UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra antropologie a genetiky člověka
Studijní program: Biologie (navazující magisterské studium) Studijní obor: Antropologie a genetika člověka
Bc. Aneta Turková
Porovnání embryotoxického účinku inzulínu a glukózy metodou CHEST.
The comparison of embryotoxic effect of insulin and glucose by the method CHEST.
Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce: Doc. MUDr. Miroslav Peterka,DSc.
Praha 2011
Prohlášení
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval/a samostatně a že jsem uvedl/a všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze dne podpis
Poděkování:
Na tomto místě bych chtěla poděkovat panu doc. MUDr. Miroslavu Peterkovi, DSc. za velkorysou pomoc, trpělivost a skvělé vedení diplomové práce. Rovněž bych ráda poděkovala kolektivu z Oddělení teratologie Ústavu experimentální medicíny AV ČR, především slečně Mgr. Petře Herlové a slečně Bc. Michaele Janíkové za vytvoření příjemného pracovního prostředí a ochotnou spolupráci při získávání výsledků k této diplomové práci. Rovněž mé díky patří rodině za trpělivost a podporu.
OBSAH ABSTRAKT ............................................................................................................ 4 ABSTRACT ……………………………………………………………………… 6 VYSVĚTLIVKY ZKRATEK …………………………………………………..... 8 1. ÚVOD ………………………………………………………………………..... 9 1.1 DIABETES MELLITUS ……………………………………………….... 9 1.1.1 Definice ...…………………………………………………………...
9
1.1.2 Rozdělení diabetes mellitus podle etiologie ...……........................... 9 1.1.2.1 Diabetes mellitus I. typu ...……………………………………. 9 1.1.2.2 Diabetes mellitus II. typu ........................................................ 10 1.1.2.3 Gestační diabetes mellitus ...………………………………… 10 1.1.2.4 Ostatní specifické typy diabetu ..…………………………...... 10 1.2 DIABETES MELLITUS A TĚHOTENSTVÍ ..……………………….. 11 1.2.1 Riziko poškození plodu u jednotlivých typů diabetu ...….............. 11 1.2.2 Zdravotní komplikace u novorozenců diabetických matek ...…... 12 1.2.2.1 Poporodní úmrtí ..……………………………………………. 12 1.2.2.2 Asfyxie ..……………………………………………………… 12 1.2.2.3 Syndrom dechové tísně ..…………………………………….. 13 1.2.2.4 Makrosomie .…………………………………………………. 13 1.2.2.5 Vrozené vady ..……………………………………………….. 13 1.2.2.5.1 Základní pojmy z oblasti teratologie ..…………….... 14 1.2.2.5.2 Diabetes mellitus a typy vrozených vad ..…………... 16
1
1.3 DIABETES – PŘÍČINY A MECHANISMY TERATOGENEZE ........ 20 1.3.1 Hypoglykémie ..................................................................................... 20 1.3.2 Obezita a nadváha ………………………………………………...... 21 1.3.3 Cévní onemocnění ………………………………………………...... 22 1.3.4 Mateřská ketoacidóza ...…………………………………………..... 22 1.3.5 Glukóza a hyperglykémie ……...…………………………………... 23 1.3.6 Inzulín ……………………………………………………………...... 25 1.4 TESTOVÁNÍ EMBRYOTOXICITY …………………………………... 27 2. CÍLE PRÁCE …………………………………………………………...…...... 31 3. MATERIÁL A METODIKA ………………………………………………..... 32 3.1 NÁSADOVÁ VEJCE ………………………………………………….... 32 3.2 PŘEVZETÍ A NASAZENÍ VAJEC …………………………………...... 32 3.3 VYTVOŘENÍ OKÉNKA VE SKOŘÁPCE ………………………….... 33 3.4 ZAVÍRÁNÍ OKÉNKA ………………………………………………….. 36 3.5 SUBGERMINÁLNÍ A INTRAAMNIÁLNÍ APLIKACE …………….. 37 3.5.1 Aplikace testované látky ………………………………………….... 39 3.6 ODBĚR ZÁRODKŮ …………………………………………………….. 40 4. VÝSLEDKY ………………………………………………………………....... 42 4.1 INZULÍN INSUMAN BASAL .................................................................. 42 4.2 INZULÍN INSUMAN RAPID …………………………………………... 48 4.3 GLUKÓZA ………………………………………………………………. 53 4.4 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ APLIKACE JEDNOTLIVÝCH LÁTEK ….. 55
2
4.5 INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU INSUMAN RAPID ………. 57 4.6 INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU INSUMAN BASAL ……… 59 5. DISKUZE ….………………………………………………………………..… 61 5.1 EMBRYOTOXICKÉ ÚČINKY INZULÍNŮ INSUMAN BASAL A INSUMAN RAPID ..………………………………………………….…. 61 5.2 EMBRYOTOXICKÉ ÚČINKY GLUKÓZY .………………………… 63 5.3 INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU ..…………………………… 64 6. ZÁVĚR .…………………………………………………………………….… 67 7. LITERATURA ..………………………………………………………….…… 68
3
ABSTRAKT Diabetes mellitus je souhrnné označení skupiny chronických onemocnění, která se projevují poruchou metabolismu sacharidů. Jedná se polygenní multifaktoriální onemocnění. To znamená, že predispozice pro toto onemocnění je jednak dědičná, ale na vzniku se značně podílí i vliv okolního prostředí. Diabetes mellitus může propuknout v jakémkoli věku bez ohledu na pohlaví postiženého. Rozlišujeme tři základní typy tohoto onemocnění: diabetes mellitus I. typu, diabetes mellitus II. typu a gestační diabetes mellitus. Specifické typy diabetes mellitus doprovázejí různá onemocnění (endokrinní, zánětlivá, vyvolaná podáváním léků). Pokud těhotné ženy trpí diabetem, mají jejich nenarození potomci až 10x vyšší riziko vzniku vývojové vady, prenatálního a postnatálního úmrtí a poporodních komplikací než potomci žen, které pocházejí ze zdravé populace. Přesná příčina uvedených komplikací není dosud známá. Mezi potencionální teratogenní vlivy patří například hypoglykémie, obezita a nadváha, cévní onemocnění, ketoacidóza a podobně. Hlavními a velmi diskutovanými potencionálními teratogenními faktory jsou především glukóza a inzulín. Tyto dvě látky se zcela běžně vyskytují v souvislosti s tímto onemocněním – glukóza v podobě hyperglykémie a inzulín jako prostředek jejího snížení. Existují však velmi rozporuplné názory na to, která z těchto dvou látek způsobuje poškození zárodku. Cílem této diplomové práce proto bylo přispět k řešení tohoto problému a otestovat přímou embryotoxicitu inzulínu a glukózy. K řešení tohoto cíle byla zvolena metoda CHEST (Chick Embryotoxicity Screening Test), která k testování přímé embryotoxicity různých látek využívá kuřecí zárodky in ovo. Principem této metody je vytvoření okénka ve skořápce vajíčka a následná subgerminální či intraamniální aplikace testované látky přímo do bezprostředního okolí kuřecího zárodku. Velkou předností této metody je vyloučení mateřského organismu z procesu testování. Rozdílné farmakokinetické vlastnosti mateřského organismu (např. člověka, myši, potkana či králíka) jsou hlavní příčinou mezidruhových rozdílů při testování látek. Další výhodou této metody je možnost vyloučení neoplodněných vajec, mrtvých či spontánně malformovaných zárodků ještě před samotnou aplikací testované látky.
4
Zárodky byly testovány zvlášť od druhého do šestého inkubačního dne. Nejprve byly podávány dva typy inzulínů – Insuman Basal a Insuman Rapid. Podávané dávky se pohybovaly v rozmezí od 3µg/3µl až 0,003µg/3µl. Poté byla testována glukóza, u které byly použity nejvyšší dávky 300µg/3µl a 30µg/3µl. Embryotoxický efekt byl nalezen u obou typů inzulínů. Začátek pásma embryotoxicity inzulínu Insuman Basal i Insuman Rapid leží mezi dávkami 0,03µg/3µl a 0,003µg/3µl. Z embryotoxických projevů převažovala zárodečná smrt nad vznikem vrozených vad. Pouze po aplikaci druhého inkubačního dne se objevil zvýšený výskyt malformací, které jsou označovány jako syndrom kaudální regrese. Glukóza žádný embryotoxický efekt nevykazovala ani v nejvyšších testovaných dávkách. V pilotní studii jsme testovali interakci mezi podáním glukózy a následnou injikací inzulínu. Cílem této studie bylo zjistit, zda se změní embryotoxické účinky inzulínů, pokud kuřecímu zárodku nejprve injikujeme glukózu.
Podaná dávka glukózy byla u obou
inzulínů stejná 30µg/3µl, podané dávky inzulínu Insuman Basal byly 3µg/3µl až 0,03µg/3µl, inzulínu Insuman Rapid 0,3µg/3µl až 0,003µg/3µl. Glukóza, která podána samostatně embryotoxicky nepůsobila, dokázala v interakci s inzulínem značně posílit jeho embryotoxické účinky a to nejméně o jeden dávkový řád. Příčinou zvýšené citlivosti zárodků by mohlo být přeplnění buněk nadbytkem glukózy a jejich následné nevratné poškození. Prozkoumání mechanismu vzniku zárodečné smrti působením inzulínu a glukózy je však již nad rámec této diplomové práce. Na základě získaných výsledků bychom doporučili budoucím matkám diabetičkám důslednou kompenzaci hyperglykémie již v prekoncepčním období a po celé období gravidity. Dávkování inzulínu u těhotných by mělo být plynulé pomocí inzulínové pumpy, abychom zabránili značnému zvýšení hladiny inzulínu v mateřské krvi po každé injikaci. Také časté glykemické kontroly by v případě léčby inzulínem mohly snížit riziko vzniku vrozených vad a smrti zárodku či novorozence u diabetických žen.
5
ABSTRACT Diabetes mellitus is a common name for a group of chronic diseases, demonstrated by carbohydrate metabolism failure. It is a polygenous multifactorial disease. It means that there is a hereditary predisposition for this disease, but its development is significantly caused also by effect of the environment. Diabetes mellitus can develop in any age, regardless of sex. We distinguish among three basic types of this disease: diabetes mellitus of the 1st type, diabetes mellitus of the 2nd type and gestational diabetes mellitus. Various diseases (endocrine, inflammatory, caused by pharmacy) accompany specific types of diabetes mellitus. If gravid women suffer from diabetes, their unborn children have 10x higher risk of development of malformation, prenatal and postnatal death and post partum complications than children of women belonging to healthy population. The exact cause of abovementioned complications is not known yet. Hypoglycaemia, obesity, excess weight, angiopathy, ketoacidosis, etc. belong among potential teratogenic effects. The main and very controversial potential teratogenic factors are especially glucose and insulin. These two substances are commonly presented in relation to this disease – glucose in a form of hyperglycaemia and insulin as an agent to decrease it. However, there are very ambivalent opinions on which one of these two substances causes damage to embryo. Therefore, the aim of this diploma thesis was to contribute to solving of this problem and test direct embryotoxicity of insulin and glucose. For solving of this issue, the so-called CHEST (Chick Embryotoxicity Screening Test) method was chosen, that uses chicken embryos in ovo for testing direct embryotoxicity of various substances. The principle of this method is creation of a window in eggshell and consequent subgerminal or intraamnial application of the substance being tested, directly into immediate surroundings of chicken embryo. The big advantage of this method is elimination of maternal organism from the testing process. Various pharmacokinetic characteristics of parental organism (e.g. human, mouse, rat or rabbit) are the main cause of inter-specific differences during testing of substances. Other benefit of this method is the possibility of elimination of non-fertilized eggs, dead or spontaneously malformed embryos before the application of tested substances.
6
Embryos were tested from the second until the sixth incubation day. Firstly, two types of insulin were injected - Insuman Basal and Insuman Rapid. Injected doses varied between 3µg/3µl to 0,003µg/3µl. Then glucose was tested, with the highest dosage of 300µg/3µl and 30µg/3µl. Embryotoxic effect was detected for both types of insulin. The beginning of embryotoxicity line of insulin’s Insuman Basal and Insuman Rapid lies between the dosage of 0,03µg/3µl and 0,003µg/3µl. From embryotoxic effect, death of embryos predominated over development of congenital malformations. Only after application on the second incubation day, there was increased occurrence of malformations that are described as syndrome of caudal regression. Glucose did not show any embryotoxic effect, not even in the highest tested doses. In the pilot study, we tested interaction between injection of glucose and consequent injection of insulin. The aim of this study was to determine whether the embryotoxic effects of insulin’s would change if we firstly apply glucose to chicken embryo. Injected dosage of glucose was the same for both insulin’s - 30µg/3µl, testing dosages of insulin Insuman Basal were 3µg/3µl to 0,03µg/3µl, and of insulin Insuman Rapid 0,3µg/3µl to 0,003µg/3µl.
Glucose, if applied separately, didn´t show any embryotoxic effects;
however, in interaction with insulin, it was able to significantly increased its embryotoxic effect, at least by one order of magnitude. The reason for this increased sensitivity of embryos could have been overloading of cells by overflow of glucose and their consequent irreversible damage. However, examination of mechanism of development death of embryo by effect of insulin and glucose is beyond the aim of this diploma thesis. Based on the results found out, we would recommend careful compensation of hyperglycaemia to expectant mothers with diabetes already during preconception period and during the whole gravidity period. Dosage of insulin to gravid women should be gradual, with use of insulin pump, so that we can avoid significant increase of insulin level in mother blood after every injection. Also frequent glycaemia check-ups in case of insulin medication could decrease the risk of development of congenital abnormalities and embryonal or neonatal death at women with diabetes.
7
VYSVĚTLIVKY ZKRATEK IDDM
Insulin - Dependent Diabetes Mellitus (diabetes mellitus závislý na inzulínu)
anti-GAD
Anti Glutamic Acid Decarboxylase (protilátky proti Langerhansovým ostrůvkům)
LADA
Latent Autoimmune Diabetes in Adults (latentní autoimunitní diabetes dospělých)
NIDDM
Noninsulin – Dependent Diabetes Mellitus (diabetes mellitus nezávislý na inzulínu)
MODY
Maturity-Onset Diabetes of theYoung (diabetes mladých začínající v dospělosti)
GDM
Gestational Diabetes Mellitus (gestační diabetes mellitus)
RDS
Respiratory Distress Syndrom (syndrom dechové tísně)
SCR
syndrom kaudální regrese
TGA
Transposition of the Great Arteries (transpozice velkých arterií)
ASD
Atrial Septal Defect (atriální septální defekt)
VSD
Ventricular Septal Defect (ventrikulární septální defekt)
L5
pátý lumbální obratel
S1
první sakrální obratel
BMI
Body Mass Index
TNF
Tumor Necrosis Factor
CRP
C-Reactive Protein
IUGR
Intrauterine Growth Retardation (intrauterinní růstová retardace)
IU
mezinárodní jednotka koncentrace inzulínu
CHEST
Chick Embryotoxicity Screening Test
UPT
umělé přerušení těhotenství
HH
Hamburger & Hamilton
8
1. ÚVOD 1.1 DIABETES MELLITUS 1.1.1 Definice Diabetes mellitus je vážné metabolické onemocnění, vznikající na základě genetické predispozice a přítomnosti faktorů vyskytujících se v zevním prostředí. Jedná se o chronické onemocnění, charakterizované především poruchami metabolismu sacharidů, lipidů a proteinů, které mohou vést k nedostatečné sekreci inzulínu anebo jsou primárně způsobeny nedostatečnou sekrecí inzulínu. Porucha sekrece inzulínu vede ke špatnému průniku glukózy do buněk a následnému vyvolání hyperglykémie. Prevalence tohoto onemocnění se ve středoevropské populaci pohybuje mezi 6 – 7,5 %. Dlouhodobě neléčený diabetes mellitus způsobuje poškození funkce různých orgánů a jejich následné selhání, nejčastěji chronickou renální insuficienci a rozvoj aterosklerózy (Racek et al., 2006). Mezi nejčastější projevy tohoto onemocnění patří zvýšená potřeba příjmu tekutin, časté močení, rozostřené vidění, úbytek tělesné hmotnosti a únava. Tělo neléčeného diabetika si získává potřebnou energii rozkladem tuků, při kterém se uvolňují ketolátky, které snižují pH vnitřního prostředí. V těžkých případech se pacienti mohou ocitnout i v bezvědomí. Bez efektivního lékařského zásahu může tento stav končit smrtí (WHO, 1999).
1.1.2 Rozdělení diabetes mellitus podle etiologie 1.1.2.1 Diabetes mellitus I. typu Diabetes mellitus závislý na inzulínu (IDDM), dříve označovaný také jako juvenilní, je onemocnění, při kterém dochází k destrukci beta-buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu a postupnému vývoji diabetes mellitus. Příčinou je pravděpodobně autoimunitní proces, vyvolaný neznámým zevním faktorem u jedinců s diabetickou predispozicí. Rychlost ničení beta-buněk je zcela variabilní (WHO, 1999; Racek et al., 2006). I když metabolický stav pacienta před projevem klinických příznaků nemoci může být zcela normální, cílenou detekcí protilátek by mohl být destrukční proces odhalen. Přítomnost anti-GAD (ostrůvkových protilátek) a protilátek proti inzulínu odpovídá autoimunitnímu
9
ničení. Přesto u některých národů, převážně u asiatů a některých afrických populací, nebyly nalezeny důkazy autoimunitního procesu. Tato forma se označuje jako idiopatický diabetes mellitus I. typu (WHO, 1999). Jako LADA bývá označován pomalu se rozvíjející diabetes mellitus I. typu v dospělosti - latent autoimmune diabetes of adults (Racek et al., 2006). 1.1.2.2 Diabetes mellitus II. typu Diabetes mellitus nezávislý na inzulínu (NIDDM) je nejčastější formou diabetu. Jedná se buď o relativní nedostatek inzulínu, způsobený například obezitou nebo sníženou odpovědí beta-buněk pankreatu na hyperglykémii, nebo inzulínovou rezistenci, jejíž příčinu musíme hledat v poškození receptorů. Bývá často spojován s pozitivní rodinou anamnézou diabetu, vyšším věkem, obezitou a s nedostatkem pohybu. V dnešní době jsou známy i konkrétní mutace genů související s tímto onemocněním např. genu pro inzulín, inzulínový receptor či genu pro glukokinázu – MODY (Racek et al., 2006). 1.1.2.3 Gestační diabetes mellitus (GDM) Jedná se o diabetes, který se projeví až v průběhu gravidity. Řadíme sem i diabetes, který mohl předcházet těhotenství, ale nebyl rozpoznán. Častěji se gestační diabetes vyskytuje u žen ve vyšším věku, s dřívější glukózovou intolerancí a také u matek z vysoce rizikových etnických skupin. Záchytový screening se provádí ve 24. a 28. týdnu těhotenství pomocí orálního glukózového tolerančního testu (WHO, 1999). U budoucích matek s gestačním diabetem je zvýšené riziko vzniku diabetu i po porodu (Buchanan, Xiang, 2005). Ženy, kterým byl diabetes mellitus odhalen před otěhotněním, jsou řazeny do skupiny pregestačního diabetu mellitu. 1.1.2.4 Ostatní specifické typy diabetu Do této skupiny je řazen diabetes doprovázející různá onemocnění, např. endokrinní, zánětlivá, vyvolaná podáváním léků a podobně. Hyperglykémie může být vyvolána nadprodukcí adrenalinu (feochromocytom, paragangliom), nadprodukcí glukokortikoidů (Cushingův syndrom), onemocněním pankreatu s destrukcí Langerhansových ostrůvků
10
(akutní či chronická pankreatitida, karcinom pankreatu), vlivem léků a podobně (Racek et al., 2006)
1.2 DIABETES MELLITUS A TĚHOTENSTVÍ Těhotné ženy trpící diabetem mají vyšší riziko výskytu vrozené vady, prenatálního i postnatálního úmrtí u svého potomka a porodních komplikací než ženy, které diabetes nemají.
Proč tomu tak je se snaží objasnit výzkumní pracovníci i lékaři již několik
desetiletí.
1.2.1 Riziko poškození plodu u jednotlivých typů diabetu Diabetes mellitus I. typu v těhotenství doprovází 7 - 10x vyšší riziko vzniku vrozené malformace (Platt et al., 2002; Penney et al., 2003; Yang et al., 2006) a téměř 2 - 5x vyšší riziko úmrtí novorozence po porodu (Platt et al., 2002; Evers et al., 2004; Yang et al., 2006). U diabetes mellitus II. typu se vyskytuje 2x vyšší riziko mrtvě narozeného dítěte, 3x vyšší riziko úmrtí novorozence po porodu a 11x více vrozených malformací než u zdravé populace (Dunne et al., 2003). NIDDM se častěji vyskytuje u černochů, asiatů a u některých minoritních skupin například indiánů (Macintosh et al., 2006). Přibližně 2x vyšším rizikem perinatálního úmrtí (Cundy et al., 2000) a 6,5x vyšším rizikem vrozené vady u svého potomka jsou ohroženy těhotné ženy trpící gestačním diabetem (Schaefer et al., 1997; Aberg et al., 2001). GDM je spojován převážně s kardiovaskulárními defekty, které se vyskytují u potomků nemocných matek (Becerra et al., 1990). Při srovnávání těhotných žen s diabetem jsou matky postiženy NIDDM významně starší, mají za sebou většinou více než jedno těhotenství a jsou častěji obézní než ženy trpící IDDM či GDM. Svou roli mohou hrát i rozdíly mezi etnickými skupinami, kdy v populaci Evropanů nacházíme nižší úmrtnost plodů než u kmene Maori (příslušník kmene na Novém Zélandě). U obyvatelů ostrovů v Pacifiku je úmrtnost plodů nižší
11
v porovnání s populací Evropanů, vztaženo na nediabetickou populaci obyvatelstva (Cundy et al., 2000). Srovnávání jednotlivých výsledků těhotenství může být ovlivněno rozdílnými kritérii epidemiologických studií, rozdílným způsobem registrace výsledků těhotenství a/nebo rozdílnou úrovní zdravotnické péče. Rozsáhlé studie zahrnující několik tisíc zkoumaných těhotenství s různými typy diabetu došly k závěru, že riziko výskytu vývojové vady a úmrtí novorozence po porodu nevykazuje významné rozdíly mezi jednotlivými typy diabetu (Schaefer-Graf et al. 2000; Macintosh et al., 2006).
1.2.2 Zdravotní komplikace u novorozenců diabetických matek 1.2.2.1 Poporodní úmrtí Poporodní mortalita se za posledních padesát let snížila z 30 % na 2 – 4 % u žen s IDDM, patrně efektivní kontrolou diabetiček před a v průběhu těhotenství a také zlepšením porodní a novorozenecké péče (Hadden, 1999). Podle studie v Helsinkách jsou nejčastější příčinou poporodního úmrtí novorozence u IDDM matek malformace, následuje nedonošenost plodu a asfyxie, která bývá příčinou již fetálního úmrtí (Schwartz, Teramo, 2000). 1.2.2.2 Asfyxie Fetální asfyxie neboli dušení plodu z nedostatku kyslíku označuje stav, jehož přesný patogenetický mechanismus u diabetických matek není ještě zcela objasněn. Přesto bylo popsáno několik mateřských, placentálních a fetálních faktorů, které se mohou na vzniku asfyxie podílet (Madsen, 1986). Například hyperglykémie mateřská i fetální a s ní související fetální hyperinsulinémie spojené se zvýšenou spotřebou kyslíku mohou být příčinou fetální chronické hypoxemie - nejlehčího stupně nedostatku kyslíku (Schwartz, Teramo, 2000). Dalšími rizikovými faktory jsou kouření a patologické změny artérií placenty u diabetických matek s vaskulárními komplikacemi.
12
1.2.2.3 Syndrom dechové tísně (RDS) Postihuje především nedonošené novorozence s nezralou plicní tkání. Plicím chybí hlavně surfaktant, což je tekutina, vystýlající plicní sklípky a zajišťující jejich roztažnost. Plicní alveoly místo toho obsahují tekutinu s vysokým obsahem proteinů, připomínající sklovitou hyalinní blanku (Moore, Persaud, 2002). Důsledkem poškození plic je nedostatečná výměna kyslíku a oxidu uhličitého. Dítě namáhavě a těžce dýchá. RDS je velmi těžkou poporodní komplikací novorozence a u potomků diabetických matek byl zjištěn až 5,6 x vyšší výskyt této poruchy než u dětí zdravých matek (Robert et al., 1976). Studie na potkanech ukázala, že vysoké hladiny glukózy potlačují syntézu i sekreci surfaktantu a tento proces je velmi výrazný v pozdním stádiu gestace (Gewolb, 1996; Gewolb, O'Brien 1997). 1.2.2.4 Makrosomie Narození dítěte s makrosomií představuje riziko poranění nejen pro samotné novorozeně, ale i pro jeho matku. Do této skupiny jsou řazeni novorozenci vážící více než 4000 g. Ženy trpící nadváhou, diabetem a jejichž těhotenství trvá déle než 42 týdnů, mají významně vyšší riziko vzniku makrosomie u potomků dosahující až 10 %. Při porodu mohou nastat komplikace v podobě dystokie ramének, následného zranění a v kritickém případě i usmrcení plodu (nedostatek kyslíku, zlomení klíční kosti, poškození hybnosti horních končetin) a velkého poranění matky. Adaptační mechanismy novorozence po porodu mohou být významně sníženy u jedinců vážících více než 5000 g. Výskyt makrosomie je častější u chlapců než u dívek a pokud je odhalena ještě před porodem, provádí se císařský řez (Spellacy et al., 1985). Makrosomie u diabetičky může vznikat díky snadnému prostupu glukózy placentou. Vysoké hodnoty glukózy v mateřské krvi jsou příčinou fetální hyperglykémie, která stimuluje produkci fetálního inzulínu. Inzulín zvyšuje syntézu sacharidů, proteinů a lipidů a významně podporuje vznik makrosomie a organomegalie. (McCormick et al., 1979). 1.2.2.5 Vrozené vady V posledních letech incidence vrozených vad jako celku v České republice klesá. Je to dáno zlepšením prenatální diagnostiky pomocí moderních ultrazvukových přístrojů
13
s následným UPT (Šípek, Gregor, 2009). U diabetických matek byl prokázán pozitivní vliv kontroly glykémie na výskyt vrozených vad, kdy ženy, které plánují své těhotenství a pravidelně docházejí na kontroly, mají snížené riziko vzniku vrozené vady (Goldman et al., 1986; Kitzmiller et al., 1991). Studium vrozených vad a principu jejich vzniku je doménou teratologie. Mezi možné příčiny vrozených defektů jsou řazeny genetické dispozice a environmentální faktory. Environmentální škodlivé faktory mohou působit v době prekoncepční na mateřský organismus anebo v prenatálním období jak na matku, tak i na zárodek.
Mezi
environmentální škodlivé faktory zahrnujeme např. chronická onemocnění mateřského organismu, akutní infekce, zvýšenou teplotu, mechanické vlivy (oligohydramnios), chemikálie, léky a radiaci (Brent, Beckman, 1990). 1.2.2.5.1 Základní pojmy z oblasti teratologie Teratologie je nauka o vrozených vadách, jejichž vznik je zapříčiněn působením zevních a/nebo genetických faktorů na individuální vývoj jedince (Peterka, Novotná, 2010). Vývojová vada vzniká odchylkou vývojového procesu jak v době prenatální, tak i v době postnatální. Ne všichni jedinci postiženi vývojovou vadou jsou schopni dožít se porodu, většina jich zaniká ještě před narozením. Proto je vývojová vada nadřazeným pojmem vady vrozené (Peterka, Novotná, 2010). Vrozená vada je charakterizována jako trvalá odchylka struktury, funkce či biochemismu, jež vznikla prenatálně narušením vývojového procesu a přesahuje meze normální variability druhu. Část vývojových vad u jedinců, kteří se dožijí porodu, jsou označovány jako vady vrozené. Vrozené vady se dělí na velké strukturální malformace (rozštěp rtu a čelisti) a malé poruchy (lehké mozkové dysfunkce, slepota, hluchota), které se většinou projevují na funkční a biochemické úrovni. Za deformace jsou považovány vady, které nevznikají poruchou vývojového procesu, ale sekundárně například tlakem děložní stěny nebo nedostatkem plodové vody. Náhlá zástava normálního vývoje plodu se označuje jako disrupce. Do skupiny vrozených vad patří také tak zvané behaviorální defekty neboli vrozené odchylky chování (Peterka, Novotná, 2010) například snížená inteligence či mírná mentální retardace.
14
Běžně se v každé populaci objevují takzvané spontánní malformace. Pro každý živočišný druh se vyskytují v různé frekvenci s nízkou incidencí a od teratogenem vzniklých vad jsou nerozeznatelné. Jsou výsledkem společného působení genetických a environmentálních faktorů (Wilson, 1973). Různé typy defektů byly pozorovány také u lidí. Na incidenci jednotlivých vad se podílejí etnické, rasové a geografické faktory (Warkany, 1971) ale i pohlaví. Například anencefalie se vyskytuje často v Irsku a Skotsku, v jiných lokalitách bývá vzácná (Schardein, 2000). Jako vývojové odchylky jsou definovány drobné změny tvaru a struktury, které se mohou vyskytovat i u zdravých jedinců. Nepoškozují jejich zdraví a umožňují jejich přežití (nadpočetná žebra). Některé mohou být pouze dočasné, například zpoždění vývoje. (Peterka, Novotná, 2010). Za teratogen je považován faktor zevního prostředí povahy chemické, fyzikální a biologické. U potomstva exponovaných jedinců může vyvolat vrozenou vadu, která není dědičná. V prostředí se vyskytuje v takovém množství, které v zasažené části populace zvýší výskyt vrozených vad nad jejich spontánní basální frekvenci v populaci neexponované (Peterka, Novotná, 2010). Citlivost k teratogenezi nezávisí pouze na genotypu zárodku a jeho interakci s faktory zevního prostředí, ale také na vývojovém stádiu v době expozice teratogenu. Během takzvaného prediferenciačního období vývoje tedy v časné fázi těhotenství u embrya většinou nevznikají vrozené vady, ale značným poškozením zárodku dochází k potratu (Schardein, 2000). Ke vzniku vývojové vady v období embryonální diferenciace dochází, pokud se překrývá kritická perioda s periodou senzitivní a působí negativní zevní faktor. Za kritickou periodu je považován určitý časový úsek organogeneze (který je druhově specifický) a částečné závislý na délce gestace a citlivosti tkání (Wilson, 1959) neboli senzitivní periodě. V senzitivní periodě se diferencující buňky stávají citlivými na působení teratogenu, vždy v závislosti na jeho povaze, dávce a druhu exponovaného jedince. Teratogeneze látky má prahový efekt, výskyt a stupeň poškození se zvyšuje s rostoucí dávkou. Působení podprahového množství teratogenní noxy nezpůsobí poškození plodu (Wilson, 1965). Kritická perioda pro vznik těžkých vrozených vad u člověka je přibližně od 3. do 8. týdne gestace (Moore, Persaud, 2002). Dalším vývojem se plod stává méně citlivým k působení teratogenních látek.
15
Mezi základní projevy embryotoxicity patří letalita, která je nejintenzivnější během prvního týdne po ovulaci, vrozené vady a intrauterinní růstová retardace (IUGR). Novorozenec s IUGR má nižší porodní váhu vzhledem k jeho gestačnímu stáří, tzn. méně než 2 500 g (Miller, 1981). Až 86 % poporodní mortality je řazeno do IUGR skupiny novorozenců (Callan, Witter, 1990). Velmi často doprovází novorozence s vrozenou vadou, ale není výjimkou ani výskyt u dětí bez zjevných strukturálních poruch, kde hlavní příčinou může být i nesprávný životní styl matky (kouření, alkohol), infekce, patologie placenty a podobně. IUGR nemá kritickou periodu a proto se může objevit v průběhu celého těhotenství (Peterka, Novotná, 2010). Základní princip teratologie zní: každá látka je v určité dávce schopna vyvolat malformaci, růstovou retardaci a fetální či embryonální smrt u zvířat. Kritickými faktory jsou dávka, druh a načasování působení látky. Stejný základní princip platí i pro člověka (Schardein, 2000). 1.2.2.5.2 Diabetes mellitus a typy vrozených vad Lecorche (1885) byl pravděpodobně prvním, který upozornil na vznik vrozené vady v souvislosti s diabetem. Popsal hydrocefalus u dvou dětí narozených diabetickým matkám. Podle současných studií mohou anomálie vyskytující se u dětí diabetických matek postihnout
všechny
orgánové
systémy.
Nejčastěji
bývá
postižen
skeletální,
kardiovaskulární a nervový systém dítěte, méně často pak systémy urogenitální a gastrointestinální. Syndrom kaudální regrese (SCR) postihne až 1 % potomků diabetických matek a patří mezi nejčastější malformace spojované s diabetem (Mills, 1982, Schardein, 2000). Klinické projevy se vyskytují již při narození dítěte. Mezi méně časté postižené části těla patří hlava (dysplazie lebečních kostí, rozštěp rtu a patra, malformované ušní boltce), skelet (krátký krk s nízkou vlasovou hranicí, dysplazie páteře a pánve, občasný výskyt nadpočetných obratlů, luxace kyčelních kloubů, hypoplazie a někdy i fůze dolních končetin – tzv. symelie, anomálie horních končetin, disproporcionální malý vzrůst), postižení gastrointestinálního a urogenitálního systému (atrézie jícnu, duodena, anu, ageneze ledvin, a močových cest, kryptorchismus), srdeční vady, ageneze plic, kožní dolíčky na hýždích, krátká intergluteální rýha a podobně. Postižení jedinci většinou umírají v útlém věku (Salmon et al., 1978; Žižka, 1994).
16
Dalšími častými vadami kosterní soustavy jsou u dětí diabetiček anomálie žeber a obratlů. Transpozice velkých artérií (TGA). Tato vada patří mezi nejčastější cyanotizující srdeční vadu u novorozených dětí. U typických případů je aorta uložena vpředu a napravo od plicnice, s počátkem v přední části pravé komory a truncus pulmonalis vychází z levé komory. Přidruženy jsou i další defekty ASD (atrialní septální defekt) a VSD (ventrikulární septální defekt), které umožňují částečnou výměnu krve mezi systémovým a plicním oběhem (Moore, Persaud, 2002). Chirurgický zákrok je nutností. Před rokem 1964 většina dětí s TGA umírala v průběhu prvního roku svého života (Gutgesell, McNamara 1975). Ventrikulární septální defekt (VSD) se vyskytuje u 25 % všech srdečních vad. Může se vyskytnout kdekoli v oblasti ventrikulárního septa, nejčastější je tzv. membranózní defekt (Behrman et al., 1996). Malé VSD se mohou samovolně uzavřít. Diagnostika izolovaných VSD probíhá v období mezi narozením a pátým rokem života. Defekt způsobuje masivní levo – pravý zkrat krevního proudu. Dušnost a srdeční selhání v dětství bývají nejčastějšími příznaky. VSD muskulární či chybění mezikomorové přepážky patří mezi méně časté defekty (Moore, Persaud, 2002). Atriální septální defekt (ASD) patří mezi běžně se vyskytující srdeční vady. Nejčastěji nalézanou formou ADS je foramen ovale patens. Na krevní průtok nemá sám o sobě žádný vliv, ale s jinými defekty (stenóza pulmonalis, atrézie) krev proudí přes foramen ovale do levé síně a vyvolává cyanózu (modrofialové zabarvení sliznic a kůže) způsobenou nedostatečným okysličováním krve (Moore, Persaud, 2002). Fallotova tetratologie v sobě kombinuje čtyři srdeční vady. Hypertrofie pravé komory, nasedající aortu, defekt mezikomorové přepážky (VSD) a stenózy pulmonalis. Projevuje se cyanózou novorozence (Moore, Persaud, 2002). Absence jedné umbilikální artérie může být součástí chromozomových aberací a dalších kardiovaskulárních defektů. Příčinou této vady je buď ageneze nebo degenerace artérie v časné fázi těhotenství (Moore, Persaud, 2002). Situs inversus. Jedná se o vrozenou poruchu uložení vnitřních orgánů, kdy fyziologicky levostranné orgány jsou uloženy vpravo (srdce, slezina) a pravostranné vlevo (plíce, játra).
17
Mikrocefalie. U této poruchy je nápadná malá kalva, která je důsledkem malého mozku, přičemž obličej má normální velikost, ploché záhlaví, ustupující čelo, nápadně velký nos, velké a prominující ušní boltce. Postižené děti jsou mentálně retardovány a mají menší vzrůst. Příčina není zcela známá (Žižka, 1994). Anencephalus je natolik charakteristické postižení, že diagnostika nečiní obtíže, defekt krania nemůže uniknout pozornosti. Na hlavě chybí lebeční kryt a mozek, těžší formy trpí kompletním nebo částečným rozštěpem páteřního kanálu, u mírnějších forem mohou být zachovány i rudimenty lebečního krytu a může být vytvořen i rudiment mozku, který často leží mimo dutinu lebeční. Obličejová část je relativně dobře vytvořena s občas se vyskytujícími anomáliemi (rozštěp rtu, kyklopie). Dochází také k postižení urogenitálního systému, deformitám nohou, rukou, srdečním vadám. Úmrtí bývá časté ještě v perinatálním období (Salmon, et al. 1978; Žižka, 1994). U holoprosencefalie je postižen přední mozek a postranní komory často splývají v jeden prostor. Přítomny jsou typické obličejové abnormity (dysplazie střední části obličeje, asymetrie obličeje, ageneze premaxily, rozštěpy čelisti, defekt nosního septa, hypoplazie
čichové
kosti,
mikroftalmie,
retinální
dysplazie,
poruchy
dentice).
Charakteristická je především poloha očí, které jsou umístěny velmi blízko u sebe (Žižka 1994; Moore, Persaud, 2002). Za velmi vážnou formu holoprosencefalie je považována kyklopie (Salmon et al., 1978). Mohou se objevit také skeletální poruchy (spina bifida, polydaktylie, syndaktylie, malý vzrůst) a postižení nervového systému (porucha diferenciace CNS, křeče a poruchy dýchání, psychomotorická retardace), anomálie kardiovaskulárního, urogenitálního, respiračního a gastrointestinálního systému. Postižené děti umírají již v prvním roce života (Žižka, 1994). Spina bifida occulta je defektem obratlových oblouků, u kterých nedošlo k jejich splynutí ve střední čáře patrně v důsledku poruchy růstu. Postihuje obratle L5 nebo S1 a ve většině případů nemá žádné klinické příznaky. Oproti tomu spina bifida cystica patří mezi velmi těžké formy spina bifida. Porušením obratlového oblouku dochází k vytlačení míchy nebo míšních obratlů v charakteristický cystický vak. Pokud jsou ve vaku obsaženy pouze obaly a cebrospinální mok, jedná se o spina bifida s meningokélou, kde mícha a kořeny spinálních nervů jsou v normální pozici. Druhá forma se nazývá spina bifida s meningomyelokélou, u které je vyhřezlá mícha i kořeny míšních nervů, a její výskyt je častější. Spina bifida cystica je často doprovázena neurologickými výpadky různého stupně 18
v závislosti na poloze a velikosti poškození. Výskyt vysokých hladin AFP v amniové tekutině nebo v krvi matky může být důsledkem této abnormality. Ultrazvuk následně dokáže odhalit přítomnost spina bifida cystica. Sonograficky lze fetální páteř vyšetřovat již 8. – 10. týden po oplození (Moore, Persaud, 2002). Ageneze ledvin se dělí na jednostrannou a oboustrannou. Jednostranná ageneze ledvin je poměrně častou poruchou, většinou chybí levá ledvina. Klinické příznaky nejsou přítomny, proto v dětství nebývá rozpoznána. Funkci obou ledvin přebírá jediná hypertrofující ledvina. Tuto poruchu lze očekávat u dětí s jednou umbilikální arterií. Oboustranná ageneze je neslučitelná se životem. Je spojena s charakteristickým výrazem obličeje: oči posazeny daleko od sebe, široký a plochý nos, nízko nasazené uši, ustupující brada a defekty končetin. Smrt novorozence s oboustrannou agenezí ledvin přichází krátce po porodu nebo během prvních měsíců jeho života (Moore, Persaud, 2002). Nejběžnějšími anomáliemi penisu jsou hypospadie. U glandulární hypospadie se ústí uretry nachází na ventrální straně žaludu, u penilní hypospadie na spodním povrchu těla pyje. Obě formy činí asi 80 % všech případů. Těžšími formami jsou hypospadie penoskrotální, u které se ústí uretry nalézá ve spojení penisu se skrotem, a hypospadie perineální, zde nedochází ke splynutí labioskrotálních valů a ústí uretry je umístěné mezi nesplynutými polovinami skrota. Za příčinu vzniku je považována porucha produkce androgenů ve fetálních varlatech nebo receptorová rezistence (Moore, Persaud, 2002). Kryptorchismus se vyskytuje poměrně často u nedonošených dětí. Při normálním vývoji varlata sestoupí do skrota do konce prvního roku. Zůstanou – li uvnitř těla, nedozrají a jedinec je v dospělosti sterilní. Kryptorchická varlata se nacházejí v dutině břišní nebo kdekoli podél dráhy jejich sestupu, nejčastěji v tříselném kanálu. Příčina není zcela známá (Moore, Persaud, 2002). Anomálie zadního střeva se nacházejí v oblasti anorektální krajiny a jsou výsledkem abnormálního vývoje urorektálního septa. Rozdělují se na horní a dolní anomálie v závislosti na vyústění rekta. Jedná se například o anální agenezi s píštělí či bez píštěle, anální stenózu, anorektální agenezi a podobně (Moore, Persaud, 2002).
19
1.3 DIABETES – PŘÍČINY A MECHANISMY TERATOGENEZE. Diabetes mellitus patří mezi multifaktoriální onemocnění, tudíž není jednoduché odhalit jednotlivé příčiny a mechanismy, které se podílejí na vzniku těhotenských komplikací. Při špatné kompenzaci onemocnění dochází velice rychle k metabolickému rozvratu vnitřního prostředí a v přítomnosti různých cévních komplikací také k metabolickým změnám, vedoucím například k hypoxii či renální insuficienci (Mills, 1982).
1.3.1 Hypoglykémie Glykémie snížená pod dolní hranici referenčního rozpětí zdravé populace (pod 3,6 mmol/l) je biochemicky definována jako hypoglykémie (Zima, 2002). Těhotné ženy trpící diabetem a především ty, které jsou léčeny inzulínem nebo léky podporujícími produkci inzulínu, jsou ohroženy vznikem hypoglykémie. Hypoglykemie vzniká při nerovnováze mezi množstvím glukózy a inzulínu v krvi. Hypoglykémii můžeme rozdělit na těžkou a lehkou formu. Mezi příznaky lehké, tedy začínající hypoglykémie, patří svalový třes, bušení srdce, podrážděnost, pocení a někdy i pocit hladu. Rychlé požití potraviny s vysokým obsahem glukózy stabilizuje zdravotní stav pacienta. Pokud dochází k dalšímu poklesu glykémie v těle, ohroženy jsou především nervové buňky, které jsou na energii získané z glukózy přímo závislé. Těžká forma hypoglykémie se proto projevuje poruchou vidění a koncentrace, bolestí hlavy, zmatením, postupně se přidávají křeče a postižený upadá do bezvědomí. Bez okamžité lékařské pomoci je život pacienta ohrožen. Ačkoli několik klinických studií nepotvrdilo vztah mezi mateřskou hypoglykémií a vzniklou embryopatií (Kalter, Warkany, 1959; Rayburn et al., 1986), existují modelové zvířecí
studie
ukazující
potencionální
teratogenní
efekt
hypoglykémie
během
organogeneze. Testování vlivu hypoglykémie odhalilo poškození srdce u myších zárodků. Docházelo
ke
zvýšení
buněčné
smrti
a
redukci
proliferace
buněk
vedoucí
k morfologickým, funkčním a metabolickým změnám u vyvíjejícího se srdce a následné nižší životaschopnosti zárodků (Smoak, 1997; Ghatnekar et al., 2004)
20
1.3.2 Obezita a nadváha Obezita a nadváha jsou v dnešní době považovány za největší celosvětový zdravotnický problém. Jsou definovány jako nadměrné hromadění tuku v těle, které může vyústit i ve vážné zdravotní potíže, diabetes a hypertenzi. Patří k rizikovým faktorům řady chronických onemocnění (kardiovaskulární choroby, diabetes mellitus, rakovina) a těhotenství. Pro klasifikaci nadváhy a obezity se nejčastěji používá takzvaný Body mass index (BMI) u dospělé populace a u dětí od 6 let. Jeho výpočet je poměrně jednoduchý, hmotnost v kilogramech vydělíme druhou mocninou výšky v metrech. Hodnota BMI by měla být považována pouze za orientační, protože nemusí odpovídat stejné míře rozložení tuku u různých jedinců. Podle Světové zdravotnické organizace (WHO) je nadváha definována jako hodnota BMI rovna nebo větší než 25 a hodnota rovna nebo větší než 30 jako obezita (WHO, 2010). Poslední prognózy WHO v roce 2008 ukazují, že na celém světě se vyskytuje přibližně 1,5 miliardy dospělých lidí s nadváhou, z nichž 200 miliónů mužů a 300 miliónů žen bylo obézních. Předpoklady pro rok 2015 ukazují na zhruba 2,3 miliardy dospělých s nadváhou, z toho více než 700 miliónů bude obézních. Nadváha a obezita již nejsou problémem pouze vyspělých zemí, výskyt obezity a nadváhy stoupá i v zemích rozvojových (WHO, 2010). Hodnota BMI rovna 40 a více je označována jako chorobná obezita (Garrow, 1983). Zkoumáním vlivu chorobné obezity na těhotenství se věnoval Kumari (2001), který zjistil, že v této skupině obézních matek je významně vysoký výskyt gestačního diabetu a preeklampsie. Obezita sama o sobě zvyšuje riziko císařského řezu a mrtvě rozeného dítěte. Více než polovina úmrtí je patrně zapříčiněna předčasným narozením dítěte, před 31. týdnem gestačního věku (Naeye, 1990). Tuková tkáň se podílí mimo jiné také na sekreci zánětlivých cytokinů (TNF alfa, interleukin 6, CRP), které jsou zvýšeny v séru obézních žen. Podílejí se na indukci inzulínové rezistence, kde TNF alfa je považován za významný faktor (Katsuki et al., 1998). V případě obézních žen mohou být právě cytokiny významnými markery při pomalu vznikajícím chronickém zánětu (Mohamed – Ali et al., 1997). Kromě toho vysoké hodnoty CRP jsou spojovány s endoteliální dysfunkcí a zhoršenou inzulínovou senzitivitou 21
zjištěnou u netěhotných žen (Festa et al., 2000). Zánět vzniklý v těhotenství by tedy mohl být součástí patogeneze preeklampsie a gestačního diabetu mellitu (Austgulen et al., 1997; Wolf et al., 2003). Waller et al. (2007) objevili souvislost mezi obezitou v těhotenství a strukturálními vadami u narozených potomků. Obézní ženy mají až 2x vyšší riziko výskytu defektu spina bifida u svého potomka a mírně zvýšené riziko vzniku vrozené srdeční vady a rozštěpu patra než ženy z kontrolní skupiny. Příčina zatím není známa.
1.3.3 Cévní onemocnění Výskyt vaskulárního onemocnění u těhotných diabetiček, především před otěhotněním, má nepříznivý vliv na morbiditu novorozenců. Byla zaznamenána přímá souvislost mezi novorozeneckou morbiditou a stupněm cévního onemocnění (Přibylová, 1993). Cévní komplikace s sebou přinášejí riziko vzniku hypoxie a IUGR (Kaaja, 2009). Vrozené vady se u diabetických matek s vážnými vaskulárními komplikacemi objevují až 8 x častěji než u kontrolních skupin (Pedersen et al., 1964). Svou roli zde může hrát i skutečnost, že tyto ženy bývají starší a diabetem trpí déle, než diabetičky bez vaskulárních chorob (Howarth et al., 2007). Vliv trvání diabetu matky se projevil nepříznivě ve výskytu hypoglykémie, hyperbilirubinémie a neurologických odchylek v novorozeneckém období ve srovnání s dětmi matek, jejichž diabetes trval méně než 5 let (Přibylová, 1993).
1.3.4 Mateřská ketoacidóza Při nedostatku glukózy v buňkách (při hyperglykémii) je energie získávána beta-oxidací mastných kyselin v játrech, která vede k tvorbě ketolátek a glykosurii. Organismus matky je dehydratovaný s vyčerpanými elektrolyty (kationty sodíku, draslíku a chloridové anionty). Je ohrožena správná funkce kardiovaskulárního a renálního systému vedoucí postupně k šokovému stavu, komatu a dokonce i smrti (Carroll, Yeomans, 2005). Ke vzniku ketoacidózy mají sklon zejména diabetičky 1. typu.
22
Diabetická ketoacidóza byla létální pro 85 % plodů těhotných žen (Drury et al., 1977) a mateřská ketonurie bývá spojována s nižším IQ u potomků diabetiček (Stehbens et al., 1977).
1.3.5 Glukóza a hyperglykémie Glukóza v těhotenství tvoří hlavní složku výživy důležitou pro růst plodu a pro syntézu mateřského mléka. Společně s glykolytickými metabolity a laktátem je glukóza důležitým zdrojem oxidace v placentální i fetální tkáni. Tvoří zásadní oxidativní a syntetický substrát důležitý pro mateřský metabolismus, především přípravu organismu na laktaci. Zásoba glukózy je tedy hlavním předpokladem pro fyziologický průběh těhotenství a laktaci (Bell, Bauman, 1997). Na počátku těhotenství dochází ke zmnožování beta-buněk Langerhansových ostrůvků vlivem estrogenu a progesteronu a následné zvýšené produkci inzulínu se sklonem k hypoglykémii (Racek et al., 2006). Ale v druhé polovině těhotenství se rozvíjí určitý stupeň inzulínové rezistence, který bývá přirovnáván ke stavu podobnému diabetu II. typu. Inzulínová rezistence je pravděpodobně odpovědí na vzrůstající hodnotu tělesného tuku a zvýšenou produkci placentárních hormonů (Buchanan, Xiang, 2005). Tato inzulínová rezistence vede ke zvýšení glukózy a volných mastných kyselin, které jsou potřebné k vytvoření dostatečné energie pro rychle se vyvíjející plod. Pokud dojde k neadekvátní odpovědi pankreatu na vzniklou situaci, vzniká gestační diabetes. U žen s gestačním diabetem dochází k mnohem většímu nárůstu inzulínové rezistence v těhotenství. Vysvětlením by mohlo být znásobení již existující inzulínové rezistence před otěhotněním a selhávání beta buněk pankreatu, které se snaží kompenzovat zvýšenou inzulínovou rezistenci během druhé poloviny těhotenství produkcí nedostatečného množství inzulínu jako odpovědi na hyperglykémii. Obezita a dědičné faktory mohou tento stav také podporovat (Homko et al., 2001; Di Cianni et al., 2003). Po porodu se situace mění, sekrece inzulínu u žen s gestačním diabetem se příliš neodlišuje od žen ze zdravé populace. Důvodem je snižování inzulínové rezistence a tím i nároku na zvýšenou inzulínovou sekreci. Tímto je defektním beta buňkám umožněna téměř normální funkce (Homko et al., 2001). Ženy s gestačním diabetem mají 20 – 50 % riziko vzniku diabetu II.
23
typu v následujících 5 – 10 letech po těhotenství a jejich potomci mohou být ohroženi diabetem a obezitou v pozdějším věku (Gillman et al., 2003). Laboratorní hodnota glykémie vyšší než horní hranice rozpětí zdravé populace je definována jako hyperglykémie. Podle nové klasifikace se vychází z glykémie na lačno. U zdravé populace je hodnota ≤ 6,0 mmol/l, diabetes mellitus je stanoven při glykémii ≥ 7,0 mmol/l (Zima, 2002). U diabetika vzniká hyperglykémie při absolutním či relativním nedostatku inzulínu, protože tkáňově specifický přenašeč glukózy svalových a tukových buněk (GLUT-4) je na něm přímo závislý. Lidské tělo se s krátkodobou hyperglykémií dokáže bez problémů vyrovnat, při dlouhodobé hyperglykémii vzniká velké množství ketolátek, způsobující rozvrat acidobazické rovnováhy. Podle velkého počtu studií prováděných na zvířatech je hyperglykémie považována za jeden z hlavních možných teratogenních faktorů diabetu. Hyperglykemické prostředí zkoumané na diabetických potkanech se velmi výrazně podílí na zvýšení oxidačního stresu v organismu (Wentzel et al, 2003), které je podporováno ještě zvýšenou aktivitou apoptózy v tomto stavu (Gäreskog et al., 2007). V obou studiích byl k indukci diabetu použit injekčně podávaný streptozotocin (40 mg/kg) a hladina glykémie u sledovaných jedinců byla udržována nad 20 mmol/l. Působením oxidačního stresu může dojít k poškození zárodku a to v takovém stádiu vývoje, kdy je jeho antioxidační odpověď stále ještě slabá (Ornoy et al., 2010). Přehnané spouštění apoptózy v zárodečných buňkách může v časné fázi vývoje myší blastocysty vést k spontánnímu potratu nebo vzniku vrozených vad. Po implantaci oplozeného vajíčka může hyperglykémie díky apoptotickým změnám přímo ovlivnit (snížit) expresi genu Pax 3, která přímo souvisí se vznikem defektu neurální trubice, srdce, kosterní a svalové soustavy. U myší s vysokou hodnotou glykémie došlo k výraznému nárůstu výskytu defektu neurální trubice, ale u myší s mírnou hyperglykémií nikoli (Fine et al., 1999; Moley, 2001). Dřívější studie ukazuje na výskyt oční vady u králíka při podávání velmi vysokých dávek glukózy. (Maeda,1937) Opačné výsledky dokládají studie, kdy potkani krmení v průběhu březosti 30 % glukózou nevykazovali žádný projev toxicity (Telford et al., 1962) a podkožní aplikace širokého spektra roztoku glukózy březím myším nevyvolala žádnou toxicitu (Draghetti, Lanzoni, 1997)
24
Populační studie poukazují na vztah mezi vyšší hladinou glykovaného hemoglobinu A1c a zvýšeným výskytem malformací (Miller, 1981). Upozorňují na pozitivní vliv kontroly a udržování normálních hodnot glykémie. Ale hyperglykémie sama o sobě nemusí být v tomto případě jediným faktorem vzniku malformací, nesmí se zapomínat na vznik velkého množství ketolátek a acidózy v organismu.
1.3.6 Inzulín – C254H377N65O75S6 Inzulín je polypeptidový hormon, tvořen dvěma řetězci aminokyselin A a B, které jsou spojeny disulfidovými můstky. Různé živočišné druhy mají jen malé rozdíly v aminokyselinovém
složení
molekuly
inzulínu.
Syntéza
inzulínu
probíhá
v endoplasmatickém retikulu beta buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu, odtud je transportován do Golgiho aparátu v podobě proinsulínu, kde se vpravuje do granul. Granula Golgiho aparátu se pohybují směrem k buněčné membráně, se kterou se spojují, a inzulín je exocytózou vytlačen ven z buňky. V granulech se před sekrecí odděluje peptidový úsek spojující oba řetězce proinzulínu a vzniká tak spojovací peptid (C – peptid) a vlastní inzulín. V krevním oběhu je inzulín přítomen asi 5 minut, téměř všechny tkáně těla ho mohou přijímat (obsahující inzulínové receptory), ale 80 % vyloučeného inzulínu je metabolizováno v játrech a ledvinách. Inzulín se podílí na zvýšení transportu glukózy, aminokyselin a draslíku do citlivých buněk, stimuluje proteosyntézu, inhibuje degradaci proteinů, aktivuje glykogen syntasy a glykolytické enzymy a inhibuje fosforylasy a glukoneogenetické
enzymy.
Hlavní
sekrece
inzulínu
je
řízena
jednoduchým
zpětnovazebným působením glukózy přímo v beta-buňkách pankreatu. Vysoká hladina glukózy podmiňuje opakující se uvolňování inzulínu. Z dalších cukrů také manosa a fruktosa stimulují sekreci inzulínu. Mezi další stimulátory patří některé aminokyseliny (arginin, leucin), nervové vlivy – nepřímo adrenalinem nebo glukokortikoidy a přímo parasympatickou cestou, hormony trávicí soustavy a podobně. Katecholaminy mohou mít jak stimulační, tak inhibiční účinek (Ganong, 1995). K léčbě diabetes mellitus se používají inzulíny lidské (humánní) nebo geneticky pozměněné (inzulínová analoga). Z tkání hovězího a vepřového dobytka se dříve vyráběly inzulíny zvířecí, které byly hojně rozšířené, ale dnes se již prakticky nepoužívají (Brož, 2006).
25
Inzulín je dalším a společně s glukózou velmi diskutovaným faktorem, který by mohl způsobit vrozené vady u těhotných diabetiček i přesto, že placentální bariéra je relativně nepropustná pro inzulín. Bylo zjištěno, že lidská placenta vychytává a ničí významné množství inzulínu v živém organismu (Buse et al., 1962). Transplacentální přenos by mohl nastat pouze v případě, je-li inzulín vázán na protilátku. Množství takto upraveného zvířecího inzulínu v pupečníkové krvi odpovídalo titru protilátky nalezeného v krvi matky (Bauman, Yalow, 1981). Důkazy embryotoxického účinku podporují hlavně zvířecí studie. Při testování na kuřecích zárodcích vyvolal inzulín vážné skeletální abnormity. Poškození obratlů bylo pozorováno v období mezi počátkem inkubace a druhým dnem, defektní drápy třetí den, anomálie končetin a zobáku čtvrtý a pátý den, dislokace kyčle šestý den. Vývojové poruchy skeletu připomínající onemocnění osteogenesis imperfekta vznikaly mezi třetím a šestým dnem po aplikaci vysokých dávek inzulínu. Inzulín byl podáván v různých dávkách (od 0,05 do 6 IU) v rozdílných intervalech po zahájení inkubace injekčně do žloutku (Duraiswami, 1950). In vitro kultivace šestidenních rudimentů dlouhých kostí kuřecího embrya v mediu bez embryonálního extraktu s inzulínem (0,16 U/ml) po dobu 8 – 10 dní vedla k retardaci růstu i délky diafýzy, rozšíření a poruše konců kostí a zhoršené diferenciaci chrupavek. Přidáním embryonálního extraktu připraveného z 12. – 14. denních kuřat došlo při kultivaci s inzulínem k jeho inaktivaci. Nedošlo k žádným poruchám růstu (Chen, 1954). Podobně deformované končetiny (aplikace 7. inkubační den), poškození obratlů (aplikace den před inkubací až 2. inkubační den) a redukci maxily (aplikace 5. inkubační den) pozoroval Julian & Abbott (1998) při testování zvířecího inzulínu na ptačím modelu. Jedné skupině byla injekčně podána dávka 2 IU vepřového a druhé 2 IU hovězího inzulínu den před zahájením inkubace až 9. inkubační den. Vepřový inzulín vyvolal celkově více poruch než hovězí. Podobnost mezi experimentálně izulínem vyvolanými abnormitami skeletu u kuřecích embryí a syndromem kaudální regrese u potomků diabetických matek může ukazovat na společný mechanismus poškození.
26
1.4 TESTOVÁNÍ EMBRYOTOXICITY Citlivost různých druhů k teratogenu je dána inter-druhovou a intra-druhovou variabilitou a také genetickými odlišnostmi mezi jedinci stejného druhu. Látka, která je teratogenní u několika druhů, může mít velmi malý anebo žádný efekt u druhů jiných. Podobné defekty způsobené teratogenní noxou se mohou vyskytovat s různou frekvencí u různých druhových populací anebo abnormalita vyvolaná stejným teratogenem u jednoho druhu je zcela odlišná od poruch vyvolaných stejnou látkou u druhů jiných (Kalter, 1968). Hlavní příčinou mezidruhových rozdílů je různá toxikokinetika látek v mateřském organismu, rozdílná vnímavost morfogenetických systémů v zárodku a uplatnění morfogenetického systému během morfogeneze. Pojem morfogenetický systém českých teratologů Jelínka R. a Rychtera Z. je objasněn v následující definici:,,Morfogenetický systém je množina buněčných populací, které nesou, vytvářejí a uskutečňují program výstavby definované části organismu (Rychter, Jelínek, 1978).“ Rozštěp patra vzniká narušením jeho morfogenetického systému. Jelikož je například morfogenetický systém patra složen z několika struktur, v závislosti na tom, která z nich a kolik je jich narušeno, se mění i typ rozštěpu. U různých druhů zvířat může být zastoupení jednotlivých struktur různé a tudíž i typ rozštěpu nebude shodný. A proto smrt, růstová retardace a odlišný typ malformace ve významné incidenci lze považovat za hodnotný ukazatel interference dané látky a její koncentrace s morfogenezí (Peterka, Jelínek, 1982). Žádná studie provedená na zvířecím modelu nemůže s absolutní jistotou předpovídat dopad účinku jakékoli látky na člověka. Vhodně zvolená studie může pouze naznačit hrozící riziko, ale nemůže zaručit bezpečí pro vyvíjející se plod. Chemikálie, prokázané jako teratogenní u zvířat, se mohou, ale nemusejí ukázat jako nebezpečné pro člověka, naopak při negativním výsledku může dojít k podcenění rizika (Schardein, 2000). Přesto jsou výzkumy na zvířecím modelu považovány za velmi významné. Jelovsek et al. (1989) zkoumal 175 chemických látek s možnou toxicitou pro člověka a srovnával je s výsledky získanými na zvířecích modelech. Sensitivita testování dosáhla hodnot 62 –75 %, pozitivní prediktivní hodnota se pohybovala mezi 75 – 100 %, negativní prediktivní hodnota mezi 64 – 91 %. Mezi faktory určující rozdílnost mezi lidským a zvířecím modelem patří i genetická heterogenita (ovlivňující absorpci látek, metabolismus, exkreci, toxicitu a podobně), počet porodů, stádium vyvíjejícího se zárodku, interakce podávaných
27
látek, rozmanitost stravy, malnutrice, nadváha, prodělaná a současná onemocnění, rozdílný přenos látek placentou a podobně (Brent, 1972). Farmakokinetické schopnosti mateřského organismu byly odhaleny jako hlavní příčina mezidruhových rozdílů testované látky. Proto je důležité z procesu testování vyřadit přenos látky z matky k zárodku. K tomu se využívají alternativní testovací systémy in vitro, které se rozdělují do několika skupin dle typu použitého modelu: a) buněčné linie zahrnující i kmenové buňky b) buněčná mikromasa (buňky CNS, mezenchymové buňky embryonálních končetin) c) nižší obratlovci a bezobratlí d) kuřecí embryo in ovo e) kultivovaná savčí embrya Alternativní metodou je také intraamniální aplikace zkoumané látky u laboratorních savců. Testovaná látka je vpravována březím samicím myší nebo potkanů do amniového vaku zárodku (Peterka, Novotná, 2010). Ideální alternativní test by měl být takový, který splňuje následující podmínky: 1. Přenos testované látky k zárodku by neměl být zprostředkován (alespoň v počátku testování) organismem matky pokusného zvířete. Tato podmínka je splněna všemi alternativními testy. 2. Umožnit testování i specificky lidských metabolitů (rozpustných či nerozpustných ve vodě). U velkého množství alternativních testů nelze zkoumat nerozpustné látky. 3. Poskytnout kvantifikovatelný výsledek – s ohledem na prahový charakter teratogeneze a pozitivní závislosti odpovědi na dávce. Splňují všechny testy. 4. Možnost pokrýt kritickou periodu řady orgánů různého typu po dostatečně dlouhé testovací období. Tuto podmínku nesplňují testy na buněčné, tkáňové a orgánové kultuře a krátkodobé kultivace celých zárodků.
28
5. Výpovědní hodnota testu vzhledem k lidskému embryu by měla být vysoká, zejména u falešně negativních výsledků. Uvedený požadavek nesplňuje žádný výše popsaný alternativní test. Rozporuplné názory na problematiku vrozených vad u potomků diabetických žen indukovaných glukózou nebo inzulínem přímo vyzývají k novému prozkoumání. Zvolit vhodný testovací model je velmi důležitým bodem výzkumu. Z uvedených alternativních metod se jako velmi spolehlivé jeví testování na zárodku kuřete in ovo. Z testu je vyřazen mateřský organismus, kuřecí embryo se vyvíjí ve svém přirozeném prostředí po dostatečně dlouhou dobu a díky tomu jsou pokryty kritické periody všech orgánů. Lze jím testovat i ve vodě nerozpustné látky. Před i po testování je možné pozorovat vývoj zárodku, metoda je levná a poměrně rychlá. V Ústavu experimentální medicíny Československé akademie věd byla kolektivem autorů vyvinuta metoda CHEST (Chick Embryotoxicity Screening Test) využívající k testování látek kuřecí zárodek in ovo. Principem této metody je vytvoření okénka ve skořápce vajíčka a následná subgerminální a intraamniální aplikace testované látky vyvíjejícímu se zárodku. Velkou předností této metody je možnost selekce zárodků vstupujících do pokusu. Díky okénku lze přesně určit vývojové stádium testovaného zárodku a vyřadit před pokusem mrtvá nebo spontánně malformovaná embrya. Výsledky testování vykazují pozitivní závislost na dávce a jsou dobře reprodukovatelné (Peterka, Novotná, 2010). Metodou CHEST bylo otestováno velké množství látek používaných například v průmyslové výrobě, zemědělství a medicíně. U každé zkoumané látky byl stanoven začátek pásma embryotoxicity a výskyt mrtvých a malformovaných zárodků s konkrétním výčtem vrozených vad (Jelínek et al., 1985, Peterka et al., 1992). K velmi zajímavým výsledkům dospěli Peterka a Fára (1990) při testování embryotoxicity notoricky známých a hojně užívaných chemických látek – vitamínů výše zmíněnou alternativní metodou. Testovány byly vitamíny skupiny B, vitamín A, E, K1 a PP. Jako nejnebezpečnější se projevil vitamín A, na druhém místě pak vitamín B2 s velmi úzkým pásmem bezpečnosti. U vitamínu A pásmo bezpečnosti neexistuje, začátek pásma embryotoxicity se překrývá s maximálními denními dávkami a u zárodku kuřete vyvolal široké spektrum malformací. Metoda CHEST se osvědčila i při testovaní důležitého fyzikálního faktoru, kterým je teplota. Zvýšená teplota je dokázaným teratogenem, který je schopný vyvolat zárodečnou
29
smrt a vrozené vady jak v laboratorních podmínkách, tak i u člověka (Krausová, Peterka, 2007). Testování embryotoxicity látek prostřednictvím mateřského organismu nedovoluje rozhodnout, zda se jedná o působení původní substance, či metabolitu přímo na zárodek anebo poškození mateřského organismu, který zárodek sekundárně poškodí. Proto jsme zvolili testovací systém, který mateřský organismus neobsahuje a testovaná látka se dostává k zárodku přímo. Testováním inzulínu a glukózy na zárodku kuřete in ovo můžeme přesně zjistit jaká z těchto dvou látek je sama o sobě embryotoxická. Předmětem naší studie bude ověřit hypotézu, zda může vyvolat přímou embryotoxicitu (smrt, malformaci zárodku či růstovou retardaci) samotný inzulín, glukóza či jejich vzájemná interakce.
30
2. CÍLE PRÁCE Cíle této práce jsou následující: 1) Porovnat embryotoxické účinky inzulínů Insuman Rapid a Insuman Basal na kuřecím zárodku, zjistit začátek pásma embryotoxicity těchto látek a její projevy. 2) Zjistit embryotoxické účinky glukózy na kuřecím zárodku, určit začátek pásma embryotoxicity a její projevy. 3) Sledovat případnou změnu embryotoxického účinku inzulínu po předchozí aplikaci glukózy.
31
3. MATERIÁL A METODIKA 3.1 NÁSADOVÁ VEJCE K testování na kuřecích zárodcích in ovo je nezbytné sehnat spolehlivého dodavatele násadových vajec. V obchodě se násadová vajíčka neseženou, prodávají se většinou vajíčka neoplozená. Násadové vejce je tedy vajíčko oplozené, které vyžaduje speciální podmínky skladování nezbytné pro přežití vyvíjejícího se zárodku. Mělo by být uchováváno při teplotě 15ºC. Při dlouhodobém skladování se doporučují i nižší skladovací teploty. Velké kolísání teplot (10ºC – 20ºC) zárodek vyčerpává a může dojít i k jeho odumření. Asi po 14 dnech skladování oplozených vajec líhnivost zárodků rapidně klesá. K pokusu byla použita násadová vejce plemene Cobb 500 od dodavatelů XAVERgen, a.s. z provozovny a líhně Habry a MAVE Jičín, a.s.
3.2 PŘEVZETÍ A NASAZENÍ VAJEC Po převzetí vajec jsou údaje o dodávce zaznamenány do sešitu k tomuto účelu určenému (datum dodání, počet vajec, datum a čas nasazení, pokus atd.). V případě, že vejce nejsou nasazena okamžitě po dodání, je nutné je skladovat v lednici přibližně při 15ºC. Před zahájením inkubace je nutné zapnout inkubátor minimálně hodinu předem, aby se dostatečně vyhřál. K pokusu byl použit inkubátor Gallenkamp, jehož velkou předností je možnost naprogramování času a teploty ještě před zahájením inkubace. Ve zvolený čas se inkubátor zapne či přenastaví na jinou teplotu. Vhodná teplota pro inkubaci je 37,5ºC. Do inkubátoru je třeba vložit nádobu s vodou, aby vlhkost prostředí dosahovala 60 – 80 %. Vajíčka se do inkubátoru vkládají na takzvaných nosičích. Při vkládání vajíček do nosičů (v horizontální poloze) je nutné dbát na pevné posazení v mřížkách. Vejce musí v mřížce dobře držet, jinak hrozí jejich propadnutí. V ideálním případě jsou vajíčka nasazována špičkou lehce nahoru. Pokud jsou příliš malá, použijí se nosiče s gázou. Na každé vajíčko by mělo být obyčejnou tužkou poznamenáno datum zahájení inkubace. Pokud jsou vajíčka správně vložena do nosičů a pečlivě popsána, mohou být umístěna do vyhřátého inkubátoru připraveného k inkubaci. Vložení nosiče
32
s vajíčky do příslušné poličky inkubátoru se musí provést s velkou opatrností. Nosič se opře jen o zadní hranu, lehce se nadzvedne a poté pomalu zasune do poličky. Pokud bychom nosič posouvali po celé jeho ploše, mohlo by dojít k přetočení nasazovaných vajíček do nevhodné polohy pro inkubaci. Vejce je potřeba otáčet během inkubace kolem jejich dlouhé osy a to přibližně o čtvrt obrátky ideálně každý den až do vytvoření okénka ve skořápce. Během inkubace dochází k vypařování vody z nádoby, která je umístěná na dně inkubátoru. Množství vody se průběžně kontroluje a v případě potřeby je pravidelně doplňováno. Nezbytnou součástí každého pokusu je vytvoření protokolu, do kterého se zaznamenává průběh testování. Do horních kolonek jsou napsány názvy testovaných látek, vlevo nahoře datum a čas nasazení, datum otevírání a aplikace.
Obr. 1: Inkubace vajec v inkubátoru Gallenkamp s možností přesného nastavení teploty na desetiny oC.
3.3 VYTVOŘENÍ OKÉNKA VE SKOŘÁPCE Okénka ve skořápce vajíčka se vytvářejí v závislosti na dni aplikace, nejpozději však třetí den inkubace. V tomto období ještě nedochází k závažnému poškození cév zárodku při otevírání tak jako u dnů pozdějších. V našem případě se okénka vytvářela druhý a třetí inkubační den. Jelikož se vytvoření okénka musí provést ve sterilním prostředí, je nezbytné si den předem přichystat a vysterilizovat při teplotě 180ºC sklíčka na překrytí okének, pinzety, kterými se sterilní sklíčka při pokusu uchopují, a jednu nebo dvě velké Petriho misky.
33
Ráno v den otevírání se inkubovaná vejce naposledy otočí a to alespoň hodinu a půl před pílením okének proto, aby se zárodek kuřete stačil posunout do vhodné polohy pro jeho určení. Mezitím se přichystá pracovní plocha a vyvaří se pinzety. Vyvaření trvá přibližně 20 minut. Nástroje na otevírání okének (pilky, bodýlka, skalpely) se ponoří do nádoby se 70 % alkoholem a nechají se vydezinfikovat. Pracovní plocha se pokryje čistými filtračními papíry. Do středu je umístěno topné hnízdo, které se zapne asi 30 minut před pokusem, aby se stihl rozpustit parafín potřebný na vytvoření rámečku kolem otevřeného okénka. Do 20 ml injekční stříkačky se připraví fyziologický roztok smícháním savčího fyziologického roztoku a vody pro injekce v poměru 10 : 3. Veškeré pomůcky a používané nádoby by měly být ošetřeny 70 % alkoholem.
Obr. 2: Pracovní plocha s topným hnízdem, Petriho miskami, pinzetami, pilkami, skalpely, štětci, sterilními sklíčky, kahany a injekčními stříkačkami s fyziologickým roztokem.
K vytvoření okénka jsou nezbytné dvě sterilní pinzety, umístěné v Petriho misce společně s vyvařenou vatou. Vedle Petriho misky se připraví nástroje na otevírání okének, speciální plynový nebo malý lihový kahánek, vysterilizovaná sklíčka a pinzety. Inkubované vajíčko se jedno po druhém prosvítí a obyčejnou tužkou se vyznačí předpokládaná poloha vyvíjejícího se zárodku formou rámečku asi 1,5 cm na délku a 1 cm na šířku. Nesmí se zapomenout na vyznačení vzduchové bubliny v oblasti tupého pólu vajíčka. Poté se pomocí brusky opatrně napílí vyznačená okénka. Při propílení skořápky může dojít k porušení cév zárodku a následnému vykrvácení. Pokud se pečlivě pílí až do rohů okénka, usnadní to pozdější odstranění skořápky. Nyní přichází rozhodující okamžik a tím je dotvoření okénka v ruce. Nejprve se nasadí rouška na obličej. Uchopí se vajíčko a pomocí bodýlka se propíchne skořápka v místě
34
vzduchové bubliny, ne příliš hluboko, postačí tři milimetry. Vajíčko se přesune do dlaně a druhou rukou se pomocí malé pilky dopiluje rámeček v drážkách naznačených bruskou. Palcem ruky se přidržuje pilka v místě drážky tak, aby neklouzala. S pílením je třeba skončit, jakmile se narazí na papírovou membránu pod skořápkou. Pozná se to tak, že pilka začne drhnout. Tímto způsobem se postupuje u všech stran okénka. Speciální pozornost si zaslouží ta strana, u které se bude okénko odklápět (jedna z delších stran rámečku). Následně se štětcem vyčistí prostor v oblasti pílení. Ke zvolené straně okénka se přiloží ostrou hranou skalpel a naplocho se zasune pod okraj skořápky. Velice opatrně se skořápka odklopí tak, aby papírová membrána zůstala neporušená. Poté se papírová membrána zakápne fyziologickým roztokem. Pod okénkem by se měla objevit vzduchová bublina jako důkaz sestupu zárodku na druhou stranu vajíčka. Pokud se vzduchová bublina neobjeví, je nutné opatrně proděravět membránu například jehlou od injekční stříkačky nebo sterilní pinzetou v místě, kde není zárodek ani jeho cévy. Po sestupu zárodku se postupně odstraňuje membrána po obvodu okénka od vnitřní strany skořápky. Hrany okénka musí zůstat čisté. Pinzeta se očišťuje od papírové membrány otřením o vlhkou vyvařenou vatu umístěnou v Petriho misce. V průběhu odstraňování membrány lze pozorovat, zda je zárodek živý nebo mrtvý. Také může být poškozený pílením nebo přilepený na skořápku v některém z rohů okénka. Mrtvé či silně krvácející zárodky a neoplodněná vajíčka se z pokusu vyřazují, stejně jako zárodky spontánně malformované. Přilepený zárodek se může jemným nakláněním vajíčka a zakapáváním fyziologickým roztokem uvolnit.
Obr. 3: Prosvícení vajíčka a hledání polohy zárodku.
Obr. 4: Napílení skořápky vajíčka na elektrické brusce.
35
Obr. 5: Propíchnutí skořápky vajíčka v místě vyznačené polohy vzduchové bubliny.
Obr. 7: Odklopení skořápky pomocí skalpelu.
Obr. 6: Ruční dopílení okénka.
Obr. 8: Odstraňování papírové membrány pomocí pinzety.
3.4 ZAVÍRÁNÍ OKÉNKA Pokud se v den otevírání vajíčka neprovádí intraamniální či subgerminální aplikace, vytvořené okénko ve skořápce je nutné co nejrychleji zavřít. Do skleněné pipety se nasaje dostatečné množství parafínu. Nejprve se musí zakápnout otvor na pólu vajíčka v místě vzduchové bubliny. Touto cestou se k zárodku může snadno přenést infekce a často se na něho při zavírání zapomíná. Poté se vytvoří rámeček okolo okénka. Do pinzety se uchopí sklíčko, které se nahřeje nad kahanem. Nahřáté sklíčko se přiklopí na okénko a jemně se na něj zatlačí. Teď zbývá pouze zkontrolovat, zda mezi parafínovým rámečkem a sklíčkem nezůstaly mezery. Pokud tam zůstaly, pečlivě se druhou vrstvou parafínu utěsní. Zavřená vajíčka se vrátí zpět do inkubátoru. Od této chvíle se vajíčka neotáčejí a musí být vždy 36
okénkem nahoru. S vajíčky by se při manipulaci mělo zacházet opatrně (příliš je nenaklánět).
Obr. 9: Vytvoření parafínového rámečku.
Obr. 10: Přiklopení sklíčka na vytvořené okénko.
Obr. 11: Zavřené okénko.
3.5 SUBGERMINÁLNÍ A INTRAAMNIÁLNÍ APLIKACE Testovaná látka byla kuřecím zárodkům podávána v přesně definovaných vývojových stádiích 2., 3., 4., 5. a 6. inkubační den. Stádia byla určována podle atlasu vývojových stádií zárodku kuřete Hamburger a Hamilton (1992).
Testování je prováděno po
dostatečně dlouhou dobu vývoje embrya tak, aby byly pokryty všechny kritické orgánové periody. Den před plánovaným pokusem je potřeba vysterilizovat mikropipety, váženky, kovovou lžičku na vážení, sklíčka na zakrytí okének, dvě pinzety, velkou a malou Petriho misku.
37
Ráno v den pokusu se připraví pracovní plocha, vyvaří se pinzety a připraví se fyziologický roztok stejným způsobem jako při vytváření okének ve skořápce. Poté se musí správně naředit roztok testované látky. Do váženky se naváží požadované množství látky pomocí vysterilizované lžičky. V případě kapalné látky je použita inzulínová stříkačka. Do váženky se poté přidá potřebné množství injekční vody. Pokud se látka rozpouští hůře, lze použít vortex. K testování embryotoxických účinků byly použity glukóza od firmy Sigma a dva typy inzulínů od firmy Zentiva - inzulín s krátkou dobou účinku Insuman Rapid a inzulín s prodlouženou dobou účinku Insuman Basal. Oba inzulíny i glukóza byly nejprve aplikovány samostatně. Zvolené ředění inzulínů se pohybovalo v hodnotách od 10-3 do 10-6. Glukóza byla podávána v nejvyšších testovaných koncentracích 10-1 a 10-2. Poté byly testovány společné účinky glukózy a jednoho z inzulínů. Ředění glukózy 10-2 bylo stejné u obou inzulínů a u všech jejich použitých koncentrací – dávka u inzulínu Insuman Rapid se pohybovala v rozmezí od 10-4 do 10-6, u inzulínu Insuman Basal od 10-3 do 10-5. Vstřikovaný objem testované látky kuřecímu zárodku činil 3 µl.
Tabulka 1. Podávané dávky testovaných látek 10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
Insuman Rapid
3µg/3µl
0,3µg/3µl
0,03µg/3µl
0,003µg/3µl
Insuman Basal
3µg/3µl
0,3µg/3µl
0,03µg/3µl
0,003µg/3µl
Glukóza
300µg/3µl
30µg/3µl
Pracovní plocha při aplikaci je rozdělena na dvě části. V jedné části pracuje osoba, která vajíčka otevírá a zavírá, v druhé části stolu (naproti) pracuje osoba aplikující testovanou látku. Na stole, kde se vajíčka otevírají a zavírají, je připravena Petriho miska, malý lihový kahánek, sklíčka a pinzety a stojan na vajíčka. Na druhou část stolu k aplikující osobě se připraví kazeta s mikropipetami, stojánek na mikropipetu s napojenou hadičkou, malá Petriho miska s navlhčenou sterilní vatou a pinzetou, váženky s roztoky látky ve zvolených
38
koncentracích a jedna váženka s injekční vodou. Aplikující si přizpůsobí binokulární lupu vlastní potřebám a na polystyrenovou podložku umístí vajíčko připravené k aplikaci.
3.5.1 Aplikace testované látky Nad kahanem se nahřeje vhodný plochý kovový předmět (například pilka na vajíčko) a krátce se přiloží na sklíčko. Po rozpuštění parafínového rámečku se lehce pomocí pinzety stáhne sklíčko z vajíčka. Skleněnou mikropipetou se pod binokulární lupou aplikuje zvolené množství roztoku testované látky buď pod kaudální konec u dvoudenního embrya (subgerminální aplikace) nebo do amniového vaku u starších zárodků (intraamniální aplikace). Do protokolu se zaznamená aplikovaná dávka, stádium zárodku a pořadové číslo vajíčka. Vajíčko se uzavře novým, sterilním sklíčkem a vrátí se do inkubátoru. Ode dne aplikace se vajíčka průběžně kontrolují a uhynulé zárodky se vyřazují. Mrtvé zárodky jsou prohlédnuty pod binokulární lupou a do protokolu je uvedeno přibližné stáří a nalezené vady.
Obr. 12: Intraamniální aplikace.
39
3.6 ODBĚR ZÁRODKŮ V den odběru zárodků, v našem případě 9. embryonální den, jsou přeživší zárodky podrobeny důkladné morfologické analýze. Je potřeba si přichystat anatomickou pinzetu, nůžky na odběr, háček, mističku s vrstvou parafínu, misky na zárodky, čtverce z buničiny, analytické váhy a binokulární lupu. Nejprve se z vajíčka odstraní sklíčko a zvětší se původní okénko opatrným oloupáním skořápky v jeho okolí. Zárodek se vystříhá ze zárodečných obalů a odstřihne se pupečník. Háčkem je zárodek uchopen za krček a přemístěn do misky. Odebrané zárodky srovnané do mističek se poté po jednom zváží a hmotnosti se zapíší do protokolu. Poslední částí odběru je důkladná kontrola zárodků pod binokulární lupou. Do mističky s tuhým parafínem se napustí voda. Zárodek se v mističce špendlíkem přichytí za dolní končetiny a hlavičku. Důkladná prohlídka je provedena u hlavy zárodku, protože v této oblasti lze odhalit například exencefalii, mikroftalmii až anoftalmii, rozštěp zobáku a hypoplazii maxily. Poté se postupuje kaudálním směrem. Mezi časté malformace trupu patří eventrace a umbilikální hernie, na končetinách se poměrně často vyskytuje polydaktylie, syndrom kaudální regrese a různé stupně redukčních deformit. Po kontrole povrchu zárodku se provede nástřih břišní stěny a zkontrolují se vnitřní orgány, především srdce. K velmi častým srdečním defektům patří transpozice velkých artérií nebo defekt mezikomorové přepážky, který lze diagnostikovat po rozstřižení stěny pravé komory srdeční. Všechny nalezené abnormity jsou zaznamenány do protokolu. Jednotlivé údaje z protokolů jsou zpracovány do kontingenčních tabulek a grafů a následně vyhodnoceny.
Obr. 13: Vyjmutí zárodku z amniového vaku.
Obr. 14: Odebrané zárodky umístěné do mističek.
40
Obr. 15: Diagnostika vývojových vad u odebraných zárodků.
41
4. VÝSLEDKY 4.1 INZULÍN INSUMAN BASAL Testování inzulínu Insuman Basal probíhalo ve 2., 3., 4., 5. a 6. inkubačním dni a byly podávány dávky v rozmezí od 10-3 do 10-6. Byly sledovány proporce mrtvých a malformovaných kuřecích zárodků v závislosti na dávce a na dni inkubace. Podáním vyšší dávky inzulínu byla pozorována rostoucí proporce mrtvých a malformovaných zárodků. Dávkou 10-6 bylo poškozeno 23 % zárodků, dávka 10-4 poškodila 58 % zárodků a dávka 10-3 téměř 87 % zárodků (Tabulka 2).
Tabulka 2: Výsledná tabulka testování inzulínu Insuman Basal. V řádcích je uveden celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po podání inzulínu Insuman Basal v závislosti na dni inkubace. Sloupce udávají celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků v závislosti na aplikované dávce. Použité zkratky: ED – embryonální den, D – mrtvé zárodky, M – malformované zárodky. ED / dávka
-3 D
2
3
4
5
6
9
-4 M
D
1
4
10 9
1
9
0
6
9
0
7
4
1
1 10
0
0
0
0
1
10 0
2
10 0
2
M
10
10 0
3
0
0
2
10 0
D
10
10 0
-6 M
10 0
3
10 11
3
10
10 9
D
10
10 6
-5 M
0 10
0
-
-
13
10
10
-
D+M (%)
86,8
58,0
38,0
22,5
celkem vajec
53
50
50
40
42
D+M (%)
celkem vajec
72,5
40
72,5
40
30,0
40
47,5
40
42,4
33
Začátek pásma embryotoxicity inzulínu Insuman Basal lze odečíst jako bod, ve kterém dojde k protnutí křivky mrtvých a malformovaných zárodků s horní hranicí konfidenčního intervalu nespecifického účinku (proporce 0,3). V případě inzulínu Basal se začátek pásma embryotoxicity pohybuje v rozmezí dávek 10-5 a 10-6 (Obr. 16).
Obr. 16: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků vzniklých po aplikaci inzulínu Insuman Basal v závislosti na podávané dávce. Oranžově je označena horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku. Šipka ukazuje na začátek pásma embryotoxicity inzulínu Insuman Basal.
43
Z embryotoxických projevů zárodečná smrt výrazně převažuje nad vznikem vývojových vad. Se stoupající dávkou výrazně vzrůstá proporce mrtvých zárodků a podáním dávky 10-3 přesahuje hodnotu 80 %. Naopak proporce malformovaných zárodků nepřesahuje hranici 10 % a v závislosti na dávce se výrazně se nemění (Obr. 17).
Obr. 17: Proporce jednotlivých projevů embryotoxického účinku inzulínu Insuman Basal v závislosti na podávané dávce.
44
Proporce mrtvých a malformovaných zárodků v závislosti na dni aplikace se pohybují v rozmezí 30 – 75 % (Tabulka 2). Druhý a třetí inkubační den bylo postiženo větší množství zárodků než po aplikaci čtvrtého, pátého a šestého inkubačního dne (Obr. 18).
Obr. 18: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci inzulínu Insuman Basal v závislosti na dni aplikace.
45
U většiny aplikovaných dnů převažuje zárodečná smrt nad vznikem vývojových vad. Pouze v případě aplikace druhého inkubačního dne došlo ke zvýšenému výskytu malformací u testovaných zárodků (Obr. 19).
Obr 19: Proporce jednotlivých projevů embryotoxického účinku inzulínu Insuman Basal v závislosti na dni aplikace.
46
Pozorované malformace vyskytující se po aplikaci druhého dne jsou souhrnně označovány jako syndrom kaudální regrese (Obr. 20a, Obr.20b ). Syndrom kaudální regrese se projevuje hypoplázií kaudální části zárodku v různém stupni – od postižení ocasní části až po těžké malformace dolních končetin.
Obr. 20a: Syndrom kaudální regrese vzniklý po aplikaci druhého inkubačního dne inzulínem Insuman Basal dávkou 10-4. Odběr 9. inkubační den. Záběr zepředu.
Obr. 21a: Kontrola, u které se vytvoří okénko, ale zárodku není aplikována žádná látka. Odběr 9. inkubační den. Záběr zepředu.
Obr. 20b: Syndrom kaudální regrese vzniklý po aplikaci druhého inkubačního dne inzulínem Insuman Basal dávkou 10-4. Odběr 9. inkubační den. Záběr ze strany. Černá šipka ukazuje zmenšení ocasní části ve srovnání s kontrolou.
Obr. 21b: Kontrola, u které se vytvoří okénko, ale zárodku není aplikována žádná látka. Odběr 9. inkubační den. Záběr ze strany.
47
4.2 INZULÍN INSUMAN RAPID Testování inzulínu Insuman Rapid probíhalo také 2., 3., 4., 5. a 6. inkubační den a byly podávány dávky od 10-3 do 10-6. Byly sledovány proporce mrtvých a malformovaných kuřecích zárodků v závislosti na dávce a na dni inkubace. Proporce mrtvých a malformovaných zárodků se zvyšovaly s použitím vyšší podávané dávky. Dávka 10-6 poškodila 18 % zárodků, dávka 10-4 již 82 % zárodků a dávka 10-3 téměř 99 % testovaných zárodků (Tabulka 3).
Tabulka 3: Výsledná tabulka testování inzulínu Insuman Rapid. V řádcích je uveden celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po podání inzulínu Insuman Rapid v závislosti na dni inkubace. Sloupce udávají celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků v závislosti na aplikované dávce. Použité zkratky: ED – inkubační den, D – mrtvé zárodky, M – malformované zárodky. -3
ED / dávka D 2
3
4
5
6
19
-4 M
D
3
7
22 11
0
8
0
6
6
0
8
5
2
0 10
0
3
0
1
0
10 0
0
10 1
1
M
10
10 0
9
0
0
0
10 0
D
10
34 0
-6 M
10 0
30
10 9
7
10
30 9
D
20
11 30
-5 M
0 10
0
1
0
9
10
10
10
D+M (%)
98,8
82,1
34,0
18,0
celkem vajec
82
84
50
50
48
D+M (%)
celkem vajec
75,8
62
65,9
41
73,8
84
45,0
40
56,4
39
Začátek pásma embryotoxicity inzulínu Insuman Rapid se pohybuje ve stejném rozmezí dávek jako u inzulínu Insuman Basal a to mezi dávkami 10-5 a 10-6 (Obr. 22).
Obr 22: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci inzulínu Insuman Rapid v závislosti na podávané dávce. Šipka označuje začátek pásma embryotoxicity. Oranžově je vyznačena horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku. Černá šipka ukazuje začátek pásma embryotoxicity inzulínu Insuman Rapid.
49
Podobné výsledky u obou inzulínů byly nalezeny i při pozorování jednotlivých projevů embryotoxicity. U inzulínu Insuman Rapid zárodečná smrt také výrazně převažovala nad vznikem vývojových vad. Se stoupající podanou dávkou prudce vzrůstá proporce mrtvých zárodků. Proporce malformovaných zárodků nepřesahuje hranici 10 % a výrazně se v závislosti na dávce nemění (Obr. 23).
Obr. 23: Proporce jednotlivých projevů embryotoxického účinku inzulínu Insuman Rapid v závislosti na podávané dávce.
50
Procento mrtvých a malformovaných zárodků se v závislosti na dni aplikace pohybuje v rozmezí 40 – 80 %. Druhý, třetí a čtvrtý inkubační den bylo postiženo větší množství zárodků než po aplikaci pátého a šestého inkubačního dne (Tabulka 2, Obr. 26).
Obr. 24: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci inzulínu Insuman Rapid v závislosti na dni aplikace.
51
Na všech testovaných dnech opět převažuje zárodečná smrt nad vznikem vývojových vad. I v případě inzulínu Insuman Rapid byl pozorován zvýšený výskyt malformací u testovaných zárodků po aplikaci druhého embryonálního dne. Pozorované malformace jsou totožné s malformacemi pozorovanými u inzulínu Insuman Basal – jedná se také o syndrom kaudální regrese. (Obr. 20a,b, Obr. 25).
Obr 25: Proporce jednotlivých projevů embryotoxického účinku inzulínu Insuman Rapid v závislosti na dni aplikace.
52
4.3 GLUKÓZA Testování glukózy probíhalo ve stejných dnech jako u obou inzulínů (2., 3., 4., 5. a 6. embryonální den). Na všech testovaných dnech byly podávány nejvyšší dávky glukózy (101
a 10-2), jelikož prvotní testování neprokázalo žádný embryotoxický efekt glukózy
(Tabulka 4). Tabulka 4: Výsledná tabulka testování glukózy. V řádcích je uveden celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci glukózy v závislosti na dni inkubace. Sloupce udávají celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po podání glukózy v závislosti na aplikované dávce. Použité zkratky: ED – embryonální den, D – mrtvé zárodky, M – malformované zárodky. ED / dávka
-1 D
2
3
4
5
6
0
-2 M
D
0
3
M 0
10 0
9 0
0
0
10 2
8 0
0
0
8 2
7 0
0
0
7 2
7 0
1
1
8
9
D+M (%)
14,0
10,0
celkem vajec
43
40
53
D+M (%)
celkem vajec
15,8
19
0
18
13,3
15
14,3
14
23,5
17
Proporce mrtvých a malformovaných zárodků v závislosti na podávané dávce nepřekročily horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku. Po podání dávky 10-1 bylo postiženo pouze 14 % testovaných zárodků, u dávky 10-2 došlo k poklesu postižených zárodků na 10 % (Obr. 26).
Obr 26: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po podání glukózy v závislosti na použité dávce. Oranžová čára představuje horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku.
Glukóza neprojevuje žádný embryotoxický efekt při testování kuřecích zárodků in ovo.
54
4.4 SHRNUTÍ VÝSLEDKŮ APLIKACE JEDNOTLIVÝCH LÁTEK Testování embryotoxických účinků inzulínů Insuman Basal a Insuman Rapid ukázalo, že začátek pásma embryotoxicity těchto inzulínů se nachází shodně mezi dávkami 10-5 a 10-6. Strmější vzestup křivky a vyšší proporce mrtvých a malformovaných zárodků v závislosti na podávané dávce u inzulínu Insuman Rapid představuje pravděpodobně vyšší embryotoxický potenciál tohoto inzulínu. Testování glukózy ve srovnání s inzulínem neprokázalo embryotoxické účinky ani v nejvyšších podávaných dávkách (Obr. 27).
Obr. 27: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po podání inzulínů Insuman Rapid, Insuman Basal a glukózy v závislosti na dávce. Oranžově je vyznačena horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku.
55
U obou inzulínů se po aplikaci druhý inkubační den objevil zvýšený výskyt jedné malformace označované jako syndrom kaudální regrese. (Obr. 28, Obr. 20a, b)
Obr. 28: Proporce malformovaných zárodků vzniklých po podání inzulínů Insuman Basal a Insuman Rapid v závislosti na dni aplikace.
Z výše uvedených výsledků tedy vyplývá, že inzulín je vysoce embryotoxickou látkou, ale glukóza ani v nejvyšších koncentracích neprojevuje embryotoxické účinky.
56
4.5. INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU INSUMAN RAPID V těle matky diabetičky je přítomna vysoká hladina glukózy a podaný inzulín slouží k jejímu snížení. V pilotní studii byla tedy zjišťována změna embryotoxických účinků u obou inzulínů v interakci s hyperglykémií. Hyperglykémie byla navozena vysokou dávkou glukózy před aplikací inzulínu. K aplikaci byl vybrán 4. inkubační den. Nejprve se všechny zárodky injikovaly stejnou dávkou glukózy (10-2) a po deseti minutách byly přidány dávky inzulínu Insuman Rapid (10-4, 10-5, 10-6). Při interakci glukózy a
dávky 10-4 inzulínu Insuman Rapid se embryotoxický efekt
projevil u 100 % zárodků, dávky 10-5 a 10-6 poškodily až 60 % testovaných zárodků (Tabulka 5).
Tabulka 5: Výsledná tabulka testování kombinace inzulínu Insuman Rapid a glukózy. V řádcích je uveden celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci jedné koncentrace glukózy a různých koncentrací inzulínu Insuman Rapid v závislosti na dni inkubace. Sloupce udávají celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po podání glukózy a inzulínu Insuman Rapid v závislosti na aplikované dávce. Použité zkratky ED – embryonální den, D – mrtvé zárodky, M – malformované zárodky.
ED / dávka
-4 D
4
10
-5 M
D
0
6
-6 M
D
0
5
M 1
10
10
10
D+M (%)
100,0
60,0
60,0
celkem vajec
10
10
10
57
D+M (%) celkem vajec
73,3
30
Ve srovnání s interakcí glukózy a inzulínu působení samotného inzulínu Insuman Rapid poškodilo na čtvrtém aplikovaném dni po podané dávce 10-4 88 % zárodků, nižší podané dávky
10-5 a 10-6 pouze 10 % zárodků. Glukóza podaná v nadbytku zvyšuje
embryotoxický projev inzulínu Insuman Rapid. (Obr. 29)
Obr. 29: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci inzulínu v interakci s glukózou a samotného inzulínu. Oranžově je označena horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku.
58
4.6. INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU INSUMAN BASAL Podmínky testování interakce inzulínu Insuman Basal a glukózy byly zvoleny stejné jako u testování interakce inzulínu Insuman Rapid. Pouze podávané dávky se mírně lišily (10-3, 10-4, 10-5). 10-3 a 10-4 inzulínu Insuman Basal se
Po aplikaci glukózy a inzulínové dávky
embryotoxický efekt projevil u 100 % zárodků, dávka 10-5 poškodila 80 % zárodků (Tabulka 6).
Tabulka 6: Výsledná tabulka testování kombinace inzulínu Insuman Basal a glukózy. V řádcích je uveden celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci jedné koncentrace glukózy a různých koncentrací inzulínu Insuman Basal v závislosti na dni inkubace. Sloupce udávají celkový počet a procenta mrtvých a malformovaných zárodků po podání glukózy a inzulínu Insuman Basal v závislosti na aplikované dávce. Použité zkratky ED – inkubační den, D – mrtvé zárodky, M – malformované zárodky.
ED / dávka
-3 D
4
10
-4 M
D
0
10
-5 M
D
0
8
M 0
10
10
10
D+M (%)
100,0
100,0
80,0
celkem vajec
10
10
10
59
D+M (%) celkem vajec
93,3
30
Pokud bychom interakci inzulínu Insuman Basal a glukózy porovnali s působením samotného inzulínu, zjistili bychom, že inzulín Insuman Basal
poškodil na čtvrtém
aplikovaném dni po podané dávce 10-3 60 % zárodků, 10-4 už jen 30 % zárodků a dávkou 10-5 pouze 20 % zárodků. Insuman Basal v interakci s glukózou rapidně zvýšil svůj embryotoxický efekt a dokonce i mnohem intenzivněji než inzulín Insuman Rapid v interakci s glukózou. Začátek pásma embryotoxicity by se v případě interakce glukózy a inzulínu mohl posunout minimálně o jeden dávkový řád (Obr. 30).
Obr. 30: Proporce mrtvých a malformovaných zárodků po aplikaci inzulínu Basal v interakci s glukózou a samotného inzulínu Insuman Basal. Oranžově je vyznačena horní mez konfidenčního intervalu nespecifického účinku.
60
5. DISKUZE 5.1 EMBRYOTOXICKÉ ÚČINKY INZULÍNŮ INSUMAN BASAL A INSUMAN RAPID Testováním inzulínů Insuman Basal a Insuman Rapid na kuřecích zárodcích jsme zjistili, že oba inzulíny se projevují embryotoxicky při podávání i velmi nízkých dávek. Začátek pásma embryotoxity obou inzulínů se projevil při podávání dávek v rozmezí 10-5 a 10-6 (0,003µg – 0,03 µg). Mezi základní projevy embryotoxicity patří letalita, malformace a růstová retardace. U obou inzulínů výrazně převažovala zárodečná smrt nad vznikem vrozených vad. Se zvyšující se dávkou účinné látky se zvyšovala proporce mrtvých a malformovaných zárodků. U inzulínu Insuman Basal mrtvé zárodky tvořily více jak 80 % všech poškozených zárodků, u inzulínu Insuman Rapid více jak 90 %. Podobné výsledky uvádí práce Julian & Abbot (1998), kteří testovali dva ty typy zvířecího inzulínu (vepřový a hovězí) na kuřecích zárodcích. Inzulíny byly podávány mezi embryonálním dnem 0 (den před inkubací) a dnem devátým do žloutkového vaku. Oba inzulíny vykazovaly velmi podobné procento mrtvých zárodků (více než 40 %), které převažovaly nad vznikem vývojových vad. Zárodečná smrt vyskytující se u 42 % zárodků byla pozorována i ve studii Jelínek et al. (1985) u Československého lidského inzulínu, lidský inzulín z USA usmrtil 22 % testovaných zárodků. Na druhém inkubačním dni jsme objevili zvýšený výskyt malformace označované jako syndrom kaudální regrese. Syndrom kaudální regrese se projevuje hypoplazií kaudální části zárodku v různém stupni postižení. Může se jednat buď jen o postižení ocasní části zárodku (Obr. 20a,b) nebo o těžké malformace dolních končetin. Syndrom kaudální regrese je charakteristickou vrozenou vadou, která se vyskytuje v souvislosti s diabetes mellitus u potomků nemocných žen (Martínez-Frías, 1994). Poškození skeletu u zárodku kuřete působením inzulínu je popsáno ve studiích Duraiswami (1950), Jelínek et al. (1985) a Julian & Abbot (1998). Julian & Abbot (1998) za hlavní teratogenní efekt inzulínu považují achondroplazii, kterou způsobily podávané injekční dávky (2 IU=70 µg) hovězího a vepřového inzulínu do žloutkového vaku kuřecímu zárodku. Další pozorovanou vadou byla mikrognacie zobáku. Poškození zobáku jsme v našich experimentech nepozorovali. Jelínek et al. (1985) po podání dávek 10-2 až 10-6 u inzulínu z ČSR pozorovali signifikantní incidenci vývojových vad mozku, očí, kaudální části zárodku a srdce. V případě inzulínu
61
z USA se projevily hlavně malformace kaudální části zárodku a srdce, v menším procentu také obličejové části zárodku. Defekt srdce jsme zachytili pouze v jednom případě po aplikaci inzulínu Insuman Rapid dávkou 10-5. Duraiswami (1950) uvádí, že inzulínové dávky (0,05 – 6 IU = 1,75 – 210 µg) aplikované do žloutku postihly převážně distální končetinové pupeny, což může souviset s poškozením kaudální částí zárodku. Výskyt a míra deformací se zvyšovaly s rostoucí dávkou. Po aplikaci vysokých dávek inzulínu v období třetího až šestého dne se jako hlavní vývojová vada vyskytovalo poškození podobné osteogenesis imperfekta. Autor také pozoroval abnormality zobáku a očí (anoftalmie a mikroftalmie). I v našem případě jsme zachytili oční deformity. Po aplikaci inzulínu Insuman Basal druhý inkubační den dávkami 10-3 a 10-4 se u dvou případů postižených syndromem kaudální regrese jako doprovodný efekt sporadicky vyskytla mikroftalmie. U přežívajících kuřecích zárodků po aplikaci inzulínů jsme také sledovali jejich hmotnost dosaženou 9. inkubační den (v den odběru). Cílem bylo zachytit růstovou retardaci zárodků, která by mohla být třetím projevem embryotoxicity inzulínu. Jelikož nám po aplikaci dávek 10-3 a 10-4 přežíval jen velmi malý počet zárodků (většina odumřela), nebylo možné spolehlivě určit změnu hmotnosti na dávce. Až 62 % abnormálních zárodků po podání inzulínu uvádí ve své studii Smithberg & Runner (1963). Testovanými zvířaty byly březí myši, kterým byl inzulín vpraven intraperitoneálně (4 – 5 IU/kg v 1 ml = 140 – 175 µg/kg v 1 ml). I v případě savčího modelu se nejčastěji vyskytovaly defekty skeletu – hlavně splývaní dvou a více sousedních žeber, různé typy defektů páteře a exencefalie nebo mozková hernie. Také prospektivní studie Kullander & Källén (1976) ukazuje na embryotoxický potenciál inzulínu. Z 15 žen léčených inzulínem 2 ženy potratily, 6 žen porodilo zdravé dítě, 3 ženy přišly o své dítě po porodu, 1 žena porodila dítě s lehkou vrozenou vadou a 3 ženy s těžkou vrozenou vadou. Některé studie naopak vylučují embryotoxické účinky inzulínu. Hannah & Moore (1971) testovali vliv hladovění a inzulínu na vývoj skeletu u myší. Inzulín byl aplikován pod kůži v dávce 0,2 IU (7 µg) po dobu 2 dní hladovým březím myším a pro kontrolu 0,4 IU (14 µg) inzulínu březím myším nehladovějícím 9. a 10. den gestace. V případě kombinace hladovění a aplikace inzulínu byl odhalen zvýšený výskyt nadpočetných žeber a duplikace obratlových center u myších embryí. Po aplikaci samotného inzulínu bez hladovění byla mláďata zdravá. Ream et al. (1970) podávali různé dávky inzulínu březím 62
myším intraperitoneálně ve 12 hodinových intervalech 6. – 12. den gestace. Jedné skupině aplikovali dávky od 10 – 160 IU (350 µg – 5,6 mg), druhá skupina přijala silné dávky 240 IU (8,4 mg). Třetí skupině byla podána podkožní dávka inzulínu 40 IU (1,4 mg). Nebyla odhalena žádná poškození. Je známo, že farmakokinetické vlastnosti mateřského organismu jsou hlavní příčinou mezidruhových rozdílů při testování látek (Peterka, Novotná, 2010). Podáním jakékoli látky mateřskému organismu ztrácíme přehled o tom, který metabolit působí na vyvíjející se zárodek. Proto pro nás jedním z důvodů pro zvolení metody CHEST k testování inzulínu byla možnost z procesu vyloučit působení mateřského organismu. 5.2 EMBRYOTOXICKÉ ÚČINKY GLUKÓZY Ve srovnání s oběma inzulíny se ani nejvyšší podávané dávky glukózy při testování na kuřecích
zárodcích
in
ovo
neprojevily
embryotoxicky.
Procento
mrtvých
a
malformovaných zárodků nepřekročilo nespecifickou hranici účinku 20 %. Vliv glukózy na resorpci zárodků u březích potkanů zkoumal Telford et al. (1962). Glukóza (30%) byla přidávána potkanům do krmení. Nebyl zjištěn žádný vliv glukózy na resorpci zárodků v porovnání s kontrolami. Hughes et al. (1974) zkoumal teratogenní efekty různých cukrů na kuřecí embryo pomocí 2 metod, mimo jiné také D – a L - glukózu. První metodou se do otevřeného vajíčka na okraj blastodermu umístilo malé množství cukru v pevném stavu (0,3 – 1 mg). Při druhé metodě byl do bílku injekčně vpraven roztok zkoumaného cukru (0,5 M). Aplikovaná byla vývojová stádia HH 4 - 5. Po 72 hodinách byly zárodky vyjmuty a histologicky zpracovány pro pozorování pod mikroskopem. U D – glukózy byl nalezen nejnižší teratogenní potenciál ze všech 10 testovaných cukrů. Přesto při první metodě z 39 zárodků 15,4 % zemřelo, 15,4 % živých i mrtvých zárodků bylo malformováno, z toho 18,2 % živých zárodků bylo malformovaných. U druhé metody z 82 testovaných zárodků 24,4 % zemřelo, 11 % všech zárodků bylo malformováno, z toho u 14,5 % živých zárodků se vyskytla malformace. Fraser et al. (2007) vystavil myší embrya a blastocysty vyším koncentracím D – glukózy (15,56 mM a 25,56 mM) po dobu 24 hodin. Pro časný vývoj embryí působila toxicky a jejím důsledkem byla nižší implantační schopnost a vyšší prenatální ztráty.
63
5.3 INTERAKCE GLUKÓZY A INZULÍNU V pilotní studii jsme zkoumali interakci mezi glukózou a inzulínem. Vytvořili jsme si takzvané,,hyperglykemické“ kuře, kterému jsme aplikovali jednotlivé dávky inzulínu. Zjistili jsme, že přítomnost nadbytku glukózy zvýšila embryotoxický účinek obou inzulínů. Intenzivnější zvýšení embryotoxického účinku bylo pozorováno u inzulínu Insuman Basal. Jedná se o pomaleji působící inzulín. Myslíme si, že příčinou by mohlo být přeplnění buněk nadbytkem glukózy a jejich následné nevratné poškození. V případě pomalu působícího inzulínu se buňky mohou plnit glukózou delší dobu a je jich tedy zničeno větší množství, než u rychle působícího inzulínu Insuman Rapid. Z toho vyplývá, že pokud kuřecímu zárodku s nadbytkem glukózy aplikujeme i velmi nízkou dávku inzulínu, poškodíme ho mnohem více, než když tuto dávku podáme kuřecímu zárodku s normální hladinou glukózy. Naše výsledky podporuje několik studií, které ukazují, že podáním optimální dávky inzulínu a jeho správným načasováním dochází ke snížení rizika vzniku vývojových vad a prenatálních ztrát. Diamond et al. (1989) použili ve své studii březí myši, u kterých vyvolali diabetes mellitus intraperitoneálním podáním alloxanu (300 mg/kg) či streptozotocinu (330 mg/kg). Jedné skupině byl inzulín podán subkutánně jednou denně v dávce 1,8 IU/kg (63 µg/kg) nebo dvakrát denně 2 IU/kg (70 µg) rozděleno do dvou dávek. Druhá skupina byla neléčená, třetí skupina tvořila kontroly. Byla měřena vyzrálost oocytů a vývoj zygot. Zpožděný vývoj oocytů i embryí byl zachycen u neléčené skupiny s hyperglykémií. U diabetických myší léčených inzulínem došlo k výraznému zlepšení vývoje oocytů i embryí. Autoři podporují hypotézu, že nekontrolovaný diabetes mellitus přispívá ke vzniku vývojových vad a postihuje proces reprodukce i ve velmi časném stádiu po oplození. Podobné výsledky jsou známy i u těhotných diabetiček. Ženy s nekompenzovaným diabetem mají vyšší riziko vzniku těžkých vrozených vad ve srovnání s ženami kompenzovanými (Miller, 1981). Diabetičky by měly plánovat své těhotenství a na kompenzaci onemocnění by se měly zaměřit ještě před početím potomka, jelikož těžké vrozené vady vznikají právě v časné fázi těhotenství. Kitzmiller et al. (1991) porovnávali zdravotní stav potomků 84 žen s kompenzovaným diabetem a 110 žen, které zjistily graviditu až mezi 6. – 30. týdnem těhotenství a na kontroly se dostavovaly nepravidelně. Kontroly byly prováděny měřením glukózy nalačno. Pouze jedna těžká anomálie byla pozorována u novorozenců kompenzovaných žen (1,2 %) ve srovnání s 12
64
anomáliemi u potomků žen nekompenzovaných (10,9 %). Z výzkumu Goldman et al. (1986) bylo zjištěno, že u špatně kontrolovaných těhotných diabetiček ještě vzrůstá riziko preeklampsie a císařského řezu. Novorozenci nekompenzovaných matek měli vyšší průměrnou váhu a významně snížené Apgar skóre (metoda pro rychlé zhodnocení zdravotního stavu novorozence). Temple et al. (2002) provedli rozsáhlou populační studii, která zahrnovala 510 000 těhotných diabetických žen. Rozděleny byly do dvou skupin podle hodnoty glykovaného hemoglobinu (< 7,5 % normální stav, ≥ 7,5 % špatná kompenzace). Vyšší výskyt nepříznivých výsledků byl pozorován převážně u špatně kompenzovaných žen. Tyto ženy častěji potratily, byl u nich zaznamenán hojnější výskyt vrozených vad a perinatální mortality. V případě nekompenzovaných těhotných diabetiček vzniká stav hyperglykémie také v těle vyvíjejícího se plodu. Obranným mechanismem plodu je zvyšování fetálního inzulínu. Asociaci mezi fetálním inzulínem nalezeným v pupečníkové krvi plodu a fetálními komplikacemi zkoumali Weiss et al. (1998). Obsah fetálního inzulínu menší než 20 µU/ml byl považován za normální koncentraci, hodnota 20 – 50 µU/ml jako mírně zvýšená koncentrace a hodnota převyšující 50 µU/ml
jako vysoká koncentrace. U
novorozenců s vyšším stupněm koncentrace fetálního inzulínu bylo významně zvýšeno riziko makrosomie a císařského řezu, vývojové nezralosti, hypoglykémie a syndromu dechové tísně. Společně s výše uvedenými studiemi zastáváme názor, že intenzivní osvěta této problematiky budoucím matkám s onemocněním diabetes mellitus společně s pravidelnou kontrolou glykémie a její důslednou kompenzací by měla vést k prevenci vrozených vad a jiných závažných komplikací, které s tímto onemocněním souvisí. Jakým způsobem dosáhnout správné kompenzace u těhotných diabetiček? Myslíme si, že nejspolehlivějším řešením uspokojivé kompenzace těhotných žen s diabetes mellitus by mohla být inzulínová pumpa. Hlavní výhodou inzulínové pumpy je jemné kontinuální dávkování inzulínu po celý den, které se maximálně přibližuje normální sekreci inzulínu u zdravého člověka. Moderní inzulínová pumpa je malý elektronický přístroj, který pacient nosí neustále u sebe. Na pumpu se napojuje hadička s kanylou, ukončena tenkou kovovou jehlou. Zavádí se do podkoží břicha, stehen, hýždí či paží. Mikrodávky inzulínu jsou nastaveny v softwaru inzulínové pumpy. Rozložením bazální dávky inzulínu se napodobuje přirozená bazální sekrece nediabetika. Bolusové dávky nahrazují sekreci inzulínu stimulovanou jídlem. Ve 65
srovnání s konvenční terapií lze bazální dávku inzulínu regulovat velmi jemně, většinou po 0,1 jednotky za hodinu. Pomáhá předcházet těžkým hypoglykémiím a rannímu vzestupu glykémie. K rizikům při léčbě inzulínovou pumpou patří vznik infekce v oblasti zavedení kanyly. Při poruše přístroje může dojít k rychlému nástupu ketoacidózy (Jirkovská, 2004). Firma Medtronic přišla na trh s novou érou inzulínových pump Paradigm Veo, které ve spojení s vysílačem a glukózovým senzorem účinně pomáhají udržet stabilní hladinu glukózy. Tato inzulínová pumpa monitoruje a zaznamenává hodnoty glykémie po celý den a upozorní, pokud hladina glukózy vybočuje z cílového rozsahu. Při nízké hladině glykémie zastaví výdej inzulínu. Při dodržování základních pravidel údržby a manipulace by inzulínová pumpa mohla sloužit jako účinná prevence v dlouhodobé kompenzaci glykémie u těhotných diabetiček. Inzulínová pumpa budoucnosti by dokonce měla být schopna plně nahradit funkci betabuněk pankreatu zdravého organismu. Měla by tedy umět sama dávkovat inzulín úměrně k aktuální změně glykémie, přičemž by glykémie musela být měřena ve velmi krátkých časových intervalech.
66
6. ZÁVĚR 1. Porovnáváním embryotoxických účinků inzulínů Insuman Basal a Insuman Rapid bylo zjištěno, že začátek pásma embryotoxicity těchto látek se pohybuje shodně v rozmezí dávek 10-5 a 10-6 (0,03µg/ 3µl a 0,003µg/ 3µl). Hlavním embryotoxickým projevem po injikaci výše zmíněných inzulínů byla zárodečná smrt, která výrazně převažovala nad vznikem vývojových vad. Navíc po aplikaci dvoudenních zárodků byl zaznamenán také zvýšený výskyt malformací, které jsou souhrnně označovány jako syndrom kaudální regrese. 2. Testování glukózy na kuřecích zárodcích ve srovnání s inzulínem neprokázalo embryotoxické účinky ani v nejvyšších podávaných dávkách. 3. Interakce glukózy a inzulínu vedla ke zvýšení embryotoxického efektu minimálně o jeden dávkový řád.
67
7. LITERATURA Aberg A, Westbom L, Källén B: Congenital malformations among infants whose mothers had gestational diabetes or preexisting diabetes. Early Hum Dev. 2001;61:85-95. Austgulen R, Lien E, Vince G, Redman CW: Increased maternal plasma levels of soluble adhesion molecules (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin) in preeclampsia. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1997;71:53-58. Bauman WA, Yalow RS: Transplacental passage of insulin complexed to antibody. Proc Natl Acad Sci USA. 1981;78:4588-4590. Becerra JE, Khoury MJ, Cordero JF, Erickson JD: Diabetes mellitus during pregnancy and the risks for specific birth defects: a population-based case-control study. Pediatrics. 1990;85:1-9. Behrman RE, Kliegman RM, Arvin AM, Nelson WE: Nelson textbook of pediatrics. Philadelphia,W.B. Saunders, 1996, pp. 2200. Bell AW, Bauman DE: Adaptations of glucose metabolism during pregnancy and lactation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1997;2:265-278. Brent RL, Beckman DA: Environmental teratogens. Bull NY Acad Med. 1990;66:123-163. Brent RL: Protecting the public from teratogenic and mutagenic hazards. J Clin Pharmacol New Drugs. 1972;12:61-70 Brož J: Základy léčby inzulínem. Praha: Nakladatelství Wiesnerová, 2006, pp 39. Buchanan TA, Xiang AH: Gestational diabetes mellitus. J Clin Invest. 2005;115:485-491. Buse MG, Roberts WJ, Buse J: The role of the human placenta in the transfer and metabolism of insulin. J Clin Invest. 1962;41:29-41. Callan NA, Witter FR: Intrauterine growth retardation: characteristics, risk factors and gestational age. Int J Gynaecol Obstet. 1990;33:215-220. Podle Schardein 2000. Carroll MA, Yeomans ER: Diabetic ketoacidosis in pregnancy. 2005;33:S347-353.
Crit Care Med.
Cundy T, Gamble G, Townend K, Henley PG, MacPherson P, Roberts AB: Perinatal mortality in Type 2 diabetes mellitus. Diabet Med. 2000;17:33-39.
68
Di Cianni G, Miccoli R, Volpe L, Lencioni C, Del Prato S: Intermediate metabolism in normal pregnancy and in gestational diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 2003;19:259270. Diamond MP, Moley KH, Pellicer A, Vaughn WK, DeCherney AH: Effects of streptozotocin- and alloxan-induced diabetes mellitus on mouse follicular and early embryo development. J Reprod Fertil. 1989;86:1-10. Draghetti MT, Lanzoni A: Preliminary communication of subcutaneous administration of 5% w/v dextrose solution in CD-1 mice embryotoxicity studies. Teratology 1997;56:394. Podle Schardein 2000. Drury MI, Greene AT, Stronge JM: Pregnancy complicated by clinical diabetes mellitus. A study of 600 pregnancies. Obstet Gynecol. 1977;49:519-522. Dunne F, Brydon P, Smith K, Gee H: Pregnancy in women with Type 2 diabetes: 12 years outcome data 1990-2002. Diabet Med. 2003;20:734-738. Duraiswami PK: Insulin-induced skeletal abnormalities in developing chickens. Br Med J. 1950,12;2:384-390. Evers IM, de Valk HW, Visser GH: Risk of complications of pregnancy in women with type 1 diabetes: nationwide prospective study in the Netherlands. BMJ. 2004;328:915. Festa A, D'Agostino R Jr, Howard G, Mykkänen L, Tracy RP, Haffner SM: Chronic subclinical inflammation as part of the insulin resistance syndrome: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study (IRAS). Circulation. 2000;102:42-47. Fine EL, Horal M, Chang TI, Fortin G, Loeken MR: Evidence that elevated glucose causes altered gene expression, apoptosis, and neural tube defects in a mouse model of diabetic pregnancy. Diabetes. 1999;48:2454-2462. Fraser RB, Waite SL, Wood KA, Martin KL: Impact of hyperglycemia on early embryo development and embryopathy: in vitro experiments using a mouse model. Hum Reprod. 2007;22:3059-3068. Ganong WF: Přehled lékařské fysiologie. Jinočany: H&H, 1995. pp 681. Gäreskog M, Cederberg J, Eriksson UJ, Wentzel P: Maternal diabetes in vivo and high glucose concentration in vitro increases apoptosis in rat embryos. Reprod Toxicol. 2007;23:63-74. Garrow JS: Indices of adipozity. Nutr Abstr Rev Ser. 1983;A53:697-708. Podle Kumari 2001. Gewolb IH, O'Brien J: Surfactant secretion by type II pneumocytes is inhibited by high glucose concentrations. Exp Lung Res. 1997;23:245-255.
69
Gewolb IH: Effect of high glucose on fetal lung maturation at different times in gestation. Exp Lung Res. 1996;22:201-211. Ghatnekar GS, Barnes JA, Dow JL, Smoak IW: Hypoglycemia induced changes in cell death and cell proliferation in the organogenesis stage embryonic mouse heart. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2004;70:121-131. Gillman MW, Rifas-Shiman S, Berkey CS, Field AE, Colditz GA: Maternal gestational diabetes, birth weight, and adolescent obesity. Pediatrics. 2003;111:221-226. Goldman JA, Dicker D, Feldberg D, Yeshaya A, Samuel N, Karp M: Pregnancy outcome in patients with insulin-dependent diabetes mellitus with preconceptional diabetic control: a comparative study. Am J Obstet Gynecol. 1986;155:293-297. Gutgesell HP, McNamara DG: Transposition of the great arteries. Results of treatment with early palliation and late intracardiac repair. Circulation. 1975;51:32-38. Hadden DR: How to improve prognosis in type 1 diabetic pregnancy. Old problems, new concepts. Diabetes Care. 1999;Suppl 2:B104-108. Hamburger V, Hamilton HL: A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 1992;195:231-272. Hannah SR, Moore LK: Effects of Fasting and Insulin on Skeletal Development in Rats. Teratology. 1971;4:135-140. Homko C, Sivan E, Chen X, Reece EA, Boden G: Insulin secretion during and after pregnancy in patients with gestational diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:568-573. Howarth C, Gazis A, James D: Associations of Type 1 diabetes mellitus, maternal vascular disease and complications of pregnancy. Diabet Med. 2007;24:1229-1234. Hughes AF, Freeman RB, Fadem T: The teratogenic effects of sugars on the chick embryo. J Embryol Exp Morphol. 1974;32:661-674. Chen JM: The effect of insulin on embryonic limb-bones cultivated in vitro. J Physiol. 1954;125:148-162. Jelínek R, Peterka M, Rychter Z: Chick embryotoxicity screening test--130 substances tested. Indian J Exp Biol. 1985;23:588-95. Jelovsek FR, Mattison DR, Chen JJ: Prediction of risk for human developmental toxicity: how important are animal studies for hazard identification? Obstet Gynecol. 1989;74:624-636.
70
Jirkovská A: Léčba diabetu inzulínovou pumpou. Interní medicína pro praxi. 2004;1:1014. Julian D, Abbott UK: An avian model for comparative studies of insulin teratogenicity. Anat Histol Embryol. 1998;27:313-321. Kaaja R: Vascular complications in diabetic pregnancy. Thromb Res. 2009;123 Suppl 2:S1-3. Kalter H, Warkany J: Experimental production of congenital maiformations in mammals by metabolic procedure. Physiol Rev. 1959;39:69-115. Kalter H: Teratology of the Central Nervous System. University of Chicago Press, Chicago. 1968. Podle Schardein 2000. Katsuki A, Sumida Y, Murashima S, Murata K, Takarada Y, Ito K, Fujii M, Tsuchihashi K, Goto H, Nakatani K, Yano Y: Serum levels of tumor necrosis factor-alpha are increased in obese patients with noninsulin-dependent diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab. 1998;83:859-862. Kitzmiller JL, Gavin LA, Gin GD, Jovanovic-Peterson L, Main EK, Zigrang WD: Preconception care of diabetes. Glycemic control prevents congenital anomalies. JAMA. 1991;265:731-736. Krausová T, Peterka M: Teratogenic and lethal effects of 2–24 h hyperthermia episodes on chick embryos. Journal of Thermal Biology. 2007;32:193–203. Kullander S, Källén B: A prospective study of drugs and pregnancy. 3. Hormones. Acta Obstet Gynecol Scand. 1976;55:221-224. Kumari AS: Pregnancy outcome in women with morbid obesity. Int J Gynaecol Obstet. 2001;73:101-107. Lecorche E: Du diabete: Dans ses rapports avee la vie uterine la menstruation et la grosse. Ann. Gynecol. Obstet. 1885;24:257. Podle Schardein 2000. Macintosh MC, Fleming KM, Bailey JA, Doyle P, Modder J, Acolet D, Golightly S, Miller A: Perinatal mortality and congenital anomalies in babies of women with type 1 or type 2 diabetes in England, Wales, and Northern Ireland: population based study. BMJ. 2006;333:177. Madsen H: Fetal oxygenation in diabetic pregnancy. Danish Med Bull. 1986;33:64-74. Podle Schwartz R, Teramo KA, 2000. Maeda,T: Experimental studies on the malformation of the eye. I. Experimental studies by administration of sucralose or glucose. Nisson Igaku. 1937;26:1515-1561. Podle Schardein 2000.
71
Martínez-Frías ML: Epidemiological analysis of outcomes of pregnancy in diabetic mothers: identification of the most characteristic and most frequent congenital anomalies. Am J Med Genet. 1994;51:108-113. McCormick KL, Susa JB, Widness JA, Singer DB, Adamsons K, Schwartz R: Chronic hyperinsulinemia in the fetal rhesus monkey: effects on hepatic enzymes active in lipogenesis and carbohydrate metabolism. Diabetes. 1979;28:1064-1068. Miller HC: Intrauterine growth retardation. An unmet challenge. Am J Dis Child. 1981;135:944-948. Mills JL: Malformations in infants of diabetic mothers. Teratology 1982,25:385-394. Mohamed-Ali V, Goodrick S, Rawesh A, Katz DR, Miles JM, Yudkin JS, Klein S, Coppack SW: Subcutaneous adipose tissue releases interleukin-6, but not tumor necrosis factor-alpha, in vivo. J Clin Endocrinol Metab. 1997;82:4196-4200. Moley KH: Hyperglycemia and apoptosis: mechanisms for congenital malformations and pregnancy loss in diabetic women. Trends Endocrinol Metab. 2001;12:78-82. Moore KL, Persaud TVN: Zrození člověka. Embryologie s klinickým zaměřením. ISV nakladatelství Praha, 2002. pp. 549. Naeye RL: Maternal body weight and pregnancy outcome. Am J Clin Nutr. 1990;52:273279. Ornoy A, Rand SB, Bischitz N: Hyperglycemia and hypoxia are interrelated in their teratogenic mechanism: studies on cultured rat embryos. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 2010;89:106-115. Pedersen LM, Tygstrup I, Pedersen J: Congenital Malformations in Newborn Infants of Diabetic Women. Correlation with Maternal Diabetic Vascular Complications. Lancet. 1964;1:1124-1126. Penney GC, Mair G, Pearson DW: Scottish Diabetes in Pregnancy Group: Outcomes of pregnancies in women with type 1 diabetes in Scotland: a national population-based study. BJOG. 2003;110:315-318. Peterka M, Fára M: Jsou vitamíny embryotoxické? Prakt. lék. 1990,70:567-569. Peterka M, Jelínek R, Pavlík A: Embryotoxicity of 25 psychotropic drugs: a study using CHEST. Reprod Toxicol. 1992;6:367-374. Peterka M, Jelínek R: Mezidruhové rozdíly morfogenetických systémů. Cas Lek Cesk. 1982;121:1153-1156. Peterka M, Novotná B: Úvod do teratologie příčiny a mechanismy vzniku vrozených vad. Univerzita Karlova v Praze, Nakladatelství Karolinum, 2010, pp. 89. 72
Platt MJ, Stanisstreet M, Casson IF, Howard CV, Walkinshaw S, Pennycook S, McKendrick O: St Vincent's Declaration 10 years on: outcomes of diabetic pregnancies. Diabet Med. 2002;19:216-220. Přibylová H: Dlouhodobé sledování dětí diabetických matek. Ústav pro péči o matku a dítě. Praha: Iga MZ ČR, 1993. Racek J, Eiselt J, Friedecký B, Holeček V, Nekulová M, Pittrová H, Rušavý Z, Senft V, Šavlová M, Těšínský P, Verner M: Klinická biochemie. Druhé přepracované vydání. Galén, Praha 2006, pp. 329. Rayburn W, Piehl E, Jacober S, Schork A, Ploughman L: Severe hypoglycemia during pregnancy: its frequency and predisposing factors in diabetic women. Int J Gynaecol Obstet. 1986;24:263-268. Ream JR Jr, Weingartern PL, Pappas AM: Evaluation of the prenatal effects of massive doses of insulin in rats. Teratology. 1970;3:29-32. Robert MF, Neff RK, Hubbell JP, Taeusch HW, Avery ME: Association between maternal diabetes and the respiratory-distress syndrome in the newborn. N Engl J Med. 1976, 12;294:357-360. Rychter Z, Jelínek R: Základy experimentální teratologie. Praha: Avicenum, 1978, pp. 160. Salmon MA, Lindenbaum R, Ounsted CH: Developmental defects and syndromes. Aylesbury HM+M Publishers, 1978, pp. 432. Schaefer UM, Songster G, Xiang A, Berkowitz K, Buchanan TA, Kjos SL: Congenital malformations in offspring of women with hyperglycemia first detected during pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 1997;177:1165-1171. Schaefer-Graf UM, Buchanan TA, Xiang A, Songster G, Montoro M, Kjos SL: Patterns of congenital anomalies and relationship to initial maternal fasting glucose levels in pregnancies complicated by type 2 and gestational diabetes. Am J Obstet Gynecol. 2000;182:313-320. Schardein JL: Chemically induced birth defects. New York, 2000, pp. 879. Schwartz R, Teramo KA: Effects of diabetic pregnancy on the fetus and newborn. Semin Perinatol. 2000;24:120-135. Smithberg M, Runner MN: Teratogenic Effects of Hypoglycemic Treatments in inbred Strains of Mice. Am J Anat. 1963;113:479-489. Smoak IW: Brief hypoglycemia alters morphology, function, and metabolism of the embryonic mouse heart. Reprod Toxicol. 1997;11:495-502.
73
Spellacy WN, Miller S, Winegar A, Peterson PQ: Macrosomia--maternal characteristics and infant complications. Obstet Gynecol. 1985;66:158-161. Stehbens JA, Baker GL, Kitchell M: Outcome at ages 1, 3, and 5 years of children born to diabetic women. Am J Obstet Gynecol. 1977;127:408-413. Šípek A, Gregor V: Vrozené vady v České republice v období 1994 - 2008: prenatální a postnatální incidence. Actual Gyn 2009;1:16-20. Telford IR, Woodruf CS, Linford RH: Fetal resorption in the rat as influenced by certain antioxidants. Am J Anat. 1962;110:29-36. Temple R, Aldridge V, Greenwood R, Heyburn P, Sampson M, Stanley K: Association between outcome of pregnancy and glycaemic control in early pregnancy in type 1 diabetes: population based study. BMJ. 2002;325:1275-1276. Waller DK, Shaw GM, Rasmussen SA, Hobbs CA, Canfield MA, Siega-Riz AM, Gallaway MS, Correa A; National Birth Defects Prevention Study: Prepregnancy obesity as a risk factor for structural birth defects. Arch Pediatr Adolesc Med. 2007;161:745-750. Warkany J: Congenital Malformations. Notes and Comments. Year Book Medical Publishers, Chicago, 1971. Podle Schardein 2000. Weiss PA, Kainer F, Haas J: Cord blood insulin to assess the quality of treatment in diabetic pregnancies. Early Hum Dev. 1998;51:187-195. Wentzel P, Ejdesjö A, Eriksson UJ: Maternal diabetes in vivo and high glucose in vitro diminish GAPDH activity in rat embryos. Diabetes. 2003;52:1222-1228. WHO: Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. World Health Organization Department of Noncommunicable Disease Surveillance, Geneva, 1999, pp. 49. WHO: Obesity and overweight, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs311/en/index.html (17. února 2010). Wilson JG: Embryological Considerations in Teratology. Ann NY Acad Sci. 1965;123:219-227. Wilson JG: Environment and Birth Defects. Academic Press, New York, 1973. Podle Schardein 2000. Wilson JG: Experimental studies on congenital malformations. J. Chronic Dis. 1959,10:111–130.
74
Wolf M, Sandler L, Hsu K, Vossen-Smirnakis K, Ecker JL, Thadhani R: First-trimester Creactive protein and subsequent gestational diabetes. Diabetes Care. 2003;26:819-824. Yang J, Cummings EA, O'connell C, Jangaard K: Fetal and neonatal outcomes of diabetic pregnancies. Obstet Gynecol. 2006;108:644-650. Zima T: Laboratorní diagnostika. Praha, Nakladatelství Galén, 2002, pp. 728. Žižka J: Diagnostika syndromů a malformací. Praha, Nakladatelství Galén, 1994, pp. 414.
75
