PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA UNIVERZITY KARLOVY V PRAZE KATEDRA ANTROPOLOGIE A GENETIKY ČLOVĚKA
RENÁLNÍ AGENEZE Diplomová práce
Iveta Svobodová Praha 2012
Vedoucí práce: Mgr. Zdeněk Musil
Vedoucí diplomové práce: Mgr. Zdeněk Musil
Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.
V Praze 6. 5. 2012
Iveta Svobodová
1
Poděkování: Za podnětné rady a odborné vedení během této práce děkuji svému školiteli Mgr. Zdeňku Musilovi. Celému kolektivu laboratoře molekulární diagnostiky ÚBLG za sdílení zkušeností během praktického zpracovávání práce. Mgr. A. Žídkové za pomoc při statistickém vyhodnocování. V neposlední řadě děkuji také svojí rodině za podporu během psaní této diplomové práce.
2
ABSTRAKT Renální ageneze je poměrně časté, geneticky podmíněné, onemocnění. Geny, které vedou k jejímu vzniku, nejsou však stále potvrzené. Předmětem této práce bylo provést molekulárně genetickou analýzu dvou kandidátních genů, které mohou vést k renální agenezi u člověka, genů kódujících tyrozinkinázový receptor RET a neurotrofický faktor GDNF. Byla provedena mutační analýza 20 exonů genu RET a 3 exonů genu GDNF v souboru 20 pacientů s diagnostikovanou unilaterální renální agenezí. Zjišťovány byly také numericné změny obou genů. Cílem práce pak bylo identifikovat případné mutace genů RET a GDNF a tím přispět k jejich asociaci se vznikem ageneze ledvin. V souboru pacientů nebyla nalezena žádná popsaná patogenní mutace, detekovány byly pouze tři popsané jednobodové polymorfizmy v genu RET. Polymorfizmus rs1800860 (GCG-GCA, Ala-Ala 432) se nachází v 7. exonu a byl nalezen u 11 pacientů z celkových 20, z toho ve dvou případech v homozygotním stavu. Polymorfizmus rs1800861 (CTTCTG, Leu-Leu 769) je lokalizován v exonu 13 a byl identifikován u 6 z 20 pacientů, z toho jeden pacient byl homozygotem pro minoritní alelu G. Polymorfizmus rs1800863 (TCCTCG; Ser-Ser) v 15. exonu byl nalezen u 5 pacientů, a to vždy v heterozygotní konstituci. Ve všech případech se jedná o časté polymorfizmy s frekvencí minoritní alely v populaci vyšší než 10%. Výsledky studie tedy nepotvrdily zvýšený výskyt mutací v genech RET a GDNF u pacientů s renální agenezí a nemohou tedy podpořit asociaci těchto dvou genů se vznikem onemocnění. Vzhledem k omezené velikosti souboru pacientů však nelze spojitost mezi RET/GDNF signálním komplexem a agenezí ledvin vyvrátit.
Klíčová slova: Renální ageneze, RET, GDNF, polymorfizmus
3
ABSTRACT Renal agenesis is relatively common, genetically determined, disease. Genes which lead to its origin are still unconfirmed. Subject of this study was to perform molecular-genetic analyses of two genes, which are candidate for origin of renal agenesis in humans, genes coding tyrosine kinase receptor RET and neurotrophic factor GDNF. Mutation analysis of 20 exons of RET and 3 exons of GDNF in group of 20 patients with diagnosed unilateral renal agenesis has been done. Numeric changes were also investigated. The aim of this work was to identify potential mutation of RET and GDNF genes and contribute to their association with renal agenesis formation. No pathogenic mutation has been found in the group of patients, only three known single-point polymorphisms in RET gene have been detected. Polymorphism rs1800860 (GCG-GCA, Ala-Ala 432) is situated in exon 7 and has been found in 9 of total 20 patients, thereof in two cases in homozygous state. Polymorphism rs1800861 (CTT-CTG, Leu-Leu 769) is located in exon 13 and has been identified in 3 of 20 patients, thereof one patient was homozygote for minority allele G. Polymorphism rs1800863 (TCC-TCG; SerSer) in 15. exon has been found in 5 patients, at any time in heterozygous state. All cases are about common polymorphisms with frequency of minority allele in population higher then 10%. The results of this study did not confirm increased occurrence of RET and GDNF mutations in patients with renal agenesis and they couldn’t support association of these two genes with disease origin. However given limited size of group of patients it is impossible to disprove connection between RET/GDNF signalling complex and renal agenesis.
Key words: Renal agenesis, RET, GDNF, polymorphism.
4
OBSAH 1.
ÚVOD ....................................................................................................................... 7 1.1
1.1.1
Fyziologická nefrogeneze ............................................................................. 8
1.1.2
Chybná nefrogeneze ..................................................................................... 9
1.2
CAKUT ..................................................................................................... 12
1.2.2
Renální ageneze ......................................................................................... 13
Genetické faktory při vzniku ageneze ledvin ..................................................... 14
1.3.1
RET ........................................................................................................... 16
1.3.2
GDNF ........................................................................................................ 19
1.3.3
Úloha Ret a Gdnf během myší nefrogeneze ................................................ 20
1.3.4
Signální dráha řídící embryonální vývoj ledvin .......................................... 22
1.3.5
Mutace genů RET, GDNF a GFRA1 u pacientů s renální agenezí ............... 26
CÍLE PRÁCE .......................................................................................................... 27 2.1
3.
Vrozená onemocnění ledvin .............................................................................. 12
1.2.1
1.3
2.
Vývoj ledvin ....................................................................................................... 8
Hypotéza ........................................................................................................... 27
MATERIÁL A METODY ....................................................................................... 28 3.1
Materiál............................................................................................................. 28
3.2
Metody.............................................................................................................. 28
3.2.1
PCR ........................................................................................................... 29
3.2.2
Gelová elektroforéza .................................................................................. 36
3.2.3
Sekvenační PCR ......................................................................................... 36
3.2.4
Přečištění produktu sekvenační PCR .......................................................... 37
3.2.5
Sekvenace .................................................................................................. 38
3.2.6
DGGE ........................................................................................................ 38
3.2.7
MLPA ........................................................................................................ 40
5
4.
5.
Výsledky ................................................................................................................. 42 4.1
Optimalizace PCR ............................................................................................. 42
4.2
Zjištěné polymorfizmy ...................................................................................... 43
4.2.1
RET (rs1800860)........................................................................................ 44
4.2.2
RET (rs1800861)........................................................................................ 45
4.2.3
RET (rs1800863)........................................................................................ 47
4.3
Výsledky MLPA ............................................................................................... 48
4.4
Statistické vyhodnocení ..................................................................................... 49
Diskuze ................................................................................................................... 52 5.1
Souvislosti vybranných genů s agenezí ledvin ................................................... 52
5.2
Geny RET a GDNF u pacientů s renální agenezí ................................................ 53
5.3
Zjištěné polymorfizmy ...................................................................................... 55
6.
Závěr ....................................................................................................................... 58
7.
Seznam zkratek........................................................................................................ 60
8.
Seznam použité literatury ........................................................................................ 63
6
1. ÚVOD Anomálie ledvin patří mezi časté vrozené vývojové vady, které významně ovlivňují naději dožití a kvalitu života celkově. Renální ageneze patří bezesporu k nejzávažnějším z této skupiny vývojových defektů. Přestože v některých případech může jednostranná forma tohoto onemocnění zůstat nerozpoznaná, u většiny postižených jedinců je spojena se zdravotními komplikacemi, které jsou primárně důsledkem kompenzační hypertrofie kontralaterální ledviny, což může v důsledku vést např. ke vzniku arteriální hypertenze. Bilaterální ageneze ledvin zase zodpovídá za významné procento potratů a časných úmrtí novorozence. Není tedy divu, že v posledních letech sílí snaha rozkrýt genetický podklad embryogeneze ledvin, a tím také identifikovat konkrétní geny zodpovědné za vznik renální ageneze. Situaci však komplikuje vysoká genetická heterogenita, variabilní exprese a neúplná penetrance tohoto onemocnění, stejně jako jeho klinická tichost v případě unilaterální formy. Podle dosavadních výsledků se zdá, že renální ageneze je příkladem onemocnění s komplexními znaky dědičnosti v důsledku malých mutací mnoha specifických genů, zapojených při normální embryogenezi. Výzkum se v současné době orientuje především na vytipované kandidátní geny, u kterých se potvrdilo, že regulují vývoj ledvin u myší. Tato diplomová práce se zaměřuje na dva z těchto kandidátních genů, a to geny RET a GDNF a jejím cílem je podpořit jejich asociaci se vznikem renální ageneze u člověka pomocí mutační analýzy.
7
1.1 Vývoj ledvin 1.1.1 Fyziologická nefrogeneze U člověka a vyšších obratlovců obecně se postupně vyvíjejí tři sady exkrečních orgánů pronefros, mezonefros a metanefros. Pronefros jsou rudimentární a nefunkční struktura, která se objevuje začátkem čtvrtého týdne embryogeneze u člověka, avšak brzy degeneruje. Následuje vznik mezonefros, které plní funkci prozatímních ledvin, než se vytvoří ledviny definitivní. Formování metanefros, čili definitivních ledvin, je zahájeno počátkem pátého týdne embryonálního vývoje a o čtyři týdny později se ledviny stávají funkčními (Moore & Persaud, 1998). Ledviny patří vedle plic či slinivky břišní k orgánům procházejícím tzv. organogenezí
pomocí
větvení,
která
je
důsledkem
komplexu
induktivních
a
morfogenetických událostí (Saxen, 1987). Ledviny se vyvíjejí ze dvou základních zdrojů – z ureterálního pupenu (UB) a metanefrického mezenchymu (MM). Oběma primordiím dává vznik intermediární mezoderm (Moore et Persaud, 1998). Vývoj je iniciován ve chvíli, kdy UB, jako výchlipka kaudální části Wolfových vývodů, začíná invaginovat MM ve svém okolí. Následně dochází k sérii reciprokých induktivních interakcí mezi oběma tkáněmi (Grobstein, 1955; 1956). UB je podněcován mezenchymen k růstu a opakovanému větvení, které má charakteristický vzor a rozsah, což je pro správný vývoj ledvin zásadní. Větvící se UB zase indukuje buňky mezenchymu ve svém okolí ke kondenzaci v metanefrogenní blastém, který nakonec diferencuje v různé segmenty nefronu, konkrétně v glomeruly, proximální a distální tubuly a Henleovu kličku. Z UB zase vzniká sběrný systém ledvin, sestávající z močovodu, ledvinné pánvičky, kalichu a sběrných kanálků dřeně i kůry (Saxen, 1987; Grobstein, 1955, 1956).
8
Obr. 1.1. Základní kroky ve vývoji ledvin: a) Během embryonálního stádia E11.5 ureterální pupen invaginuje metanefrický blastém a dichotomicky se větví; b) Ve stádiu E15.5 probíhá diferenciace nefronu. Nejprve dochází ke hromadění mezenchymálních buněk kolem špiček UB, poté následuje jejich epiteliální transformace v renální váčky, které jsou jakýmisi prekurzory nefronu. Renální váčky diferencují nejprve v tzv. kanálky stočené do tvaru písmena C a poté v esovité kanálky. Kolem esovitých kanálků se zvětšují kapiláry, což vede ke vzniku glomerulů, které spolu s kanálky nakonec dávají vznik nefronům; c) Definitivní stavba ledviny i nefronu (převzato z Schedl et al., 2007).
1.1.2 Chybná nefrogeneze Přítomnost některých genetických, ale i environmentálních faktorů během nefrogeneze může vést k jejímu narušení a vyústit tak ve strukturální anomálie ledvin (obr. 1.1), (Renkema et al., 2011). Ústředním dějem celé nefrogeneze je interakce mezi UB a MM, jakákoli abnormalita této interakce tak vede k různým formám vrozených anomálií ledvin a močového ústrojí (Pope et al., 1999). K nejčastějším defektům dochází hned v úvodním procesu vývoje ledvin, tedy během indukce růstu UB. Výsledkem může na jedné straně být ageneze ledvin, a to pokud ke vzniku UB vůbec nedojde, na straně druhé pak duplikace ledvin i močovodu v případě nadměrné stimulace růstu UB. Pokud dojde k indukci růstu UB v chybné poloze, výsledkem jsou ektopické ledviny (Schedl, 2005; Kerecuk et al., 2008; Renkema et al., 2011).
9
Narušení vývoje ledvin během větvení UB může ovlivnit rychlost a výsledný počet těchto větvení, na čemž přímo závisí konečný počet nefronů, a tím pádem také celková velikost ledvin. Snížená rychlost větvení UB je tak nejčastější příčinou vzniku hypoplazie ledvin (Schedl, 2005; Kerecuk et al., 2008). I zdánlivě malý deficit v počtu nefronů však může znamenat predispozici k onemocněním ledvin v pozdějším životě (Pohl et al., 2002). Počet nefronů u zdravé populace přitom až pětinásobně kolísá, pohybuje se zhruba v rozmezí 0,3-1,3 milionů nefronů na jednu ledvinu (Clark et al., 1999). V případě abnormálního vývoje UB na úrovni tvorby nefronů může dojít ke vzniku dysplastických ledvin, charakteristických primitivními nefrony, sběrnými kanálky a dalšími nespecifickými malformacemi. Dysplazie může být částečná nebo kompletní, krajní variantou je pak aplazie, při které ledvina o velmi malé velikosti zastavuje svůj další růst a vývoj. Pokud jsou navíc ledviny zvětšené cystickými útvary, jedná se o tzv. cystickou dysplazii, v případě postižení celé ledviny pak o multicystickou dysplazii. Cystické dysplastické ledviny si, na rozdíl od ledvin postižených aplazií či multicystickou dysplazií, zachovávají některé funkční nefrony, a tím pádem i částečnou exkreční funkci (Schedl, 2005; Kerecuk et al., 2008).
10
Obr. 1.1. Znázornění fyziologického i abnormálního vývoje ledvin (převzato z Kerecuk et al., 2008).
11
1.2 Vrozená onemocnění ledvin 1.2.1 CAKUT Vrozené anomálie ledvin a močového traktu, souhrnně označované CAKUT, zahrnují onemocnění s různou klinickou závažností, od renální ageneze, přes hypoplazii, dysplazii, hydronefrózu, megaureter, hydroureter, vezikoureterální reflux, až po multicystické ledviny (Pope et al., 1999; Jain, 2009; Sanna-Cherchi et al., 2009). CAKUT patří k častým vývojovým vadám, vyskytujícím se s prevalencí v rozmezí 3-6/1000 živě narozených dětí, přičemž výrazně ovlivňují naději dožití (Sanna-Cherchi et al., 2009). I přes pokroky v prenatální diagnostice, tak CAKUT tvoří nejčastější příčinu chronických onemocnění ledvin u dětí a odhaduje se, že zodpovídají za více než 40% případů jejich selhání (Pope et al., 1999; Sanna-Cherchi et al., 2009). Často je proto nutná chirurgická intervence, v horším případě dialýza či transplantace ledvin (Pope et al., 1999). Všechny tyto komplikace v dětském věku mohou vést k těžkému poškození fyzického vývoje, pacienti často trpí růstovou retardací, narušením sexuální maturace a dalšími komplikacemi, což v konečném důsledku negativně ovlivňuje jejich psychosociální integraci (Groothoff, 2005). Skupina letálních malformací ledvin, někdy souhrnně označovaná jako BRAHD, zahrnuje bilaterální renální agenezi, hypoplazii a dysplazii a objevuje se s incidencí 1,3/10 000 živých porodů, fetálních úmrtí a předčasných ukončení těhotenství z důvodu zjištěné anomálie plodu (Harewood et al., 2010). Odhaduje se, že tyto velké malformace zodpovídají asi za 7% případů potratů a časných úmrtí novorozence (do 6. týdne po narození), (Pohl et al., 2002). Závažnost jednotlivých anomálií se odráží také v období jejich diagnostiky. Zatímco většina pacientů např. s multicystickými dysplastickými ledvinami či s bilaterální hypodysplazií je diagnostikována před nebo bezprostředně po narození, méně závažná, především jednostranná postižení, mohou zůstat nerozpoznaná nebo jsou zjištěna náhodně. Postnatální diagnostika je také často provedena na základě druhotných klinických příznaků, které CAKUT doprovázejí, jako třeba proteinurie či hypertenze (Dursun et al., 2007). Velká část případů je také odhalena díky vyšetření zobrazovacími metodami, indikovanými prvotně z jiných důvodů (Sanna-Cherchi et al., 2009). Abnormality ledvin se
12
mohou vyskytovat izolovaně nebo komplexně, ale také jako součást některých syndromů, postihujících více orgánových soustav (tab. 1.1.).
1.2.2 Renální ageneze Samotná kongenitální renální ageneze u lidí je poměrně častá vývojová vada, její průměrná roční prevalence se podle registrů vrozených vad pohybuje v rozmezí 0,15-0,2/1000 (Schulman et al., 1993; Schedl, 2007), incidence až 0,6/1000 porodů (Pohl et al., 2002). Bilaterální renální ageneze (BRA) je neslučitelná se životem. Její frekvence se odhaduje na 1/30000 porodů (Schedl, 2007), podle některých zdrojů je však BRA podstatně častější, a to až 1/5000-10000 porodů (Carter et al., 1979; Pohl et al., 2002). Zdá se navíc, že frekvence BRA pomalu stoupá (Schulman et al., 1993), což však může být způsobeno pouze častějším záchytem této vady u potratů díky pokročilejším diagnostickým metodám, ale také stále systematičtější evidencí potratů. Unilaterální renální ageneze (URA) je sice častější než BRA, stanovení její přesné frekvence je však komplikováno faktem, že zůstává často asymptomatická, což ve výsledku způsobuje podhodnocování frekvencí URA, zjištěných pouze na základě diagnostikovaných případů. Nejčastěji udávaná frekvence URA je tak 1/4000-5000 (Schedl, 2007; Reiterová & Merta, 2008), některé odhady „skutečné“ incidence onemocnění, tj. včetně nediagnostikovaných případů, se však pohybují okolo 1/200 (Pohl et al., 2002). Evidované případy URA přitom pocházejí nejčastěji z autopsií (Schulman et al., 1993; Carter et al., 1979). Zajímavé je, že renální ageneze, ale i další anomálie patřící do CAKUT, vykazují mužskou predispozici s poměrem postižených mužů: ženám 2,5: 1 (Carter et al., 1979; Sanna- Cherchi, 2009; Harewood et al., 2010). Dalším rizikovým faktorem je vedle mužského pohlaví plodu také diabetes matky (Nielsen et al., 2005; Davis et al., 2010). 1.2.2.1 Klinický obraz a extrarenální projevy renální ageneze Ageneze ledvin bývá doprovázena některými extrarenálními projevy, které častěji a také výrazněji postihují pacienty s BRA, než ty s jednostranným defektem. BRA je obvykle asociována se závažným oligohydramniem, který má za následek deformace obličeje, ten pak získává vzhled charakteristický pro Potterův syndrom – nízko posazené měkké ušní boltce, široký a plochý nos a ustupující brada (Fitch & Lachance, 1972; Schulman et al., 1993). Velmi častá je v případě BRA také plicní hypoplazie, která pacienty s URA
13
většinou nepostihuje (Hislop et al., 1979; Schulman et al., 1993; Harewood et al., 2010). Velkými malformacemi bývají postiženy také končetiny a gastrointestinální trakt (Carter et al., 1979; Harewoode et al., 2010). Redukce renální tkáně při URA se projevuje tzv. kompenzační hypertrofií zbylé ledviny. Funkčně je tato solitérní ledvina více zatížená, což vede ke zvýšení glomerulárního průtoku krve a krevního tlaku, tzv. hyperfiltraci (Fine & Norman, 1992; Brenner et al., 1996).
1.3 Genetické faktory při vzniku ageneze ledvin I přes vzrůstající úsilí v posledních letech se stále nedaří mapovat konkrétní lokus či gen zodpovědný za renální agenezi a ostatní anomálie ledvin. Familiární výskyt CAKUT sice svědčí o účasti genetických faktorů při vzniku těchto onemocnění, vzorec dědičnosti však vykazuje variabilní expresivitu, s výskytem různých fenotypů napříč rodokmeny a také neúplnou penetranci, díky které vzniká prostor pro působení environmentálních faktorů, což identifikaci příslušného lokusu znesnadňuje. Také klinická tichost unilaterální renální ageneze a vysoká genetická heterogenita onemocnění celou situaci komplikuje (Cain et al., 1974; Fitch, 1977; Squiers et al., 1987; Sanna-Cherchi et al., 2007; Renkema et al., 2011). Zřejmě jako důsledek těchto překážek dosud nebyla pro renální agenezi publikována žádná úspěšná vazebná studie. Riziko vzniku renálních defektů se zvyšuje u plodů, jejichž příbuzní prvního stupně jsou postiženi nějakou anomálií ledvin, empirické riziko pro CAKUT je v takových případech okolo 10% (Renkema et al., 2011), pro BRAHD asi 5% (Fitch, 1977; Harewood et al., 2010) a pro renální agenezi asi 3,5-9% (Sanna-Cherchi, 2007; Carter et al., 1979). Také přítomnost různých anomálií ledvin, včetně renální ageneze, jako jednoho ze symptomů u řady multiorgánových syndromů se specifickým typem dědičnosti, ať už autozomálně dominantních (Townes-Brockův syndrom či), recesivních (Fraserův syndrom) či vázaných na X chromozom (Kallmanův syndrom), svědčí o důležitosti genetických faktorů při vzniku renální ageneze a ostatních CAKUT (Pope et al., 1999). Přehled syndromů souvisejících s defekty ledvin je v tabulce 1.1. V neposlední řadě bývá renální ageneze součástí některých chromozomálních aberací, jako např. Downova, Patauova, Edwardsova či Turnerova syndromu (Nicolaides et al., 1992).
14
Tab. 1.1 : Seznam syndromů, u kterých se jako jeden z příznaků vyskytuje renální ageneze a jiné vady ledvin. K syndromům jsou přiřazeny také konkrétní geny, které stojí za jejich vznikem (převzato z Sanna-Cherchi et al., 2007). Kandidátní geny pro renální agenezi zahrnují skupiny genů a) popsaných ve studiích o postižených rodinách, b) důležitých během nefrogeneze, c) vyvolávající syndromové formy onemocnění, d) způsobující experimentální agenezi u zvířat, e) o kterých bylo během studia jejich exprese u lidí či potracených embryí postižených renální agenezí zjištěno, že jsou deregulovány (Renkema et al., 2011). Většina genů, potenciálně zapojených do fyziologického vývoje ledvin, a tudíž i při poruchách jejich vývoje u člověka, je však popsána na základě zvířecích (především myších) studií. V posledních letech se pro identifikaci konkrétních řídících proteinů využívá především studií knockoutu vytipovaných genů u myší a také experimentů s tkáňovými a orgánovými kulturami. Zatím bylo popsáno více než 40 genů, účastnících se myší renální organogeneze (Bates, 2000). Mezi nejvýznamnější z nich patří především Ret (Schuchardt et al., 1994), Gdnf (Sanchez et al., 1996), Gfra1 (Cacalano et al., 1998), Pax2 (Torres et al., 1995) a Wt1 (Keidberg et al., 1993) geny. Všechny tyto geny jsou zároveň považovány za kandidátní geny pro renální agenezi u člověka.
15
Jak již bylo popsáno v kapitole o vývoji ledvin, pro vznik plně funkčních ledvin jsou nezbytné a zároveň postačující dvě tkáně - ureterální pupen (UB) a metanefrický mesenchym (MM), mezi nimiž dochází k reciprokým induktivním interakcím. Tato diplomová práce se zaměřuje na dva z kandidátních genů pro renální agenezi, a to RET a GDNF, které jsou exprimovány právě těmito dvěma tkáněmi časné nefrogeneze. O obou genech je zároveň potvrzeno, že způsobují agenezi u myší (Schuchardt et al., 1994; Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996). Zvýšený výskyt mutací RET a GDNF byl zaznamenán také u pacientů a potracených plodů s renální agenezí, ať už unilaterální čí bilaterální (Skinner et al., 2008).
1.3.1 RET 1.3.1.1 RET gen Gen RET, známý také jako RET protoonkogen, patří do superrodiny tyrozinkinázových receptorů (RTK) a vykazuje signifikantní sekvenční i strukturní homologii s ostatními členy této rodiny (Takahashi & Cooper, 1987). Jeho název vznikl jako akronym pro „rearranged during transfection“ a vychází z původního popsání sekvence RET protoonkogenu
jako genového přeskupení po transfekci NIH 3T3
fibroblastů
prostřednictvím DNA z lidského T-lymfomu (Takahashi et al., 1985). RET je lokalizován na chromozomu 10q11.2 (obr. 1.1) a obsahuje 20 exonů v rozsahu asi 60 kb (Ceccherini et al., 2002). Kromě vyvíjejícího se vylučovacího systému je RET exprimován také v centrálním, periferním a enterickém nervovém systému. Dokazuje to studium exprese Ret protoonkogenu, který vykazuje vysokou podobnost s lidským RET protoonkogenem, během myší embryogeneze (Pachnis et al., 1993). 1.3.1.2 RET protein RET Kóduje glykoprotein o molekulové hmotnosti 170 KDa v glykosylované formě. Je umístěný na vnější buněčné membráně, kde se účastní přenosu signálů pro buněčný růst a diferenciaci (Jain, 2009). Jako typický tyrozinkinázový receptor je RET tvořen třemi doménami: extracelulární, transmembránovou a intracelulární (obr. 1.2). Extracelulární doména slouží k interakci s příslušnými koreceptory a ligandy, což umožňuje dimerizaci RET receptoru a jeho následnou autofosforylaci, která je pro kinázovou aktivaci a následný přenos signálu nezbytná (Jain, 2009). Součástí extracelulárního regionu RET jsou také čtyři cadherinové domény, důležité pro buněčnou adhezi a interakci, které RET odlišují od
16
ostatních tyrozinkinázových receptorů a zároveň naznačují vzdálenou příbuznost s cadherinovou superrodinou (Anders et al., 2001). Extracelulární doména RET obsahuje také na cystein bohatou oblast, která je mezidruhově konzervovaná a zřejmě slouží k tvorbě disulfidických můstků (Ponder, 1999). Oblasti s kinázovou aktivitou nese intracelulární doména RET. Variace v počtu aminokyselin (AK) v intracelulární doméně určují příslušnost k jedné ze dvou hlavních isoforem RET, RET9 či RET 51. Tyto isoformy vznikají alternativním splicingen 3‘ konce RET protoonkogenu. Výsledný protein je identický až na C-terminální oblast, která obsahuje 9 či 51 odlišných AK (Jain, 2009). Isoformy se liší také v počtu tyrozinových zbytků (Y) v intracelulární doméně, RET9 obsahuje 16 a RET51 18 tyrozinových zbytků, konkrétně delší isoforma obsahuje navíc RET-Y1090 a RET-Y1096 (Arighi, 2005).
Obr. 1.1. Lokalizace RET protoonkogenu na chromozomu 10q11.2, přesněji od bazického páru 43,572,516 po 43,625,798 (převzato z http://ghr.nlm.nih.gov/gene/RET)
17
Obr. 1.2. Schematická struktura RET proteinu. Znázorněna jsou čtyři extracelulární cadherinová opakování, na cystein bohatá oblast, transmembránová a kinázová (intracelulární) doména RET, a také obě hlavní isoformy, RET9 a RET51 (převzato z Arighi et al., 2005). 1.3.1.3 Onemocnění asociovaná s RET protoonkogenem Mutace genu RET se podílí na vzniku řady onemocnění (Pasini et al., 1996). Jako protoonkogen může například projít transformací a stát se onkogenem. Hraje pak roli u některých nádorových onemocnění, jako například při papilárním karcinomu štítné žlázy (PTC). Prevalence tohoto typu nádoru významně stoupla v oblastech zasažených radioaktivním spadem po Černobylské havárii v roce 1986. U více než 60% pacientů, vystavených radiaci a následně postižených PTC, byla také identifikována mutace v RET protoonkogenu (Fugazzola et al., 1996). RET není za normálních okolností ve štítné žláze
18
exprimován, pokud však dojde k fúzi jeho tyrozinkinázové domény s jiným, konstitutivně exprimovaným genem, který poskytne promotor a dimerizační funkci, může vzniknout stále aktivní dimerická forma RET proteinu (Peterka & Novotná; 2010). Germinální RET mutace jsou pak asociovány s některými dědičnými syndromy – mnohačetnou endokrinní neoplasií typu 2A a 2B (MEN2A a MEN2B), charakteristickými pheochromocytomem (tumor vycházející z chromafinních buněk dřeně nadledvin), adenomem příštítné žlázy a medulárním karcinomem štítné žlázy (MTC). MTC má často familiární charakter a bývá pak považován za samostatný syndrom (FMTC). Všechny tyto syndromy (MEN2A, MEN2B a FMTC) jsou způsobeny tzv. aktivační mutací, která má za následek zvýšenou nebo konstitutivní expresi RET protoonkogenu (Hansford & Mulligan, 2000). Na druhé straně, delece či jiná mutace vyvolávající snížení aktivity genu RET, stojí za autozomálně dominantní formou Hirschsprungovy choroby (Hofstra et al., 2000).
1.3.2 GDNF 1.3.2.1 GDNF gen GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) je vzdáleným členem TGF-β superrodiny, s ostatními členy této rodiny jej však spojuje spíše jeho funkce či fyziologie než sekvence, ať už nukleotidová či aminokyselinová. Vykazuje totiž méně než 20% sekvenční homologii s ostatními členy TGFβ (Lin et al., 1993). Gen GDNF je lokalizovaný na chromozomu 5p12-p13.1 a zahrnuje oblast 28 kb (Schindelhauer et al., 1995). Obsahuje pouze 3 exony, první exon je navíc netranslatovaný a od druhého exonu jej dělí intron o rozsahu asi 10 kb (Grimm et al., 1998; Hellmich et al., 1996). GDNF je exprimován v několika orgánech, které se vyvíjejí prostřednictvím induktivních epiteliálněmezenchymálních interakcí, vždy je však striktně omezen na mezenchymální tkáně. Kromě embryonálních ledvin, konkrétně MM, se transkripty GDNF vyskytují např. ve vyvíjejícím se zažívacím traktu, varlatech, končetinových pupenech, mezenchymálních komponentech uší, nosu, očí a zubů a především pak ve vyvíjejícím se nervovém systému (Hellmich et al., 1996). V posledních letech je však GDNF studován především v souvislosti s dopaminergickými neurony. Bylo totiž zjištěno, že rekombinantní lidský GDNF podporuje přežití, diferenciaci, ale také vysoce-afinitní příjem dopaminu těmito neurony v kultuře embryonálních buněk mezimozku. Na rozdíl od ostatních faktorů, které mají stejnou schopnost (IGF-I, IGF-II, EGF či FGF), však GDNF nepůsobí jako mitogen.
19
Progresivní degenerace dopaminergický neuronů mezimozku způsobuje Parkinsonovu chorobu, GDNF by tak mohl být užitečný při léčbě této, ale i dalších neurodegenerativních onemocnění s podobnou etiologií (Lin et al., 1993). GDNF má také důležitou funkci při ochraně motorických neuronů periferálního nervstva a svalstva. Zabraňuje totiž jejich programované i axotomií indukované buněčné smrti (Oppenheim et al., 1995). 1.3.2.2 GDNF ptotein Gen GDNF kóduje proteinový prekurzor o 221 AK, který je následně upraven a vylučován jako glykosylovaný, disulfidovými můstky spojený, homodimer o 134 AK. Tato úprava při syntéze proteinu je pro TGFβ rodinu specifická (Lin et al., 1993; Lin et al., 1994). GDNF navíc obsahuje sedm cysteinových zbytků, stejně uspořádaných jako u zbylých TGFβ členů (Lin et al., 1994). Tento neurotrofní faktor je vysoce mezidruhově konzervován, myší a lidský GDNF například vykazuje 93% shodu na aminokyselinové úrovni (Hellmich et al., 1996).
Obr. 1.3. Lokalizace genu GDNF na chromozomu 5p12-p13.1, od bazického páru 37,812,778 po 37,839,781 (Převzato z http://ghr.nlm.nih.gov/gene/GDNF).
1.3.3 Úloha Ret a Gdnf během myší nefrogeneze Exprese genů Ret a Gdnf, analogů lidských RET a GDNF, je detailně popsána u myší. Ret je poprvé detekován v tzv. nefrotomu, což je oblast laterálního mesodermu, ze kterého následně vznikají embryonální a poté i definitivní ledviny. Během vývoje pronefros a mezonefros se exprese Ret přesouvá do Wolfových vývodů, přičemž nejvyšší hladiny Ret
20
mRNA jsou detekovány v jejich kaudální části, odkud později vyrůstá UB. Současně je v MM, konkrétně v oblasti kaudálně přilehlé k Wolfovým vývodům, poprvé zaznamenána exprese Gdnf mRNA (obr. 2a), (Pachnis et al., 1993; Hellmich et al., 1996; Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996). Vývoj ledvin je u myší, stejně jako u člověka, zahájen ve chvíli, kdy se UB vychlípí z kaudální oblasti Wolfových vývodů a začne invaginovat okolní mezenchym (obr. 2b). K této důležité události nefrogeneze dochází u myší 11. embryonální den. Ve stadiu, kdy se UB poprvé větví, lze detekovat silnou expresi Ret protoonkogenu v pupenovém epitelu, nikoli však v okolním MM. Zde je naopak zaznamenáno velké množství Gdnf transkriptů, UB je pro expresi Gdnf negativní (obr. 2c). Jak vývoj ledvin postupuje, exprese Ret se, stejně jako růst a větvení, přesouvá do okrajových částí ledvin, tedy do špiček rostoucích sběrných kanálků a zároveň mizí z dříve utvořených a více centrálně umístěných částí sběrného systému. Periferně, do oblasti obklopující špičky UB, se přesouvá také Gdnf exprese. Metanefrogenní blastém, stejně jako jeho deriváty, zůstávají i v dalších stádiích vývoje ledvin negativní pro expresi Ret protoonkogenu (obr. 2d), (Pachnis et al., 1993; Hellmich et al., 1996; Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996; Durbec et al., 1996; Shakya et al., 2005). Vzorec exprese Ret během myší nefrogeneze tedy odpovídá oblastem s aktuálně nejintenzivnějším růstem a větvením UB, což naznačuje význam tohoto genu pro růst a morfogenezi UB i jeho derivátů, a tím i pro celkovou organogenezi ledvin. Časověprostorové vymezení exprese Gdnf má pak analogický význam pro vývoj MM. Důležitost obou genů pro vývoj ledvin u myší je dále podpořena faktem, že myši s homozygotní mutací genů Ret či Gdnf umírají záhy po narození z důvodu renální ageneze či závažné dysgeneze. Zatímco u heterozygotů pro Gdnf mutaci lze v některých případech taktéž pozorovat abnormality ledvin, včetně renální ageneze, Ret heterozygoti mají fenotyp vždycky normální (Schuchardt et al., 1994; Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996). Hladina Gdnf, produkovaná buňkami metanefrogenního blastému u heterozygotů pro Gdnf mutaci, tedy nemusí být, na rozdíl od množství Ret uvolňovaného u heterozygotů, postačující pro indukci vývoje metanefros. Na základě následné studie orgánových kultur lze navíc spektrum defektů ve formování UB během embryogeneze přiřadit ke konkrétním renálním defektům pozorovaným při narození. Např. frekvence mutantních embryí bez jakéhokoli náznaku vychlipování UB odpovídala frekvenci renální ageneze u novorozených myší a byla
21
zároveň nejčastějším fenotypem (57 %). To potvrzuje, že ageneze ledvin je důsledek selhání ve formování pupenu. Podíl embryí, u kterých se sice UB vytvořil, ale nedorostl do metanefrického blastému, korespondoval s podílem myší se slepě ukončeným ureterem. Pokud došlo ke kontaktu pupenu s metanefrickým blastémem, růst a větvení bylo abnormální a projevilo se hypodysplastickými ledvinami při narození (Schuchardt et al., 1994; Schuchardt et al., 1996). K potvrzení toho, že Gdnf je skutečně faktorem, který je uvolňován z MM a aktivuje růst a následné větvení UB, byly kultivovány explantované urogenitální tkáně s Gdnf mutací za přítomnosti rekombinantního Gdnf na agarózových kuličkách. Větvení UB bylo u těchto mutantů významně zvýšeno. Kontrolní kultivace nemutovaných tkání za stejných podmínek navíc vyústila ve vznik nadpočetných UB (Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996; Sainio et al., 1997). Zatímco v případě myší s mutovaným Ret protoonkogenem tedy selhává schopnost Wolfových vývodů a UB reagovat na induktivní signál vysílaný z MM, u myší s mutovaným Gdnf naopak vůbec nedochází k uvolňování tohoto signálu z MM. Výsledek je však v obou případech stejný, dochází k narušení schopnosti UB správně růst a větvit se. Všechna tato zjištění - fyziologicky koordinovaný vzorec exprese Ret a Gdnf (Pachnis et al., 1993; Hellmich et al., 1996), defekty v renálním vývoji u myších embryí s mutacemi v jednom z těchto genů (Schuchardt et al., 1994; Schuchardt et al., 1996; Sánchez et al., 1996), ale také dříve publikované studie o vývoji ledvin na základě reciprokých induktivních interakcí (Saxen, 1987), kterým exprese Ret i Gdnf dobře odpovídá, jak časově, tak i prostorově - potvrzují jednotný model úlohy tyrozinkinázového receptoru Ret
a růstového
faktoru Gdnf jako ústředních signálních molekul
nepostradatelných pro správný vývoj ledvin. 1.3.4 Signální dráha řídící embryonální vývoj ledvin Gdnf je klíčový růstový faktor, který zprostředkovává růst a větvení UB (Hellmich et al., 1996; Sánchez et al., 1996; Pichel et al., 1996). Je exprimován MM a později také kondenzovaným
metanefrogenním
blastémem
a reaguje
s epiteliálními
buňkami
Wolfových vývodů a následně také UB prostřednictvím svého, zde sekretovaného, receptoru (Chi et al., 2009). Tím je tyrozinkinázový receptor Ret (Durbec et al., 1996; Trupp et al., 1996). Do signálního komplexu Ret-Gdnf byl dodatečně zahrnut také
22
koreceptor Ret, a to Gfrα1 (Jing et al., 1996). Tento buněčně povrchový receptor, vázaný pomocí glykosylfosfatidylinositolu (GPI), je exprimován, stejně jako Ret, ve Wolfových vývodech a UB, ale také v některých buňkách MM (Sainio et al., 1997). Gdnf vazbou na své receptory stimuluje nebližší buňky Wolfových vývodů k proliferaci a následně k formování UB. Pupen roste směrem k metanefrogennímu blastému zřejmě podle gradientu Gdnf. Ve chvíli, kdy doroste až do blastému, Gdnf podněcuje jeho dichotomické dělení ve dvě souměrné větve. V pozdějších stádiích vývoje ledvin je exprese Ret i Gfrα1 omezena na buňky špiček UB, kde Gdnf pokračuje v indukci růstu a větvení (Schuchardt et al., 1996; Sainio et al., 1997), (obr. 2). Tato signální dráha je pro normální růst a větvení UB zásadní, její podstata a to, jak je specifická reakce Wolfových vývodů a UB zprostředkována, není však zatím jasné.
Obr. 1.4. Formování UB a metanefrogenního blastému během fyziologického vývoje ledvin. Barevně jsou odlišeny oblasti exprese tří hlavních genů zapojených do nefrogeneze. Modře je znázorněna exprese Ret a Gfrα1, červeně Gdnf. Gfrα1 je sice exprimovaný také buňkami MM, signalizace během vývoje ledvin se však účastní pouze Gfrα1 exprimovaný UB (převzato z Constantini & Shakya, 2006). 1.3.4.1 GDNF/GFRA1/RET signalizace GFRA1 specificky váže svůj ligand, GDNF, a následně zprostředkovává vysoce-afinitní vazbu GDNF-GFRA1 komplexu se dvěma molekulami RET a poté je touto vazbou aktivován (obr. 3), (Jing et al., 1996; Vega et al., 1996; Arighi et al., 2005). Aktivování RET se projeví fosforylací klíčových tyrozinových zbytků (Y) v kinázové doméně RET,
23
čímž je nastartovaná intracelulární signalizace. Jeden ze zbytků, RET-Y905, stabilizuje aktivní konformaci kinázy a usnadňuje autofosforylaci dalších čtyř tyrozinových zbytků (RET-Y981, RET-Y1015, RET-Y1062 a RET-Y1096), které slouží jako vazebná místa pro intracelulární adaptory, jejichž navázání vede k aktivaci významných signálních drah. Fosforylovaný tyrozinový zbytek RET-Y905 je vazebným místem pro Grb7/10, RETY981 pro Src, RET-Y1015 pro PLCγ a RET-Y1096, který je přítomný pouze u isoformy RET51, váže Grb2. Fosforylací RET-Y1062 vzniká vazebné místo hned pro několik intracelulárních adaptorů či efektorových proteinů, včetně Shc, ShcC, FRS2, IRS1/2, Dok1, Dok4-6, Enigma, PKCα a Shank3. Po stimulaci ligandem se na fosforylovaný RETY1062 vážou nejméně dva proteinové komplexy prostřednictvím Shc adaptoru, Grb2/GAB vede k aktivaci PI3K/Akt, Grb2/Sos zase spouští MAPK kaskádu. Dráha PI3K/Akt může být také aktivována přímou vazbou Grb2/GAB komplexu na RET-Y1096. Hlavní dráhy aktivované prostřednictvím Src a PLCγ jsou RAS-MAPK a PKC (obr. 4). Tyto složité intracelulární signální dráhy regulují buněčné procesy jako proliferace, diferenciace,
migrace,
chemotaxe či regenerace v mnoha tkáňově specifických
zárodečných buňkách, včetně embryonálních ledvin (Sariola & Saarma, 2003; Arighi et al., 2005; Jain, 2009).
24
Obr. 1.5. GDNF/GFRA1/RET signalizace. Homodimer GDNF se váže na dvě molekuly GFRA1 a tento komplex následně dimerizuje a váže dvě molekuly Ret, což vede k jeho autofosforylaci a poté ke spuštění intracelulárních signálních kaskád (převzato z Sariola & Saarma, 2003).
Obr. 1.6. Podrobná struktura RET proteinu, včetně tří hlavních domén a dvou isoforem. Znázorněno je přesné umístění klíčových tyrozinových zbytků (Y) a konkrétní intracelulární adaptory a efektorové bílkoviny, které s nimi reagují. Podrobný popis signálních drah je v textu (Jain, 2009). 25
1.3.5 Mutace genů RET, GDNF a GFRA1 u pacientů s renální agenezí Přelomová studie Skinner et al., publikovaná v roce 2008, poprvé asociovala mutace v RET protoonkogenu s renální agenezí u člověka. Studie přináší analýzu genů RET, GDNF a GFRA1 u potracených plodů s vrozenou renální agenezí či závažnou dysplazií. Celkem bylo zkoumáno 33 plodů, z toho 29 s bilaterální či unilaterální agenezí a 4 s dysplazií ledvin. Mutace v RET protoonkogenu byly zjištěny v 7 z 19 případů s BRA (37%) a v 2 z 10 případů URA (20%), nejčastěji mutovaný byl exon 6 (4 případy). U jednoho z potracených plodů byly dokonce zjištěny dvě různé mutace RET. Celkem bylo rozpoznáno 10 odlišných sekvenčních variant, všechny z nich významně ovlivňovaly aktivaci RET. Buď k jeho fosforylaci vůbec nedocházelo, nebo byla konstitutivně aktivovaná. GDNF mutace byla identifikovaná pouze v jednom případě s URA, tento plod měl navíc dvě další RET mutace. Mutace GFRA1 nebyla pozorována u žádného z potracených plodů. Tato práce významně podpořila dlouho předpokládanou hypotézu, že gen RET se významně účastní abnormálního vývoje ledvin a je mutovaný u podstatného podílu pacientů s renální agenezí. Překvapivé byly naopak nízké frekvence GDNF a GFRA1 mutací, naznačující, že tyto geny jsou během vývoje ledvin nahraditelné. Výsledky další podobné studie, Jeanpierre et al. (2011), však častý výskyt RET a GDNF mutací u pacientů s vrozenými anomáliemi ledvin nepotvrdily. Analyzováno bylo 105 potracených plodů se závažnými oboustrannými defekty ledvin, včetně BRA (65 případů) a URA v kombinaci s jinými defekty kontralaterální ledviny (25). Zaznamenáno bylo 7 dříve nepopsaných variant kódující oblasti RET, tedy potenciálních mutací (6,6%), z toho 1 nonsense mutace, 4 missense mutace a dvě neutrální změny. Všechny varianty byly v heterozygotní konstituci a nebyly identifikovány u žádné ze 180 kontrol. Ve 4 ze 7 případů mutací byla navíc analyzována také DNA rodičů, ve všech případech byla stejná změna v heterozygotním stavu nalezena u zdravého otce. Žádná z těchto 4 mutací, včetně nonsense, nebyla tedy schopná sama o sobě vyvolat zmíněné defekty v renálním vývoji. V případě GDNF nebyla nalezena žádná mutace. Studie Jeanpierre et al. (2011) je tedy v rozporu se všemi dříve publikovanými analýzami (Pachnis et al., 1993; Schuchardt et al., 1994; Hellmich et al., 1996; Schuchardt et al., 1996; Sánchez et al., 1996; Skinner et al., 2008), které nasvědčují tomu, že mutace GDNF/RET signálního komplexu má na vznik renálních abnormalit zásadní vliv.
26
2. CÍLE PRÁCE · Provést molekulárně-genetickou analýzu genů RET a GDNF v souboru 20 pacientů s unilaterální renální agenezí · Popsat případné změny, mutace či polymorfizmy, v těchto dvou genech v daném souboru pacientů a na základě toho podpořit či naopak spíše vyvrátit jejich asociaci s renální agenezí u člověka · Shrnout dosavadní znalosti o renální agenezi a popsat její souvislosti s geny RET a GDNF, které jsou často zmiňovanými kandidátními geny pro toto onemocnění u člověka.
2.1 Hypotéza · Správná funkce genů RET a GDNF je pro fyziologický vývoj ledvin nezbytná Nepostradatelnost obou genů během renální organogeneze prokazují především mnohé studie vývoje ledvin u myší. Význam růstového faktoru Gdnf a jeho receptorů, tyrozinkinázového receptoru Ret, ale i GPI-vázaného proteinu Gfrα1 pro nefrogenezi naznačuje už fyziologický vzorec jejich exprese. Důležitost těchto genů během vývoje ledvin u myší je pak podpořena také faktem, že cílená inaktivace jakéhokoli z nich vede ke vzniku renální ageneze. Také studie na souboru potracených lidských plodů s bilaterální agenezí, kdy kauzální mutace RET protoonkogenu byla identifikována u 1/3 postižených embryí, podporuje význam regulační role tohoto genu během nefrogeneze. Vzhledem k těmto skutečnostem lze předpokládat zvýšenou frekvenci mutací genů RET a GDNF v souboru pacientů s renální agenezí.
27
3. MATERIÁL A METODY Praktická část této diplomové práce byla provedena v laboratoři molekulární diagnostiky Ústavu biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.
3.1 Materiál Jako genetický materiál byla použita genomická DNA vyizolovaná z periferní krve 20 pacientů s diagnostikovanou unilaterální renální agenezí. Vzorky byly získány při vyšetření těchto pacientů ve Fakultní nemocnici v Motole (2 pacienti), Všeobecné fakultní nemocnici v Praze (15 pacientů), Fakultní nemocnice Královské Vinohrady (2 pacienti) a Fakultní nemocnici v Ostravě (1 pacient) a to v období let 2007-2012. Izolace genomické DNA byla u všech vzorků provedena na lince QIAcube (Qiagen) pomocí kitu QIAamp DNA mini kit (250) a to z lymfocytů získaných z periferní krve. Všechny vzorky DNA byly tímto postupem vyizolovány v laboratoři molekulární diagnostiky Ústavu biologie a lékařské genetiky 1. LF a VFN. U všech pacientů byl před zařazením do studie zajištěn písemný informovaný souhlas s molekulárně genetickým vyšetřením. Kontrolní četnosti pro porovnání zastoupení jednotlivých alel poskytl Endokrinologický ústav v Praze.
3.2 Metody · PCR · Gelová elektroforéza · Sekvenační PCR · Přečištění produktu sekvenační PCR · Sekvenace · DGGE · MLPA Pro všechny kódující oblasti (exony) genů RET a GDNF byla nejprve provedena PCR amplifikace. Sekvenace příslušných primerů jsou v tabulce 3.1. PCR produkty byly dále analyzovány, v případě exonů 10, 11 a 13-16 genu RET byla provedena denaturační
28
gradientová gelová elektroforéza (DGGE), ostatní exony obou genů byly podrobeny přímé sekvenci.
3.2.1 PCR 3.2.1.1 Princip PCR reakce Polymerázová řetězová reakce je základní metodou molekulární genetiky. Pomocí specifických oligonukleotidů je vybrán konkrétní úsek DNA a ten je během PCR reakce, která je složená ze tří opakujících se teplotních cyklů, exponenciálně amplifikován. Z počátečního množství DNA o n kopiích tak na konci reakce např. o 30 cyklech dostáváme n x 230 kopií. Templátem pro reakci může přitom být i velmi malé množství DNA, teoreticky dokonce stačí jedna molekula. PCR obvykle sestává z 20-40 cyklů o třech krocích. Základním principem reakce je opakovaná řízená denaturace dvouřetězcové DNA (ds DNA), zpravidla při teplotě 92-95 °C a následná renaturace po snížení teploty na 45-70 °C, při které dojde k hybridizaci jednovláknové DNA (ss DNA) se specifickými oligonukleotidy, které jsou v reakční směsi v nadbytku. Přesná teplota renaturace, neboli annealingu, závisí na konkrétní délce a složení oligonukleotidů, které následně slouží jako primery pro syntézu nového řetězce DNA. K syntéze dochází při posledním kroku, tzv. extenzi, která probíhá při teplotě 72 °C, což je optimum pro taq polymerázu, z volných nukleotidů. Podrobné schéma PCR reakce je na obrázku 3.1.
3.2.1.2 Komponenty PCR reakce · DNA templát (DNA vyizolovaná z periferní krve pacientů s renální agenezí) · Oligonukleotidy (primery), naředěny na koncentraci 10 pmol/μl (firma Genery Biotech) · Termostabilní Taq DNA polymeráza / Platinum ® Pfx DNA polymeráza (Fermentas / Invitrogen) · Taq pufr / Pfx Amlification pufr (Fermentas / Invitrogen) · 25 mM MgCl2 / MgSO4 (Fermentas / Invitrogen)
29
· Deoxynukleotidtrifosfáty deoxyguanozintrifosfát
(dNTP):
deoxyadenozintrifosfát
(dATP),
(dGTP),
deoxycytozintrifosfát
(dCTP),
deoxytyminozintrifosfát (dTTP), (Fermentas) · DMSO / Enhancer (MP Biomedicals / Invitrogen) · Voda (Braun Medical)
30
Obr. 3.1. Schéma průběhu PCR reakce (převzato z http://fmel.ifas.ufl.edu/buzz/csPCR.shtml)
31
GEN
EXON
RET
1
RET
2
RET
3
RET
4
RET
5
RET
6
RET
7
RET
8
RET
9
PRIMER (Forward (5‘-3‘) / Reverse (5‘-3‘)) F: GCACCCGCCATCCAGACCC R: GAGCCGGCGGCCGGCAGAAC F: CCATATTCTCACCATCCCTC R: AGTGTCAGCGGCTGTGATAA F: GGCCGATGCCCCCACAGACCT R: AAGACCAGCAGTAGCAGGCA F: GCCCCTGTCTGCTTGGTG R: GGACACTAAACCGACCGAG F: ACTGACCAACGCCCTCTGC R: GCACCTCATTTCCTGGGGG F: ATTGTTGTGCCCCTACCTG R: CCCCAGACAGGCAATAGGTA F: TCTACCCTCAGGCCATTACA R: GCTCCCAGACCCCGACCCT F: CTGGTGCTGTTCCCTGTCC R: CCACCGGTGCCATCGCCCCT F: AGTCTGCTGTGTGTCCTGTG R: CCATGCCCTGATTAAACCCT
ROZSAH (bp) 166
387
373
342
275
251
367
262
160
F: AGGCTGAGTGGGCTACGTCT RET
10
R: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCC GCCCGTTTTTTTTTTAGATGTGCTGTTGAGACCTC
252
F: CTCTGCGGTGCCAAGCCTCA RET
11
RET
12
RET
13
R: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC CCG CCCGGAGTAGCTGACCGGGAAGG F: TCTTCTCCCCCTTCCCTCAT R: GCCCCGGAGACTCCCCCAG F: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC CCG CCCGGAACTTGGGCAAGGCGATGC R: ACCTCACCCTGCAGCTGGC
32
262
225
272
F: GAAGACCCAAGCTGCCTGAC RET
14
RET
15
R: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCC CGCCCGGCTGGGTGCAGAGCCATATG F: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCC CGCCCGTTTTTTTTCATGGCCTGACGACTCGTGC
314
241
R: CCTGGGAGCCCCGCCTCATC RET
16
F: CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCC CCGCCCGAGGGATAGGGCCTGGGCTTC
135
R: ACCCCAAGAGAGCAACACCC RET
17
RET
18
RET
19
RET
20
GDNF
1
GDNF
2
GDNF
3
F: CACTGGTCCTTCACTCTCT R: GGGAGGGAATGCACACAGAT F: CTGTGGTGGGCTGTCCTTCTG R: CTGGGGTGAGGCTGGAGTCT F: AGTGACCGGCCATCTCTGT R: ATAGTGCAGAGGGGACAGC F: AGTTTTGGTTCTTCAGTGC R: GACTTTCCATTCTCAGCAT F: GAACTCTTGCCCCTGACC R: CGGAGACCCGATCCGAG F: AAGATGAGGTTATGGGATGTCGTGG R: CGCCCTTCGCGCTGAGCAGTG F: TATGCCAGAGGATTATCCTGATCAG R: GTCACTGACTTGGGTCTGGGCTA
231
234
229
266
130
150
246
Tab 3.1. Seznam primerů navržených pro jednotlivé exony genu RET a GDNF. Primery pro exony 10, 11, 13, 14, 15, 16 genu RET jsou navržené pomocí primeru3 a obsahují CG svorky pro následné použití DGGE. Primery pro zbylé exony RET převzaty z Ceccherini et al. (1994), primery pro všechny exony genu GDNF převzaty z Grimm et al. (1998). Správnost sekvence jednotlivých primerů ověřena pomocí databáze NCBI, jedinečnost navržených primerů pomocí databáze BLAST.
33
3.2.1.3 Optimalizace PCR reakce Pro získání jediného produktu bylo nutné provést optimalizaci PCR reakce. Ta byla provedena pomocí gradientové PCR, kdy pro stejný vzorek byla použita různá teplota annealingu, a to od 55-65 °C. Korigována byla také koncentrace MgCl2, použito bylo 1, 2 a případně také 3 μl 25 mM MgCl2 na jednu rekci. 3.2.1.4 Příprava vzorků Do 0,5 ml mikrozkumavky bylo napipetováno příslušné množství (podle počtu reakcí) vody, pufru, MgCl2, dNTP, primerů a na závěr polymerázy (konkrétní reakční směsi jsou uvedeny v tabulce 3.2.). Takto připravený master mix (mm) byl promíchán pomocí vortexu (GILSON) a rozpipetován do jednotlivých 0,2 ml mikrozkumavek, do kterých bylo posléze přidáno příslušné množství DNA templátu. Připravené mikrozkumavky byly vloženy do termocycleru MyCycler (Bio-Rad Laboratories), kde proběhla za specifického teplotního režimu PCR amplifikace (konkrétní teplotní režimy jsou v tabulce 3.3.). Reakční složka
H2 O
Množství (μl)
Exon
10
RET 14
17,2
RET 13
17,45
RET 10, 15
17,6
RET 11
17,95
RET 16
18,6
GDNF 1, 2, 3; RET 1-10, 12, 17-20 2,5
Taq pufr
MgCl2 / MgSO4
dNTP
0,5
RET 11, 15
0,75
RET 10, 13, 16
1
GDNF 1, 2, 3; RET 1, 4, 7, 12, 17
1,5
RET 18, 19, 20
2
RET 2, 3, 5, 6, 8, 9, 19
2,5
RET 14
0,5
ostatní
0,75
RET 15
2,5
RET 14
34
Reakční složka
DMSO/enhancer
Přímy primer
Zpětný primer
Taq polymeráza / DNA platina
DNA templát
Množství (μl)
Exon
1
RET 16
1,25
RET 10, 11, 13
2,5
RET 15
3
RET 14
0,5
RET 15, 13, 16
1
RET 10, 11, 14
0,25
RET 10, 11
0,5
RET 15, 16
1
RET 13, 14
0,3
Ostatní
1
RET 14
1
Ostatní
2
RET 10, 11
Tab. 3.2. Množství jednotlivých složek PCR reakce v jedné reakční směsi. DMSO byl použit jen v případě exonů 10, 11, 13, 14 a 16 genu RET, a to pro zamezení tvorby sekundárních struktur a větší specifitu reakce. V exonu RET 15 byla použita DNA platina, enhancer a MgSO4 namísto MgCl2. Teplotní režimy Krok
Teplota (°C)
Čas (min)
1. Iniciační denaturace
94
2
2. Denaturace
94
3. Annealing
4. Elongace
00:45
Ostatní
00:15
RET 10, 11, 14, 15
1
Ostatní
00:40
RET 13, 16
00:30
RET 10, 11, 14, 15
55
GDNF 3, RET 15, 17, 18, 19
57
RET 6, 8, 9, 16
58
RET 2
59
RET 10, 11
60
GDNF 1, 2; RET 1, 4, 7, 12-14, 20
65
RET 1, 3, 5
68
RET 14, 15
00:45
Ostatní
72
Ostatní
00:30
RET 14
35
5. Terminační elongace
68
RET 14, 15
1
RET 14
72
Ostatní
5
Ostatní
6. Zchlazení
4
∞
Tab. 3.3. Shrnutí teplotních režimů PCR amplifikace pro jednotlivé exony. Kroky 2-4 byly opakovány: 30x v případě exonů 1-6, 8, 9, 17-20 genu RET 33x pro exony 7 a 12 genu RET a exonu 3 genu GDNF 35x pro exony 10, 11, 13, 15, 16 genu RET 37 x pro exon 14 genu RET
3.2.2 Gelová elektroforéza Po každé PCR reakci byla provedena kontrolní elektroforéza amplifikovaného fragmentu. Do jamek 2% agarózového gelu byly naneseny 3 μl bromfenolové modři spolu s 5 μl PCR amplifikátu, předem smíchané v mikrotitrační destičce, a to včetně negativní kontroly (PCR reakce bez DNA templátu). Do poslední jamky byl pak nanesen velikostní marker, 100 bp ladder (firma Fermantas). Celý gel pak byl přenesen do elektroforetické vany naplněné TBE pufrem a vystaven konstantnímu napětí 150V. PCR produkty byly nakonec vizualizovaný UV transluminátorem. Elektroforetickou analýzou bylo ověřeno jak množství a velikost amplifikovaného fragmentu, tak specifita a úspěšnost celé reakce.
3.2.3 Sekvenační PCR Sekvenační PCR reakce byla prováděna v termocycleru MyCycler (Bio-Rad Laboratories). Používaný teplotní režim je v tabulce 3.4. Reakční směs obsahovala sekvenační kit BigDye® Terminator v1.1 (Applied Biosystems), vodu (Braun Medical), forward či reverse primer (o koncentraci 10 pmol/μl) a PCR produkt. Pro každý exon tak byly provedeny 2 reakce, jedna s přímým a druhá se zpětným primerem. Reakční směs je upřesněna v tabulce 3.5.
36
Krok
Teplota (°C)
Čas (min)
Opakování
Iniciační deneturace
96
3
1x
Denaturace
96
00:20
Annealing
50
00:10
Elongace
60
4
Terminační elongace
60
1
1x
Zchlazení
4
∞
1x
25x
Tab. 3.4. Teplotní režim, používaný pro sekvenační PCR reakci
Reakční složka
Množství (μl)
H2O
2,4
Primer F/R
0,3
Sekvenační kit
2
PCR produkt
0,3
Tab. 3.5. Množství jednotlivých složek sekvenační PCR reakce pro výsledný objem 5 μl vzorku
3.2.4 Přečištění produktu sekvenační PCR Pro čištění produktu sekvenční PCR reakce byla vždy použita etanolová precipitace. K 5 μl produktu bylo přidáno 13 μl čerstvě připravené směsi 96% etanolu (12,5 μl) a octanu sodného (0,5 μl). Výsledná směs se nechala nejprve 10-15 min odstát při laboratorní teplotě a poté byla centrifugována 30 min při 14500 rpm. Celý obsah zkumavky, kromě usazeného zbytku na dně, byl následně odstříknut a bylo přidáno 60 μl 70% etanolu. Následovala další centrifugace 10 min při 14500 rpm a znovu odstříknutí neusazeného obsahu zkumavky. Poslední tři kroky byly ještě jednou zopakovány a poté se vzorky nechaly cca 10 min sušit při 40 °C. Po dokonalém vysušení zkumavek bylo přidáno 30 μl formamidu a vzorky se denaturovaly při 95 °C po dobu 5 min. Vzápětí byly zkumavky přeneseny do chladícího stojánku.
37
3.2.5 Sekvenace Sekvenace byla prováděna pracovníky laboratoře molekulární diagnostiky Ústavu biologie a lékařské genetiky 1.LF a VFN na sekvenátoru Genetic Analyzer 3130 (Applied Biosystems) metodou Dye-terminator sequencing. Sekvenace vzorků byly v podobě chromatogramu kontrolovány ručně příp. s použitím
programu
BioEdit
a
porovnány
s referenční
sekvencí
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NG_007489.1).
3.2.6 DGGE 3.2.6.1 Princip DGGE Denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) je velmi citlivá metoda, která umožňuje separaci DNA molekul v polyakrylamidovém gelu na základě odlišné sekvence. Tato metoda dokáže zachytit i jednonukleotidové rozdíly v sekvenci, používá se proto i k zjišťování bodových mutací. Rychlost putování dsDNA v elektrickém poli je určená její molekulovou hmotností. Při DGGE se využívá zvyšující se koncentrace denaturujících látek (formamid a urea) pro oddělení ds DNA. Při určité koncentraci těchto denaturujících látek dojde k rozdělení dsDNA vláken na jednovláknové molekuly, čímž se výrazně změní jejich pohyblivost. Rychlost denaturace přitom závisí na počtu vodíkových vazeb, snáze proto dojde k oddělení AT než CG párů. Primery pro PRC amplifikaci, předcházející DGGE, se navrhují s tzv. CG svorkami, aby nedocházelo k úplnému oddělení ds DNA, úplně oddělené ssDNA by totiž při následné detekci byly neostré. 3.2.6.2 Komponenty pro DGGE · Roztok akrylamidu (AA) a bisakrylamidu (BAA) v poměru 29:1 (SERVA) · Formamid · Urea (Fluka) · TEMED (MP Biomedicals) · APS (MP Biomedicals) · PCR amplifikát · Barva na DGGE (roztok 50% sacharózy (SERVA) a 6x Orange Loading Dye solution (Fermentas)) · Pufr TAE (roztok Tris, kyseliny octové a EDTA; vše SERVA)
38
· Ethidiumbromid (Fluka) 3.2.6.3 Příprava gelu pro DGGE Nejprve byly připraveny roztoky AA/BAA o příslušných koncentracích denaturujících látek. Žádoucí koncentrace se docílí smícháním roztoků 100% a 0% akrylamidu v příslušném poměru. 100% roztok akrylamidu obsahuje AA a BAA v poměru 29:1, formamid, ureu a 50x TEA pufr. V 0% roztoku denaturující látky chybí. Do připravených roztoků byl přidán TEMED a APS, které slouží jako polymerizační činidla a za stálého míchání byly roztoky nality pomocí jehly mezi skla aparatury pro DGGE. Nejprve se vlévá roztok o vyšší koncentraci, poté směs obou roztoků a nakonec roztok o nižší koncentraci, aby vznikl gel o příslušném gradientu s vyšší koncentrací denaturujících látek ve spodní části gelu. Gel tuhl přes noc při pokojové teplotě. Gradienty použité pro exony genu RET jsou v tabulce 3.6. Exon
Gradient
Doba denaturace (hod)
RET 10
40%-80%
4
RET 11
40%-80%
4
RET 13
40%-80%
5
RET 14
45%-85%
6
RET 15
40%-80%
5
RET 16
20%-60%
5,5
Tab. 3.6. Gradienty akrylamidových roztoků použité pro denaturaci amplifikovaných exonů 10, 11, 13 - 16 genu RET spolu s časovým vymezením reakce.
3.2.6.4 Vlastní DGGE Do jamek v polyakrylamidovém gelu bylo naneseno 15 μl produktu předchozí PCR amplifikace spolu s 8 μl barvičky. Následně byla celá aparatura přenesena do vany s TEA pufrem, vyhřátým na 65 °C, kde byl gel se vzorky vystaven konstantnímu napětí 150V po stanovený čas. Poté byl gel na 10 minut ponořen do 0,1% roztoku ethidiumbromidu a následně byly denaturované molekuly DNA vizualizovány UV transluminátorem.
39
3.2.7 MLPA 3.2.7.1 Princip MLPA Principem této metody je multiplexová PCR využívající jednoho páru univerzálních primerů k amplifikaci sond, hybridizovaných k cílové sekvenci a následně zligovaných. Používá se k detekování numerických změn a je schopná rozlišit sekvence lišící se v jednom nukleotidu. Produkty amplifikace, o délce 130 až 480 nukleotidů, jsou následně rozděleny podle velikosti, a to pomocí kapilární elektroforézy. Takto rozdělené produkty jsou nakonec analyzovány speciálním počítačovým programem. V našem případě byl použit program COOFFALYSER, volně dostupný na mlpa.com. Schéma průběhu MLPA amplifikace je na obrázku 3.2.
3.2.7.2 Komponenty pro MLPA · DNA templát · Voda (Braun Medical) · Sada pro MLPA amplifikaci od MRC – Holland MLPA®: o
SALSA Probe-mix
o MPLA pufr o Ligase-65 pufr A o Ligase-65 pufr B o Ligase-65 o 10x SALSA PCR pufr o SALSA PCR primery o SALSA Enyzm Dilution pufr o SALSA polymeráza 3.2.7.3 Průběh MLPA MLPA probíhá ve třech krocích. · 1,5 μl DNA spolu s 1 μl H2O se nechá denaturovat 5 min při 98 °C, poté se roztok zchladí na 25 °C a ke každému vzorku se přidá 0,75 μl SALSA Probe mix a 0,75 μl MLPA pufru. Následuje inkubace 1 min při 95 °C a poté 16 hodin při 60 °C, během které hybridizují sondy.
40
· Následuje ligační reakce: teplota cycleru se sníží na 54 °C a přidá se 16 μl směsi Ligase 65 (1,5 μl Ligase-65 A a B pufru, 12,5 μl H2O a 0,5 μl Ligase-65), která se před použitím uchovává na ledu. Poté se vzorky inkubují 15 min při 54 °C a následně 5 min při 98 °C. · Posledním krokem je PCR reakce. Smíchají se 2 μl 10x SALSA PCR pufru, 13 μl H2O a 5 μl produktu legační reakce. Takto připravený roztok se zahřeje na 60 °C a při této teplotě se přidá 5 μl polymerázové směsi (1 μl SALSA PCR primery, 1 μl SALSA Enzyme Dilution pufr, 2,75 μl H2O a 0,25 μl SALSA polymerázy). Celá směs se promíchá a spustí se PCR reakce (35 cyklů). o Podmínky PCR:
Denaturace: 95 °C / 30 s Annealing: 60 °C / 30 s Elongace: 72 °C / 60 s Závěrečná elongace: 72 °C / 20 min
Obr. 3.2. Schéma základních kroků MLPA amplifikace (převzato z mlpa.com)
41
4. Výsledky V rámci této diplomové práce byla provedena mutační analýza genů RET a GDNF v souboru 20 pacientů s unilaterální renální agenezí. Postup při praktickém zpracovávání práce byl následující. Nejprve byla pro všechny exony obou genů provedena optimalizace PCR reakce, a to pomocí gradientové PCR. Všech 20 exonů genu RET i 3 exony genu GDNF byly následně za optimálních podmínek amplifikovány pomocí PCR a podrobeny další analýze. V případě exonů 10, 11, 13 – 16 genu RET byla provedena DGGE, ostatní exony genu RET a všechny exony genu GDNF byly osekvenovány v obou směrech a následně porovnány s referenční sekvencí. Pro analýzu numerických změn jsme použili metodu MLPA.
4.1 Optimalizace PCR Pro všechny kódující oblasti genu RET i GDNF byla úspěšně provedena optimalizace PCR reakce. Vizualizace gradientové PCR a následné PCR exonu 5 genu RET za optimálních podmínek jsou na obrázku 4.1. a 4.2.
Obr. 4.1. Gradientová PCR 5. exonu genu RET. Bylo použito rozmezí teplot od 55-65 °C a dvě různé koncentrace Mg. V pravé části obrázku jsou zobrazeny amplifikáty po reakci s použitím 2μl, v levé pak 1μl 25 mM MgCl2.
42
Obr. 4.2. Vizualizace specificky amplifikovaného exonu 5 genu RET u několika pacientů. Produkt má velikost 275bp.
4.2 Zjištěné polymorfizmy Analýzou všech vzorků byly nalezeny tři popsané jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), a to v exonu 7 (rs1800860), v exonu 13 (rs1800861) a v exonu 15 (1800863) genu RET. Podle databáze dbSNP NCBI se ve všech případech jedná o časté varianty s frekvencí minoritní alely v populaci přesahující 10%. Přehledné zobrazení genotypů všech nalezených polymorfizmů je v grafu 4.1. Žádná popsaná patogenní mutace nebyla identifikována.
43
Graf 4.1. Zastoupení genotypů nalezených polymorfizmů rs1800860, rs1800861 a rs1800863. Počet případů je rozdělen mezi muže a ženy. Genotyp GG polymorfizmu 1800863 nebyl identifikován.
4.2.1 RET (rs1800860) V případě polymorfizmu rs1800860 se jedná o záměnu A za G v pozici 432 (GCG-GCA; Ala-Ala). Minoritní alela A se přitom vyskytuje v populaci s frekvencí 25%. Tento polymorfizmus byl identifikován na základě sekvenací, a to u 11 pacientů z celkových 20, z toho ve 2 případech v homozygotním stavu. Zastoupené genotypy jsou v tabulce 4.1. Na obrázku 4.3. jsou zobrazeny výseky forward, na obrázku 4.4. pak reverse sekvenací pacientů se záměnou A za G, jak v homozygotním, tak v heterozygotním stavu. Pro porovnání je uveden také vzorek bez záměny. Genotyp
Počet případů
Alela
GG
GA
AA
G
A
9
9
2
27
13
Tab. 4.1. Zastoupení genotypů a alel polymorfizmu RET rs1800860
44
Obr. 4.3. Zobrazeny jsou všechny alelické formy polymorfizmu rs1800860 v 7. exonu genu RET. Na 1. obrázku je ukázán pacient s majoritní alelou G v homozygotním stavu, na 2. obrázku je G/A heterozygot, na 3. obrázku je pak pacient s homozygotní záměnou G→A v pozici 432.
Obr. 4.4. Výseky z reverse sekvenací pacientů s různými genotypy v pozici 432 polymorfizmu rs1800860. Na 1. obrázku je homozygot pro majoritní alelu, na 2. heterozygot a na 3. homozygot pro alelu minoritní.
4.2.2 RET (rs1800861) Při polymorfizmu rs1800861 dochází k záměně G za T v pozici 769 (CTT–CTG; LeuLeu). Alela G se vyskytuje v populaci s frekvencí 20%. Tato varianta byla detekována prostřednictvím DGGE, a to v 6 případech z 20, v 1 případě se jednalo o homozygota pro minoritní alelu. Přítomnost polymorfizmu byla následně potvrzena také sekvenací příslušného exonu. Zastoupené genotypy jsou v tabulce 4.2. Vizualizace exonu 13 po DGGE je na obrázku 4.5., na obrázku 4.6. je pak pro porovnání exon 11 bez mutací či 45
polymorfizmů. Na obrázku 4.7. je zobrazena nalezená substituce v pozice 769 po následné sekvenaci. Genotyp
Počet případů
Alela
TT
TG
GG
T
G
14
5
1
33
7
Tab. 4.2. Zastoupení genotypů a alel polymorfizmu RET rs1800861
Obr. 4.5. Vizualizace exonu 13 genu RET po DGGE. Dráha 1 poukazuje na homozygota pro alelu G, dráha 5 a 6 na heterozygoty TG. V ostatních dráhách jsou homozygoti pro alelu T polymorfizmu rs1800861.
Obr. 4.6. Vizualizace exonu 11 genu RET po DGGE. U žádného vzorku v našem souboru nebyla detekována změna.
46
Obr. 4.7. Zobrazeny jsou všechny nalezené alelické formy polymorfizmu rs1800861 v 13. exonu genu RET. Na 1. obrázku je homozygot pro majoritní alelu T, na 2. heterozygot T/G a na 3. homozygot pro minoritní alelu G.
4.2.3 RET (rs1800863) V případě polymorfizmu rs1800863 se jedná o záměnu G za C v pozici 904 (TCC-TCG; Ser-Ser). Výskyt minoritní alely G v populaci dosahuje frekvence 12%. Polymorfizmus rs1800863 byl identifikován na základě DGGE a poté potvrzen sekvencí. Vyskytoval se u 5 pacientů z celkových 20, pokaždé v heterozygotní konstituci. Zastoupené genotypy jsou v tabulce 4.3. Zobrazení 15. exonu po DGGE je na obrázku 4.8., po následné sekvenaci na obrázku 4.9.
Genotyp
Počet případů
Alela
CC
CG
GG
C
G
15
5
0
35
5
Tab. 4.3. Zastoupení genotypů a alel polymorfizmu RET rs1800863
47
Obr. 4.8. Vizualizace exonu 15 po DGGE. V dráze 3, 6, 8 a 9 jsou heterozygoti (CG), v ostatních drahách jsou homozygoti pro alelu C polymorfizmu rs1800863.
Obr. 4.9. Zobrazení nalezených alelických forem polymorfizmu rs1800863 v 15. exonu genu RET. Na prvním obrázku je homozygot pro majoritní alelu C, na 2. pak C/G heterozygot.
4.3 Výsledky MLPA Všech 20 pacientů bylo pro identifikaci případných numerických změn podrobeno analýze MLPA. U žádného z pacientů nebyla nalezena žádná odchylka oproti kontrolním vzorkům. Ukázky výstupů po fragmentační analýze jsou na obrázku 4.10.
48
Obr. 4.10. Počítačové vyhodnocení fragmentační analýzy po MLPA amplifikaci. Profily dvou vybraných pacientů (v horní části obrázku) jsou zde porovnané s kontrolou (v dolní části). Jednotlivé píky odpovídají produktům o konkrétní velikosti, plocha píků pak koresponduje s množstvím amplifikátů o stejné velikosti. Je patrné, že počet i velikost píků je stejná u obou uvedených pacientů jako u kontroly.
4.4 Statistické vyhodnocení Nejprve bylo pomocí exaktního testu (Wigginton et al., 2005) zjišťováno, jestli jsou obě námi srovnávané populace, tedy skupiny pacientů a kontrol, v Hardyho-Weinbergově rovnováze (HW), přičemž hladina významnosti (α) byla stanovena 0,05. H0 – Zkoumaná populace je v HW rovnováze H1 – Zkoumaná populace není v HW rovnováze Pro všechny nalezené polymorfizmy byly vypočteny také hodnoty P (tab. 4.4. a 4.5.), které nám nepřímo udávají sílu důkazů proti nulové hypotéze. Nakonec byly vyhodnoceny rozdíly v četnostech alel jednotlivých polymorfizmů mezi souborem pacientů a kontrol pomocí asociačního testu, včetně výpočtu hodnot OR (odds ratio), které nám porovnávají pravděpodobnost výskytu jednotlivých variant u obou srovnávaných skupin (tab. 4.5.).
49
Pokud je OR > 1, pravděpodobnost výskytu minoritní alely je vyšší u pacientů, v případě že je OR < 1, pravděpodobnost stejného jevu je vyšší u kontrol. H0 – Minoritní alela je přítomna ve stejné míře u obou skupin H1 – Minoritní alela není přítomna ve stejné míře u obou skupin Pro všechny výpočty byl použit program PLINK, který popisuje Purcell et al. (2007). Chr.
SNP
Skupina
Alela 1 Alela 2
Četnosti O (HET) E (HET) P genotypů 25/102/98 0,4533 0,4474 0,8827
10
1800860 Pacienti + kontroly
A
G
10
1800860
Pacienti
A
G
2/9/9
0,45
0,4388
1
10
1800860
Kontroly
A
G
23/93/89
0,4537
0,4482
1
10
1800861 Pacienti + kontroly
G
T
7/81/137
0,36
0,3331
0,3156
10
1800861
Pacienti
G
T
1/5/14
0,25
0,2888
0,4678
10
1800861
Kontroly
G
T
6/76/123
0,3707
0,3371
0,2128
10
1800863 Pacienti + kontroly
G
C
14/71/140
0,3156
0,3432
0,243
10
1800863
Pacienti
G
C
0/5/15
0,25
0,2188
1
10
1800863
Kontroly
G
C
14/66/125
0,322
0,3534
0,2336
Tab. 4.4. V tabulce jsou uvedena zastoupení jednotlivých genotypů nalezených polymorfizmů rs1800860, rs1800861 a rs1800863, a to ve formátu: homozygoti pro alelu 1 / heterozygoti / homozygoti pro alelu 2. Dále jsou uvedeny vypočtené hodnoty pozorované heterozygozity (O(HET)) a heterozygozity očekávané (E(HET)) a také hodnoty P exaktního testu. Alela 1 udává minoritní, alela 2 pak majoritní alelu pro všechny polymorfizmy. Chr. značí číslo chromozomu, na kterém se nachází všechny zkoumané polymorfizmy.
Vypočtené hodnoty P jsou ve všech případech vyšší než stanovená hladina významnosti 0,05 a proto nemůžeme vyvrátit H0. Lze tedy říci, že obě porovnávané skupiny jsou z hlediska genotypových zastoupení všech tří zkoumaných polymorfizmů v HW rovnováze.
50
SNP
A1
FA1 u kontrol 0,339
A2
A
FA1 u pacientů 0,325
1800860 1800861
G
0,175
1800863
G
0,125
2
FA2 u kontrol 0,661
X
P
OR
G
FA2 u pacientů 0,675
0,03205
0,8579
0,9387
0,2146
T
0,825
0,7854
0,3438
0,5577
0,7762
0,2293
C
0,875
0,7707
2,309
0,1286
0,4802
Tab. 4.5. V tabulce jsou frekvence minoritních (FA1) a majoritních (FA2) alel všech nalezených polymorfizmů, jak pro skupinu pacientů, tak pro kontroly. Uvedeny jsou také hodnoty X2, P hodnoty X2 testu a také OR.
Na základě asociačního testu s hladinou významnosti 0,05 lze říci, že rozdíly mezi frekvencemi alel obou porovnávaných souborů byly pro všechny zkoumané polymorfizmy statisticky nevýznamné (P > 0,05). Pravděpodobnost výskytu minoritní alely G v polymorfizmu 1800863 je sice u kontrol oproti pacientům mírně zvýšená (P = 0,1286; OR = 0,4802), o statisticky významný rozdíl se však nejedná (P > 0,05). Příčinou toho, že jsme ani v tomto případě neprokázali statisticky významný rozdíl, může být malá velikost zkoumaného souboru pacientů. Proto by bylo nutné zkoumany vzorek rozšířit.
51
5. Diskuze V souboru 20 pacientů s unilaterální renální agenezí byla provedena mutační analýza dvou kandidátních genů, které se mohou podílet na vzniku tohoto onemocnění u člověka, a to genů pro tyrozinkinázový receptor RET a růstový faktor GDNF. Hlavním cílem této práce pak bylo identifikovat případné mutace v obou genech a na základě toho se pokusit definovat možnou roli těchto dvou genů pro vznik ageneze ledvin. Zjištěny byly 3 již dříve popsané jednobodové polymorfizmy, z nichž ani jeden nemění smysl aminokyseliny. Nebyla nalezena žádná mutace, kterou můžeme považovat za kauzální. Tato diplomová práce tedy nepotvrdila dříve předpokládanou myšlenku o zvýšeném množství mutací genů RET a GDNF u pacientů s renální agenezí a nemůže tedy ani podpořit jejich asociaci.
5.1 Souvislosti vybranných genů s agenezí ledvin Geny RET a GDNF byly pro tuto diplomovou práci vybrány z poměrně široké skupiny kandidátních genů pro renální agenezi u člověka hned z několika důvodů. Oba geny, a to jak z hlediska exprese, tak vzájemné interakce, byly intenzivně studovány především na modelu myší nefrogeneze. Odtud také vychází většina argumentů pro jejich zařazení mezi kandidátní geny pro agenezi u člověka. Už vzorec exprese Ret a Gdnf, tedy myších analogů vybraných genů, během fyziologické nefrogeneze naznačuje důležitost jejich úlohy pro celý proces vývoje ledvin. Expresi obou genů lze zaznamenat hned v počátcích nefrogeneze, každý z nich je však specifický pro jinou ze dvou esenciálních tkání, ze kterých se diferencují budoucí ledviny. Tyrozinkinázový receptor Ret je exprimován v ureterálním pupenu, zatímco růstový faktor Gdnf v metanefrickém mezenchymu. Exprese obou genů je omezena na příslušnou tkáň po celé období vývoje ledvin a vždy odpovídá oblastem s aktuálně nejintenzivnějším růstem. Jak již bylo popsáno v úvodu, vývoj ledvin je poměrně složitý děj, jehož základem je série reciprokých induktivních interakcí právě mezi ureterálním pupenem a metanefrickým mezenchymem. Jakékoli narušení těchto interakcí pak vede k abnormálnímu vývoji ledvin. Na základě toho, jak je popsána exprese Ret a Gdnf během myší nefrogeneze z časového i prostorového hlediska a také toho, že jejich produkty fungují jako receptor a ligand, lze
52
předpokládat, že právě tyto dva geny řídí interakce UB a MM. Chyby na úrovni komunikace Ret a Gdnf by tedy měly vést k narušení těchto reciprokých interakcí, a tím pádem také k různým defektům ledvin. Tento předpoklad byl potvrzen hned několika studiemi cíleného knock-outu těchto dvou genů, ať už byl homozygotní mutací zasažen gen Ret nebo Gdnf, postižené myši umíraly záhy po narození z důvodu renální ageneze či závažné dysgeneze. Všechna tato zjištění, která byla díky studiu myší nefrogeneze v souvislosti s geny Ret a Gdnf popsána, jasně definují roli obou genů jako důležitých signálních molekul nepostradatelných pro vývoj ledvin u myší a zároveň naznačují jejich potenciální obdobný význam pro lidskou nefrogenezi. Není tedy divu, že na základě těchto argumentů sílila snaha prozkoumat geny RET a GDNF také u lidských pacientů s agenezí ledvin. Dosud však byly publikovány pouze dvě zahraniční studie, a to Skinner et al. (2008) a Jeanpierre et al. (2011), které se zabývají analýzou mutací těchto dvou genů v souborech pacientů s renální agenezí, ať už unilaterální či bilaterální. Výsledky těchto studií jsou však protichůdné. Zatímco Skinner et al. (2008) potvrzuje předpoklad zvýšeného výskytu mutací u postižených pacientů alespoň v případě genu RET, novější studie Jeanpierre et al. (2011) význam obou zmíněných genů pro vznik onemocnění popírá.
5.2 Geny RET a GDNF u pacientů s renální agenezí Rozpor mezi studií Skinner et al. (2008), která zaznamenala mutace RET protoonkogenu u 1/3 potracených plodů s renální agenezí a výsledky studie Jeanpierre et al., (2011), které, stejně jako v případě této diplomové práce, nepotvrdily zvýšený výskyt mutací tohoto genu v souboru pacientů se stejným onemocněním, může být způsoben několika faktory. Všechny tři práce se v první řadě liší velikostí zkoumaného souboru pacientů. Zatímco tato práce zahrnuje skupinu o 20 pacientech a studie Skinner et al. (2008) o 29 pacientech, v případě Jeanpierre et al. (2011) se jedná o širší studii, zabývající se hned 90 případy. Výsledky takto rozsáhlého projektu mají pochopitelně vyšší výpovědní hodnotu, nedochází totiž k tak významnému zkreslení výsledků, jako v případě malých souborů. Obě zahraniční studie se navíc zabývají soubory potracených plodů, postižených závažnými oboustrannými defekty ledvin, a to buď BRA nebo URA v kombinaci s jinou malformací kontralaterální ledviny, které byly zároveň vyhodnoceny jako příčina 53
předčasného úmrtí těchto plodů. Tato diplomová práce se naproti tomu zaměřuje na skupinu pacientů s jednostrannou renální agenezí. Tato forma onemocnění pochopitelně není tak závažná, někteří ze zařazených pacientů byli dokonce úplně bez symptomů a diagnostikováni náhodně na základě vyšetření zobrazovacími metodami. Je jasné, že v případě oboustranných malformací ledvin, které jsou neslučitelné se životem, je pravděpodobnost nějaké dysbalance na genetické úrovni vyšší než je tomu u unilaterální ageneze. Studie Jeanpierre et al. (2011) navíc zahrnuje 21 případů pocházejících z rodin, kde se již nějaká renální abnormalita vyskytla, což napovídá o genetickém podkladu onemocnění. Přesto však tato práce nezaznamenala zvýšený výskyt mutací ve zkoumaných kandidátních genech u postižených plodů, identifikováno bylo pouze 6 potenciálních mutací v genu RET, z toho ve třech případech byla stejná varianta přítomna také u zdravého otce. Náš soubor pak zahrnoval jen 2 pacienty s výskytem onemocnění v rodině. Určitý vliv na nesrovnalosti mezi těmito třemi studiemi, týkající se frekvence mutací v genu RET, by také mohly být způsobeny různou etnicitou zkoumaných souborů pacientů, přičemž tato diplomová práce je první studií, která mapuje roli genů RET a GDNF při vzniku renální ageneze u českých pacientů. Co se týče vlivu genu GDNF na vznik ageneze ledvin, výsledky této studie se shodují s oběma zahraničními. Tato práce, stejně jako Jeanpierre et al. (2011), neidentifikovala žádnou mutaci v genu pro tento růstový faktor, studie Skinner et al. (2008) pak zaznamenala pouze jedinou mutaci ve zmíněném genu, navíc u pacienta, který byl zároveň postižen dvěma dalšími mutacemi v genu RET. Na základě těchto výsledků lze prakticky vyloučit, že by mutace v genu GDNF byly důležitým či dokonce hlavním spouštěcím mechanismem pro vznik renální ageneze. Výsledky této diplomové práce jsou v souladu se zahraniční studií Jeanpierre et al. (2011) a nasvědčují tomu, že mutace GDNF/RET signálního komplexu nehrají zásadní roli při vzniku renální ageneze. Obě studie jsou tedy zároveň v rozpouru se všemi analýzami provedenými na myších (Pachnis et al., 1993; Schuchardt et al., 1994; Hellmich et al., 1996; Schuchardt et al., 1996; Sánchez et al., 1996), v případě genu RET, pak také se závěry další obdobné studie lidských plodů s agenezí (Skinner et al., 2008). Všechny tyto dříve publikované práce jasně naznačují, že renální defekty jsou asociovány s genomickými změnami těchto dvou genů. Tato studie, stejně jako Jeanpierre et al.
54
(2011), tedy spíše přispívá k teorii, že genetický podklad renální ageneze je mnohem komplexnější, než se původně zdálo, a to především díky již zmiňované vysoké genetické heterogenitě a také významnému vlivu modifikujících faktorů, ať už genetických či environmentálních. Pro vznik určitého defektu ledvin potom zřejmě nestačí mutace v jediném genu, natož v konkrétním lokusu, ale je výsledkem více mutací několika genů, řídících normální nefrogenezi.
5.3 Zjištěné polymorfizmy Polymorfizmus rs1800860 G/A, který byl identifikován u 11 pacientů z celkových 20, z toho ve dvou případech v homozygotním stavu, byl již dříve asociován s redukcí počtu nefronů u dětí s minoritní alelou A (Zhang et al., 2008). Tyto děti, ať už s jednou nebo se dvěma alelami A, vykazovaly snížený objem ledvin o 9,7% a zároveň pokles renální funkce, a to o 9,2% oproti homozygotům pro alelu G. Ukázalo se, že právě substituce G→A, nacházející se v pozici 1476 v 7. exonu RET protonkogenu, může ovlivňovat splicing v této oblasti genu, jelikož leží v regulační sekvenci pro zesilování sestřihu, tzv. exonic splice enhancer (ESE), (obr. 5.1). Konkrétně bylo prokázáno, že minoritní alela 1467 (A) redukuje afinitu RET k proteinům mRNA spliceozomu a následkem toho může vznikat aberantní nefunkční transkript. Exprese standardního transkriptu je v přítomnosti alely A snížena na úkor transkriptu nefunkčního asi o 19%. Bližší analýzou aberantního transkriptu bylo zjištěno, že je deletována část genu od 1476 (A) až po místo splicingu v exonu 14, čímž je ztracena část cadherinové domény 4, célá cysteinová, transmembránová a první tyrozinkinázová doména RET. Následkem toho aberantní RET postrádá místo pro interakci se svým ligandem GDNF i koreceptorem GFRA1 v extracelulární doméně proteinu (obr. 5.2.). Tato zjištění poukazují na to, že i časté varianty polymorfizmů, které se vyskytují v genech zahrnutých do fyziologické nefrogeneze, mohou ovlivňovat počet nefronů, který v normální populaci až pětinásobně kolísá a zvyšovat tak riziko vzniku hypertenze či renální insuficience v pozdějším věku. Kombinace účinků jednotlivých polymorfizmů v genu RET, ale i v dalších genech renální organogeneze, by tedy zřejmě mohla zodpovídat za významnou část případů hypoplazie ledvin, s renální agenezí je však asociovat nelze. Žádná souvislost zbylých dvou polymorfizmů, které byly v rámci této studie identifikovány, tedy rs1800861 a rs1800863, s vývojem ledvin publikována nebyla.
55
Obr. 5.1. Genomická struktura genu RET a znázornění polymorfizmu rs1800860 uvnitř sekvence ESE (exonic splice enhancer) v 7. exonu tohoto genu (převzato ze Zhang et al., 2008).
Obr. 5.2. Struktura aberantního RET transkriptu s deletovanou oblastí mezi 7. a 14. exonem. Abnormální splicing je důsledkem přítomnosti minoritní alely A v pozici 1476 v 7. exonu. Uvedena je také doménová struktura proteinu, znázorňující příslušnost jednotlivých domén ke konkrétním exonům standardního RET transkriptu (převzato ze Zhang et al., 2008).
56
K rozsáhlejší a přesnější analýze české populace bude nutné dále pokračovat ve sběru vzorků se zaměřením na rodiny postižené renální agenezí, kde je pravděpodobnost dědičného genetického podkladu vyšší.
57
6. Závěr V rámci této diplomové práce byla provedena mutační analýza genů RET a GDNF v souboru 20 pacientů s diagnostikovanou unilaterální agenezí. V případě obou těchto genů bylo v minulosti potvrzeno, že způsobují experimentální agenezi u myší. Následně začaly být geny RET a GDNF považovány za jedny z kandidátních genů, které se mohou podílet na vzniku tohoto onemocnění také u člověka. Výsledky práce lze shrnout takto:
· Byla úspěšně provedena mutační analýza genů RET a GDNF v souboru pacientů v renální agenezí. K tomuto účelu byla použita metoda PCR, které předcházela její optimalizace, dále pak metody DGGE a přímá sekvence kódujících oblastí. Pro doplnění byla zařazena také metoda MLPA, pomocí které jsme analyzovali numerické změny obou genů. Jednalo se přitom o první studii, zabývající se renální agenezí v souvislosti s geny RET a GDNF v rámci české populace. · Byly identifikovány tři popsané jednonukleotidové polymorfizmy v genu RET, z nichž ani jeden nemění smysl aminokyseliny. Jednalo se o polymorfizmy rs1800860 v 7. exonu, rs1800861 v 13. exonu a rs1800863 v exonu 15. Četnosti genotypů jednotlivých polymorfizmů nevykazovaly ve srovnání s kontrolami statisticky významný rozdíl. V kódujících oblastech genu GDNF nebyla nalezena žádná varianta. · V teoretické části této diplomové práce byly shrnuty dosavadní znalosti o renální agenezi v souvislosti s geny RET a GDNF.
Tato studie nepotvrdila předpoklad zvýšeného množství mutací v genech RET a GDNF u pacientů s renální agenezí. Zdá se, že genetický podklad i následná buněčná signalizace, které stojí v pozadí vzniku renální ageneze, jsou mnohem komplexnější, než se původně zdálo. Situaci komplikuje především vysoká genetická heterogenita onemocnění a také významný vliv modifikujích faktorů, který se zde uplatňuje. Ohledně
vzniku
renální
ageneze
tedy
zůstává
stále
mnoho
otázek
nezodpovězených. Pro přesnější analýzu této problematiky v rámci české populace pak
58
bude nutné rozšířit vzorek pacientů se zaměřením na rodiny s tímto onemocněním, kde je pravděpodobnost genetické etiologie vyšší.
59
7. Seznam zkratek A
Báze adenin
AK
Aminokyselina
Akt
Proteinkináza
bp
Bazický pár
BRA
Bilaterální renální ageneze
BRAHD
Letální malformace ledvin - Bilaterální renální ageneze/Hypoplazie/Dysplazie
C
Báze cytozin
CAKUT
Vrozené anomálie ledvin a močového traktu (Congenital anomalies of the kidney and urinary tract)
dATP
Deoxyadenozintrifosfát
dCTP
Deoxycytozintrifosfát
DGGE
Denaturační gradientová gelová elektroforéza
dGTP
Deoxyguanozintrifosfát
DMSO
Dimetylsulfoxid
DNA
Deoxyribonukleotidová kyselina
dNTP
Deoxynukleotidtrifosfát
Dok1-6
Adaptorové proteiny (Docking protein 1-6)
ds DNA
Dvouřetězcová (double-strand) DNA
dTTP
Deoxytyminozintrifosfát
EDTA
Etylendiamintetraoctová kyselina
Enigma
Adaptorový protein
FMTC
Familiární medulární karcinom štítné žlázy (familial medullary thyroid carcinoma)
FRS2
Substrát pro fibroblastový růstový faktor (Fibroblast growth factor receptor substrate 2)
G
Báze guanin
GAB
Signální protein (Grb-associated binder)
GDNF
Neurotrofní faktor odvozený od linie gliálních buněk u člověka (Glial cell line-derived neurotrophic factor)
GDNF
Gen pro neurotrofní faktor GDNF u člověka
60
Gdnf
Neurotrofní faktor odvozený od linie gliálních buněk u myší, analog lidského GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic factor)
Gdnf
Gen pro neurotrofní faktor Gdnf u myší
GFRA1
GPI-vázaný buněčně povrchový receptor pro GDNF u člověka (GDNF family receptor α-1)
GFRA1
Gen pro GFRA1 receptor u člověka
Gfrα1
GPI-vázaný buněčně povrchový receptor pro GDNF u myší (GDNF family receptor α-1)
Gfrα1
Gen pro Gfrα1 receptor u myší
Grb2/7/10
Receptor pro růstový faktor vázající protein 2, 7, 10 (Growth factor receptor-bound protein 2, 7, 10)
IRS1/2
Proteiny inzulínového receptorového substrátu (Insulin receptor substrate 1/2)
MAPK
Mitogenem aktivovaná protein kináza
MEN2A a B
Mnohačetná endokrinní neoplazie typu 2A/2B (multiple endocrine neoplasia type 2A/2B)
MLPA
Multiplex ligation-dependent probe amplification
MM
Metanefrický mezenchym
mm
Master mix
MTC
Medulární karcinom štítné žlázy (medullary thyroid carcinoma)
NIH 3T3
Buněčná linie myších embryonálních fibroblastů
PCR
Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
PI3K
Fosfatidylinositol-3-kináza (Phosphatidylinositol 3-kinase)
PKC/α
Proteinkináza C/α
PLCγ
Fosfolipáza Cγ (Phospholipase Cγ)
PTC
Papilární karcinom štítné žlázy (papillary thyroid carcinoma)
RAS
Signální protein, RAS je akronym pro rat sarcoma, jelikož gen pro RAS byl poprvé objeven jako transformující onkogen
RET
Gen pro tyrozinkinázový receptor RET u člověka
Ret
Tyrozinkinázový receptor u myší, analog lidského RET
Ret
Gen pro tyrozinkinázový receptor Ret u myší
RET
tyrozinkinázový receptor u člověka (Rearranged during transfection)
61
rpm
otáček za minuta
RTK
Receptor tyrozinové kinázy
Shank3
Protein, který propojuje neurotransmiterové receptory, iontové kanály a další membránové proteiny s aktinem a signální dráhou Gproteinů (Src homology and multiple ankyrin repeat domains 3)
Shc/C
Adaptorový protein (Src homology 2 domain-containingtransforming protein C)
Sos
Signální protein
Src
Nereceptorická tyrozinkináza, Src je akronym pro sarcom, jelikož gen pro Src se nachází ve formě onkogenu v genomu viru Rousova sarkomu
ss DNA
Jednořetězcová (single-strand) DNA
T
Báze tymin
TAE pufr
Roztok Tris, kyseliny octové a EDTA
TBE
Roztok Tris, kyseliny borité a EDTA
TGFβ
Transformující růstový faktor beta (transforming growth factor β)
UB
Ureterální pupen (Ureteric bud)
URA
Unilaterální renální ageneze
UV
Ultrafialové záření
Y
Tyrozinový zbytek
62
8. Seznam použité literatury Anders J., Kjær S., Ibáñez C. F. (2001) Molecular modeling of the extracellular domain of the RET eeceptor tyrosine kinase reveals multiple cadherine-like domains and a kalcium binding site. J Biol Chem 276: 35808–35817. Arighi E., Borello M. G., Sariola H. (2005) RET tyrosine kinase signaling in development and cancer. Cytokine Growth Factor Rev 16:441-467. Bates C. M. (2000) Kidney development: Regulatory molecules crucial to both mice and men. Mol Genet Metab 71: 391-396. Review Brenner B. M., Lawler E. V., Mackenzie H. S. (1996) The hyperfiltration theory: A paradigm shift in nephrology. Kidney Int 49:1774-1777. Cacalano G., Fariñas I., Wang L., Hagler K., Forgie A., Moore M., Armanini M., Phillips H., Ryan A. M., Reichardt L. F., Hynes M., Davies A., Rosenthal A. (1998) GFRα1 is an essential receptor component for GDNF in the developing nervous system and kidney. Neuron 21:53-62. Cain D. R., Griggs D., Lackey D. A., Kagan B. M. (1974) Familial renal agenesis and total dysplasia. Am J Dis Child 128:377-380. Carter C. O., Evans K., Pescia G. (1979) A family study of renal agenesis. J Med Genet 16:176-188. Ceccherini I., Hofstra R. M. W., Yin L., Stulp R. P., Barone V., Stelwagen T., Boccardi R., Nijveen H., Bolino A., Seri M., Ronchetto P., Pasini B., Bozzano M., Buys C. H. C. M., Romeo G. (1994) DNA polymorphisms and conditions for SSCP analysis of the 20 exons of the RET proto-oncogene. Oncogene 9: 3025-3029. Ceccherini I., Bocciardi R., Luo Y., Pasini B., Hofstra R., Takahashi M., Romeo G. (2002) Exon Structure and Flanking Intronic Sequences of the Human RET Proto-oncogene. Biochem Biophys Res Commun 196(3):1288-1295. Clark A. T., Bertram J. F. (1999) Molecular regulation of nephron endowment. Am J Physiol 276:F485-F497.
63
Constantini F. & Sakya R. (2006) GDNF/Ret signaling and the development of the kidney. BioEssays 28:117-127. Review Davis E. M., Peck J. D., Thompson D., Wild R. A., Langlois P. (2010) Maternal diabetes and renal genesis/dysgenesis. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol 88:722-727. Durbec P., Marcos-Gutierrez C. V., Kilkenny C., Grigoriou M., Wartiowaara K., Suvanto P., Smith D., Ponder B., Constantini F., Saarma M., Sariola H., Pachnis V. (1996) GDNF signalling through the Ret receptor tyrosine kinase. Nature 381: 789-793. Durson H., Bayazit A. K., Cengiz N., Seydaoglu G., Buyukcelik M., Soran M., Noyan A., Anarat A. (2007) Ambulatory blood pressure monitoring and renal functions in children with a solitary kidney. Pediatr Nephrol 22:559-564. Fine L. G. & Norman J. T. (1992) Renal growth responses to acute and chronic injury: routes to therapeutic intervention. J Am Soc Nephrol 2:S206-S211. Fitch N. (1977) Heterogeneity of bilateral renal agenesis. Can Med Assoc J 116:381-382. Fitch N. & Lachance R. C. (1972) The pathogenesis of Potter’s syndrome of renal agenesis. C M A Journal 107: 653-656. Fugazzola L., Pierotti M. A., Vigano E., Pacini F., Vorontsova T. V., Bongarzone I. (1995) Molecular and biochemical analysis of RET/PTC4, a novel oncogenic rearrangement between RET and ELE1 genes, in a post-Chernobyl papillary thyroid cancer. Oncogene 13(5):1093-1097. Grimm L., Holinski-Feder E., Teodoridis J., Scheffer B., Schindelhauer D., Meitinger T., Ueffing M. (1998) Analysis of the human GDNF gene reveals an inducible promoter, three exons, a triplet repeat within the 3‘-UTR and alternative splice products. Human Mol Genet 7:1873-1886. Grobstein, C. (1955) Inductive interaction in the development of the mouse metanephros. J Exp Zool 130:319–340. Grobstein, C. (1956) Inductive tissue interaction in development. Adv Cancer Res 4:187– 236.
64
Groothoff J. W. (2005) Long-term outcomes of children with end-stage renal disease. Pediatr Nephrol 20:849-853. Hansford J. R. & Mulligan L. M. (2000) Multiple endocrine neoplasia type 2 and RET: from neoplasia to neurogenesis. J Med Genet 37: 817-827. Harewood L., Liu M., Keeling J., Howatson A., Whiteford M., Branney P., Evans M., Fantes J., FitzPatrick D. (2010) Bilateral renal agenesis/hypoplasia /dysplasia (BRADH): Postmortem analysis of 45 cases with breakpoint mapping of two de novo translocations. Plos one 5: e12375. Hellmich H. L., Kos L., Cho E. S., Mahon K. A., Zimmer A. (1996) Embryonic expression of glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF) suggests multiple developmental roles in neural defferentiation and epithelial-mesenchymal interaction. Mech Dev 54:95105. Hislop A., Hey E., Reid L. (1979) The lungs in congenital bilateral renal agenesis and dysplasia. Arch Dis Child 54:32-38. Hofstra R. M. W., Wu Y., Stulp R. P., Elfferich P., Osinga J., Maas S. M., Siderius L., Brooks A. S., Ende J. J., Heydendael V. M. R., Severijnen R. S. V. M., Bax K. M. A., Meijers C., Buys Ch. H. C. M. (2000) RET and GDNF Gene Scanning in Hirschsprung Patients Using Two Dual Denaturing Gel Systems. Hum Mutat 15:418-429. Chi X., Michos O., Shakya R., Riccio P., Enomoto H., Licht J. D., Asai N., Takahashi M., Ohgami N., Kato M., Mendelsohn C., Constantini F. (2009) Ret- dependent cell rearrangements in the Wolffian duct epithelium initiate ureteric bud morphogenesis. Dev Cell 17:199-209. Jain S. (2009) The many faces of RET dysfunction in kidney. Organogenesis 5:4, 95-108. Jeanpierre C., Macé G., Parisot M., Morinière V., Pawtowsky A., Benabou M., Martinovic J., Amiel J., Attié-Bitach T., Delezoide A., Loget P., Blanchet P., Gaillard D., Gonzales M., Carpentier W., Nitschke P., Tores F., Heidet L., Antignac C., Salomon R. (2011) RET and GDNF mutations are rare in fetuses with renal genesis or other severe kidney development defects. J Med Genet 48:497-504.
65
Jing S., Wen D., Yu Y., Holst P. L., Luo Y., Fang M., Tamir R., Antonio L., Hu Z., Cupples R., Luis J., Hu S., Altrock B. W., Fox G. M. (1996) GDNF - induced activation of the Ret protein tyrosine kinase is mediated by GDNFR-α, a novel receptor for GDNF. Cell 85:1113-1124. Kerecuk L., Schreuder M. F., Woolf A. S. (2008) Renal tract malformations: perspectives for nephrologists. Nat Clin Pract Nephrol 4:312-325. Kreidberg J. A., Sariola H., Loring J. M., Maeda M., Pelletier J., Housman D., Jaenisch R. (1993) WT-1 is required for early kidney development. Cell 74: 679-691. Lin L. H., Doherty D. H., Lile J. D., Bektesh S., Collins F. (1993) GDNF: a glial cell linederived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260:1130-1132. Moore K. L. & Persaud T. V. N. (1998) Zrození člověka: Embryologie s klinickým zaměřením. Praha: ISV, ISBN 80-85866-94-3. Nicolaides K. H., Cheng H. H., Abbas A., Snijders R. J. M., Gosden C. (1992) Fetal Renal Defects: Associated Malformations and Chromosomal Defects. Fetal Diagn Ther 7:1–11. Nielsen G. L., Nørgard B., Puho E., Rothman K. J., Sørensen H. T., Czeizel A. E. (2005) Risk of specific congenital abnormalities in offspring of women with diabetes. Diabet Med 22:693-696. Oppenheim R. W., Houenou L. J., Johnson J. E., Lin L. H., Li L., Lo A. C., Newsome A. L., Prevette D., Wang S. (1995) Developing motor neurons rescued from programmed and axotomy-induced cell death by GDNF. Nature 373:344-346. Pachnis V., Mankoo B., Constantini F. (1993) Expression of the c-ret protooncogene during mouse embryogenesis. Development 119: 1005-1017. Pasini B., Ceccherini I., Romeo G. (1996) RET mutations in human disease. Trends Genet 12: 138- 144. Review Peterka M. & Novotná B. (2010) Úvod do teratologie: příčiny a mechanizmy vzniku vrozených vad. Praha: Karolinum, ISBN 978-80-246-1780-0.
66
Pichel J. G., Shen L., Sheng H. Z., Granholm A., Drago J., Grinberg A., Lee E. J., Huang S. P., Saarma M., Hoffer B. J., Sariola H., Westphal H. (1996) Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 382:73ů-76. Pohl M., Bhatnagar V., Mendoza S. A., Nigam S. K. (2002) Toward an etiological classification of developmental disorders of the kidney and upper urinary tract. Kidney Int 61:10-19. Ponder B. A. (1999) The phenotypes associated with ret mutations in the multiple endocrine neoplasia type 2 syndrome. Cancer Res 59:1736s-1741s. Pope J. C. IV., Brock J. W. III., Adams M. C., Stephens F. D., Ichikawa I. (1999) How they begin and how they end: classic and new theories for the development and deterioration of congenital anomalies of the kidney and urinary tract, CAKUT. J Am Soc Nephrol 10: 2018- 2028. Purcell S., Neale B., Todd-Brown K., Thomas L., Ferreira M. A. R, Bender D., Maller J., Sklar P., Bakker P. I. W., Daly M. J., Sham P. C. (2007) PLINK: A Tool Set for WholeGenome Association and Population-Based Linkage Analyses. Am J Hum Genet 81:559– 575. Reiterová J. & Merta M. (2008) Genetické aspekty nefrologických onemocnění. Med pro praxi 5(11): 423-425. Renkema K. Y., Winyard P. J., Skovorodkin I. N., Levtchenko E., Hindryckx A., Jeanpierre C., Weber S., Salomon R., Antignac C., Vainio S., Schedl A., Schaefer F., Knoers N. V. A. M., Bongers E. M. H. F. (2011) Novel perspectives for investigating congenital anomalies of the kidney and urinary tract (CAKUT). Nephrol Dial Transplant 26: 3843-3851. Sainio K., Suvato P., Davies J., Wartiovaara J., Wartiovaara K., Saarma M., Arumӓe U., Meng X., Lindahl M., Pachnis V., Sariola H. (1997) Glial-cell-line-derived neurotrophic factor is required for bud initiation from ureteric epithelium. Development 124:4077-4087. Sánchez M. P., Silos-Santiago I., Frisén J., He B., Lira S. A., Barbacid M. (1996) Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature 382:70-73.
67
Sanna-Cherchi S., Caridi G., Weng P. L., Scolari F., Perfumo F., Gharavi A. G., Ghiggeri G. M. (2007) Genetic approaches to human renal genesis/hypoplasia and dysplasia. Pediatr Nephrol 22:1675-1684. Sanna-Cherchi S., Ravani P., Corbani V., Parodi S., Haupt R., Piaggio G., Innocenti M. L., Somenzi D., Trivelli A., Caridi G., Izzi C., Scolari F., Mattioli G., Allegri L., Ghiggeri G. M. (2009) Renal outcome in patiens with congenital anomalies of the kidney and urinary tract. Kidney Int 76: 528-533. Sariola H. & Saarma M. (2003) Novel functions and signalling pathways for GDNF. J Cell Sci 116:3855-3862. Saxen L. (1987) Organogenesis of the kidney. Cambridge: Cambridge University Press, ISBN 0 521 30152 1. Shakya R., Watanabe T., Constantini F. (2005) The role of GDNF/Ret signaling in ureteric bud cell fate and branching morphogenesis. Dev Cell 8:65-74. Schedl A. (2007) Renal abnormalities and thein developmental origin. Nat Rev Genet 8:791-802. Schuchardt A., D’Agati V., Larsson-Blomberg L., Constantini F., Pachnis V. (1994) Defects in the kidney and enteric nervous system of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature 367: 380-383. Schuchardt A., D’Agati V., Pachnis V., Constantini F. (1996) Renal agenesis and hypodysplasia in ret-k⁻ mutant mice result from defects in ureteric bud development. Development 122: 1919-1929. Schulman J., Edmonds L. D., McClearn A. B., Jensvold N., Shaw G. M. (1993) Surveillance for and comparison of birth defect prevalences in two geographic areas-United States, 1983-88. MMWR CDC Surveill Summ 42:1-7. Squiers E. C., Morden R. S., Bernstein J. (1978) Renal multicystic dysplasia: An occasional manifestation of the hereditary renal adysplasia syndrome. Am J Med Gent Suppl 3:279-284.
68
Takahashi M. & Cooper G. M. (1987) ret transforming gene encodes a fusion protein homologous to tyrosines kinases. Mol Cell Biol 7, 1378-1385. Takahashi M., Ritz J., Cooper G. (1985) Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell 42, 581-588. Torres M., Gomez-Pardo E., Dressler G. R., Gruss P. (1995) Pax-2 controls multiple steps of urogenital development. Development 121: 4057-4065. Trupp M., Arenas E., Fainzilber M., Nilsson A., Sieber B., Grigoriou M., Kilkenny C., Salazar-Grueso E., Pachnis V., Arumӓe U., Sariola H., Saarma M., Ibáñez C. (1996) Functional receptor for GDNF encoded by the c-ret proto-oncogene. Nature 381: 785-789. Vega Q. C., Worby C. A., Lechner M. S., Dixon J. E., Dressler G. R. (1996) Glial cell linederived neurotrophic factor activates the receptor tyrosine kinase RET and promotes kidney morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 93:10657-10661. Wigginton J. E., Cutler D. J., Abecasis G. R. (2005) A Note on Exact Tests of HardyWeinberg Equilibrium. Am J Hum Genet 76:887–883.
69
