Patogenní bakterie šířené potravinami, indikátorové mikroorganismy Sabina Purkrtová Mikrobiologické zkoumání potravin
Obsah • • • • •
Onemocnění z potravin – definice Zažívací trakt Bakteriální toxiny Výskyt onemocnění z potravin Jednotlivé skupiny patogenů a indikátorových mikroorganismů
2
Onemocnění z potravin Definice onemocnění z potravin (foodborne disease) dle Světové zdravotnické organizace (the World Health Organization - WHO) „Jakákoliv nemoc infekční nebo toxické povahy, u které je známo nebo je domněnka, že byla způsobena požitím potravin nebo vody“ • Primárně jsou tato onemocnění spojena s gastrointestinálním traktem a vykazují symptomy jako průjem a/nebo zvracení, mohou být však také přítomny další symptomy jako paralytické otravy z mořských plodů, botulismus, listerióza, stejně jako ty způsobené toxickými chemikáliemi • Nezahrnují ale potravinové alergie a intolerance 3
Onemocnění z potravin • Většina je mikrobiálního původu (100 000 častější než např. z důvodu kontaminace potravin pesticidy) • Pravděpodobně nejvíce rozšířený problém současného světa • Důležitá příčina redukce ekonomické produktivity
4
Onemocnění z potravin Různé typy onemocnění • Obvykle akutní gastroenteritida spojená se zažívacím traktem charakterizovaná průjmem a zvracením, často popisovaná jako „otrava z jídla“ (ačkoliv mechanismy vzniku mohou být různé) • Některá onemocnění však působí i mimo zažívací trakt, který tak slouží pouze jako vstup patogenů či toxinů do těla (tyfoidní horečka, botulismus, listerióza) • Spektrum od relativně mírných, samolimitujících gastrointestinálních problémů po život ohrožující stavy (botulismus)
Některé onemocnění mohou způsobit závažné následné komplikace • Hemolyticko-uremický syndrom u 10 % E. coli O157:H7 infections • Neurologické onemocnění Guillain-Barre´ syndrom u 0.1% kampylobakterióz
Některé skupiny jsou více susceptibilní • K více závažným důsledkům • Starší lidé, kojenci a malé děti, imunokompromizovaní pacienty v důsledku nemoci či chemoterapie
5
Gastrointestinální trakt Funkce: Trávení a absorpce jídla a vylučování odpadních látek Ústa Sliny: zásadité, obsahují škrob degradující enzymy (amylasy), antimikrobiální imunoglobuliny (IgA), lysozym, laktoferrin a laktoperoxidasu Mikroflora • Záleží na konzumovaném jídle a podmínkách mikroprostředí • Zubní plak na zubech – organický biofilm, ve kterém jsem bakterie usazeny v matrici z glykoproteinů obsažených ve slinách a mikrobiálních polysacharidů • Běžní zástupc: vláknité Fusobacterium streptokoky http://www.gistsupport.org/about-gist/what-is-gist.php
6
Gastrointestinální trakt
Mikroflóra • Počet mikroorganismů je nízký • lactobacilli jsou často nalézány přichyceny na žaludeční stěně http://www.gistsupport.org/about-gist/what-is-gist.php
Žaludek • kyselé žaludeční šťávy (HCl) • proteasy (pepsin), lipasy • Částečná natrávenin jídla a žaludečních kyselin (chymus) je posunována do tenkého střeva • pH: 0.8-5.0 (obvykle 2.0-3.0) • zabíjí většinu bakterií • Normálně přežijí pouze acidotolerantní vegetativní buňky a spóry • bakterie mohou uniknout • chráněny v částech jídla • rychlým průchodem jídla (např. plný žaludek) • při neutralizaci kyseliny jídlem • Při nedostatečné kyselosti např. v důsledku nemoci
7
Gastrointestinální trakt Tenké střevo – trávení a absorpce • dlouhé 6 m, násobně zahnuté • pokryté výstupky nebo villi (pokryté microvilli) – absorpce živin a vody, pasivně nebo častěji proti koncentračnímu gradientu Duodenum (2 %) • Trávenina smíšená s trávicími šťávami z pankreatu a žlučí ze žlučníku (neutralizace, emulsifikace tuků žlučovými solemi) • Trávicí enzymy pro disacharidy a peptidy Lieberkühnových komůrek in the duodenum Jejunum a ileum • Jídlo je posouváno peristaltikou, pomaleji vzhledem k absorbpci vody Mikroflóra: http://www.gistsupport.org/about-gist/what-is-gist.php • hlavně laktobacily and streptokoky • postupně se zvyšuje z duodena (102-103/ml) k jejunu (103-104/ml), hornímu tračníku (105/ml) and dolnímu tračníku (106/ml) • V duodenu přežívají pouze mikroorganismy schopné se přichytit vzhledem k rychlosti posunu tráveniny
8
Gastrointestinální trakt Tlusté střevo • Aktivní absorpce vody a solí • delší doba průchodu – extenzivní bakteriální růst • stolice • bakteriální buňky 25-30 % (1010-1011 KTJ/g) • Nestravitelné zbytky jídla • epiteliální buňky ze zažívacího traktu • minerály a žluč Mikroflóra • obligátní anaerobové Bacteroides and Bifidobacterium (99 %) • Enterobacteriaceae (nejvíce E. coli – B12 produkce) – kolem 106 KTJ/g http://www.gistsupport.org/about-gist/what-is-gist.php • enterokoky 105 KTJ/g Střevní mikroflóra = tenké a tlusté střevo • Lactobacillus, Clostridium and Fusobacterium Více než 400 druhů 3- 105 KTJ/g 10 Asi 1014 více než počet buněk lidského • Ostatní jako kvasinky, stafylokoky a těla pseudomonády na nižších úrovních (Např. Clostridium difficile je přítomno ve velmi • Běžná střevní mikroflóra – ochrana proti infekci nízkých počtech, ale při porušení rovnováhy např. ATB léčbou, může kolonizovat střevo za uvolňování toxinů toxins)
9
TOXINY Dva typy bakteriálních toxinů Lipopolysacharidy (LPS) – přítomny v buněčné stěně gramnegativních bakterií – součást vnější membrány – uvolněny až lýzí buňky = ENDOTOXINY (released after cell lysis) pyrogenní (horečku vyvolávající) Proteiny – obvykle uvolňovány patogenními bakteriemi do extracelulárního prostředí – poté se jedné EXOTOXINY
http://classes.midlandstech.com/carterp/Courses/bio225/chap15/15-04_Toxins_1.jpg
10
BAKTERIÁLNÍ TOXINY - PROTEINY
http://figures.boundless.com/10434/full/99-0206-f1.jpe
Proteinové toxiny – specifita • vysoce specifická cytotoxická aktivita (atakují pouze specifické buňky – tetanus, botulotoxiny) • širokospektrá cytotoxická aktivita vedoucí k nespecifickému odumírání tkání (nekrózy) • fosfolipasy – relativně nespecifické • pouze některé letální (např. anthrax toxin)
Proteinové toxiny připomínají enzymy • jsou to proteiny s vysokou biologickou aktivitou (obvykle katalytickou), které vykazují specifitu působení (vzhledem k substrátu a typu působení) • denaturace teplem, kyselinami, proteolytickými enzymy • Jednotlivé podskupiny jsou pojmenovány vzhledem k cíli jejich působení • „enterotoxin“ – působí na střevní sliznici za vyvolání průjmu • „neurotoxin“, „leukocidin“, „hemolysin“ Obvykle složeny ze dvou jednotek : podjednotka A: enzymaticky aktivní podjednotka B: vazba na specifický receptor na hostitelské buněčné membárně a přenos 11 enzymatické podjednotky přes ni
LIPOPOLYSACHARIDY
http://www.slideshare.net/MMASSY/bacterial-toxins
http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/lipidA/Figure1.png
Endotoxiny • tepelně stabilní (k destablizaci nedochází ani po 30 min varu) • Méně účinné a specifické v jejich působe, nepůsobí enzymaticky • Uvolňovány při množení či dezintegraci bakterií – signifikantně přispívají k symptomům bakterémie a septikémie vyvolaných gramnegativními bakteriemi Lipid A je toxickým komponentem • velice silný stimulant imunitního systému • Reaguje s povrchem makrofágů, které v rámci pathofyziologické odpovědi uvolňují cytokiny • Při vysokých koncentracích tak může způsobit šok až smrt vzhledem k nadměrné a nekontrolovatelné imunitní odpovědi 12
BAKTERIÁLNÍ ONEMOCNĚNÍ Z POTRAVIN – TYPY Intoxikace Toxiny mohou být bakteriemi produkovány již v potravině – požití toxinu v potravině Relativně krátká inkubační doba, absence interpersonálního šíření • Staphylococcus aureus enterotoxiny, Bacillus cereus – emetický syndrom • Botulismus (gastrointestinalní symptomy jsou ale zcela podružné)
Neinvazivní infekce Živé bakterie kolonizují střevní lumen přichycením na epiteliální struktury pomocí adhesinů (obvykle tenké střevo – méně intenzivní kompetice) Následně produkují enteroxotiny • měnící průchod elektrolytů a vody přes mukózu z absorpce na sekreci • nebo stimulující enterocyty nadprodukcí cyklických nukleotidů
13
BAKTERIÁLNÍ ONEMOCNĚNÍ Z POTRAVIN – TYPY Invazivní infekce • Bakterie invadují do buňky, ale normálně se nešíří mimo bezprostřední okolí zažívacího ústrojí (gut) • Salmonella preferenčně proniká v ileu • Prochází skrze epiteliální buňky a množí se v lamina propria • produkce tepelně labilních enterotoxinů a cytotoxinů vede k lokální zánětlivé infekci (horečka, zimnice), která zvyšuje hladinu prostaglandinů, aktivátorů adenylát cyklasy (vodnatý průjem)
• Shigella a enteroinvasivní E. coli obsazují sliznici střeva • Adherují na enterocyty přes adhesiny na vnější membráně – dochází k jejich proniknutí do cytoplazmy fagocytózou • v cytoplazmě dochází k jejich pomnožení a průniku do sousedních buněk a níže ležících tkání • silná zánětlivá odpověď • dysenterický syndrom = zánět, abcesy nebo ulcerace střeva, průjem s krví nebo stolice se slizem a hnisem • Některé též produkují Shiga toxin – role v patogenezi zůstává neznámá 14
INVAZIVNÍ INFEKCE Invazivní infekce
http://www.mdpi.com/2072-6651/6/2/430/htm
15
CHOLERA TOXIN • • •
• •
•
•
•
http://www.nature.com/nrgastro/journal/v8/n12/fig_tab/nrgastro.2011.174_F2.html It binds to and ADP-ribosylates Gs, stimulating the AC complex to produce increased cellular levels of cAMP, leading to activation of PKA, phosphorylation of the major chloride channel, CFTR, and secretion of chloride (Cl−) and water.
•
produkován Vibrio cholerae molekulová hmotnost 84 kDa po strávení kolonizuje Vibrio cholerae tenké střevo a dochází k sekreci cholera toxinu pět B podjednotek se váže na specifické receptory enterocytů (gangliosidy) Jediná podjednotka A prochází hydrofilním kanálem v buněčné membráně podjednotka A enzymaticky přenáší ADPribosyl skupinu na protein regulující adenylát cyklasu, která je tak uzamčena v aktivním stavu dochází k akumulaci cyklického adenosis monofosfátu (cAMP) je inhibována absorpce iontů Na+, Cl-, zatímco sekrece iontů Cl-, HCO3- a Na+ je stimulována pro udržení osmotické rovnováhy dochází k sekreci vody do střevního lumen, která převyšuje jeho absorpční schopnosti – vodnatý průjem 16
CHOLERA-LIKE TOXIN Tepelně labilní toxin (LT) produkován některými typy enterotoxigenních E. coli – působí stejně jako cholera toxin Tepelně stabilní toxin Produkován E. coli – podobným způsobem stimuluje produkci cGMP (cyclic guanosine monophosphate), sice částečně odlišného od cAMP, avšak se stejným výsledkem – průjem v důsledku elektrolytické disbalance http://ocw.tufts.edu/data/2/191262/191297_xlarge.jpg
CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ENTEROTOXINY Uvolňovány během sporulace v tenkém střevě Působení se skládá (1) aktivace (2) Navázání na buněčné receptory (3) Tvorba perforací ve střevních epiteliálních buňkách sledem reakcí, což vede ke zvýšení permeability membrány k malým makromolekulám (<200 Da) http://enhs.umn.edu/current/5103_spring2003/perfringens/perfmetabolic.html
17
SHIGA TOXIN SHIGA TOXIN • Inhibuje proteosyntézu inaktivací 60S ribozomální podjednotky • Cytotoxická, neurotoxická aktivita • Jako enterotoxin způsobuje akumulaci tekutin – role v patogenesi neznámá
http://www.mdpi.com/2072-6651/3/6/626/htm
Shiga toxins are a čeleď of related toxins with two major groups, Stx1 and Stx2, expressed by genes considered to be part of the genome of lambdoid prophages. The toxins are named for Kiyoshi Shiga, who first described the bacterial origin of dysentery caused by Shigella dysenteriae. The most common sources for Shiga toxin are the bacteria S. dysenteriae and the shigatoxigenic group of Escherichia coli (STEC), which includes serotypes O157:H7, O104:H4, and other enterohemorrhagic E. coli (EHEC). 18
SEKREČNÍ SYSTÉM TYP III
http://webdeptos.uma.es/genetica/tipoiii/Imagenes/Type_III_Sc heme.jpg
•
http://www.nature.com/nature/journal/v406/n6797/images/406768aa.2.jpg
Sekreční systém typu III je použit pro sekreci signálních bakteriálních proteinů přímo do hostitelské buňky, kde ji přeměňují tak, že dojde k receptory zprostředkované endocytóze bakteriální buňky http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1a/Endocytosis_types.svg/1280pxEndocytosis_types.svg.png
19
Onemocnění z potravin
Adams a Moss, 2008
20
Onemocnění z potravin
Adams a Moss, 2008
21
Onemocnění z potravin
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/3991.htm
22
Onemocnění z potravin
http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/3991.htm
23
Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 Potraviny nesmějí obsahovat mikroorganismy nebo jejich metabolity v závislosti na předpokládaném zdravotním riziku
1. Kritéria bezpečnosti potravin (platí během doby údržnosti) nutnosti monitorovat v různých typech potravin vybrané druhy mikroorganismů anebo jejich metabolity v závislosti na předpokládaném zdravotním riziku spotřebitele daného typu výrobku průkaz nepřítomnosti Listeria monocytogenes Salmonella spp. či Salmonella Typhimurium a Salmonella Enteritidis Cronobacter spp. Shiga toxin produkujících E. coli (STEC) určitých sérotypů stafylokokových enterotoxinů stanovení počtu KTJ/g, ml v určitém limitu E. coli L. monocytogenes stanovení koncentrace v určitém rozmezí histamin (biogenní amin - vzniká působením bakterií (bakteriální dekarboxylací) z aminokyseliny histidinu – zvláště ryby)
Nařízení komise (ES) č. 2073/2005 2. Kritéria hygieny výrobního procesu - indikují hygienickou přijatelnost a/nebo bezpečnost V jednotlivých skupinách výrobků • maso a výrobky z něj • mléko a mléčné výrobky • vaječné výrobky • produkty rybolovu • zelenina a ovoce a výrobky se v závislosti na typu výrobku provádí stanovení počtu KTJ/g, ml, cm2 aerobních mikroorganismů Enterobacteriaceae E. coli koaguláza pozitivních stafylokoků presumptivních B. cereus průkaz nepřítomnosti Salmonella spp. 3. Pravidla pro odběr vzorků a přípravu zkušebních vzorků
Indikátorové mikroorganismy • Mikroflóra potraviny se mění v průběhu výroby, zpracování, distribuce, skladování a prodeje jak po kvalitativní, tak po kvantitativní stránce. • Nelze vyšetřovat potraviny na výskyt všechn nežádoucích mikroorganismů. • Jsou proto vytipovány tzv. indikátorové mikroorganismy – určité druhy, rody a skupiny bakterií, jejichž počty v potravinách jsou obrazem mikrobiologické „situace“ v potravině, vodě či výrobním zařízení
26
Indikátorové mikroorganismy • Pro potravinářské provozy jsou počty (KTJ/g, ml) indikátorových mikroorganismů odrazem úrovně hygieny a sanitace potravinářských provozů a ukazují na možnou fekální kontaminaci potravin. • Pro potraviny zvýšené počty (KTJ/g, ml) indikátorových mikroorganismů mohou ukazovat na sekundární kontaminaci nebo nedostatky v technologii výroby potravin (nedostatečné tepelné opracování, přerušení chladírenského řetězce, apod.), případně informovat o probíhajícím kažení potravin.
27
Indexové mikroorganismy • Tzv. indexové mikroorganismy upozorňují na možnou přítomnost choroboplodnodných zárodků v potravině nebo vodě upozorňují – Např. výskyt E. coli (fekální kontaminace) v pitné vodě upozorňuje na potenciální přítomnost Salmonella Typhi nebo jiných závažných střevních patogenů – Indexové mikroorganismy: • E. coli • koliformní termotolerantní mikroorganismy stanovované jak v potravinách, tak v pitné vodě.
28
Indikátorové mikroorganismy • informují o primární nebo sekundární kontaminaci surovin, potravin, obalů a ploch přicházejících do styku s potravinami a o dodržování zásad správné výrobní a hygienické praxe při výrobě a zpracování potravin jsou – celkový počet mikroorganismů (CPM) – počet bakterií čeledi Enterobacteriaceae – počet enterokoků – počet psychrotrofních bakterií – počet termorezistentních a počet termofilních bakterií. 29
Indikátorové mikroorganismy • informují především o kažení potravin – počet kvasinek a plísní – počet aerobních sporotvorných bakterií – počet anaerobních sporotvorných bakterií – počet proteolytických bakterií – bakterie rodu Proteus – Celkové počty mikroorganismů (CPM) – počty bakterií čeledi Enterobacteriaceae – počty psychrotrofních a koliformních bakterií. 30
Bacillus cereus Fyziologické a biochemické vlastnosti: • grampozitivní, tvoří spóry • Fakultativně anaerobní • Velké vegetativní buňky, typicky 1,0 mm x 3,0–5,0 mm v řetízcích • Elipsoidní spóry jsou umístěny centrálně, nezduřují buňku • Teplota růstu: 8 - 55 °C, optimum 28–35 °C • Žádná význačná rezistence k nízkému pH (min. 5.0–6.0 v závislosti na kyselině) or nízké vodní aktivitě (min. ~0,95) • Spóry vykazují variabilní tepelnou odolnost: • D hodnoty při 95 °C v fosfátovém pufru jsou mezi 1-36 min, rezistence závisí na sérotypu Výskyt • Široce rozšířen v prostředí (ubikvitní) – půdnídwelling saprofyt • Izolován z půdy, vody a vegetace, běžná součást přechodné střevní mikroflóry u lidí
https://www.flickr.com/photos/peteredin/400555369
http://www.microregistrar.com/wpcontent/uploads/2014/07/Bacillus-cereus-on-blood-agar.jpg
31
Bacillus cereus group Bacillus cereus group – půdní saprofyté, kteří však příležitostně způsobují široké spektrum onemocnění u lidí, včetně otrav z jídla, systematickýh infekcí a vysoce letálních forem antraxu Kontroverzní historická taxonomie je založen pouze na několik odlišných fenotypických vlastnostech B. anthracis – původce antraxu B. cereus- dvě formy otravy z jídla se symptomy zvracení nebo průjmu B. mycoides – nepatogenní druh tvořící odlišitelné rhizoidní formace kolonií B. thuringiensis - tvoří parasporální krystalové proteiny, může být toxický pro hmyz či obratlovce B. weihenstephanensis – psychrotrofní fyziologie Fenotypově a klasickou DNA hybridizací nemohou být tyto taxony jednoznačně odlišeny – lze je považovat za jeden druh Ale vzhledem k patogenitě B. anthracis a aplikaci B. thuringiensis v biokontrolách bylo zachováno toto odlišení do druhů Xavier Didelot et al., “Evolution of Pathogenicity in the Bacillus Cereus Group.,” Systematic and Applied Microbiology 32, no. 2 (April 2009): 81–90, doi:10.1016/j.syapm.2009.01.001.
32
Bacillus cereus
Adams and Moss, 2008
33
Bacillus cereus Diarrhoealní syndrom • Podobný otravě z jídla způsobené Clostridium perfringens • Ve střevě dochází k produkci dvou tří-komponentních enterotoxinů : • hemolytický enterotoxin HBL (consisting of three proteins B, L1 and L2) • nehemolytický enterotoxin (NHE) • Některé kmeny produkují HBL i NHE, některé pouze jeden z nich • Tyto toxiny, tepelně senzitivní a senzitivní k proteolytickým enzymům (trypsin, pepsin jsou produkovány v pozdní exponenciální/rané stacionární fázi růstu • váží se na buňky epitelu, kde rozrušují jejich membránu • Mohou být též produkovány v potravině, ale vzhledem k jejich senzitivitě k nízkému pH a proteolýze a relativně dlouhé inkubační době, je onemocnění způsobeno primárně jejich produkcí ve střevě
34
Bacillus cereus Emetický syndrom • podobný enterotoxikóze způsobené Staphylococcus aureus • Způsoben emetickým toxinem tvořeným v jídl • emetický toxin – cereulid • a 1.2 kDa cyklický peptid • odolný tepelně a ke kyselinám • produkován v pozdní exponenciální fázi růstu • působí vazbou a stimulací nervus vagus
http://www.chiralix.com/rightclick.cfm?id=67352#
cereulide cyclo[-Val-1-13C-D-O-Leu-D-Ala-3-13C-O-Val-]3
35
Bacillus cereus •
Spóry jsou rezistentní k vysušení a záhřevu •
tyto bacily jsou široce rozšířeny v prostředí, ale pouze jako malá část celkové mikroflóry
• •
K selekci spór na úkor ostatní mikroflóry dochází během záhřevu Spóry následně vyklíčí a vyrostou, pokud je připravené jídlo skladováno v nevhodných teplotních podmínkách, zvláště u potravin s vysokou vodní aktivitou aw (např. omáčky při pokojové teplotě) Emetický syndrom Diarrhoealní syndrom • Škrobové potraviny jako rýže a těstovinové • Masné produkty, pokrmy polévky, zelenina, • typicky: rýže připravené dopředu ve velkém pudinky a omáčky, objemu med • chlazení pod below 8 °C nemusí být účinné, • Sušené bylinky a vzhledem k jeho nízké rychlosti v centru pokrmu koření used in food • znovuohřev nezničí emetický toxin preparation http://whatscookingamerica.net/Informati on/Pepper/MultiPeppercorns.JPG
http://www.howtoboil.net/wpcontent/uploads/2012/05/boil-rice.jpg
Mléko a mléčné produkty: • Izolován z pasterizovaného mléka či smetyn skladované v nevhodných teplotních podmínkách, ale zřídka spojeno s infekcí – prostředí není vhodné pro tvorbu toxinu 36
http://www.nidsun.com/wp-content/uploads/2014/02/pad-tang-tek-noodles.jpg
Staphylococcus aureus • Grampozitivní kok (kolem 1 µm in průměru) • Buněčné dělení ve více rovinách – vede ke vzniku nepravidelných shluků tvaru vinných hroznů (staphylus) • žlutě pigmenotvané kolonie (aureus – zlaty) • Fakultativní anaerob • katalasa pozitivní, oxidasa negativní catalase-positive, • koagulasa pozitivní • Růstová teplota: 7 - 48 °C, optimum 37 °C https://www.flickr.com/photos/peteredin/400555369 • Nevýrazná teplotní rezistence • D62 =20–65 s, D72 = 4.1 s (mléko) • pH rozsah: 4.0 and 9.8–10.0, pH optimum: 6–7 • halotolerantní: 5-7 % NaCl, některé kmeny až ~20 % NaCl • Tolerance k redukované vodní aktivita: aw (>0.83) Králičí plazma
http://bioquelljp.studiorepublic.com/technology/micro biology/community-associated-methicillin-resistantstaphylococcus-aureus-ca-mrsa/ http://www.uwyo.edu/molb2210_lect/medmic ro/images/coagulase1.jpg
http://apchute.com/wellmeyer/media/Coagulneg.jpg
37
Staphylococcus aureus Výskyt: • Kůže, kožní žlázy a mukozní membrány u teplokrevných zvířat, velice často u vyšších primátů • U lidí nacházen u 20–50% zdravých jedinců (nosní trakt) • běžně neškodný parazit • Metabolizuje kožní produkty a brání kolonizaci kůže jinými mikroorganismy • Menší abcesy (vřídky) • oportunní patogen – může vyvolat vážnější kožní onemocnění při porušení kožní bariéry či nízké rezistenci hostitele • Sporadicky izolován z dalších environmentálních zdrojů jako půda, moře, řeky, rostliny, prach a vzduch......
http://www.hal.kagoshima-u.ac.jp/dental/Saikin/english/study1.html
38
Staphylococcus aureus
http://www.slideshare.net/FarirahNoi/staphylococcal-food-poisoning24597599
Pinchuk et al., 2010
Stafylokokové toxikózy • intoxikace • 1-8 h po jídle (i pouze 30 min) • těžké nevolnost a zvracení, žaludeční křeče, průjem • Způsobeny stafylokokovými enterotoxiny • Tepelně odolné • Odolné širokému rozsahu pH • Odolné proteasám http://femsre.oxfordjournals.org/content/36/4/815/F1.large.jpg
39
Staphylococcus aureus Potraviny • Přítomnost malého množství v potravině není neběžná, ale je špatný kompetitor, takže dochází k inhibici růstu – ke kontaminaci poté dochází křížovou kontaminací při úpravě potravin • Přirozeně v drůbežím a syrovém masu • Syrové mléko – mastitida dojnic Případy (outbreaks) • Přítomnost enterotoxin produkujícícho kmene S. aureus + podmínky pro jeho tvorbu • Sušené mléko a čokoláda • Růst a produkce enterotoxinu v syrovém mléce, enterotoxiny přežijí pasterizaci • Drůbeží produkty a studené, vařené maso • Soloné maso • Inhibice velké části kompetitivní mikroflóry, zatímco S. aureus není ovlivně • Jídla v bufetu • Připraveny dopředu, skladovány při pokojové teplotě či nedostatčně chlazeny • Konzervy • Prostředí bez kompetitorů • Tvrdé sýry, studená sladká jídla, krémy, krémem plněné pečivo, zmrzlina
http://www.slideshare.net/FarirahNoi/staphylococcal-food-poisoning24597599
40
Listeria monocytogenes • Grampozitivní tyčinky (0,4–0,5 mmx0,5–2,0 mm) • Při kultivaci při teplotě 20–25 °C tvoří peritrichní bičíky s charakteristickou vrtivou motilitou • fakultativně anaerobní • růstová teplota: 0–42 °C, optimum 30 - 35 °C • tepelná odolnost podobná jiným nesporulujícím G+ • D60 ~ několik min, D70 ~ několik s • pH: inhibice růstu pod pH 5.5
http://www.foodqualitynews.com/Industry-news/EFSA-calls-for-Listeria-risk-data
• minimální pH závisí jak na kmeni, tak na použité kyselině (mezi 5.6 a 4.4)
• Poměrně halotolerantní • schopna růst do 10% NaCl • Přežití rok v 16% NaCl při pH 6,0 • katalasa pozitivní, oxidasa negativní http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xlm/xlm01.html
41
Listeria monocytogenes Ros Listeria má šest druhů, dva z nich patogenní: • L. monocytogenes – listerióza • L. ivanovii – zvířecí patogen • L. innocua, L. seeligeri, L. welshimerii, L. grayi
Listeria monocytogenes produkuje listerolysin O • 58 kDa b-hemolysin, • Působí synergisticky s hemolysinem produkovaným Staphylococcus aureus = zvýšená hemolýza na krevním agaru • CAMP test after Christie, Atkins, and MunchPeterson
L. monocytogenes
Rhodococus equi
L. ivanovii
Krevní agar Min. 1 cm
L. inocua CAMP test
1-2 mm
Staphylococcus aureus 42
Listeria monocytogenes Výskyt • Ubikvitní v prostředí • Izolována z mořských i sladkých vod, půdy, čistíren, hnijící vegetace, siláží Potraviny • Schopna růst na většině nekyselých potravin • Relativně rezistentní k udícím procedurám • případy • Syrová zelenina • lahůdky • Uzené ryby (např. losos) • syrové a pasterizované mléko (křížová kontaminace) • Měkké sýry • Špatně přežívá v nezrajících měkkých sýrech (cottage sýry) • Dobře přežívá ve zrajících sýrech (typy Camembert, Brie) • Mikrobiální utilizace laktátu během zrání – uvolněné aminy zvyšují povrchové pH – listerie mají podmínky pro pomnožení na nebezpečnou úroveň 43
Listeria monocytogenes Fakultativně intracelulární patogen • Přežívá a množí se (monocyty) v buňkách makrofágů • proniká přes Peyerovy pláty (součást slizničního imunitního systému tenkého střeva) nebo enterocyty • endocytosa makrofágy je vyvolána virulenčními faktory (internalin, listeriolysin O etc.) • uvolnění a replikace v cytoplazmě makrofágů • Pouze 10% monocytů je při invazi úspěšných • Přenos k další buňce přes obklopení hostitelskými aktinovými vlákny, což umožňuje uniknout imunitnímu systému • Šíření v těle z mezenterických lymfatických uzlin skrze krev • Játra • Možná eliminace a kontrola infekce • Infikované hepatocyty – intenzivní zánětlivá odpověď – destrukce neutrofily spolu s bakteriemi • Pokud infekce v játrech není pod kontrolou, dojde k výsevu skrze krev až do centrálního nervového systému nebo placenty
http://textbookofbacteriology.net/Listeria_2.html
http://alicelebreton.free.fr/research.html
44
Listeria monocytogenes Listerióza
http://www2.kaiyodai.ac.jp/~kimubo/english/research/torikumi/1.html
Starší, imunokomprimovaní pacienti septikémie, meningitida, meningoencefalitida, endokarditida Vysoká mortalita 13 - 34% Včasná léčba antibiotiky je základní, ale u většiny těžkých forem zůstává prognóza špatná
Inkubační doba: 1-90 dní, typicky několik týdnů Symptomy: od mírné, chřipce podobné nemoci po meningitidu a meningocefalitidu Pravděpodobnější k propuknutí u těhotných žen • Většinou též podobna chřipce (horečka, bolest hlavy), příležitostně gastrointestinální symptomy, ale transplacentální infekce plodu (potrat, narození mrtvého dítěte, předčasný porod) Infekce novorozenců Rané syndromy (mortalita do 38 %) pneumonia, septikémie až široce vyseté granulomy ve vnitřních orgánech Pozdní syndromy (mortalita do 26 %) nejčastěji meningitida 45
Enterobacteriaceae a koliformní bakterie Čeleď Enterobacteriaceae Nacházena v půdě, vodě, rostlinách a zvířatech a jejich gastrointestinálních traktech Gramnegativní, rovné tyčinky, některé pohyblivé Většina roste dobře při 37 °C, některé lépe při 25 - 30°C, Fakultativně anaerobní, fermentují glukózu Oxidasa negativní a katalasa pozitivní(mimo Shigella dysenteriae type 1), Odolné ke žlučovým solím Salmonella sp., Shigella sp., Yersinia sp., Cronobacter sp. Proteus sp., Hafnia sp., Pantoea sp. etc.
koliformní bakterie = podskupina Enterobacteriaceae Podobné E. coli = coliform Nacházeny jako běžná střevní mikroflóra u lidí a/nebo zvířat, považovány za oportunní patogeny – indikátor fekálního znečištění ve vodě či špatné hygieny/nevhodných skladovacích podmínek u potravin Escherichia sp., zvl. Escherichia coli; Enterobacter sp., Klebsiella sp., Citrobacter sp. Fermentují laktosu (enzym β-D-galactosidase) Escherichia coli β-D-glucuronidasa (app. 97 % of strains), indol positivní 46
Salmonella spp. • Čeleď Enterobacteriaceae • Růstová teplota: 5-47 °C, optimum 37 °C • Tepelně sensitivní, ale více rezistentní při nízké aktivitě vody aw
• V mléce: • D72 = 0,09 min pro nejodolnější S. Senftenberg 775W • D72=0,003 min pro S. Typhimurium • Ale v čokoládové omáčce • D70 =11,3–17,5 h pro S. Typhimurium
• Růstové pH: optimum kolem pH 7
• Minimum pH od 5,4 (kys. octová) do 4,05 (HCl a kyselina citronová)
http://www.urmc.rochester.edu/news/story/uploadedimages/salmon ella-image_2036_250x250.jpg
http://redbook.solutions.aap.org/data/Books/886/116_27.jpeg
47
Salmonella spp. Rod Salmonella obsahuje dva druhy • Salmonella enterica (rozdělen do šesti poddruhů) • Salmonella bongori (dříve označován jako poddruh V) Různé sérotypy (více než 2500) jsou charakterizovány antigenní strukturou = přítomnost White–Kauffmann– Le Minor scheme různých typů O, H a Vi antigenů
Antigenní formule (i) O antigeny písmena a čísla, 69 typů : odděleny čárkou (ii) fáze 1 H antigeny (a-z) : Odděleny dvojtečkou (iii) Fáze 2, pokud přítomna (1-12)
• O (somatické, tělové) antigeny • lipopolysacharidy • H (flagelární, bičíkové) antigeny • proteiny (flagelin) • fáze 1 a fáze 2 • Různé v primární struktuře • Různé geny, exprimovány střídavě • Vi (kapsulární) antigen • polysacharid • přítomny pouze u některých sérotypů (e.g. S. Typhi, S. Dublin a S. Hirschfeldii)
Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium = Salmonella Typhimurium (4,5,12:i:1,2)
48
Salmonella spp. V poddruhu I (S. enterica subsp. enterica) - sérotypy jsou určeny jménem (obvykle spojeným s nemocí, geografickým původem, či obvyklým místem výskytu)
Number of serovars
Total
1531 505 99
2557
336 73 13
Agbaje et al. (2011)
22
22
Primárně obývají gastrointestinální trakt • Široké hostitelské rozpětí, obvykle bez projevu nějaké zřejmé nemoci • Hospodářská a divoká zvířata, hlodavci, ptáci, plazi, hmyz..... • Dle hostitelské adaptability jsou děleny do tří skupin: • Skupina 1: adaptace na vyšší primáty a člověka, e.g. Salmonella Typhi, Paratyphi A, B, C and Sendai • Skupina 2: celkově či široce adaptovány na specifická zvířata, např. S. Dublin na dobytek, S. Gallinarum na drůbež, S. Abortusequi na koně, S. Choleraesuis na prasat, ale nepravidelně na lidi • Skupina 3: všechny ostatní, které nejsou hostitelsky adaptovány a produkují infekci u člověka a širokého rozsahu zvířat, např. S. Typhimurium and S. Enteritidis
49
Salmonella spp. Enterititdy • Gastrointestinální infekce • Nejznámější typ salmonelózy (často označován přímo jako „salmonelóza“) • Závažnost: od bezpříznakového nosičství po těžké průjmy • Převážně spojeno se sérotypy, které se běžně nacházejí u zvířat a lidí http://www.eurosurveillance.org/images/dynamic/EE/V19N19/Hugas_fig1.jpg
• Nejčastější sérotypy pro enteritidu (netyfoidní infekce): S. Enteritidis, S. Typhimurium (další: S. Virchow, S. Infantis, S. Newport...) 50
Enteritis
Salmonella spp.
http://farm4.static.flickr.com/3773/9143107059_58fbe59171.jpg
• • • •
http://wiki.ggc.edu/images/3/36/Salmonella.gif
Adheze na epiteliální buňky ilea (skrze fimbrie) Pomocí sekrečního typu III je u hostitelských buněk vyvolána exprese faktorů pro endocytózu prováděnou receptory Endocytované salmonely procházejí skrze buňky epitelu uvnitř na membránu vázaných vakuol, kde se množí a kde jsou poté uvolňěny v lamina propria (níže položená vrstva slizničního vaziva, složená z řídkého kolagenního vaziva) Zánět v tomto místě poté vede k uvolnění prostaglandinů, které aktivují adenylát cyklázu a dochází k 51 k uvolňování tekutých sekretů do střevního obsahu
Salmonella spp. Tyfoidní a paratyfoidní horečka • Systematické onemocnění způsobené sérotypy adaptovanými na člověka (tyfoidní salmonely) S. Typhi a S. Paratyphi A, B, and C Jediným zdrojem infekce jsou lidé • Spojeno se systémem dodávek vody, špatných sanitačních podmínek a kontaminovaným jídlem • hlavně v rozvojových zemích • Od mírných po těžké symptomy, ale bez promptní ATB léčby mohou způsobit závažné komplikace a být smrtelné (mortalita až 25 %) • vakcinace • Na hostitele adaptované sérotypy jsou více invazivní a mají tendenci vyvolávat systematická onemocnění – jsou rezistentní k fagocytóze http://www.atsu.edu/faculty/chamberlain/website/lectures/tritzid/shigello.htm
52
Salmonella spp. Enteritidy = zoonózy (zoonotické infekce) • Hlavním zdrojem onemocnění jsou infikovaná zvířata • přenos: fekálně-orální cesta • Kontaminace vody a potravin střevním obsahem infikovaných zvířat • Skladovací teplota potravin umožní růst salmonel • Nedostatečné či chybějící závěrečné tepelné ošetření • Křížová kontaminace dalších potravin (přímým kontaktem nebo přes zařízení a nástroje) • Přímý přenos z osoby na osoby je obvykle omezen pouze na případy v různých institucích (nemocnice, domovy důchodců, pečovatelské domy) http://www.poultry-health.com/library/risk/risk984.jpg
53
Salmonella spp. Enteritidy – primární vehikly • Maso, mléko, drůbež a vejce • Syrové či nedovařené, křížová kontaminace • Salátová zelenina, ovoce (např. melouny) • Použití kontaminovaných zavlažovacích vod (lidské či zvířecí fekálie použité jako hnojivo) • Oříšky, koření, semínka....
http://www.foodpoisonjournal.com/foodborne-illness-outbreaks/anunforgettable-salmonella-illness/#.VVNWFPAXgfo
http://cdn2b.examiner.com/sites/default/files/styles/image_content_width/hash/eb/e2/ ebe297fd4d7cabc35cffe0cc78bfbe03.png?itok=u-YIbaBS
54
Escherichia coli • čeleď Enterobacteriaceae • gramnegativní nesporulující tyčinky (typicky 0.5 µm x 1–3 µm) • fakultativně anaerobní • katalasa pozitivní, oxidasa negativní • pohyblivé-peritrichní bičíky • teplota růstu: 7-10 až 50 °C, optimum 37 °C • teplotně senzitivní • D60 = 0.1 min
• pH růstu: optimum kolem pH 7 • Minimum : pH 4.4 (za jinak optimálních podmínek) • aw růstu: minimum 0.95
http://www.ecl-lab.ca/en/ecoli/
http://www.trabajaconaloe.com/wp-content/uploads/2014/05/E.Coli1_.jpg
55
Escherichia coli Ziskem mobilních genetických elementů (fágy, virulentní plazmidy a ostrovy pathogenity), stejně jako ztrátou některých chromozomálních DNA oblastí dochází k diferenciaci jednotlivých linií E. coli při evoluci odlišných klonů, patřících k různých E. coli pathotypům, které jsou asociovány se specifickými symptomy nemocí. LEE – locus pro destrukci enterocytů; PAI - ostrov patogenity; pEAF plazmid s adhezivními faktory enteropatogenní E. coli; pENT plazmidy kódující enterotoxiny; Stx bakteriofág kódují Shiga-toxin
http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n5/fig_tab/nrmicro1889_F3.html
Univerzální „obyvatel“ zažívacího traktu lidí a dalších teplokrevných zvířat •
• • •
Predominantní mezi fakultativními anaeroby, kteří ale tvoří pouze menšinu celkové mikroflóry
obecně neškodný komenzál oportunní patogen - způsobuje infekce jako gramnegativní sepse, infekce močového traktu, pneumonie u imunosuprimovaných pacientů, meningitidy u novorozenců pouze malá část kmenů E. coli je patogenní • patogenitu způsobují virulentní faktory a jejich produkce
56
Escherichia coli
http://www.bats.ch/bats/publikationen/1996-1_e.coli/96-1_ecoli_k12.php
http://www.foodsafetymagazine.com/magazine-archive1/april-may-2012/understanding-stec-a-growing-concern/
57
Escherichia coli
http://idsc.nih.go.jp/iasr/33/383/graph/t3831.gif
58
Escherichia coli
http://en.ria.ru/images/16441/98/164419823.jpg
59
Escherichia coli Důležitý rezervoár E. coli O157:H7 • prasata, drůbež, ovce • např. ve VB izolován z • 0.9–8.2% zdravého skotu • 3.7% ze 164 vzorků čerstvého hovězího v maloobchodě • 1–2% ostatních čerstvých masných produktů jako vepřové, drůbeží a skopové http://www.ecl-lab.ca/en/ecoli/
Propuknutí EHEC sérotypu O157:H7 • Relativně nízká infekční dávka (2-2000 buněk) • Obvykle nedostatečně uvařené produkty z mletého masa • Příležitostně syrové mléko • další: salát, výhonky řeřichy, klíčky vojtěšky, nepasterizovaný jablečný džus
60
Escherichia coli Květen 2011 – Německo • propuknutí onemocnění způsobeného vysoce virulentní Shiga-toxin (Stx) produkující E. coli O104:H4 • Přes 830 případů hemolyticko-uremického syndromu (HUS) – 46 úmrtí !!!! • Sérotyp O104:H4, dosud neizolovaný ze zvířat, byl v minulosti s HUS spojen pouze výjimečně • Kmeny spojované s HUS mají geny typicky nacházené ve dvou typech patogenních E. coli – v enteroagregativních kmenech (EAEC) a enterohemoragických kmenech (EHEC) • Navržený model: přenosem virulentních faktorů kódovaných na chromozomu a plazmidech vznikl vysoce patogenní hybrid EAEC and EHEC
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0022751#pone-0022751-g006
Jako nejpravděpodobnější zdroj infekce byly nakonec identifikovány klíčky (počáteční podezření na španělské okurky bylo zamítnuto). http://blog.thomsonreuters.com/index.php/e-colibreakout-in-europe-graphic-of-the-day/
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106482
61
Shigella spp. • čeleď Enterobacteriaceae • studie příbuznosti DNA Shigella spp. a Escherichia coli prokázaly, že tyto druhy jsou si geneticky vysoce příbuzné a dle taxonomických pravidel by měly náležet do jednoho rodu („E. coli“) • kmeny Shigella spp. jsou však relativně biochemicky inaktivní • většina kmenů Shigella spp. je patogenních (na rozdíl od Escherichia coli) • Redefinice by tedy mohla být zavádějící a byly proto zachovány oba rody • 4 druhy – všechny způsobují bacilární dysentérii u lidí a vyšších primátů s různým stupněm závažnosti • Sh. dysenteriae – vážná forma (hlavně tropické země, zřídka Evropa či Sev. Amerika) • Sh. sonnei – nejmírnější (běžnější v Evropě a Sev. Americe) • Sh. boydii a Sh. flexneri – středně těžká forma
Shigellosis (bacillary dysentery) • •
nízká infekční dávka (10–100 buněk) inkubační doba: 7 h - 7 dní • Infekce z jídla – kratší inkubační doba – do 36 h • Symptomy: • průjem • klasické průjmové syndromy krvavé stolice s hnisem a slizem (Sh. dysenteriae, Sh. flexneri a Sh. boydii) • vodnatý průjem(Sh. sonnei) • břišní křeče, zvracení, horečka • Doba trvání: 3 - 14 dní • může se vyvinout nosičství, které přetrvává až několik měsíců • Léčba: • Mírnější formy - samolimitující, bez léčby • Sh. dysenteriae infekce často vyžadují náhradu tekutin a elektrolytů a ATB terapii
62
Shigella spp. Shigelosa • zdrojem infekce je často voda kontaminovaná lidskými fekáliemi a infekce je přenášena fekálně-orální cestou • obvyklý způsob přenosu je přímo z osoby na osobu z rukou do úst, zvláště při slabé hygieně mezi dětmi • Infekce z potravin • nejsou příliš časté • obvykle se jedná o kontaminaci připravovaného jídla infikovaným přenašečem • velice vzácně je infikována přímo potravina – např. ledový salát • přenašečem je též hmyz
https://bioweb.uwlax.edu/bio203/s2013/ward_aman/interactionspic2.jpg
http://www.frontiersin.org/files/Articles/22287/fcimb-0200081-HTML/image_m/fcimb-02-00081-g001.jpg
63
Shigella spp. Shigelosa je invazivní infekce, kdy jednotlivé faktory virulence jsou kódovány na velkém plazmidu u velikosti 221 kbp Geny spjaté s virulencí a dalšími funkcemi kódované na velkém Shigella-virulentním plazmidu Gen
Protein MW
Regulační nebo efektorová funkce
virF
30 kDa
Pozitivní regulace virG a ipa-mxi-spa lokusů
invA(mxi Potřebný pro invazi (orientuje produkty ipa 38 kDa B) genů ve vnější membráně) mxiA ippI
76 kDA 18 kDa
ipaB
62 kDa
ipaC ipaA ipaD
43 kDa 38 kDa 78 kDa
virB
33 kDa
virG (icsA)
120 kDa
ipaH
60 kDa
shET2
60kDa
viz invA(mxiB) viz invA(mxiB) Necessary for invasion: mediates endocytic uptake of shigellae Potřebný pro invazi: zprostředkovává endocytózu shigel viz ipaB viz ipaB Neznáme role pozitivní regulátor virG a ipa-mxi-spa lokusů Kompletace aktinových vláken, kterými bakterie pronikají do buněčné cytoplazmy a sousedních buněk Pět různých alel; IpaH7.8 umožňuje shigelám únik z vakuol fagocytů ShET2 enterotoxin
http://textbookofbacteriology.net/Shigella_3.html
64
Yersinia enterocolitica • čeleď Enterobacteriaceae • gramnegativní nesporulující tyčinky (typicky 0,5 mm x 1–2 µm) • fakultativně anaerobní • katalasa pozitivní, oxidasa negativní • pohyblivé při teplotách pod 30 °C (peritrichní bičíky) • teplota růstu: 1-40 °C, the optimum 29 °C • Teplotně sensitivní – slabě vyšší rezistence k teplotě • D62.8 v plnotučném mléku = 0,7-57,6 s
• Růst ph 7-8 • Minimum 4.1-5.1 (dle použité kyseliny) • Schopna růsto do 5 % NaCl Výskyt • Široce rozšířená v životním prostředí • izolována z půdy, sladkovodních zdrojů, zažívacích traktů mnoha zvířat • Chroničtí přenašeči - prasata • Potraviny: kontaminované maso, mléko, voda a křížová kontaminace např. fazolových klíčků
Patogeneze rodu Yersinia • Y. pseudotuberculosis – mezenterická adenitida, Y. pestis – mor (bubonická forma) • Y. enterocolitica – gastroenteritida • Většina izolátů z potravin je nepatogenních • Samolimitující enterokolitida, zvláště u dětí mladších 7 let • Inkubační doba: 1-11 dní • Doba trvání: 5-14 dní • Břišní křeče, průjem, mírné horečky, vzácně zvracení • Možné postinfekční komplikace: arthiritida, erythema nodosum • Produkce tepelně stabilního enterotoxinu (podobného E. coli ST v některých vlastnostech)
65
Cronobacter spp. • čeleď Enterobacteriaceae • gramnegativní nesporulující tyčinky (typicky 0,5 mm x 1–3 mm) • fakultativně anaerobní • katalasa pozitivní, oxidasa negativní • Obecně pohyblivé (peritrichní bičíky) • teplota růstu: 6-47 °C • Teplotně senzitivní – slabě vyšší rezistence • D60 = 2.5 min
• Více rezistentní k nízké vodní aktivitě – důležitý faktor pro transimisi v prostředí a potravinách Taxonomie: • původně – kmen Enterobacter cloacae produkující ve vodě rozpustný žlutý pigment na trypton-sójovém agaru • 1980 – přejmenován na Enterobacter sakazakii na počest významného japonského mikrobiologa působícího hlavně v bakteriální taxonomii Riichi Sakazaki • 2008 – nový rod Cronobacter spp. (Kronus – bůh řecké mytologie, který požíral své děti)
http://cdn2b.examiner.com/sites/default/files/styles/image_content_width/hash /1a/49/1a494b7b8f041605e548d925aa99a46a.jpg?itok=-cqsZCdJ
66
Cronobacter spp. Patogeneze
• Vzácná, ale velmi závažná infekce u malých dětí •
způsobuje meningitidu, cerebritidu, bakterémii a nekrotizující enterokolitidu • vysoká mortalita – až 50 % či více • těžký, dlouhý průběh, u většiny přeživších nevratné následky (kvadruplegie, poškození zraku či sluchu) • největší predispozice k onemocnění • děti s nízkou porodní váhou či předčasně narozené • Ve všech věkových skupinách: • infekce ran či močových traktů, případně infekce krevního oběhu u imunokomprimovaných či starších lidí Výskyt • široce rozšířen v prostředí • izolován z vody, půdy, rostliny, prachu v sáčcích od luxu, dětské výživy, sušeného mléka, rostlinných čajů, škrobů...
http://www.redorbit.com/media/uploads/2012/01/health-010212-003-617x416.jpg
Běžný zdroj infekce: Rekonstituovaná sušená dětská výživa • Obvykle post-pasterizační kontaminace • Rizikové faktory při přípravě: • Špatná hygiena při přípravě (rekonstituci) • Skladování připravené rekonstituované sušené dětské výživy vedoucí k pomnožení kronobakterů 67
Campylobacter spp. • • •
• • • •
•
• • •
čeleď Campylobacteraceae rod Campylobacter - 23 druhů gramnegativní zakřivené či spirálovité nesporulující tyčinky (0,2-0,8 μm × 0,5-5 μm) • ve starších kulturách mohou přecházet do kokoidní formy (enzymatická degradace peptidoglykanové vrstvy) Většina druhů pohyblivá pomocí polárních bičíků • Unipolární či bipolární, případně multipolární • Charakteristický vývrtkovitý pohyb Mikroaerobní bakterie (5 % O2 + 10 % CO2 + 85 % N2) • Některé druhy vyžadují též přítomnost mravenčanu či vodíku Metabolismus • Utilizace aminokyselin a intermediátů Krebsova cyklu • Nemá schopnostnost fermentovat či oxidovat sacharidy Oxidasa pozitivní (katalasa závisí na druhu) • mimo C. gracilis and některé kmeny C. concisus a C showae Optimalní teplota růstu • Pro většinu druhů - 35-37 °C • Kampylobakteriózu ale způsobují termotolerantní druhy s optimální teplotou růstu – 41,5 °C, které nerostou při teplotách nižších než 25 °C pH rozsah 4.9 – 9.0, optimum – 7 1,5 % NaCl působí baktericidně min. aw 0,98
www.photoshelter.com
Campylobacter – řecky „zakřivená hůl“
68
Campylobacter spp. Většina kampylobakterií přirozeně obývá gastrointestinální trakt mnoha divokých či domácích zvířat a ptáků Druhy vyskytující se u zvířat •
Nepatogenní pro zvířata s neprokázanou patogenitou pro člověka e.g. C. hyointestinalis, C. isulaenigrae, C. lanienae C. canadensis
•
Patogenní pro zvířata i člověka, ale u lidí způsobují onemocnění velice vzácne e.g. C. fetus subsp. fetus - spontánní potraty ovcí a krav (hum.: gastroenteritida)
•
TERMOTOLERATNÍ DRUHY (optimální teplota růstu 41,5 °C) •
Pro člověka obligátní či oportunní patogeny (mimo C. helveticus), ale pro své zvířecí hostitele patogenní být nemusí (vet.:) C. jejuni subsp. jejuni – drůbež, prasata, skot, ovce, kočky, psi (vet.:gastroenteritida,
hepatitida u ptáků) – 90 % případů kampylobakterióz C. jejuni subsp. doylei – známy pouze klinické izoláty C. coli – prasata, drůbež, skot, ovce, ptáci– (vet. gastroenteritida) – 5- 10 % případů kampylobakterióz C. lari – psi, kočky, opice, koně, tuleni, voda (vet.: gastroenteritida u ptáků, hum. gastroenteritida) C. upsaliensis – kočky, psi - (vet., hum.:gastroenteritida) C. helveticus – kočky, psi (vet.: gastroenteritida, hum.: -)
Druhy spojené s lidskou ústní mikroflórou Rostoucí za anaerobních podmínek (vyžadují atmosférický vodík) Onemocnění dásní, výjimečně gastroenteritida • např. C. concisus, C. curvus, C. gracilis, C. rectus, C. mucosalis, C. showae, C. hominis
69
Campylobacter spp. CAMPYLOBACTERIOSIS • Průchod kampylobakterií do tenkého střeva • pomnožení • Adheze a průnik na střevní sliznici • Produkce toxinů • CDT (cytolethal distending toxin) • Shiga toxin • cholera-like enterotoxin • Příp. šíření lymfatickým a krevním systémem Doba inkubace: 1-3 dny Doba trvání: 7-10 dní Vodnatý či krvavý (až do 15 % případů) průjem Břišní křeče, horečka, bolest hlavy, závratě, bolest svalů, zimnice, zvracení •
Infekční dávka U dospělých • cca. 102-103 buněk v tuhých potravinách • cca. 500 buněk v tekutinách či tekutých potravinách (mléko, voda) • vzhledem k tekuté konzistenci více buněk přežije rychlý průchod žaludkem do tenkého střeva
Děti mladší 1 roku – často zvracení bez horečky, krev ve stolici (92 %)
Rehydratace a odpočinek na lůžku ATB pouze při těžkém průběhu
http://www.fao.org/docrep/007/y4722e/y4722e03.gif
70
Campylobacter spp. Postinfekční komplikace: Guillain-Barré syndrom (GBS) = autoimunitní onemocnění
http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/students/spring2006/blumer/gbs.html
30-50% všech GBS případů (1-2/100 000 people) are linked to C. jejuni infection AIDP • nejčastější • Problémy s vnímáním, bolest • Rychlý rozvoj slabosti v horních a dolních končetinách • Dýchací potíže a/nebo svalová paralýza • Při včasném rozpoznání a bez komplikací lze léčit
71
http://www.bio.davidson.edu/courses/immunology/students/spring2006/blumer/gbs.html
Campylobacter spp. •
V posledních 10 letech se kampylobaterióza stala nejčastějším gastrointestinálním onemocněním v rozvinutých zemích (možné důvody: lepší metody detekce, konzumace kuřecího masa)
number of cases
Gastroenteritidy v ČR
Výskyt gastroenteritid v České republice 2000-2009 a 2010 (leden listopad) Zdroj : http://www.szu.cz/data/infekce-v-cr Vyšší incidence je též vztažená k lepším metodám detekce. Incidence má typické sezónní vrcholy (nejvíce onemocnění v pozdním jaře a létě – grilování) 72
Campylobacter spp.
Průmyslově rozvinuté země Gastroenteritida běžně u mladých dospělých a dospělých Rozvojové země Širší spektrum symptomů od závažných zánětlivých onemocnění po mírné průjmy či asymptomatické nosičství – s nemocí se setkávají lidé již od raného věku Gastroenteritida je běžná u dětí, zvláště mladších 2 let při nezanedbatelné morbiditě a mortalitě (vývin imunity) U dospělých je gastroenteritida spíše vzácná (v důsledku získané imunity), může být ale zjištěno bezpříznakové nosičství
Kampylobakterióza v EU, 2007 (celkově případů: kampylobakterióza - 200 507, salmonelóza 151 995) – též závisí na úrovni, způsobu a metodice hygienického dozoru http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/doc/223r.pdf
73
Campylobacter spp. Zdroje infekce Potraviny (dominantní) • Maso a masné produkty • drůbež , skot a vepřové maso • Syrové mléko a mléčné produkty • Voda • Mořské plody, houby, zřídka syrová zelenina • Nedostatečná tepelná úprava • Křížová kontaminace • Skladování v lednici • Kontaminace pracovní plochy a nástrojů • Přímý přenos rukama PŘÍMÝ PŘENOS (vzácný) •Infikovaná zvířata (mazlíčci), přenos z člověka na člověka ENVIRONMENTÁLNÍ ZDROJE • V některých případech to vyplývá ze zjištěných genotypů • Nejsou známy zdroje infekce • Nepříznivé podmínky – změny ve fyziologii –„viable but non-culturable“ state (VBNC) – živé, avšak nekultivovatelné • K resuscitaci dochází v hostiteli (zvíře, člověk)
http://parasites.czu.cz/food/_data/187.jpg
Kampylobakterie nejsou schopny se v potravině pomnožovat, pouze přežívají. Jejich výskyt proto není regulován Nařízením 2073/2005.
http://foodpoisoning.pritzkerlaw.com/ uploads/image/Chicken-Salmonella.jpg
http://faq-forall.ru/images/vkusnye_blyuda/kurica_zharenaya 74 .jpg
Campylobacter spp. Jak se vyhnout nákaze 1. Přikryjte a skladujte v chladu syrové kuřecí maso – Zakryjte syrové kuře a skladujte jej na spodní přihrádce ledničky, tak aby šťávy nemohly kapat na ostatní jídlo a kontaminovat jej. 2. Neomývejte syrové kuřecí maso –Vařením budou zabity všechny přítomné bakterie, včetně kampylobakterií, zatímco při omývání můžete tyto bakterie přes šplíchance vody šířit všude po kuchyni. 3. Omývejet použité náčiní – Pečlivě omyjte a vyčistěte všechny nástroje, prkénka a plochy, které byly použity ke zpracování syrového kuřete. Omyjte mýdlem a teplou vodou ihned po jejich použití při zpracování syrového kuřecího masa. 4. Uvařte kuře dostatečně – Ujistěte se, že kuře je všude dostatečně horké. Řízněte do nejsilnější části masa a zkontrolujte dostatečnou propečenost (žádné růžové maso, šťávy jsou průzračné).
http://www.redcat.gb.com/blog/
75
Campylobacter spp. Výskyt Campylobacter spp. vzhledem ke zdroji ( %) in EU, 2007 (Member State-MS) http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/d oc/223r.pdf
Výskyt Campylobacter spp. v čerstvém kuřecím mase v tržní síti v EU (http://www.efsa.europa.eu/en/scdocs/d oc/223r.pdf)
Drůbež: Velmi vysoká kontaminace – zvláště C. jejuni Kolonizace v caecum do 1010 KTJ/g je asymptotická Horizontální přenost v hojnu fekálně-orální cestou Vliv technologie zpracování potravin Kontaminace během porážky a následného zpracování Schopnost kampylobakterií přežít se liší v závislosti na potravinové matrici a použitých technologiích zpracování 76
Vibrio parahaemolyticus
čeleď: Vibrionaceae • gramnegativní pleomorfní (zakřivené nebo rovné) krátké tyčinky • fakultativně anaerobní • katalasa pozitivní, oxidasa positivní • Pohyblivé – polární opouzdřené bičíky • teplota růstu: 5-43 °C, optimum kolem 37 °C • růst pH: • Obecně citlivé na kyselé prostředí, ale známo, že mohou růst i při 4.5-5.0 • optimum 7.5-8.5, růst do 11.0 • Teplotní senzitivita – slabě zvýšená rezistence
http://www.biken.osakau.ac.jp/english/topics_e/3094.html
http://www.revista.unam.mx/vol.6/num4/art33/imagenes/imagen 2.jpg
• D49 in clum slurry = 0.7 min
• Potřebují 3 % NaCl pro optimální růst (0.5-8 %) • Minimum aw: 0,973 – 0,986 • Rostou velice rychle
77
Vibrio parahaemolyticus V. cholerae • Infekce šířená hlavně vodou (cholera) • Částým vehiklem též jídlo kontaminované kontaktem s kontaminovanou vodou V. vulnificus • Infekce spojená hlavně se syrovými ústřicemi • Citlivé jedinci a imunokomprimovaní pacienti by se jim měly vyhnout http://www.bccdc.ca/NR/rdonlyres/69D2EA7B-EA5C4089-8820-BB679B10A9C0/0/oysters.jpg
http://beachprophhi.files.wordpress.com/2013/10/shrimpfestival.jpg
V. parahaemolyticus infekce V. parahaemolyticus • inkubační doba ~24 hodin, trvání symptomů: 72 hodin (až 10 dní • Možná součást přirozené mikroflóry ryb v u imunokomprimovaných osob) pobřežních vodách • vodnatý průjem doprovázený nevolností, zvracením, křečemi • Ryby a mořské plody břicha, často horečka • chobotnice, makrela, tuňák, sardinky, • obvykle samolimitující, bez nutnosti léčby krab, krevety, škeble – ústřice a slávky • ve vážných případech doplnění tekutin a elektrolytů • Výskyt onemocnění v pobřežních regionech • Koreluje s produkcí termostabilního přímého hemolyzinu (Vp-TDH) během léta a časného podzimu (vyšší teplota - delece Vp-TDH genů vede ke ztrátě enterotoxické aktivity v vody) laboratorních modelech • Křížová kontaminace na rybích trzích • beta-hemolýza na modifikovaném krevním agaru • Sezónní výskyt v USA a v Evropě, ale v (Wagatsuma agar) – tzv. Kanagawa fenomén (region v Japonsku nejčastější původce otravy z jídla Japansku) (konzumace syrových či pouze částečně • Kanagawa-pozitivní kmeny (v Japonsku: 96 % klinických vařených ryb) případů, pouze 1 % environmentálních kmenů) produkují průjmové onemocnění, zatímco Kanagawa-negativní kmeny 78 nikoliv
Clostridium perfringens • čeleď: Clostridiaceae • grampozitivní tyčinky, relativně velké (9-13 µm ) • tvoří oválné subterminální endospóry zduřující buňku • Enkapsulované, nepohyblivé • Anaerobní (ale v přítomnosti kyslíku mohou přežít, nemnoží se však) • Katalasa negativní • teplota růstu: 12-50 °C, optimum 43-47 °C • Vegetativní buňky: • Teplotně senzitivní D60 (hovězí maso) = několik minut • minimum pH 5, optimum 6.0-7.5 • minimum aw 0,95-0,97 • Endospóry • Tepelně odolné D60 =0.31 min-38 min (interkmenově variabilní)
http://i.ytimg.com/vi/UFec1P3tmrk/hqdefault.jpg
79
Clostridium perfringens Klasifikace do pěti typů (A–E) • Na základě produkce 4 hlavních typů toxinů (a, b, e, i) a 8 minoritních typů toxinů
•
•
•
C. perfringens typ A – způsobuje většinu oněmocnění z potravin (a plynovou sněť) • produkce pouze hlavní toxinu A s lecitinázovou aktivitiou (fosfolipáza C) • schopnost hydrolyzovat lecitin – důležitá role v patogenezi plynové sněti • žádná role při onemocnění z potraviny Široce rozšířen v prostředí • Půda – do úrovně 103–104 CFU/g • izolován z vody, sedimentů, prachu, syrových a zpracovaných potravin • Běžná součást lidského gastrointestinálnícho traktu • Počty spór 103–104 /g běžně ve fekáliích zdravých jedinců typy B,C,D, and E jsou obligátní parazité zvířat s mnohem omezenějším výskytem 80
Clostridium perfringens Clostridium perfringens enterotoxin • 35 kDa protein • Inaktivace ve fyziologickém roztoku při záhřevu na 60 °C po dobu 10 min • Senzitivní k proteolytickým enzymům • Působí jako cholera toxin –(nadprodukce cAMP) obrácení toku Na+,Cl-, a vody přes epitel zažívacího traktu z absorpce na sekreci • Syntetizován sporulujícími buňkami Infekce • Samolimitující, horečnaté onemocnění • Zvracení, břišní křeče, průjem, méně často i zvracení • Obvykle způsobeno sporulací strávených vegetativních buněk v tenkém střevu • Inkubační doba: 8 - 24 h, uzdravení 1-2 dny • Zdraví jedinci nevyžadují speciální léčbu • Příležitostně smrtelné u velmi starých osob či výrazně oslabených osob • Pouze vzácně způsobeno požitím již vytvořeného toxinu, inkubační doba je Poté méně jak 2 hod
Typický scénář otravy C. perfringens • masný pokrm je uvařen dopředu a poté skladován při špatné kombinaci teplota/čas a servírován studené či málo ohřátý • ~spóry, které přežily vaření, jsou za ideálních podmínek bez kompetitivní mikroflóry (naopak vařením zničené), schopny vyklíčit ve vegetativní buňky, které se následně rychle množí a nedojde k jejich následné destrukci Food • masné produkty jako dušené maso, masové šťávy, pečeně, masné koláče • Časté spojení s masnými výrobky, kdy ale hlavními faktory jsou • nízký redoxní potenciál • způsob přípravy a konzumace • většina výskytů – ve spojení s cateringem v institucích jako školy, domovy důchodců a nemocnice
81
Clostridium botulinum • čeleď: Clostridiaceae • grampozitivní rovné nebo lehce zahnuté tyčinky (2–10 µm dlouhé) • Tvořící centrální nebo subterminální oválné spóry zduřujícíc buňku • Enkapsulované, pohyblivé (peritrichní bičíky) • Obligátně anaerobní • Dělení kmenů do čtyřech skupin (I, II, III and IV) dle fyziologické diverzity • reálně jsou ovšem kmeny jednotlivých skupin tak fyziologicky a biochemicky odlišné, že nesplňují definici pro kmeny jednoho druhu, vzhledem k tradici a možným fatálním následkům při záměnách při reklasifikaci je toto rozdělení akceptováno • Nejdůležitější společný rys = produkce farmakologicky podobných neurotoxinů způsobujících botulismus • Rozeznáváno osm sérologicky odlišných toxinů • A, B, C1, C2, D, E, F, a G • C2 není neurotoxin
• Jeden kmen obvykle produkuje pouze jeden typ toxinu
82
Clostridium botulinum
Většina případů botulismu u lidí je spojena s toxiny typu A, B nebo E C. botulinum - výskyt • Půdní saprofyt, široce rozšířený • Velmi často izolován z např. vodních bažin (vlhké, anaerobní, výživově bohaté prostředí) • Příležitostně nacházen růst v zažívacím traktu ptáků a zvířat
83
Clostridium botulinum Růst pH • minimum pH závisí na faktorech jako teplota, vodní aktivita a kyselina • Dlouho bylo jako absolutní minimum považováno pH kolem 4.7 • Důležité pro konzevárenský průmysl • Neproteolytické kmeny mají vyšší minimum (inhibovány při pH 5.0–5.2) • Avšak k růstu může docházet i při hodnotách pH až kolem 4.0 v prostředí, kde je ochranným faktorem vysoký obsah proteinů (což není situace v konzervárenském průmyslu) • maximum pH 8.5–8.9 a toxin je nestabilní v alkalickém prostředí (možný protektivní faktor u fermentovaných rybích výrobků) Botulismus • tři typy • Botulism z potravin • Bakteriální intoxikace • Požití exotoxinu produkovaného C. botulinum při jeho růstu v potravině • Botulotoxiny jsou neurotoxiny – primárně ovlivňují cholinergní nervy periferního nervového systému • Dětský či infekční botulismus • Botulismus ran 84
Clostridium botulinum botulotoxiny • 150 kDa proteiny • Nejtoxičtější známé substance • Letální dávka pro dospělou osobu: ~10-8 g • Inaktivace záhřevem 80° C po dobu 10 min • Produkovány během exponeciální fáze růstu jako komplexy • Zmírnit efekt toxinu, který je již navázán na neuromuskulární spojení je téměř kompletně nemožné (dočasné zlepšení mohou přinést někteří antagonisté neuromuskulární blokády) 85
Clostridium botulinum
http://www.drugs.com/health-guide/images/205243.jpg
http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/documents/image/ucm070006.gif
• • • • • • •
Vzácné, ale vážné onemocnění Počáteční symptomy: od 8 hod do 8 dní, obvykle 12–48 hod Zvracení, zácpa, zadržování moče, dvojité vidění, obtížné polykání (dysfagie), suchá ústa a potíž při mluvení (dysfonie) Smrtelné případy – selhání dýchání či srdeční selhání (1-7 dnů poté) při pacientově vědomí Mortalita: 20-50 %, závisí na typu toxinu (typ A obvykle vyšší mortalita než typy B či E), požitém množství, typu jídla a rychlosti léčby Přeživší pacienti – až 8 měsíců do plné rekonvalescence Přežití kriticky závisí na včasné diagnóze a léčbě • Alkalický výplach žaludku pro odstranění zbylé potraviny • Intravenózní podání specifických nebo polyvalentních anti-toxinů pro neutralizaci již cirkulujícícho toxinu 86 • napojení na umělé dýchání, je-li potřeba
Clostridium botulinum Výskyt botulismu (1) Potravina kontaminovaná u zdorje či během zpracování spórami či vegetativními buňkami C. botulinum. (2) Potravina je ošetřena způsobem, které restrihuje kompetitivní mikroflóru a za normálních okolností též slouží ke kontrole C. botulinum. (3) Podmínky v potravině (teplota, pH, Eh, aw) jsou vhodné pro růst C. botulinum. (4) Potravina je konzumována studená či po mírném zahřátí, nedostatečném k inaktivaci toxinu. http://microbiology2009.wikispaces.com/Botulism
Potraviny Nízkokyselé konzervované potraviny • Konzervárenský průmysl: striktní systém kontroly • problém: domácí zavařování a konzervace potravin, nedostatečné tepelné procesy • Zvláště zelenina, maso (botulus – lat. klobása) Další případy: • Nedostatečné uzení masa • Nedostatečně uzené ryby (hotsmoked) konzumované bez ohřátí • Rybí produkty konzumované syrové po nevhodných fermentačních procesech • Oříškové pyré (nedostatečně tepelně ošetřeno) • Bramborový salát (vařené brambory skladované několik dní při pokojové teplotě a za anaerobních podmínek před dalším zpracováním) • Balený zeleninový salát (špatná teplota skladování, anaerobní podmínky – baleno vakuově či v hliníkové fólii) • Pasterizovaný mrkový džus (nedostatečné ochlazení produktu) http://ruhlman.com/wp-content/uploads/2011/02/
[email protected]
87
Virová onemocnění z potravin Norwalk virus (Norovirus) Group IV (+)ssRNA) Hepatovirus A Group IV (+)ssRNA) Rotavirus Group III (dsRNA)
Pro rozvoj onemocnění dostačuje pouze několik virových částic. Vysoké množství virových částic je poté přenášeno skrze fekálie infikovaných osob (až 1011 virových částic/g). K replikaci virů dochází pouze ve specifických buňkách (podslizničních buňkách žaludku či tenkého střeva), nemohou se tedy replikovat v potravinách či vodě. Viry způsobující onemocnění z potravin jsou relativně stabilní a odolné kyselému prostředí vně svého hostitele.
88
Viral foodborne infections
https://d2q0qd5iz04n9u.cloudfront.net/_ssl/proxy.php/http/gallery.mailchimp.com/38b0ca172dd441815 3d0766c0/images/Norovirus.jpg
http://4.bp.blogspot.com/-xuS_qEJtXww/UWV0wm95BNI/AAAAAAAABJI/-V27jIY8Nlw/s1600/AronHallQuote.png
89
PRAVIDLA PRO BEZPEČNÉ ZACHÁZENÍ S POTRAVINAMI
http://tx.english-ch.com/teacher/christin/foodsafetyrules.jpg
https://cheflynnie.files.wordpress.com/2013/03/safety.jpg
90
PRAVIDLA PRO BEZPEČNÉ ZACHÁZENÍ S POTRAVINAMI
http://cdn.entwellbeing.com.au/wp-content/uploads/2014/01/scombroid-poisoning-prevention.png
http://www.eskyweb.com/files/image/images/esky-food-storage-preview.png
91
Literature: Adams M.R., Moss M.O. Food Microbiology. The Royal Society of Chemistry, 2008. Agbaje M., Begum R.H., Oyekunle A.M., Ojo O.E., Adenubi O.T. “Evolution of Salmonella Nomenclature: A Critical Note.” Folia Microbiologica 56, no. 6: 497– 503. Didelot X., Barker M., Falush D., Priest F.G. “Evolution of Pathogenicity in the Bacillus Cereus Group.” Systematic and Applied Microbiology 32, no. 2 : 81–90. Pinchuk I.V., Beswick E.J., Reyes V.E. “Staphylococcal Enterotoxins.” Toxins 2, no. 8 : 2177–97.
92
DĚKUJI VÁM ZA POZORNOST
[email protected]
93
