diabetologie
PERSPEKTIVY FARMAKOTERAPIE DIABETU 2. TYPU: AKTIVÁTORY GLUKOKINÁZY PERSPECTIVES IN PHARMACOTHERAPY OF T2DM: GLUCOKINASE ACTIVATORS TOMÁŠ EDELSBERGER Diabetologická ambulance Krnov SOUHRN Glukokináza (GK) je jedním ze zástupců savčí rodiny hexokináz. Tento enzym zajišťující fosforylaci glukózy je v posledním desetiletí nadějným terčem snah vědců a farmaceutických firem o nalezení nových způsobů léčby diabetu. GK slouží jako glukózový senzor v beta-buňkách pankreatu a zároveň sehrává klíčovou roli při proměně glukózy v jaterní glykogen. Nové světlo do této problematiky přinesly i aktivující resp. inaktivující mutace GK (mutace způsobující zrychlení či zpomalení reakce katalyzované tímto enzymem, či zvýšení resp. snížení afinity k substrátu) označované společným názvem „glukokinázová nemoc“. Nedávno objevené malé molekuly aktivující GK prostřednictvím vazby na allosterické místo GK nazývané aktivátory glukokinázy (GKA) jsou příslibem pro novou efektivní léčbu diabetu 2. typu. Článek přináší přehled role glukokinázy při udržování glukózové homeostázy, stejně tak jako biochemické a farmakologické aspekty GKA. Klíčová slova: aktivátory glukokinázy, glukokináza, diabetes 2. typu, perorální antidiabetika SUMMARY Glucokinase (GK) which is one memeber from the mammalian hexokinases family that phosphorylate glucose has emerged as a promising drug target for last decade. GK serves as a glucose sensor in pancreatic beta-cells and plays a critical role in the conversion of glucose to glycogen in the liver. The syndromes associated with activating and inactivating GK mutations which are now collectively described as ‘glucokinase disease’ brought some new data to this issue. Recently small molecules that activate GK via binding to an allosteric site on the enzyme have been discovered. Through their ability to enhance the activity of GK, such so-called GK activators (GKAs) hold promise as a novel and effective treatment for type 2 diabetes. The article to follow describes the physiological backround as well as biochemical and pharmacological actions of this new class of potential drugs for type 2. diabetes. Key words: glucokinase activators, glucokinase, type 2. diabetes, oral antidiabetic drugs
ÚVOD Aktivátory glukokinázy (GKA) představují zcela novou třídu antidiabetických léků. Preklinická data ukazují, že hypoglykemizující účinek těchto látek je vyvolaný jejich současným působením na játra i na pankreas. Předpokládá se, že tento duální účinek povede k výraznému hypoglykemizujícímu efektu u pacientů s diabetem. A tak pokud jsem v minulém článku poukazoval na skutečnost, že látky ze skupiny selektivních inhibitorů renálního transportu glukózy (SGLT2) snižují glykemii bez ohledu na patofyziologické mechanizmy, které ji vyvolávají, zde je situace zcela odlišná. GKA v experimentálních modelech zvyšují afinitu a maximální rychlost enzymatické reakce (Vmax) glukokinázy a zesilují tak jaterní metabolizmus glukózy i na glukóze závislou sekreci inzulinu (glucose-stimulated insulin release; GSIR) v buňkách pankreatu. U několika zvířecích modelů diabetu 2. typu vedlo podávání GKA ke snížení hladin glykemie, zlepšení glukózo-tolerančních testů a ke zvýDMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
šení jaterního vychytávání glukózy. Tyto nálezy jsou motivací k dalšímu vývoji a klinickému testování tohoto nového potenciálního a do značné míry převratného způsobu léčby diabetu 2. typu. Strukturální, kinetické a molekulárně-genetické vlastnosti glukokinázy predisponují tento enzym k jeho primární funkci glukózového senzoru v síti neuro/endokrinních buněk udržujících glukózovou homeostázu u řady obratlovců, včetně lidí. Hlavní součástí této soustavy jsou beta-buňky pankreatu, které se považují za jakýsi model pro pochopení činnosti ostatních extrapankreatických glukózosenzitivních buněk. Kolem 99 % veškeré glukokinázy nicméně obsahuje jaterní parenchym, kde plní svoji druhou hlavní funkci – vysokokapacitní odsun glukózy z krve do jater. Názornými příklady stěžejní role GK v glukózovém metabolizmu jsou aktivující resp. inaktivující mutace tohoto enzymu (mutace způsobující zrychlení či zpomalení reakce katalyzované tímto enzymem, či zvýšení resp. snížení afinity k substrátu),
113
diabetologie vedoucí u lidí k hypo- resp. hyperglykemickým syndromům označovaným společným termínem „glukokinázová nemoc“, potvrzujíc tak paradigma GK jako hlavního senzoru glukózy, a to nejen v pankreatu, ale v řadě dalších tkání lidského těla (např. gastrointestinální trakt, mozkový kmen, hypothalamus etc.).
GLUKOKINÁZA Glukokináza (GK; hexokináza D; ATP: D-glukózo 6-fosfotransferáza; EC 2.7.1.1) je izoenzymem ze skupiny hexokináz přítomným v beta-buňkách pankreatu (glukokináza typu B; GKB) a v játrech (glukokináza typu L; GKL), který fosforyluje glukózu na 6. uhlíku za vzniku glukóza-6-fosfátu (G6P). Glukokináza je monomerním enzymem o velkosti 50 kD složeným ze dvou domén (velké a malé), které jsou oddělené mezerou, ve které probíhá zmíněná fosforylace. Na rozdíl od ostatních hexokináz není inhibována fyziologickými koncentracemi G6P a má mnohem nižší afinitu ke glukóze a kinetiku odpovídající sigmoidální křivce (Hillův koeficient nH ~1,6) (14,26). V beta-buňkách i hepatocytech je rychlost metabolizmu glukózy určována převážně aktivitou GK. Inaktivující mutace tohoto enzymu vedou ke vzniku MODY 2 (MaturityOnset Diabetes of the Young) diabetu, aktivující mutace zase k manifestaci perzistující hyperinzulinemické hypoglykemie u dětí (Persistent Hyperinsulinemic Hypoglycemia of Infancy – PHHI) (2–4). Vzhledem k velké kapacitě glukózového transportéru GLUT2 (5) přítomného rovněž v obou lokalitách se extracelulární koncentrace glukózy „měří“ právě pomocí GK až intracelulárně (10). Klíčovým působením GK v jaterním parenchymu je zase urychlování vychytávání glukózy játry ve stavu hyperglykemie (12). Svou duální expresí v játrech a pankreatu tak sehrává zásadní roli „glukózového senzoru“. Nedávno zveřejněný model proteinové struktury GK osvětlil princip působení inaktivujících a zejména aktivujících mutací, které vedou k odhalení allosterického vazebního místa pro zatím neznámý fyziologický aktivátor glukokinázy. Tento objev byl předpověděn již několik let předtím identifikací malých organických molekul – aktivátorů glukokinázy , které zesilují účinek jaterní i pankreatické GK (1). Glukokináza byla objevena v roce 1964 nezávisle na sobě ve třech laboratořích. Na základě experimentů se předpokládalo, že enzym je specifický pro játra a reguluje postprandiální odsun glukózy z cirkulace do jater (9). Krátce nato (1968) prokázali Matschinsky a Ellerman přítomnost GK v pankreatické ostrůvkové tkáni a vyslovili hypotézu o duálním působení tohoto enzymu: 1. jako glukózového senzoru v pankreatických buňkách produkujících inzulin a 2. jako vysokokapacitní iniciální krok umožňující následné uskladnění glukózy v játrech ve formě glykogenu (obr. 1) (27). Dalším významným objevem (1986) bylo zjištění, že exprese glukokinázy v pankreatu a v játrech podléhá odlišným kontrolním mechanizmům, resp. že je tento enzym kódovaný jedním společným genem se dvěma rozdílnými tkáňově specifickými promotéry (upstream promoter pro beta-buňku a downstream promoter pro hepatocyt) (28,29). Výskyt GK byl posléze prokázán v řadě dalších tkání včetně některých oblastí hypotalamu, mozkového kmene, v hypofýze či endokrinně aktivních buňkách gastrointestinálního traktu.
114
Tab. 1 Charakteristika lidské glukokinázy (podle Matschinského) velikost molekuly
50 kD, monomer
kcat
60–70 s-1
glukóza S0,5
7,5 mmol/l
ATP Km
0,4 mmol/l
Hillův koeficient (nH)
1,7
inflexní bod
3,5
inhibitory
GKRP a acyl-CoA
aktivátory
GKA
umístnění v buňce
cytosol, jádro, sekreční granule a mitochondrie
tkáňová lokalizace
alfa- a beta-buňky pankreatu, hepatocyty, endokrinní buňky,
hypotalamické neurony, buňky hypofýzy kcat – katalytická konstanta; S0,5 – koncentrace substrátu při které je Vmax enzymu poloviční; Km – konstanta Michaelis-Mentenové; GKRP – glucokinase related protein; GKA – aktivátory glukokinázy
Přehled účinků glukokinázy v pankreatu (dle Matschinského) • GK je odpovědná za GSIR (glukózou stimulovanou sekrecí inzulinu) ve fyziologickém rozmezí 4–8 mmol/l. • GK je potřebná k sekreci inzulinu stimulovanou aminokyselinami a mastnými kyselinami • GK umožňuje zesílení inzulinové sekreční odpovědi vyvolané inkretiny a stimulací n. vagus (acetylcholinem) • GK kontroluje glukózou stimulovanou syntézu a uskladnění inzulinu I když vykazuje pankreatická i jaterní GK obdobnou kinetiku a je kódovaná totožným genem, jejich primární struktura v N-terminální oblasti je odlišná v důsledku odlišného „krájení“ transkripční RNA. Oba subtypy enzymu jsou tedy tvořené 465 aminokyselinami s N-terminální oblastí lišící se v 13–15 reziduích. Popis struktury genu kódujícího tyto dva subtypy GK odhalil, že obě cDNA jsou kódovány jediným genem s 10 exony, exon 1 se však odlišuje v obou lokalitách (pankreas vs. játra) rozdílnou promotérovou oblastí. Existence alternativních promotérů tak umožňuje tkáňově specifickou regulaci exprese genu pro GK (26).
GLUKOKINÁZA JAKO GLUKÓZOVÝ SENZOR V BETA-BUŇKÁCH PANKREATU Jak jsem již zmínil, díky glukózovému transportéru GLUT2 vychytávají pankreatické beta-buňky glukózu bez ohledu na její extracelulární koncentraci (9). Při nízkých hladinách glykemie (< 2,5 mmol/l) dochází v beta-buňce jen k minimální fosforylaci tohoto substrátu, pravděpodobně vzhledem k nízké expresi ostatních izoforem hexokináz s vysokou afinitou ke glukóze (hexokinázy I-III; HK). Na rozdíl od betabuněk je exprese těchto izoenzymů HK v ostatních tkáních dostatečně veliká aby udržela konstantní intracelulární koncentraci glukózo-6-fosfátu (G6P) k zabezpečení bazální produkce ATP a zachování funkčnosti buněčného metabolizmus i v podmínkách nízkých extracelulárních hladin glukózy. Rychlost glukózového transportu a/nebo spotřeba G6P jsou v těchto tkáních hlavním metabolickým tokem udržujícím DMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
diabetologie Obr. 1 Centrální postavení glukokinázy (GK) v zabezpečení glukózové homeostázy.
abnormalit metabolizmu glukózy vytváří komplexy právě s glukokinázou. Glukokináza se ve světle těchto informací stává mnohem významnějším „hráčem“ v metabolizmu glukózy, než se zdálo doposud. V případě, že by GKA přestupovaly hemato-encefalickou bariérou, mohlo by jejich centrální působení hypoteticky ovlivnit metabolická centra v hypotalamu a regulovat tak prostřednictvím trvalé aktivace glukózových senzorů apetit či energetickou bilanci (12).
ROLE
GKB – pankreatická glukokináza; GKL – jaterní glukokináza; GKA – aktivátory glukokinázy; GLUT2 – glukózový transportér; IR – inzulinový receptor; G6P – glukóza-6-fosfát; ADP – adenozindifosfát; ATP – adenozintrifosfát
energetickou zásobu buněk konstantní a nezávislou od extracelulárních výkyvů glykemie (10). V beta-buňkách pankreatu naopak vede absence, nebo jen minimální přítomnost ostatních HK při hladinách glykemie < 2,5 mmol/l k nízkému „glykolytickému toku“ a nízkému poměru ATP/ADP, což zajišťuje nízkou bazální inzulinovou sekreci. Při vzestupu glykemie na hodnoty > 2,5 mmol/l dochází k fosforylaci glukózy v beta-buňce prostřednictvím glukokinázy, což dokládá vzestup poměru ATP/ADP pozorovaný při hladinách glykemie 5–10 mmol/l. Skutečnost, že GK není prostřednictvím zpětné vazby inhibována G6P vede ke zvýšení podílu cytoplazmatického G6P při narůstajících koncentracích extracelulární glukózy. Sigmoidální závislost mezi aktivitou GK a koncentrací glukózy (S0.5 = 8 mmol/l) činí beta-buňky maximálně citlivými vůči změnám koncentrace extracelulární glukózy v rozmezí blízkém fyziologickým hodnotám. Rozdílné využití dvou různých promotérů udržuje expresi enzymu v pankreatu v mnohem nižších koncentracích než v jaterním parenchymu, takže se aktivita GK v pankreatu stává limitujícím krokem dalšího metabolizmu glukózy v beta-buňce. Na druhé straně pomáhá nadbytečná exprese GK v játrech zajistit rychlé vychytávání a uskladnění glukózy z portální žíly v postprandiálním stavu. K dosažení toho vede silná aktivace hepatálního promotéru genu pro GK inzulinem, zatímco glukagon jej v období nalačno potlačuje. Promotérová oblast GK v beta-buňkách není v takové míře ovlivněna akutními změnami nutričního stavu (10). Existence GK byla v poslední době prokázána v řadě dalších tkání (hypotalamus, mozkový kmen, hypofýza, endokrinní buňky enterálního systému, portální véna). Glukokináza tak tvoří určitou síť, která se pravděpodobně podílí na kontinuálním monitorování hladin glykemie a vysílání nervových a endokrinních signálů zajišťujících koordinaci různých fyziologických procesů, glukózové homeostázy a energetické rovnováhy (9). Pozoruhodným zjištěním publikovaným v roce 2003 byla možná souvislost spojující glukokinázu s procesem buněčné apoptózy (33). Autoři zde poukázali na fakt, že člen proapoptotické rodiny BCL-2 označovaný BAD (the Bcl-2/Bcl-XL-associated death promoter), který účinkuje jako spouštěč buněčné smrti v důsledku DMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
GLUKOKINÁZY V JATERNÍM METABOLIZMU
Je známým faktem, že rovnováha mezi produkcí, resp. vychytáváním glukózy v játrech je u diabetu 2. typu narušená. Hyperglykemie nevede k dostatečné supresi hepatální produkce glukózy stejně tak jako k adekvátní extrakci přebytečné glukózy z krevního oběhu a jejímu uskladnění ve formě glykogenu. Tato neschopnost glukózy regulovat jaterní glukózovou rovnováhu se někdy označuje jako snížená efektivita glukózy (GE; glucose effectiveness); (obr. 2). Množí se důkazy, že za sníženou efektivitou glukózy u osob s diabetem 2. typu stojí oslabený tok glukózy přes hepatální GK zároveň s nižší pankreatickou inzulinovou sekrecí. Lék, který by byl schopen obnovit efektivitu glukózy a stimulovat inzulinovou sekreci by tak mohl vést i k obnovení glukózové rovnováhy v játrech. Obr. 2 Regulace jaterní glukózové rovnováhy (podle Leightona).
HGP – hepatic glucose production (jaterní produkce glukózy); HGU – hepatic glukoce uptake (jaterní vychytávání glukózy); GK – glukokináza; GE – efektivita glukozy (glucose effectiveness)
Z předešlého logicky vyplývá, že význam působení glukokinázy v játrech se akcentuje zejména v postprandiálním stavu. Následkem vzestupu glykemie po jídle se aktivita GK za fyziologických podmínek zvyšuje, což vede ke zvýšenému vychytávání glukózy játry (hepatal glucose uptake; HGU) a k poklesu hepatální produkce glukózy (hepatal glucose production; HGP). Činnost GK v játrech (ne však v pankreatu) je kromě koncentrace glukózy regulována i prostřednictvím proteinu o velikosti 68 kD s názvem GKRP (glucokinase regulatory protein), který tak činí na principu kompetitivní inhibice s glukózou. GKRP se váže na glukokinázu a allostericky inhibuje aktivitu enzymu prostřednictvím snížení jeho afinity ke glukóze. Vazebnou afinitu GKRP vůči GK zvyšuje fruktóza-6-fosfát a snižuje fruktóza-1-fosfát. GKRP rovněž určuje subcelulární lokalizaci GK – v stavu nalačno vytváří určitý neaktivní „pool“ glukokinázy v oblasti buněčného jádra. Následkem zvýšení intracelulární koncentrace glu-
115
diabetologie kózy, fruktóza-1-fosfátu a/nebo působením inzulinu dojde k uvolnění vazby GK a GKRP, ke změně konformace enzymu do katalyticky aktivního uzavřeného stavu a k translokaci GK do cytoplazmy, což urychlí proces fosforylace a utilizace glukózy po jídle (obr. 3) (1).
zovou toleranci ani efekt glykemie na jaterní metabolizmus. Arteficiální nadměrná hepatoselektivní exprese GK u myší zlepšuje toleranci glukózy, u dietou indukovaných obézních myší zase způsobuje snížení glykemie nalačno a pokles sekrece inzulinu (1).
Obr. 3 Subcelulární lokalizace a regulace aktivity GK prostřednictvím GKRP (dle Iynedjiana).
Inaktivující mutace (MODY 2 diabetes) Nejlépe prozkoumaným typem heterozygotní inaktivující mutace glukokinázy je jedna z monogenních forem diabetu - MODY 2. Onemocnění je asymptomatické a porucha je zjištěna většinou náhodně u osob mladších 25 let, které nebývají obézní a postrádají i další komponenty metabolického syndromu. Glykemie nalačno se stabilně pohybuje v rozmezí 5,5–8,0 mmol/l, přičemž kolísání kolem těchto hodnot je malé a věkem se příliš nemění. Pacienti s tímto postižením vykazují zhoršenou reaktivitu beta-buněk na glukózu, sníženou schopnost akumulace glykogenu a zvýšenou postprandiální jaterní produkci glukózy. Mutace genu pro GK popsané u MODY2 diabetu vedou k poklesu aktivity tohoto enzymu následkem redukce jeho Vmax (maximální rychlost enzymatické reakce) a/nebo snížené afinity vůči jeho substrátům (glukóze a ATP). Ve srovnání s nediabetickými osobami je obsah glykogenu po jídle u pacientů s MODY 2 nižší. Tento defekt je asociován s vyšší postprandiální hyperglykemií a sníženou supresí jaterní produkce glukózy. V případě homozygotního postižení, kdy nesou inaktivující mutace obě alely, dochází k manifestaci hyperglykemie již v novorozeneckém období (obvykle do týdne po porodu) (1,30).
„GLUKOKINÁZOVÁ (INAKTIVUJÍCÍ
NEMOC“
VERSUS AKTIVUJÍCÍ MUTACE GLUKOKINÁZY)
Podobně jako tomu bylo v případě selektivních inhibitorů glukózových transportérů SGLT2, kdy vědě při vývoji této nové lékové skupiny posloužil přirozeně se vyskytující genetický model glykosurie, i v případě aktivátorů glukokinázy máme k dispozici názorný příklad modifikace aktivity GK v podobě osob postižených aktivujícími či deaktivujícími mutacemi tohoto enzymu. První zprávy o existenci „glukokinázové nemoci“ charakterizované hypo- resp. hyperglykemickými syndromy se objevily v průběhu 90. let minulého století. Na základě rozsáhlých rodinných studií publikovali Froguel a Hattersley v roce 1992 geneticky i biochemicky verifikovaný průkaz asociace autozomálně dominantního diabetu typu MODY 2 s inaktivující mutací genu pro glukokinázu. Postižení pouze jedné alely vede k mírné formě hyperglykemie, zatímco přítomnost mutace u obou alel má za následek těžký permanentní diabetes novorozenců. Na druhé straně k projevům těžké hypoglykemie dochází u lidí již při výskytu aktivující mutace pouze jedné alely. Homozygotní případy aktivujících mutací genu pro glukokinázu prozatím nebyly popsány. Celkově bylo doposud objeveno více než 200 mutací glukokinázy vedoucích k aktivaci resp. inaktivaci tohoto enzymu a z toho pramenící hypo- či hyperglykemii. Soubor těchto mutací se souhrnně označuje jako glukokinázová nemoc (9). Další zajímavé informace o mutacích genu pro GK přinesly zvířecí experimenty. Myši s úplným poškozením genu pro glukokinázu v beta-buňkách umírají několik dní po narození, zatímco heterozygotní modely vykazují pouze mírnou hyperglykemii. Heterozygotní vyřazení jaterní GK u myší vede k ztrátě schopnosti glukózy tlumit její hepatální produkci a k poklesu vychytávání glukózy játry. Na rozdíl od toho vede pokles pankreatické formy GK ke snížené sekreci inzulinu, neovlivňuje však hladiny glykemie nalačno, glukó-
116
Aktivující mutace Na rozdíl od MODY2 diabetu způsobují zřídkavé aktivující mutace GK u lidí hyperinzulinemii provázenou hypoglykemií (zvyšují katalytickou aktivitu GK a snižují práh pro GSIR). Efekt těchto mutací na jaterní metabolizmus glukózy nebyl pozorován. Studie in vitro dokládají, že tyto mutace zvyšují aktivitu GK na podkladě zvyšování její afinity ke glukóze. Nedávné informace o struktuře glukokinázy pomohly osvětlit molekulární mechanizmus, jakým se tak děje – viz allosterická aktivace glukokinázy (1). Aktivující mutace genu pro GK vedoucí ke kongenitálnímu hyperinzulinizmu je jednou z poměrně raritních příčin heterogenního syndromu označovaného jako perzistující hyperinzulinemická hypoglykemie novorozenců (PHHI). Mnohem častěji je tento syndrom zapříčiněn inaktivujícími mutacemi genů pro sulfonylureový receptor SUR1 (gen ABCC8) resp. jeho podjednotky Kir6.2 (KCNJ11), nebo aktivujícími mutacemi genu pro glutamát dehydrogenázu GDH (GLUD1) (26). Aktivující mutace GK byly popsány zatím pouze v 5 rodinách, přičemž každá z nich je nositelkou unikátní mutace. Jedná se konkrétně o mutace V455M a A456V v exonu 10, T65I v exonu 2, W99R v exonu 3 a Y214C v exonu 6. Dědičnost těchto mutací vykazuje autozomálně dominantní vlastnosti s postiženými osobami v každé generaci. U dvou rodin byla popsána spontánní mutace. Dle in vitro studií zvyšují tyto mutace (V455M, A456V, T65I, W99R a Y214C) aktivitu GK na základě 2–6násobného zvýšení afinity GK ke glukóze (26).
ALLOSTERICKÁ
AKTIVACE GLUKOKINÁZY
Jako allosterický efekt (z řeckého allós = jiný, stereós = prostor) se označuje konformační změna v určité části molekuly enzymu, vyvolaná jistou změnou v jiné části molekuly. DMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
diabetologie Tab. 2 Vliv GKA a aktivujících mutací na kinetiku enzymu glukokinázy (podle Coghlana) aktivátory glukokinázy (GKA)
aktivující mutace GK
kontroly
RO-281675
GKA50
Compound A
100
142,2
94,1
160
100
41,0
219,0
108
S0,5 (mmol/l)
7,3
0,74
0,53
0,60
8,45
1,71
4,90
3,02
Hillův koeficient
1,64
1,36
1,36
1,11
1,44
1,26
1,44
1,62
Vmax (% aktivity)
Touto změnou může být kovalentní modifikace (např. fosforylace enzymu) či nekovalentní vazba nízkomolekulárního či makromolekulárního efektoru (např. vazba nekompetitivního inhibitoru na enzym, pozitivní homotropní allosterický efekt u hemoglobinu, vyvolání konformační změny membránového receptoru vazbou bílkovinného hormonu apod.). Allosterický efekt se uplatňuje zásadním způsobem při regulaci biologické aktivity mnoha bílkovin (6). Na základě popisu krystalické struktury glukokinázy došlo k odhalení existence hydrofobního allosterického vazebného místa, které je lokalizováno mimo hlavní katalytickou vazebnou oblast enzymu. Toto místo je vystaveno vnějšímu prostředí v situaci, kdy je na GK navázána glukóza a enzym je v uzavřené, katalyticky aktivní konformaci. Tehdy se v oblasti spojení velké a malé domény GK vytváří jakási „kapsa“. Naproti tomu při otevřené konformaci (bez přítomnosti glukózy) je tato hydrofobní kapsa mezi velkou a malou doménou skryta. (Pozn. Korespondující oblast ostatních hexokináz je rigidnější a neposkytuje prostor pro potenciální navázání GKA, což zajišťuje specificitu působení GKA pouze na glukokinázu). Většina bodových aktivujících mutací genu pro GK (T651I, Y214C, V455M, A456V, V62M, D158A, F456V) vede ke stabilizaci uzavřené konformace (tzn. urychlení zpracování glukózy), pravděpodobně prostřednictvím redukce velikosti hydrofobní plochy allosterické „kapsy“ vystavené vnějšímu prostředí. Právě objev existence allosterického efektu u GK podnítil „honbu“ za nalezením aktivátorů tohoto enzymu, které by byly schopny tuto vlastnost využít v léčbě diabetu (1,12).
AKTIVÁTORY
GLUKOKINÁZY
Možnost využít glukokinázu jako potenciální farmakologický cíl byla formulována Matschinským a výzkumníky z Hoffmann-La Roche již počátkem 90. let minulého století, kdy společnost zahájila „drug discovery“ program k prověření této možnosti. Snaha o objevení molekuly (molekul) schopných přímo či nepřímo zvyšovat aktivitu glukokinázy byla ale velkou výzvou pro celý farmaceutický průmysl. Nejschůdnější cestou se na začátku zdálo pátrání po mimetikách fruktóza-1-fosfátu, které by mohly bránit inhibici GK blokádou GKRP nacházejícího se v játrech (a snad i v betabuňkách). Screeningová metoda využívající rekombinantní GK inhibovanou lidským GKRP byla schopna posoudit až 120 000 malých molekul a vedla k objevu základní složky aktivátorů GK (substituovaný derivát kyseliny fenyloctové), která vede kromě blokády inhibice GKRP i k přímé aktivaci GK na principu allosterického ovlivnění aktivity enzymu. Optimalizace této prvotní složky vedla k odvození řady molekul označovaných společným názvem aktivátory glukokinázy – GKA, které vedou k snížení hodnoty S0,5 glukózy (koncentrace substrátu, při které je rychlost enzymatické reakce poloviční) a zvýšení kcat (katalytické konstanty). Vývoj GKA byl do znač-
118
kontroly
T651
W99R
V455M
né míry ovlivněný i nalezením souvislosti mezi syndromem PHHI a aktivující mutací genu pro GK (V455M). Tato mutace lokalizovaná v oblasti allosterické „kapsy“ glukokinázy zvýšila její afinitu ke glukóze, zatímco ostatní kinetické konstanty a parametry enzymu zůstaly nezměněné. Tento přirozeně se vyskytující experiment posloužil jako důkaz (proof of concept) možnosti využití GKA v léčbě diabetu. Společná krystalizace GKA a GK totiž prokázala, že se tyto látky vážou právě v oblasti allosterického vazebního místa glukokinázy (9,26). Během několika posledních let byla nalezena řada různých aktivátorů glukokináz. Jejich společným rysem je snížení S0,5 glukózy, ovšem účinky na ostatní kinetické parametry (Vmax, koncentrace, kcat, Hillův koeficient) glukokinázy jsou rozdílné. Jaké jsou dosavadní experimentální poznatky o účincích GKA? 1) GKA zvyšují efekt glukózy na inzulinovou sekreci izolovaných potkaních i lidských pankreatických ostrůvků a zesilují glukózou zprostředkovanou indukci pankreatické GK (9,26). 2) U zvířecích modelů diabetu vedlo podávání GKA v clampových studiích k stimulaci inzulinové sekrece, zvýšení syntézy glykogenu a redukci jaterní produkce glukózy. GKA vykazovaly na dávce závislé snižování glykemie (single-dose studie) u rozdílných standardních modelů diabetu 2. typu (ob/ob resp. db/db myš a Zuckerův fa/fa potkan) a rovněž efektivně zlepšovaly exkurze glukózy v tolerančních testech (C57/BL6J a ob/ob myš); (26,7). 3) V 40týdenní studii vedlo podávání aktivátoru glukokinázy k prevenci vývoje hyperglykemie u dietou indukované obézní myši s porušenou glukózovou tolerancí. Podávání GKA těmto myším mělo na konci studie za následek zlepšení glykemických exkurzí v orálním glukózo-tolerančním testu ve srovnání s kontrolní skupinou (26). RO-28-1675 První z objevených molekul specificky aktivujících glukokinázu byla RO-28-1675, která zesiluje jaterní metabolizmus glukózy i glukózou indukovanou sekreci inzulinu. RO28-1675 účinkuje na principu allosterické aktivace (váže se na obdobné místo GK jako některé aktivující mutace). Při vazbě na GK soutěží s glukózou a je antagonizována fruktóza-1-fosfátem. In vitro vede RO-28-1675 k odstranění inhibičního působení GKRP, což naznačuje možné působení tohoto GKA na subcelulárně lokalizovanou hepatální glukokinázu. Perorální podání RO-28-1675 (15–50 mg/kg) vedlo k poklesu glykemie a/nebo zlepšení glukózové tolerance u nediabetických myší (C57BL/6J mice) stejně tak jako u zvířecích modelů diabetu (ob/ob myš, KK-Ay myš, dietou indukovaná obézní C57BL/6J myš a Goto-Kakizaki potkan). Podání RO-28-1675 vedlo dále k poklesu jaterní produkce glukózy (HGP) převyšujícímu samotný supresní efekt hyperglykemie (21,26). DMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
diabetologie GKA 1 a GKA 2 Další z aktivátorů glukokinázy GKA1 a GKA2 zvyšují afinitu GK ke glukóze 4 resp. 11krát. V hepatocytech vedlo podání GKA1 a GKA2 ke stimulaci fosforylace glukózy, glykolýzy a syntézy glykogenu, podobně jako tomu bylo v případě sorbitolu, prekurzoru fruktóza-1-fosfátu, který aktivuje GK nepřímo prostřednictvím oddělení glukokinázy od GKRP. GKA1 a GKA2 dále vedly k translokaci GK z buněčného jádra do cytoplazmy, přičemž tento efekt byl aditivní k působení sorbitolu (nebyl tedy způsobený jen disociací GK a GKRP) a označuje se jako „glucose-like” efekt GKA (1,22). GKA 50 GKA50 je aktivátorem s poměrně silným hypoglykemickým působením. Ve studii in vitro vedlo jeho podání k aktivaci vápníkových kanálů a k stimulaci inzulinové sekrece potkaních a lidských pankreatických ostrůvků a MIN6 buněk. Zvýšení aktivity GK při koncentraci glukózy 1 mmol/l dosáhlo 1,6násobek, při 2 mmol/l 3,4násobek a při 5 mmol/l bylo dokonce 8,3násobné (11). LY2121260 LY2121260 prokazatelně zvyšuje afinitu GK ke glukóze a rychlost enzymatické reakce. V dávce 10 μmol došlo k zvýšení Vmax o 40 % a k poklesu S0,5 glukózy (kontroly 6,8 ± 0,5 mm; LY2121260, 0.4 ± 0,1 mm). Inkubace potkaních ostrůvků s LY2121260 v rozdílných koncentracích při konstantní glykemii 10 mmol/l prokázala na dávce závislý vzestup sekrece inzulinu a rovněž zmnožení hladin glukokinázového proteinu. Dlouhodobé podávání GKA by tak mohlo vést k zlepšení sekreční odpovědi beta-buňky nejen ovlivněním kinetiky GK, ale i zvýšením jejího množství v pankreatu. Efektivita LY2121260 na zlepšení glukózové tolerance byla rovněž prokázána na zvířecích modelech diabetu (25). PSN-GK1 Výrazný hypoglykemizující účinek perorálně podávaného PSN-GK1 byl prokázán při studiích na normálních (C57Bl/6) i diabetických (Zucker, db/db, ob/ob) zvířatech. Zkoumán byl efekt na lidskou jaterní GK, sekreci inzulinu z MIN6 buněk a vychytávání 2-deoxy-D-[3H]glukózy (2-DG) potkaními hepatocyty. Při glykemii 5 mmol/l vedlo podávání PSN-GK1 k 4,3násobné aktivaci GK, 26násobnému zvýšení sekrece inzulinu MIN6 buňkami a 3násobnému nárůstu vychytávání 2-DG hepatocyty. Při delším podávání nebyla zaznamenána tachyfylaxe a úprava glykemie nebyla provázena změnou lipidogramu, hmotnosti jater, obsahu glykogenu či tělesné hmotnosti (7). COMPOUND A Compound A podobně jako předešlé GKA zvyšuje afinitu ke glukóze a maximální rychlost enzymatické reakce glukokinázy. V kulturách izolovaných potkaních ostrůvků pankreatu a hepatocytů vedlo přidání této molekuly k zvýšení sekrece inzulinu resp. zvýšení utilizace glukózy. Během oGTT snížil compound A hladiny glykemie společně s vzestupem plazmatické koncentrace inzulinu zvýšením jaterního glykogenu. V potkaních hepatocytech vedlo podání tohoto GKA k zvýšení koncentrace cytoplazmatické GK prostřednictvím inhibice vazby GKRP na GK (31). ARRY – 403 Tento aktivátor glukokinázy vykazuje v experimentech silný hypoglykemizující efekt na koncentrace glukózy nalačDMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
no i postprandiálně. V podmínkách in vitro vedl k silné aktivaci GK (S0.5 = 0,93 mmol; Vmax = 134 %) ve srovnání s kontrolami. ARRY-403 vykazuje dobrou rozpustnost, buněčnou permeabilitu, nízký potenciál pro lékové interakce, předpokládanou nízkou hepatální klírens a dobrou selektivitu vůči širokému spektru receptorů a enzymů. Při oGTT prováděném na C57Bl/6J myších vykazoval tento GKA na glukóze závislý antihyperglykemický účinek (při perorálním dávkování 3, 10 a 30 mg/kg došlo k redukci plochy pod křivkou (AUC) glykemie o 15, 32, resp. 37 % ve srovnání s 10% redukcí při léčbě sitagliptinem v dávce 30 mg/kg) bez indukce hypoglykemie. Při 28denním podávání 3 mg/kg/den ob/ob myším vedl ARRY-403 k redukci lačných i postprandiálních glykemií na hodnoty zaznamenané u normálních myší, a to bez nežádoucího ovlivnění sérových lipidů či tělesné hmotnosti (32).
SHRNUTÍ Vědecké důkazy o významu glukokinázy při zabezpečování glukózové homeostázy a vlivu aktivátorů glukokinázy na funkci tohoto enzymu ve dvou odlišných tkáních (pankreas resp. játra) staví tuto perspektivní skupinu potenciálních antidiabetických léků do světla zájmu a pozornosti. GKA mohou vést k zvýšení sekrece inzulinu, ale zároveň přimět játra k normalizaci hepatálního vychytávání resp. produkce glukózy u pacientů s diabetem 2. typu. Poprvé se zde tedy jedná o uplatnění dvou základních farmakologických přístupů v jedné molekule (sekretagogum i senzitizér), účinek GKA se navíc zdá být endogenně regulován hladinou glykemie. Simultánní ovlivnění nízkokapacitní regulační i vysokokapacitní zásobní funkce glukokinázy by mohlo vést k vzestupu inzulinové sekrece, poklesu hladin kontraregulačních hormonů, modifikaci autonomního nervového systému společně s přímou stimulací vychytávání glukózy z cévního řečiště a supresí její produkce. To by znamenalo reaktivaci či „vzkříšení“ širokého spektra fyziologických mechanizmů udržujících glukózovou homeostázu, které jsou ovšem u diabetu 2. typu defektní. Jaká jsou možná rizika léčby aktivátory glukokinázy? Obavy panují zejména z excesivní akumulace jaterního glykogenu a/nebo nárůstu proměny glukózy na mastné kyseliny a triglyceridy vedoucí ke steatóze (což bylo zaznamenáno u potkanů s masivní expresí jaterní GK), i když žádný z těchto projevů se nevyskytl u lidí s aktivujícími mutacemi GK nebo u diabetických potkanů dlouhodobě léčených pomocí GKA. Na druhé straně stojí potenciální nebezpečí hyperinzulinemií indukované hypoglykemie (podobně jako u PHHI). V případě aktivujících mutací se ovšem jedná o supra-fyziologickou aktivaci enzymu při normálním metabolizmu glukózy. Situace u osob s diabetem 2. typu je odlišná a citlivé „seřízení“ glukostatu k fyziologickým hodnotám by k hypoglykemiím vést nemělo. Zásadní pro další vývoj a použití aktivátorů glukokinázy ovšem budou výsledky klinických studií zkoumajících účinky GKA u lidí s diabetem. V centru výzkumu budou nadále i aktivující/inaktivující mutace GK, účinky GKA na pankreatické i extrapankreatické glukózosenzitivní buňky exprimujcí glukokinázu a biofyzikální a biochemické experimenty detailněji zkoumající samotnou molekulu glukokinázy. Všechny tyto kroky mohou přispět k vývoji zcela nové a efektivní léčby diabetu 2. typu.
119
diabetologie LITERATURA 1. Leighton B, Atkinson A, Coghlan MP. Small molecule glucokinase activators as novel anti-diabetic agents. Biochemical Society Transactions (2005) Volume 33, part 2: 371-374 2. Vionnet N, Stoffel M, Takeda J et al. Nonsense mutation in the glucokinase gene causes early-onset non-insulindependent diabetes mellitus. Nature 356, 721–722 (1992) 3. Froguel P, Zouali H, Vionnet N et al. Familial hyperglycemia due to mutations in glucokinase. Definition of a subtype of diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 328, 697–702 (1993) 4. Glaser B, Kesavan P, Heyman M et al. Familial hyperinsulinism caused by an activating glucokinasemutation. N. Engl. J. Med. 338, 226–230 (1998) 5. Thorens B, Sarkar HK, Kaback HR, Lodish HF. Cloning and functional expression in bacteria of a novel glucose transporter present in liver, intestine, kidney, and beta-pancreatic islet cells. Cell 55, 281–290 (1988). 6. Kodíček M. Biochemické pojmy - výkladový slovník, 1. vydání, 2004, VŠCHT 7. Fyfe M C, White JR, Taylor A, Chatfield R, Wargent E, Printz RL, Sulpice T, McCormack JG., Procter MJ, Reynet C, Widdowson PS, Wong-Kai-In P. Glucokinase activator PSN-GK1 displays enhanced antihyperglycaemic and insulinotropic actions. Diabetologia. 2007 Jun;50(6):1277-87. Epub 2007 Apr 6. 8. Iynedjian PB. Molecular physiology of mammalian glucokinase. Cell Mol Life Sci. 2009 Jan;66(1):27-42. 9. Matschinsky FM, Magnuson MA, Zelent D, Jetton TL., Doliba N, Han Y, Taub R, Grimsby J. The network of glucokinase-expressing cells in glucose homeostasis and the potential of glucokinase activators for diabetes therapy. Diabetes. 2006 Jan;55(1):1-12. 10. Schuit FC, Huypens P, Heimberg H, Pipeleers DG. Glucose sensing in pancreatic beta-cells: a model for the study of other glucose-regulated cells in gut, pancreas, and hypothalamus. Diabetes. 2001 Jan;50(1):1-11. 11. Johnson D, Shepherd RM, Gill D, Gorman T, Smith DM, Dunne MJ. Glucose-Dependent Modulation of Insulin Secretion and Intracellular Calcium Ions by GKA50, a Glucokinase Activator. DIABETES, VOL. 56, JUNE 2007: 1694-1702 12. Al-Hasan, H, Tschöp MH, Cushman SW. Two birds with one stone: novel glucokinase activator stimulates glucose-induced pancreatic insulin secretion and augments hepatic glucose metabolism. Mol Interv. 2003 Oct;3(7):367-70. 13. Guertin KR, Grimsby J. Small molecule glucokinase activators as glucose lowering agents: a new paradigm for diabetes therapy. Curr Med Chem 2006; 13(15):1839-43. 14. Grimsby J, Berthel SJ, Sarabu R. Glucokinase activators for the potential treatment of type 2 diabetes. Curr Top Med Chem 2008; 8(17):1524-32. 15. Sarabu R, Grimsby J. Targeting glucokinase activation for the treatment of type 2 diabetes--a status review. Curr Opin Drug Discov Devel 2005 Sep; 8(5):631-7. 16. Nishimura T, Iino T, Mitsuya M, Bamba M, Watanabe H, Tsukahara D, Kamata K, Sasaki K, Ohyama S, Hosaka H, Futamura M, Nagata Y, Eiki JI. Identification of novel and potent 2-amino benzamide derivatives as allosteric glucokinase activators. Bioorg Med Chem Lett 2009 Jan 21. 17. McKerrecher D, Allen JV, Caulkett PWR, Donald CS, Fenwick ML, Grange E, Johnson K M, Johnstone C, Jones CD, Pike KG, John W, Rayner and Rolf P. Walker. Design of a potent, soluble glucokinase activator with excellent in vivo efficacy . Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. Volume 16, Issue 10, 15 May 2006, Pages 2705-2709 18. Bertram LS, Black D, Briner PH, Chatfield R, Cooke A, Fyfe MC, Murray PJ, Naud F, Nawano M, Procter MJ, Rakipovski G,
120
Rasamison CM, Reynet C, Schofield KL, Shah VK, Spindler F, Taylor A, Turton R, Williams GM, Wong-Kai-In P, Yasuda K . SAR, Pharmacokinetics, Safety, and Efficacy of Glucokinase Activating 2-(4-Sulfonylphenyl)-N-thiazol-2-ylacetamides: Discovery of PSNGK1. J Med Chem 2008 Jun 28. 19. Coghlan Matthew1 Leighton Brendan1 Glucokinase activators in diabetes management. Expert Opinion on Investigational Drugs, Volume 17, Number 2, February 2008 , pp. 145-167(23) 20. Kamata K, Mitsuya M, Nishimura T, Eiki J-I, Nagata Y. (2004) Structure 12, 429–438 21. Grimsby J, Sarabu R, Corbett WL, Haynes NE, Bizzarro FT, Coffey JW, Guertin KR, Hilliard DW, Kester RF, Mahaney PE, Marcus L, Qi L, Spence CL, Tengi J, Magnuson MA, Chu CA, Dvorozniak MT, Matschinsky FM, Grippo JF. Allosteric activators of glucokinase: potential role in diabetes therapy. Science. 2003 Jul 18;301(5631):370-3. 22. Brocklehurst KJ, Payne VA, Davies RA, Carroll D, Vertigan HL, Wightman HJ, Aiston S, Waddell ID, Leighton B, Coghlan MP. Stimulation of Hepatocyte Glucose Metabolism by Novel Small Molecule Glucokinase Activators. DIABETES, VOL. 53, MARCH 2004, 535–541 23. Gloyn AL, Noordam K, Willemsen MA, Ellard S, Lam WW, Campbell IW, Midgley P, Shiota C, Buettger C, Magnuson MA, Matschinsky FM, Hattersley AT. Insights into the biochemical and genetic basis of glucokinase activation from naturally occurring hypoglycemia mutations. Diabetes. 2003 Sep;52(9):2433-40. 24. Printz RL, Granner DK. Tweaking the glucose sensor: adjusting glucokinase activity with activator compounds. Endocrinology. 2005 Sep;146(9):3693-5. 25. Efanov AM, Barrett DG, Brenner MB, Briggs SL, Delaunois A, Durbin JD, Giese U, Guo H, Radloff M, Sanz Gil G, Sewing S, Wang Y, Weichert A, Zaliani A, Gromada J. A novel glucokinase activator modulates pancreatic islet and hepatocyte function. Endocrinology 2005; 146:3696–3701 26. Matschinsky FM, Magnuson MA. Glucokinase and glycemic disease. Frontiers in Diabetes, Volume 16. S. Karger,2004, Basel, Switzerland 27. Matschinsky FM, Ellerman JE. Metabolism of glucose in the islets of Langerhans. J Biol Chem 243:2730 –2736, 1968 28. Magnuson MA, Shelton KD. An alternate promoter in the glucokinase gene is active in the pancreatic beta cell. J Biol Chem 264:15936 –15942, 1989 29. Magnuson MA. Glucokinase gene structure: functional implications of molecular genetic studies. Diabetes 39:523–527, 1990 30. Njølstad PR, Sagen JV, Bjørkhaug L, Odili S, Shehadeh N, Bakry D, Sarici SU, Alpay F, Molnes J, Molven A, Søvik O, Matschinsky FM. Permanent neonatal diabetes caused by glucokinase deficiency: inborn error of the glucose-insulin signaling pathway. Diabetes. 2003 Nov;52(11):2854-60 31. Futamura M, Hosaka H, Kadotani A, Shimazaki H, Sasaki K, Ohyama S, Nishimura T, Eiki J, Nagata Y. An allosteric activator of glucokinase impairs the interaction of glucokinase and glucokinase regulatory protein and regulates glucose metabolism. J Biol Chem. 2006 Dec 8;281(49):37668-74. Epub 2006 Oct 6. 32. http://www.arraybiopharma.com/ 33. Danial NN, Gramm CF, Scorrano L et al. BAD and glucokinase reside in a mitochondrial complex that integrates glycolysis and apoptosis. Nature 424, 952–956 (2003).
MUDr. Tomáš Edelsberger Říční okruh 28 794 01 Krnov e-mail:
[email protected] DMEV • ROČNÍK 12 • 2009 • ČÍSLO 3
