≥1
visszakapjuk a HPLC-re érvényes felbontás képletét
Optimálási lehetőségek: • Micellák típusa és koncentrációja (MEKC elúciós ablak) • Puffer típusa, koncentrációja és pH-ja • Szerves módosító használata (MeOH, ACN, iPrOH) • Vegyes micellák használata • Micellák + királis szelektorok (ciklodextrinek) használata • Kapillárisfal borítása, más hőmérséklet vagy feszültség használata
23.
Anabolikus szteroidok MEKC elválasztása H3C CH3
1
H
OH
5
H H
H
CH3
3
6
CH 3 H
CH3
O
H H3 C
7
H
CH3 H
O O CH3
H
O
CH3
H
H
H OH CH 3
O O
H
O
H
H
CH3 CH 3
H
O
CH3 OH
2
CH3
H
O
O
CH3
H H
O
• 50 m ID kapilláris, 65 (50) cm • BGE: 60 mM borát, 30 mM foszforsav, 20 mM SDS, 10% 1-propanol • referencia minta: 50 g ml-1 (0,2 mM) szteroid BGE-ben • EK injektálás 11 kV, 4 s • elfo: +27 kV, 25 °C, UV detektálás 245 nm WC Lin, CC Sue, CH Kuei, Chromatographia 1999, 49, 454-456.
24.
Doxorubicin + metabolitjai egyetlen sejtből: MEKC + LIF
A: egyetlen sejtből, B: sejtszuszpenzió extraktumból • NS-1 sejtek inkubációja: 25 M DOX, 8 h, majd mosás HEPES/mannitol pufferrel • 20 m ID 39,5 cm kapillárisba mikroszkóp alatt az 5 ml sejtszuszpenzióból egyetlen sejtet felszippantunk (gravitációs injektálás, 114 cm, 1 sec, <0,1 nl), pufferben sejt lízis 30” • BGE: 10 mM borát, 10 mM SDS (pH 9,3) • elfo: 400 V cm-1, detektálás: LIF Ar-ion lézer 488 nm gerj, 635 ± 28 nm bandpass detektálás • DOX kalibráció: 0,1 – 10 nM lineáris, LOD: 61 ± 13 zmol (36600 molekula) • átlagosan 9,5 fmol DOX / sejt, metabolit: 0,03-1 amol/sejt (<0,1%: lassú metabol. vagy efflux?) AB Anderson, J Gergen, EA Arriaga, J Chromatogr. B 2002, 769, 97-106.
Mikroemulziós elektrokinetikus kromatográfia (MEEKC) (Watarai, 1991)
Semleges molekulák (ionok) elválasztása eltérő olaj / víz megoszlásuk (+ionmozgékonyságuk )alapján • oktán vízben + SDS: tejszerű emulzió tenzidbevonata van a cseppeknek (10 um) • + egyenesláncú alkohol (co-surfactant): feltisztul !! átlátszó, TD stabil, „olaj a vízben” mikroemulzió • határfelületi feszültség közel zérus, viszkozitása alig nagyobb egy vizes pufferénál • mintaelőkészítési előny: krémek, olajok közvetlen szolubilizálása • a tenzid határozza meg a csepp töltését, hangolható (kationos, ikerionos is van) • pozitív analitokkal a megoszlás mellett felületi ionpárképzés is lehetséges • flexibilisebb (?) a MEKC-nél, szélesebb lipofilitás-tartományban használható, hatékonyabb fázistranszfer, nagyobb elúciós ablak (pl. oktanofenon a marker)
26.
Fólsav validált MEEKC mérése vitamintablettában
fólsav (B11 vitamin)
belső standard: niacin (B3 vitamin) • mikroemulzió: 0,5% etilacetát; 0,6% SDS; 1,2% butanol; 15% 2-propanol; 82,7% 10 mM borátpuffer (pH 9,2) • kalibr. görbe fólsavra: 160-240 ug/ml, LOQ 9 ug/ml, LOD 3 ug/ml • 20 tabletta porítása, bemérése, jelre töltése a B3 törzsoldattal, szonikálás, szűrés alikvot további 10x hígítása a B3 törzsoldattal, szonikálás • hidr.injektálás 40,2 (30) cm 75 um ID kapillárisba, +28 kV, 25 C, UV det. 214 nm MS Aurora-Prado, CA Silva, MFM Tavares, KD Altria, J Chromat A 2004, 1051, 291-296.
Kapilláris elektrokromatográfia Capillary Elektrochromatography (CEC) Ionok vagy semleges molekulák elválasztása eltérő állófázis / puffer megoszlásuk, tehát hidrofobicitásuk (lipofilitásuk) alapján (mint az RP-HPLC-ben) Ionok esetén vegyes mechanizmus, mert mozgékonyság szerinti elválasztás is történik („HPLC + CZE”) 1981. Jorgenson, Lukacs: 10 m ODS fázis 170 m kapillárisban 1987. Tsuda: coated open tubular cap. 1987-91. Knox, Grant: CEC gyakorlati megvalósítása 1994. Smith, Evans: gyógyszermolekulák CEC elválasztása (ODS tölteten)
28.
Kapilláris elektrokromatográfia (CEC)
• HPLC hatékonyságának növelése: részecskeméret csökkentése m alá egyre nagyobb oszlopellenállás, egyre nagyobb nyomás kell! • hidraulikus áramlási profil: parabolikus, csúcsdiszperzióhoz vezet • nyomás helyett EOF hajtsa a folyadékot: - elérhető a HPLC-ben megszokott sebesség (0.5-3 mm/s) - dugószerű áramlási profil: nagyobb hatékonyság - részecskeméret elvileg m alá is csökkenthető • Elválasztás elve: semleges molekulák álló/mozgófázis közti megoszlása
Az EOF szerepe • a töltet részecskéinek felületén is kialakul elektromos kettősréteg elég közeli részecskék kettősrétegei átfednek, EOF megszűnhet! • Stern-Gouy-Chapman modell: egyre kisebb részecskék esetén egyre nagyobb pufferkoncentráció kell (10 mM-ig), hogy vékonyabb kettősréteg legyen, az elmélet szerint 0,4 um-ig le lehet menni a részecskeátmérővel pressurized CEC (pCEC) = PEC (pszeudo-elektrokromatográfia): • EOF mellett nyomáskülönbség (pumpa) is hajtja az eluenst (inletben p) (Verheij, Hugener; Tsuda, 1987)
29.
CEC oszlop készítése
• a részecskék felületén is kialakul elektromos kettősréteg töltöttek frit kell a kapilláris végére a töltet kiáramlásának megakadályozására: - szilikakapilláris végének szinterelésével (huzalon áramot átvezetve, 450 °C) - kálium-szilikát és formamid in situ polimerizálása - a töltet anyagának szinterelésével • oszlop töltése állófázissal: - „zagy (slurry)”: állófázis szuszpendálva a mozgófázisban, kapillárisba töltés, majd a mozgófázis kimosása vízzel - 1-2 mm vastag kapillárist száraz állófázissal töltenek, majd géppel kihúzzák - szilikagél töltött, elektrokinetikusan be lehet vinni - újabban: monolith column (continuous bed column) kémiailag belepolimerizálják az állófázist, nem kell frit (kb. 2000-től) • buborékképződés megakadályozása: kis túlnyomás a pufferedényekben
grafika: HP CE Partner
30.
Használt állófázisok
• „C18” oktadecilszilán (ODS), 3 m - erősen bázisos anyagok esetén „szilika hatás” - mixed-mode: pl. C6/SCX (kationcserélő szulfonátcsoport ugyanazon a szemcsén) • szilikafalhoz kémiailag kötött „C8” • szilikafalhoz kémiailag kötött alfa-savas glikoprotein (AGP) királis elválasztásra
Mozgófázis választása • adott pH-jú puffer víz/acetonitril (vagy víz/metanol) oldószerelegyben %ACN-el nő (!) az EOF • ikerionos (Good-típusú) puffer előnyös 1-5 mM (hő- és buborékfejlődés kivédésére) • pl. 5 mM SDS: ionpárképző és hatékony buborék-gátló (fel.fesz. csökken a szilárd/folyadék fázishatáron)
31.
Gyógyszeralapanyag (API) gyártási példa: Ibuprofen szennyezésprofilja pCEC-val • fused silica kapilláris (33 cm, 24.5 cm, i.d. 100 um), töltet: Lichrosphre 100 RP-18 (5 um) • mobil fázis: 10 : 40 : 50 arányban: - 100 mM hangyasav/ammónia, pH 2,5 - víz - acetonitril • 0,5 mg/ml metanolos minta, injektálás 12 bar 24 sec • elektrokromatográfia: 25 kV és 12 bar • lineáris tartomány: 0,05-0,15 mg/ml, 1% szennyezők kvantitatív mérése
Quaglia, et al. Il Farmaco 55 (2003) 699-705
V. Királis analízis kapilláris elektroforézissel
33.
Királis elválasztások – alapfogalmak
• Kiralitás (IUPAC): egy merev objektumnak az a geometriai tulajdonsága, hogy tükörképével nem hozható fedésbe. • Míg diasztereomerek kromatográfiás vagy migrációs tulajdonságai (elvileg) különbözőek, az R/S enantiomereké – akirális környezetben – azonosak. • Indirekt királis elválasztás: elválasztás előtti származékképzés királis reagenssel (C) diasztereomer-képzés R + C
R–C
S + C
S–C
• Direkt királis elválasztás: egy királis szelektorral diasztereomer-komplex dinamikus (tranziens) képződése az elválasztás során R + C
RC
S + C
SC
[ R ] [S] ee 100% • Enantiomer felesleg: [R ] [S] [R] AR A 100% 100% R 100% • Enantiomer szennyezés: eiR [ R ] [S] AR AS AS
A királis kapilláris elektroforézis alapjai
34.
• hárompontos illeszkedés, enantiomerek szupramolekuláris felismerése
• Gassman, et al. (1985) alkalmazta először • A legtöbb CE módban megvalósítható a királis elválasztás: CZE, ITP, MEKC: „pszeudofázis”
a futtatópufferben oldjuk fel a királis szelektort „kapilláris elektrokinetikai kromatográfia” (Terabe)
előnyök ( HPLC):
anyagtakarékos, flexibilis, gyorsabb módszerfejlesztés
hátrányok:
preparatív királis elválasztás nehézkes
semleges királis szelektor (CZE, ITP) töltött királis szelektor: „kapilláris elektrokinetikai kromatográfia, EKC” (Terabe) királis micellák: királis MEKC CGE:
gélbe belekevert / belepolimerizált királis szelektor
CEC:
állófázisba belekevert / belepolimerizált királis szelektor
35.
Királis szelektorok és elválasztható vegyületcsaládok I.
királis szelektor
enantiomerelválasztást mutató vegyületcsalád
natív ciklodextrinek: -CD
alig szubsztituált aromás gyűrű
-CD
diszubsztituált aromás gyűrű
-CD
többszörösen szubsztituált / anellált aromás gyűrű(k)
semleges,
DM--CD
a -CD-nél általánosabban használható
módosított
TM--CD
a -CD-nél általánosabban használható
ciklodextrinek: HP--CD
aromás gyűrű és hidroxilcsoport a királis szénatomon
anionos CD-származékok: CM--CD, S--CD, SBE-CD semleges vagy kationos vegyületek (aromás gyűrű!) kationos CD-származékok: QA--CD
semleges vagy anionos vegyületek M Blanco, I Valverde, Trends Anal. Chem. 2003, 22, 428439.
36.
Királis szelektorok és jellemző vegyületcsaládok II.
királis szelektor
enantiomerelválasztást mutató vegyületcsalád
királis koronaéterek
primer aminok, ammóniumsók
királis tenzidek:
merev, anellált gyűrűs vegyületek (szteroidok
epesavak
enantiomerjei, epimerjei)
makrociklusos antibiotikumok - Anzamicinek
semleges vagy kationos (amincsoportok!)
- Glikopeptidek
anion/karboxil/amid és aromás gyűrű a királis szénatom közelében
lineáris poliszacharidok: heparán-szulfonátok
heterociklusos N és még egy ionizálható N
ligandumcsere-komplexek
aminosavak, amino-alkoholok és hidroxisavak
királis ionpárképzők M Blanco, I Valverde, Trends Anal. Chem. 2003, 22, 428439.
37.
Izoproterenol enantiomerek CZE elválasztása (semleges ciklodextrinekkel)
* OH
HO O
„natív CD”
O
OH
O
HO
O
OH HO
O
RS
O
HO O HO
OH O
hidroxipropil-
OH
HO
OH
O
HO
OH HO OH
OH HO
O
O O
O OH
OH
O HO
béta-ciklodextrin
dimetil-
trimetilkét CD keveréke („duál CD rendszer”)
• 50 mM foszfát/TEA puffer, pH = 3,0, 30 kV H Godel, R Weinberger, HP Application Note, 1995, 12-5963-5502E.
38.
Tropánvázas alkaloidok királis CZE elválasztása szulfatált -CD-vel • 55 mM foszfát (pH 7), 2,9 mM S--CD • 50 m i.d. kapilláris (48,5 cm / 40 cm) • inj. 16 nl minta (0.1 mg/ml) • elfo 20 kV, 20 °C • UV detektálás 195 nm • alkaloid analízis szemcseppből és növényi gyökérkivonatból (0.1 mg/ml) • mintaelőkészítés: szuperkritikus fluid extrakció (CO2 + 20% MeOH) során kisebb racemizáció, mint szilárd/folyadék extrakció (CH3Cl / MeOH / NH3) során
L Mateus, S Cherkaoui, P Christen, JL Veuthy, J. Chromat. A 2000, 868, 285-294.
39.
Tramadol és humán fázis I metabolitjai (mind királis) • korábbi bioanalitika: HPLC-UV, HPLC-ampero királis: HPLC királis állófázissal • CZE-UV problémái: érzékenység... => MS detektálás?
Mt: 263.3
249.3
• királis CD-CZE előzmény: anionos CD, foszfátpuffer (pH 3), egyik sem MS-kompatibilis...
Megoldások:
249.3
• BGE: 40 mM ammónium-acetát, pH 4.0 +2,5 mg/mL SBE-bCD • partial filling: csak hosszának 90%-ig van anionos CD a kapillárisban és visszafelé migrál... 235.3 +__________________________________________________________________ → ESI
235.3
• polivinilalkohol bevonatú kapilláris,CZE: 25 kV,20°C kvadrupól MS: ESI+ ionizáció (MH+ molekulaionok), Single Ion Monitoring (SIM) 221.3
S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868, 295-303.
40.
Tramadol és metabolitjai: CD-CZE-ESI-MS (SIM)
mind 100 ng/ml
Reconstructed Ion Chromatogram Single Ion Monitoring
S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868, 295-303.
40.
Tramadol és metabolitjai: CD-CZE-ESI-MS (SIM)
mind 100 ng/ml
Reconstructed Ion Chromatogram Single Ion Monitoring
S Rudaz, S Cherkaoui, P Dayer, S Fanali, JL Veuthey J Chromatogr A 2000, 868, 295-303.
41.
Az enantiomer migrációs sorrend szerepe
• Az aszimmetrikusan torzult csúcsalak (fronting / tailing) gyakoribb a CE-ben, pl. elektromigrációs diszperzió miatt
K R [C] ( R RC ) ( K R KS ) 1 [C] ( K R KS ) K R KS [C]2
• a migrációs sorrend megváltoztatása - KR és KS relatív nagysága (CD szubszt.fok) - [C] változtatása - R változtatása a pH-val - EOF változtatása, illetve ellentétes polaritás - ellentétes szelektivitású szelektor hozzáadása - akirális micellák vagy szerves oldószer
42.
Példák a migrációs sorrend egyszerű változtatására
• binaftil-foszfát enantiomerek pH-függő migrációja
• ofloxacin kombinált ligandumcserés (L-Phe-Zn) és zárványképzésen alapuló királis elválasztása
Horiami, et al. J. Chromat. A 1997, 760, 235.
VI. Kapilláris elektroforézis a gyógyszerkönyvben Az European Pharmacopoeia 7.1 CE tárgyú cikkelyei I. • Kapilláris elektroforézis fejezet: - általános bevezető után CZE, CGE, cIEF és MEKC módszerek elve, - kvantifikálás normált csúcsterületek alapján, - rendszeralkalmasság: N, Rs, As (csúcsszimmetria) - (normált) csúcsterületek és (relatív) migrációs idők reprodukálhatósága • Levocabastin HCl: rokon szennyezők és epimer elv. - BGE: pH 9,0 Na-borát, SDS, HP-béta-CD, 10% izopropanol - MEKC fokozatosan növekvő áramprogrammal, 50 °C-on, 60 perc • Galantamin HBr: szintetikus változatára királis CZE módszer - BGE: Na2HPO4 és alfa-ciklodextrin, CZE: 15 kV (35'), 214 nm • S-(-)-Ropivacaine HCl: enantiomertisztaság CD-CZE-vel - BGE: pH 3,0 foszfát+trietanolamin, DIMEB CD - CZE: 375 V/cm (30 perc), 206 nm - limit: max. 0,5% engedélyezett a disztomerből
44.
Az European Pharmacopoeia 7.1 CE tárgyú cikkelyei II.
• Glutation (GSH) mellett GSSG, dipeptidek, Cys - BGE: pH 1,8 foszfát - CZE: 20 kV, 45 perc, 200 nm • Aprotinin (58 aminosav, 3 diszulfidhíd) peptid szennyezői (dez-Ala, -dez-Gly) - BGE: pH 3 foszfát - CZE: 25 °C-on 200 V/cm 30 percig, 214 nm) • Eritropoietin (165 aminosav, 2 diszulfidhíd, 31 kDa) izoformákra terület% limit - sótalanítás után a minták 4 °C-on analízis előtt! - BGE: pH 5,5: Na-acetát; tricin; NaCl; putrescin 2,5 mM; urea 7 M - CZE: 30 °C-on 143 V/cm 80 percig, 214 nm [továbbfejlesztés: CZE-TOF-MS, BGE: pH 2,6: ecetsav + 20% metanol: 135 izoforma, 44 glikoforma, a stabilabb pegilált változatok is...] • Szomatropin (191 aminosav, 2 diszulfidhíd, 22 kDa) dezamidált töltésvariánsok vizsg. - a minták 4 °C-on analízis előtt! - BGE: pH 6,0 ammónium-hidrogénfoszfát - CZE: 30 °C-on 217 V/cm 80 percig, 200 nm • Intakt glikoproteinek glikánmintázatának vizsgálata: - általánosan „CE”, SDS-PAGE vagy IEF módszert ajánl (MS, SEC … mellett)
45.
Miért nem használják szélesebb körben a hatóságok? (pedig a gyógyszerkincs 90%-a ionizálható...)
Érzékenységi problémák • UV detektálás: kis injektált térfogat, rövid optikai úthossz... • Buborékcellánál az on-line előkoncentrálás 10-100x hatékonyabb lehet (Field-amplified SS, Large Volume SS, MEKC sweeping...) • MS full-scan: nem sokkal jobb az UV-nál, Single Ion Mode: LOQ < 0,1% • Érzékenyebb detektorok: LIF, vezetőképesség (C4D), amperometria...
Validálási problémák • ma már nemigen vannak! (intercompany cross-validations...) • migrációk idők és felbontás LC-hez hasonló reprodukálhatósága: a kapillárisfal állapota a döntő! (mosási protokollok, dinamikus borítás, hőmérsékletkontroll) • injektálás reprodukálhatósága: belső std., relatív területek
„More expertise needed...” U Holzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, 2283-2292.
46.
Kapilláris elektroforézis és a kromatográfiák...
„Ortogonális” elválasztástechnikák • megbízhatóbb szennyezésprofil, ha eltérő elvű módszerekkel is vizsgáljuk • CE-n belül is vannak ortogonális technikák (CZE vs. MEKC...) • pl. „gentamicin” több vegyület keveréke, HPLC + pulzus amperometriához képest on-line származékképzés OPA-val és MEKC elválasztás: hatékonyabb, gyorsabb • fluorokinolonokra viszont a HPLC-UV is 0,1%-ra érzékeny vs. CZE-LIF...
Királis analízis, enantiomertisztaság vizsgálata • gyógyszerkönyv: még mindig polarimetria, királis oszlopú HPLC... a CE-t sokkal szélesebb körben kellene használni! • validálás: izomertiszta vs. random szubsztituált ciklodextrinek (sarzsonként eltérő szelektivitás, felbontás ?) U Holzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, 2283-2292.
Bacitracin analízise kétféle technikával
47. HPLC @ EP
MEKC
bacitracin A U Holzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, 2283-2292.
48.
Levodopa mellett D-DOPA - validált CD-CZE módszer
• EP: HPLC módszer: akirális RP-18 állófázis, mozgófázis: réz-acetát és N,N-dimetil-L-Phe metanol-vízben Rs > 5, érzékenység: D-DOPA > 0,5% • CD-CZE módszer (Hoogmartens, 2002) továbbfejlesztése és teljes validálása: L-DOPA
• 31 (22,5) cm 50 um ID kapilláris • BGE: 20 mM Na-foszfát, pH 2,5 10 mM szulfatált béta-CD
D-DOPA 0,1%
• CZE: -15 kV (82 uA), 200 nm • minden minta 0,1 M HCl-ben készült • D-DOPA LOD: 0,015%, LOQ: 0,04% linearitás: 0,04-0,6% D (+1 mg/mL L)
D-DOPA 0,5%
• repeatability (intraday, interday prec.) rel.migr.idő < 0,9 RSD% csúcsterület-arány: < 4 RSD% • robustness: BGE conc, temp, voltage => Rs relatív változása <10%
U Holzgrabe, D Brinz, S Kopec, C Weber, Y Bitar Electrophoresis 2006, 27, 2283-2292.
49.
Mikrochip elfo, „lab-on-a-chip”, micro-TAS, mikrofluidika • fotolitográfiásan gyártott lapkák - üveg, fused silica - poli(dimetil)sziloxán, PMMA • EK injektálás, detektálás: LIF, MS, amperometria • néhány cm migrációs úthossz sec-időskálára rövidült analízis • előkoncentrálás, reakció is lehetséges „lab-on-a-chip”
1-puffer, 2-minta, 3-minta waste, 5-elválasztás, 4-waste
• biokémiai, orvosdiagnosztikai alkalmazások! GlucoWatch(R) – bőrön át
Összefoglalás: CE - “jolly joker” technika (nemcsak) ionokra • egy platform, számos elválasztási mechanizmus • a gyógyszeranalízisben még (mindig) nem elég elterjedt, pedig...
A Espada, M Molina-Martin DDT 2012
