Fixace molekulového dusíku mikroorganismy

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Fixace molekulového dusíku mikroorganismy

(Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie – směr Mikrobiologie)

Jindřiška Hammerová

Brno 2006

Poděkování: Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu bakalářské práce doc. RNDr. Miroslavu

Němcovi, CSc. za poskytnutí materiálů, četné konzultace a cenné rady při psaní této literární rešerše.

2

OBSAH:

Úvod ............................................................................................................ 4

Cíl práce ........................................................................................................ 5

1. Koloběh dusíku v biosféře ......................................................................... 6

1.1 Výskyt dusíku......................................................................................................... 6

1.2 Koloběh dusíku ...................................................................................................... 6

2. Metabolismus dusíku u prokaryot .............................................................. 9 2.1 Katabolické dráhy ................................................................................................. 9 2.1.1 Metabolismus dusíku u chemoorganotrofních bakterií .................................... 9

2.1.1.1 Zdroje dusíku ......................................................................................... 9

2.1.1.2 Zdroje energie ........................................................................................10 2.1.1.2.1 Denitrifikace ...................................................................................10

2.1.1.2.2 Kvašení aminokyselin .....................................................................11

2.1.2 Metabolismus dusíku u chemolitotrofních bakterií .........................................11

2.1.2.1 Proces nitrifikace ....................................................................................12

2.2 Anabolické dráhy ...................................................................................................12

2.2.1 Fixace molekulového dusíku ..........................................................................12 2.2.2 Biosyntéza aminokyselin ................................................................................13

3. Chemismus fixace molekulového dusíku ................................................... 14 3.1 Struktura nitrogenázy .............................................................................................14 3.1.1 FeMo-protein .................................................................................................15 3.1.2 Fe-protein ......................................................................................................15

3.2 Mechanismus funkce nitrogenázy ..........................................................................15 3.3 Alternativní nitrogenázy ........................................................................................16

3.4 Regulace funkce nitrogenázy .................................................................................17

4. Nitrogenázové geny a jejich exprese ........................................................ 19 4.1 Nitrogenázové geny ...............................................................................................19 4.1.1 Nif geny u Klebsiella pneumoniae ..................................................................19 4.1.2 Nif geny u N2-fixujících sinic .........................................................................20

4.1.3 Nif geny u rhizóbií ......................................................................................... 20

4.2 Regulace exprese nif genů ......................................................................................21

3

5. Mikroorganismy fixující molekulový dusík ............................................... 23 5.1 Volně žijící organismy fixující molekulární dusík ...................................................23

5.2 Symbioticky žijící organismy fixující molekulární dusík .........................................24

5.2.1 Asociativní symbióza ......................................................................................25

5.2.2 Nodulující symbióza ......................................................................................25

5.2.3 Nenodulující symbióza....................................................................................26

6. Nesymbiotická fixace molekulového dusíku .............................................. 27 6.1 Azotobacter ............................................................................................................27

6.2 Clostridium.............................................................................................................27

6.3 Fixace N2 u sinic.....................................................................................................28 6.3.1 Prostorová separace ........................................................................................28 6.3.2 Časové oddělení fixace N2 a fotosyntézy .........................................................29

7. Symbiotická fixace molekulového dusíku .................................................. 30 7.1 Nodulující (hlízkovité) symbiózy ............................................................................30

7.2 Nenodulující symbióza - lišejníky (Lichenes)..........................................................31 7.2.1 Mykobiont ......................................................................................................31 7.2.2 Fotobiont ........................................................................................................32

8. Fixace molekulového dusíku u leguminózních

a neleguminózních rostlin........................................................................... 33 8.1 Vzájemná výměna signálů mezi mikroorganismem a leguminózní rostlinou ...........33

8.1.1 Reakce rostliny na bakteriální Nod faktory...................................................... 35 8.1.1.1 Deformace a stáčení kořenového vlásku ..................................................36

8.1.1.2 Tvorba infekčního vlákna ........................................................................36 8.1.1.3 Vznik kořenové hlízky ............................................................................37

8.1.1.4 Vytvoření bakteroidů ..............................................................................38

8.2 Fixace N2 u neleguminózních rostlin.......................................................................38

8.2.1 Infekce neleguminózní rostliny baktériemi ...................................................... 39 8.2.2 Symbiotický vztah: neleguminózní rostlina – Rhizobium.................................40

9. Arbuskulární mykorhizální symbióza a

fixace molekulového dusíku ....................................................................... 41 9.1 Germinace spóry; vzájemná výměna signálů hyfou a rostlinou ...............................41 9.2 Vznik appresoria, průnik hyfy do kořene, vznik arbuskule ......................................42

4

9.3 Výměna živin mezi houbou a rostlinou ...................................................................42 9.4 Arbuskulární mykorhizální symbióza vs. fixace molekulového dusíku;

ektomykorhiza ……………………………………………………………………... 43

10. Význam fixace molekulového dusíku ....................................................... 44 10. 1 Význam fixace dusíku v zemědělských systémech ..............................................44 10.1.1 Azolla a produkce rýže .................................................................................45

10.1.2 Cukrová třtina ~ Acetobacter diazotrophicus.................................................46

10.1.3 Sója luštinatá (Glycine max)..........................................................................46

10.2 Lišejníky a jejich význam v prostředí....................................................................47 10.3 Inokulace hospodářsky významných leguminóz

bakteriálními kmeny rodu Rhizobium...................................................................47

Závěr.............................................................................................................. 49 Použitá literatura ............................................................................................ 50

5

Úvod

Biologická fixace molekulového dusíku byla popsána u leguminóz v 80. letech 19. století

německým vědcem G. Hellriegelem a jeho spolupracovníkem H. Wilfarthem. Avšak

zemědělci již dávno před objevením dusíku jako chemického prvku věděli o schopnosti bobovitých rostlin obohacovat půdu živinami a tento jev v praxi značně využívali.

Brzy po objevení mikroorganismů žijících v symbiotickém vztahu s leguminózami byli

objeveni i volně žijící fixátoři N2 – anaerobní baktérie Clostridium pasteurianum (S.

Vinogradskij), aerobní baktérie Azotobacter sp. (M. V. Beijerinck). Fixace N2 u některých

sinic byla potvrzena později B. Frankem. Bylo také prokázáno, že kořenové hlízky olší mají stejnou funkci jako hlízky bobovitých rostlin.

Proces biologické fixace dusíku (ať již jde o fixaci symbiotickou či volnou) je pro svoji

důležitost v koloběhu dusíku srovnáván s významem fotosyntézy při koloběhu uhlíku. Využití biologické fixace dusíku umožňuje jeho efektivní hospodaření bez používání minerálních dusíkatých hnojiv, na jejichž výrobu je potřeba velké množství energie z fosilních paliv.

Fixace N2 jednak obohacuje dusíkem nadzemní orgány hostitelských rostlin, jednak se

vznikající amonné ionty “rozptylují“ prostou difuzí v půdě. Přítomnost dusíku se také

projevuje vysokou koncentrací proteinů a jiných dusíkatých látek v bobovitých rostlinách, což má velký význam pro býložravce a následně pro řadu organismů nacházejících se v potravních řetězcích výše (včetně člověka).

6

Cíl práce Cílem bakalářské práce bylo zpracování literárních údajů zaměřených na problematiku

fixace molekulového dusíku mikroorganismy. Pozornost byla soustředěna zejména na

mechanismus tohoto procesu. Snahou rovněž bylo zahrnout biologickou fixaci do celkového koloběhu dusíku v biosféře a vyzdvihnout význam začlenění molekulového dusílu do organické hmoty.

7

1. Koloběh dusíku v biosféře Růst všech organismů závisí na dostupnosti minerálních prvků (živin). Podle množství

potřebného pro organismus je rozlišujeme na makrobiogenní, mikrobiogenní a stopové. Mezi nejdůležitější makrobiogenní prvky mimo uhlík, vodík, kyslík a fosfor patří právě dusík,

který je většinou organismů vyžadován ve velkém množství. Dusík je v organismu součástí různých organických látek, např. bílkovin a nukleových kyselin, jež jsou esenciální součástí organismů.

1.1 Výskyt dusíku

Dusík se v přírodě vyskytuje volný i vázaný. I přes malou reaktivitu je přítomen v celé

řadě přírodních sloučenin. Sloučeniny dusíku mohou být anorganického nebo organického původu.

Dusík je v zemském ovzduší přítomen v molekulární formě N2 a chová se jako chemicky

netečný plyn. V troposféře zaujímá 78,08 % objemu. V horninách a v hydrosféře je dusíku na

rozdíl od ovzduší poměrně málo, v litosféře jen 0,002 %. Dusík je důležitou komponentou pro tvorbu imino- a amikoskupin, které se vyskytují v aminokyselinách, nukleotidech a dalších

organických sloučeninách. Z prostředí ho organismy přijímají nejčastěji ve formě dusičnanových NO3-, dusitanových NO2- nebo amonných NH4+ iontů. 1.2 Koloběh dusíku

Koloběh dusíku je velmi složitým procesem. Hlavním zdrojem dusíku je zemská

atmosféra, odkud se dostává dusík také do vody i půdy. Volný vzdušný dusík mohou vázat z organismů jen některé mikroorganismy, nazývané vazači (fixátoři) dusíku, mezi které patří některé skupiny půdních bakterií, sinic a aktinomycét, bakterie symbioticky žijící v hlízách na

kořenech bobovitých rostlin a aktinomycety u olše aj. Rostliny přijímají dusík převážně jako nitrátový (NO3-) nebo amonný ion (NH4+) a využívají jej ke svému metabolizmu. S potravou se dostává do těl živočichů, kteří jej částečně využívají při tvorbě vlastních bílkovin

a částečně vylučují močí. Při rozkladu organické hmoty uvolňují destruenti dusík v anorganické formě (NO3- a NH4+), který mohou rostliny opět přijímat. Plynný dusík, který se

může vytvářet v průběhu rozkladu se vrací zpět do ovzduší spolu s oxidy dusíku. Část dusíku se do atmosféry dostává díky sopečné činnosti. Tento koloběh je názorně rozkreslen na obr. 1.

8

Obr. 1. Koloběh dusíku.

Sloučeniny dusíku v biosféře neovlivněné antropogenní činností jsou převážně biogenního

původu, vznikají při rozkladu organických dusíkatých látek rostlinného i živočišného charakteru. „Anorganickým“ zdrojem dusíku jsou atmosféra, sopečná činnost (oxidy dusíku, amoniak), splaškové vody ze zemědělsky obdělávané půdy hnojené minerálními dusíkatými hnojivy, atmosférické vody (zvláště v období bouřkové činnosti, oxidy dusíku vznikají také

jako vedlejší produkty při spalování paliv a jsou obsaženy ve výfukových plynech motorových vozidel) a některé průmyslové odpadní vody, např. z tepelného zpracovávání uhlí.

Dusíkaté sloučeniny tedy zastávají v chemii vod velmi významné místo. Účastní se všech

biochemických pochodů, které v nich probíhají a při jejich biologickém čištění. Ve vodách jsou jednak přítomné biologické formy dusíku, jednak se do nich sloučeniny dusíku dostávají se srážkovými vodami. Hlavní formy dusíku vyskytující se ve vodě jsou shrnuty v tabulce 1.

9

Tab. 1. Formy dusíku nacházející se ve vodách. Forma dusíku

molekulární N2 anorganicky vázaný amoniakální dusitanový dusičnanový dusík umělého původu organicky vázaný siláže, močůvka

NH3, NH4+ NO2NO3kyanidy, kyanatany

Množství jednotlivých forem dusíku není závislé jen na jejich zdroji, ale i na metabolické

aktivitě organismů – procesech, které ve vodném prostředí neustále probíhají. Mezi

nejvýznamnější procesy patří fixace molekulárního dusíku, amonifikace (proces biologického

rozkladu – organický dusík se uvolňuje v amoniakální formě), nitrifikace (proces, který probíhá v přírodě ve velkém měřítku a dochází při něm k oxidaci amonných iontů na dusitany a dusičnany) a denitrifikace (proces, kterým se z dusičnanů a dusitanů stává opět plynný dusík nebo N2O).

Také v půdě podléhá dusík různým přeměnám, jsou to především procesy biologické

fixace, nitrifikace a denitrifikace. Jednotlivé procesy přeměn dusíku v půdách se značně podílejí a spolurozhodují o jeho distribuci v půdě, a tím i jeho využití rostlinami a v návaznosti na ně i dalšími organismy.

10

2. Metabolismus dusíku u prokaryot Metabolismus je velmi komplikovaný soubor enzymatických dějů probíhající v buňkách.

Je to dynamický děj, jehož funkcí je poskytovat jednak stavební kameny pro růst a udržování buňky, jednak energii.

Podle toho, jakých zdrojů uhlíku využívá organismus pro tvorbu organických látek a

jakým způsobem je zpracovává, lze organismy rozdělit na organismy autotrofní – jako jedinný zdroj uhlíku využívají CO2 a organizmy heterotrofní – hlavním zdrojem uhlíku je

organická látka. Ve vztahu ke zdroji energie se organismy dělí na organismy fototrofní –

zdrojem energie je sluneční světlo a organismy chemotrofní – získávají energii přeměnou chemických látek.

Podle významu v buňce lze rozlišovat dráhy katabolické, které vedou k rozkladu látek

složitějších na jednodušší a k zisku energie a dráhy anabolické, vedoucí k syntéze složitějších látek s využitím energie získané v katabolických drahách. Energetické propojení mezi oběma typy drah zprostředkuje adenozinfostát - anabolické děje získávají energii štěpením ATP na ADP nebo AMP; katabolické dráhy potom dodávají energii pro resyntézu ATP. 2.1 Katabolické dráhy

V katabolických drahách jsou nejdůležitější reakce oxido-redukční. Přenos redukčních

ekvivalentů se děje v živých systémech především prostřednictvím NAD+ nebo NADP+. 1. Oxidace substrátu XH2: XH2 + NAD+ = X + NADH2 2. Redukce substrátu Y:

Y + NADH2 = YH2 + NAD+

2.1.1 Metabolismus dusíku u chemoorganotrofních bakterií

Katabolické dráhy slouží k tvorbě energie přeměnou složitějších organických látek na

látky jednodušší. Tedy na látky s nižší energetickou hladinou.

Tyto procesy probíhají buď v nepřítomnosti kyslíku, kdy dochází k anaerobní

dehydrogenaci (kvašení neboli fermentace) nebo v přítomnosti kyslíku, kdy je ATP vytvářen oxidativní fosforylací.

2.1.1.1 Zdroje dusíku

Nejčastějším zdrojem dusíku u chemoorganotrofních bakteríí jsou aminokyseliny a

proteiny (mimo amonné soli, amoniak, dusičnany a močovinu). Pro mnohé z nich mohou být

11

zároveň zdrojem uhlíku a energie. Proteiny mohou využívat jen ty bakterie, které produkují proteolytické enzymy pro štěpení těchto látek na aminokyseliny. Podle účinku na peptidický

řetězec se dělí na exopeptidázy (atakující koncové články) a endopeptidázy (působí podél peptidického řetězce). Účinkem proteolytických enzymů je molekula bílkoviny štěpena až na

volné aminokyseliny, které mohou být využívány mikroorganismy přímo jako základní stavební kameny pro anabolické pochody nebo jsou dále mikroorganimy disimilovány. 2.1.1.2 Zdroje energie

Chemoorganotrofní bakterie získávají energii oxidací organického substrátu, který je

primárním donorem vodíku a elektronů a jejich akceptorem je organická, anorganická látka nebo molekulární kyslík. APT se v tomto procesu tvoří oxidativní fosforylací a organický

substrát slouží též jako zdroj uhlíku. Podle typu akceptoru elektronů se u chemoorganotrofních bakterií rozlišují tyto způsoby respirace:

1. Anaerobní respirace (denitrifikace, desulfurikace) - akceptorem elektronů není přímo

molekulární kyslík, ale molekula obsahující kyslík; donorem elektronů je organická látka.

2. Kvašení (fermentace).

3. Aerobní respirace – donorem elektronů je organická látka, jejich akceptorem molekulární kyslík.

2.1.1.2.1 Denitrifikace

Je procesem, při kterém akceptorem elektronů je dusičnan, který se elektrony redukuje

na dusitan popřípadě až na N2, probíhá podle schématu:

NO3- → NO2- → NO → N2O → N2.

Elektrotransportní systém je lokalizován na cytoplazmatické membráně a je společný

s aerobním elektrontrasportním systémem s výjimkou cytochromu b556, který je specifický pro

nitrátreduktázový systém. Jde tedy o alternativní způsob přenosu elektronů v anaerobních

podmínkách, Obr. 2 (Němec a Horáková, 2002). Některé bakterie mohou dusičnany redukovat na amoniak, který pak zabudují do vlastních bílkovin. Proces nazýváme asimilační

redukcí dusičnanů, též označovanou jako nepravá dentrifikace, neboť nedochází ke ztrátám dusíku, ale pouze k jeho přeměně (Němec, 1986). Uskutečňují ho bakteri r. Bacillus,

Alcaligenes, Pseudomonas a další. Bakteriální redukci, při níž dochází ke vzniku těkavých produktů – molekulového dusíku, označujeme pravou denitrifikací (Němec, 1986). Způsobuje

12

ztráty v dusíkaté bilanci, neboť dusík v podobě plynu uniká do ovzduší. V přírodě se s denitrifikačními bakteriemi setkáváme v půdě, chlévské mrvě a ve znečistěných vodách. Obr. 2. Alternativní způsob přenosu elektronů v procesu denitrifikace.

Převzato Němec a Horáková (2002). 2.1.1.2.2 Kvašení aminokyselin

Cílem kvašení aminokyselin není většinou získání energie, ale jejich transformace. Při

těchto reakcích nevzniká žádná nebo jedna molekula ATP. Výjimečně mohou vzniknout dvě molekuly ATP. Rozklad aminokyselin je již uveden v podkapitole 2.1.1.1, v této podkapitole je něj pohlíženo jako na proces, kterým může mikroorganismus získat energii.

Kvašení aminokyselin může probíhat dvojím způsobem (Němec a Horáková, 2002):

1) Kvašení jednotlivých aminokyselin – dochází buď k reduktivní deaminaci a vzniku NH3 (Pseudomonas aeruginosa) nebo k transaminaci (Clostridium butyricum).

2) Kvašení dvojice aminokyselin – tyto reakce se označují jako reakce Sticklandovy, jde o spřažení oxidace a redukce dvou aminokyselin, z nichž jedna je donorem a druhá akceptorem vodíku.

2.1.2 Metabolismus dusíku u chemolitotrofních bakterií

Chemolitotrofní bakterie stejně jako fotolitotrofní získávají uhlík z CO2, který je fixován

přes Calvinův cyklus. Energii získávají oxidací jednoduchých anorganických látek a převádějí ji do molekul ATP. Syntéza ATP je tedy spřažena s oxidací donoru elektronů, což je

anorganická látka. Podle donoru elektronů se pak chemoautotrofní bakterie dělí na vodíkové –

energii získávají oxidací vodíku, který se také účastní redukce CO2; sirné bakterie – jako zdroj

energie slouží sirovodík, thiosíran, elementární síra atd., konečným produktem je většinou síran; bakterie oxidující železo – oxidují Fe2+ na Fe3+ (tato oxidace probíhá v kyselém

13

prostředí) a nitrifikační bakterie – oxidace amoniaku (nitritační bakterie) nebo dusitanů (nitratační bakterie).

2.1.2.1 Proces nitrifikace

Nitrifikace má v přírodě zásadní význam, protože vede ke vzniku dusičnanů, tj.

rozhodující formy dusíku pro jeho příjem rostlinami. Probíhá ve dvou krocích, prvním krokem je oxidace amoniaku na dusitany nitritačními bakteriemi dle rovnice: 2 NH3 + 3O2 → 2 NO2- + 2 H2O + 2H+,

druhým krokem je následná oxidace dusitanů na dusičnany nitratačními bakteriemi dle rovnice:

2 NO2- + O2 → 2 NO3-.

Oxidace amoniaku na kyselinu dusitou je uskutečňována zástupci rodů Nitrosomonas

(vyskytují se především na dobře obdělávaných půdách), Nitrosospira (vyskytují se hlavně

v nekultivovaných půdách) a Nitrosococcus (nacházející se převážně v tropickém pásmu).

Bakterie rodu Nitrobacter jsou schopny provádět obě části procesu. Nitrifikační bakterie jsou

striktně autotrofní (Němec, 1986). Nitrifikace je velice citlivá na teplotu (tepelné optimum je

30 °C), dostatečný přísun kyslíku, k pH půdy a obsahu organické hmoty v prostředí, ale také k množství těžkých kovů. 2.2 Anabolické dráhy

V katabolických procesech nezískává bakteriální buňka jenom energii a redukční

ekvivalenty, ale také meziprodukty, které mohou sloužit jako stavební kameny v drahách anabolických. Biosyntetické dráhy mohou být v podstatě shodné s dráhami katabolickými, ale v opačném pořadí. Některé kroky jsou však specifické.

Při biosyntéze je energie spotřebována, jsou to tedy ve většině případů reakce

endergonické.

2.2.1 Fixace molekulového dusíku

Tento proces je velice energeticky náročný. Je specifický pro úzký okruh organismů,

jejichž specifita je dána přítomností enzymového komplexu nitrogenázy. Fixace může probíhat jako symbiotická (Rhizobium, Frankia, Anabaena, Nostoc), nebo v rámci asociativní

symbiózy (Azotobacter, Klebsiella, Bacillus, Azospirilum) či nesymbiotická (Azotobacter,

Clostridium). Reakce probíhá podle sumární rovnice:

N2 + 8e- + 8H+ + 16 ATP → 2 NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi . 14

2.2.2 Biosyntéza aminokyselin

Ve většině případů je bakteriální buňka schopna syntetizovat aminokyseliny de novo. Pro

tvorbu uhlíkatých skeletů slouží meziprodukty vznikající v katabolických drahách. Do těchto uhlíkatých skletů se aminoskupiny zavádí přímou aminací nebo transaminací. Přechod

anorganické formy dusíku do organické se však vždy děje přes amoniak (Němec a Horáková, 2002).

15

3. Chemismus fixace molekulového dusíku Volný dusík se v atmosféře vyskytuje ve formě dvouatomových molekul N2 (78 obj. %).

Tyto atomy jsou vázány trojnou vazbou, která svojí pevností zapříčiňuje nízkou reaktivitu

dusíku, a proto její redukce při průmyslovém využití vyžaduje velmi vysokou teplotu (500 °C), tlak (300 atm.) a železo jako katalyzátor - tzv. Haber-Boschova syntéza amoniaku.

V přírodě jsou redukce molekulového dusíku schopné pouze omezené skupiny organismů

(jedná se výhradně o prokaryota), u kterých se v průběhu evoluce vyvinul mechanismus, jímž

je molekula N2 asimilována do organické hmoty. Klíčem k tomuto mechanismu je enzym

nitrogénáza a tedy shopnost organizmů pro její syntézu. Enzym byl objeven v roce 1960 v buněčném extraktu Clostridium pasteurianum. Tento enzym i samotný proces fixace je velice citlivý na kyslík.

3.1 Struktura nitrogenázy

Nitrogenáza je enzymový komplex tvořený dvěma metaloproteiny (nehemovými proteiny).

Větší z nich je tzv. FeMo-protein, menší pak Fe-protein (Obr. 3). Klíčové postavení má

molekula molybdenu. U některých organismů např. u bakterie rodu Azotobacter chroococcum

může být molybden nahrazen vanadem. Jestliže nitrogenáza obsahuje jiný atom než Mo, nazývá se „alternativní“ nitrogenázou.

Obr. 3. Struktura enzymu nitrogenázy.

16

3.1.1 FeMo - protein

FeMo-protein je tetramer α2β2 o molekulové hmotnosti 220 – 240 000, který je složen ze

dvou alfa (2 x 50 000) a dvou beta (2 x 60 000) podjednotek. Tento protein obsahuje dva atomy Mo, asi třicet atomů Fe a několik S2- iontů. Atomy železa jsou lokalizovány ve čtyřech Fe4S4 klastrech, tzv. p-klastrech a ve dvou železo-molybdenových kofaktorech (FeMoco).

Předpokládá se, že FeMo-protein obsahuje dvě nezávislé funkční jednotky, z nichž každá je

tvořena železo-molybdenovými kofaktory a polovinou p-klastrů (které jsou buď ve formě velkého klastru, nebo dvou velmi těsně spojených Fe4S4 klastrů) a které jsou od sebe vzdáleny asi 7 nm, takže se nalézají blízko povrchu proteinu (Bishop a Joerger, 1990). 3.1.2 Fe - protein

Je tvořen dvěma stejnými podjednotkami, mezi nimiž se nachází jedno centrum Fe4S4.

Molekulová hmotnost tohoto proteinu je 57 – 72 000. Ionty železa jsou uspořádny v klastru tvaru krychle, který je navázán na polypeptidy právě přes atomy železa. Volné Fe-proteiny

mají redoxní potenciál Em podle původu –240 až –393 mV. V přítomnosti MgADP nebo

MgATP se redox potenciál dále snižuje. Stejně tak jako FeMo-protein tak i Fe-protein je

extrémně citlivý na kyslík.

3.2 Mechanismus funkce nitrogenázy

Pro nitrogenázovou redukci je zapotřebí nízký redoxní potenciál (asi –450 mV), který se

dosahuje v Fe-proteinu po jeho spojení s MgATP. Během redukce molekuly N2 jsou

přenášeny elektrony postupně z Fe-proteinu na MoFe-protein. Během tohoto procesu se spotřebují dvě molekuly ATP.

Vlastní redukce probíhá v těchto krocích (Obr. 4):

1. Redukce Fe-proteinu redukovaným ferredoxinem nebo flavodoxinem. 2. Aktivace Fe-proteinu pomocí ATP.

3. Vazba redukovatelného substrátu na nitrogenázu (přesněji na FeMo-protein).

4. Asociace aktivovaného Fe-proteinu a FeMo-proteinu. 5. Přenos elektronů uvnitř tohoto komplexu. 6. Přenos elektronu na substrát.

7. Rozpad komplexu: uvolnění redukovaného produktu, ADP a Pi (Škára a Ferenčík, 1983).

17

Obr. 4. Schéma reakce nitrogenázy.

Upraveno podle Gloser (1998). Pomalá disociace proteinů je příčinou toho, že nitrogenáza je „pomalý“ enzym - jeden úplný redukční cyklus trvá déle než 1 s (Leigh, 1988).

Zdrojem ATP jsou u heterotrofních bakterií organické látky, u fotoautotrofních bakterií

a sinic je ATP tvořeno v průběhu cyklické nebo necyklické fosforylace. Zdrojem elektronů je

ferredoxin nebo flavodoxin, pro jejich redukci se elektrony získávají rozkladem organických látek - baktérie nebo vody – sinice (Šimek, 1993).

ATP se účastní reakce jako komplex s Mg2+. Na přenos 8 elektronů, které jsou potřeba

k redukci jedné molekuly N2 a 1 molekuly H+, se spotřebuje 16 molekul MgATP

(960 kJ mol-1), podle rovnice:

N2 + 8H+ + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 16MgADP + 16Pi

U některých bakterií (např. rhizobií) a sinic (Bothe a kol., 1991) byl zjištěn enzym

hydrogenáza, který který oxiduje část nebo všechen vznikající H2. To vede k efektivnějšímu

metabolismu a vyššímu výtěžku dusíkatých sloučenin. Tyto kmeny se označují jako tzv. Hup+ kmeny (hydrogen uptake positive); (Šimek, 1993). 3.3 Alternativní nitrogenázy

U většiny organismů schopných fixovat vzdušný dusík nitrogenáza ve svém kofaktoru

obsahuje molybden (FeMoco). Existují však i nitrogenázy, které mají ve svém aktivním

centru místo molybdenu vanad (tzv. nitrogenáza 2 nebo také V-nitrogenáza). Mimo tyto dva

typy nitrogenázy je znám také enzym, který se tvoří za Mo- a V-deficitních podmínek.

V aktivním centru má pravděpodobně Fe (Bishop a Joerger, 1990) a nazývá se nejčastěji nitrogenáza 3.

18

Alternativní nitrogenázy byly doposud zjištěny pouze u několika rodů bakterií (např. rod

Azotobacter) a u několika málo rodů sinic. Většinou jsou to organismy žijící buď za nízkých

teplot nebo v prostředí extrémně Mo-deficitním, např. v kyselých půdách s vysokým obsahem oxidů železa (Bishop a Joeger, 1990).

V podstatě se nitrogenázy vzájemně odlišují strukturně a částečně i funkčně.

Strukturní rozdíly spočívají:

1. V různém obsahu prvků – různé zastoupení S2-, Fe, V a Mo.

2. V přítomnosti další podjednotky proteinu δ (enzym má potom toto podjednotkové složení: α2β2δ2); subjednotka δ je poměrně malá, její molekulová hmotnost je

13 – 15 000 a její sekvence aminokyselin se nepodobá žádnému proteinu (Leigh,

1988).

3. V rozdílné sekvenci aminokyselin produktů strukturních genů nitrogenáz.

Funkční rozdíly spočívají:

1. V různě účinné redukci N2; zatímco v případě Mo-nitrogenázy je za optimálních

podmínek distribuce elektronů mezi redukcí N2 a tvorbou H2 v poměru 3:1, v případě

V-nitrogenázy je tento poměr 1:1 (Leigh, 1988). U nitrogenázy 3 je rozdíl v efektivitě

ještě zřetelnější. Celkově jsou tedy V-nitrogenáza a Fe-nitrogenáza méně efektivní než Mo-nitrogenáza.

2. V rozdílné redukci acetylénu a tvorbě produktu (tzv. acetylenová analýza, užívá se pro testování aktivity jednotlivých nitrogenáz).

3. V rozdílné schopnosti redukovat další substráty; nitrogenázy katalyzují redukci celé

řady substrátů, mezi než patří: hydrazin (redukce na amoniak), azid (na amoniak nebo N2), alkiny (na alkeny – např. acetylén na etylén), alén (na propen), oxid dusný (na

N2), cyklopropen (na cyklopropan nebo propen), nitrily a izonitrily aj. (Leigh, 1988). 3.4 Regulace funkce nitrogenázy

Aktivita nitrogenázy závisí na řadě faktorů. Mezi nejdůležitější z nich patří kyslík.

Kyslíkem je nitrogenáza irreverzibilně inhibována, přičemž extrémně citlivé jsou oba proteiny, tvořící tento enzym, tedy jak Fe-protein tak i FeMo-protein. Např. k regulaci

koncentrace kyslíku u organismu, který fixuje dusík jako symbiont, slouží leghemoglobin, u sinic je to tvorba heterocytů.

Dalším aspektem je přítomnost dusíku v jiných formách než N2 v prostředí, v němž

organismus žije. Proces fixace dusíku je velice energeticky náročný, takže organismus dává 19

raději přednost anorganickým případně organickým formám dusíku. Jako inhibitor se uplatňuje i ADP.

U bakterií Rhodospirillum rubrum a Azospirillum sp. je popsán systém represe a dereprese

nitrogenázové aktivity přítomností NH4+. Amonné ionty kontrolují přímo tvorbu nitrogenázy na úrovni transkripce a nepřímo represí aktivity glutamin-syntetázy (Škára a Ferenčík, 1983).

Dostupnost iontů molybdenu, železa a hořčíku je odpovědna za efektivitu fixace.

Nepřítomnost molybdenu může být vyvážena tvorbou V-nitrogenázy nebo Fe-nitrogenázy. Nepřítomnost hořčíku snižuje účinnost fixace, protože ATP vstupuje do reakce jako komplex s Mg2+.

20

4. Nitrogenázové geny a jejich exprese Genetika fixace dusíku je dobře prostudována jen u několika málo bakterií, zejména

u bakterie Klebsiella pneumoniae. Funkce mnoha produktů nitrogenázových genů je dosud objasněna jen částečně, nebo není známa vůbec. 4.1 Nitrogenázové geny

Geny, které nesou informaci o nitrogenáze se nazývají nif geny (nitrogen-fixing genes).

Některé geny jsou společné pro organismy mající různé typy nitrogenáz (nitrogenáza 1, 2, 3), např. nifB a nifM. Naproti tomu určité struktury V- a Fe-nitrogenáz jsou kódované specifickými geny vnf (pro V-nitrogenázu; 2) a anf (pro Fe-nitrogenázu; 3).

4.1.1 Nif geny u Klebsiella pneumoniae

U této bakterie je 20 nif genů (Obr. 5) a nacházejí se na 22 - 24 kb úseku DNA, a to

v osmi operonech (transkripčních jednotkách): nifJ, nifHDKTY, nifENX, nifUSVWZ, nifM,

nifF, nifLA a nifBQ. Ve většině případů jsou tytéž geny přítomny i u jiných fixátorů molekulárního dusíku. Tedy jak u volně žijících, tak i u symbiotických fixátorů N2.

Geny nifB, Q, E, N, V, K, D a T kódují strukturu většího proteinu - FeMo-proteinu

nitrogenázy včetně FeMoco, geny nifH a nifM pak strukturu menšího z nich - Fe-proteinu.

Transport elektronů k nitrogenáze regulují produkty genů nifF a nifJ. Funkce ostatních

genů je prozatím neznámá (Zehr a Turner, 2001).

Obr. 5. Organizace nif genů u bakterie Klebsiella pneumoniae.

Převzato od Šimek (1993).

21

4.1.2 Nif geny u N2-fixujících sinic

Ve srovnání s bakteriemi jsou v organizaci nif genů u sinic jisté rozdíly. Existují také

značné rozdíly v organizaci genů u jednobuněčných sinic (např. jejich nifHDK operon se podobá bakteriálnímu) a u vláknitých sinic (kde nifK je ve vegetativní buňce oddělen od nifDH genů) a také u vegetativních buněk a heterocytů heterocytických sinic (Šimek, 1993).

Během změny vegetativní buňky v heterocyt dochází ke změnám v jejím genomu (Golden

a kol., 1987) tak, že v sousedství nifD a nifS genů jsou vypuštěny úseky 11 kb a 55 kb, (Obr. 6).

Pro vyvolání diferenciace vegetativní buňky v heterocytů jsou také nezbytné specifické geny, které nemají ve vegetativních buňkách žádnou funkci (cca 60 genů). Příkladem mohou být geny hetA a hetB u sinice Anabaena 7210 ( Kang a kol., 2005). U sinic byl již také zjištěn

regulační gen ntrC.

Obr. 6. Organizace genů u sinice Anabaena sp.

Převzato od Šimek (1993). 4.1.3 Nif geny u rhizobií

Průběh vytváření fixačního systému u rhizobií a leguminóz a jeho funkce se účastní tzv.

sym geny, které se dělí na nod geny (nesou informaci o látkách, které jsou potřebné při tvorbě

hlízek), nif geny (nesoucí informaci o tvorbě enzymu nitrogenázy) a fix geny (některé geny,

které jsou nezbytné pro funkčnost fixačního systému). Plazmidové Nod geny ke své expresi

potřebují rostlinné induktory, jimiž mohou být flavonoidy nebo betainy. U volně žijících

22

bakterií se exprimuje pouze gen nodD, který je regulační a exprimuje se stále. Geny nodA, nodB a nodC jsou geny obecné, vlastní všem symbiotickým druhům kmene Rhizobium.

Kódují enzymy zajišťující syntézu základní glukosaminové kostry Nod faktorů. Zmíněné nif geny rhizobií jsou v podstatě analogy nif genů volně žijících bakterií a sinic (Catoira a kol., 2000).

U některých kmenů rhizobií jsou specifické geny - tzv. hup geny, kódující hydrogenázu

(enzym, jež je schopen redukce produkovaného H2). 4.2 Regulace exprese nif genů

Nif geny jsou podřízené dvěma regulačním úrovním: globální – souvisí s regulačním

systémem metabolismu dusíku v buňce, a specifické - pro fixaci N2. Kontrola a regulace

fixace dusíku je důležitá hned z několika důvodu. Patří mezi ně především energetická náročnost tohoto procesu (tato energie ve formě ATP by mohla být využita pro jakýkoli jiný

děj v buňce), dále je to velmi malá rychlost nitrogenázy a tedy potřeba nasyntetizovat jí co nejvíce a konečně i aktivní ochrana nitrogenázy před kyslíkem. V podstatě jsou známy dva regulační mechanismy syntézy nitrogenázy: regulace dusíkem a regulace kyslíkem.

Metabolismus dusíku v buňce regulují tři ntr geny. Systém regulace zajišťuje, že

organizmus nesyntetizuje nitrogenázu, jestliže je k dispozici buď dostatek metabolizovaného dusíku – NH3, nebo příliš mnoho kyslíku v prostředí (Postgate a kol., 1986). Ntr geny regulují

celý nif regulon prostřednictvím přímé regulace transkripce nifLA operónu, jehož produkt

reguluje expresi ostatních nif genů, viz Obr. 7.

Regulace kyslíkem funguje přímo vlivem O2 na nifL gen, jehož exprese zastaví syntézu

nitrogenázy (Postgate a kol., 1986).

Genetický aparát a jeho regulace u symbiotického fixačního systému rhizóbií a leguminóz

je složitější, a to díky tomu, že zahrnuje dva zcela různé organismy. Regulaci metabolismu dusíku zajišťují nif-ntr geny a dále geny, které zajišťují hostitelskou specifitu a tvorbu hlízek.

23

Obr. 7. Regulace nitrogenázy.

Vysvětlivky: Mechanismy regulace syntézy nitrogenázy: _________ pozitivní regulace

------------- negativní regulace

…………

nespecifikované vazby

GRMN = globální regulace metabolismu dusíku v buňce

Upraveno podle Šimek (1993).

24

5. Mikroorganismy fixující molekulový dusík

Mikroorganismy schopné využívat molekulární dusík jsou někdy označovány jako

diazotrofové (fixátoři molekulárního dusíku). Velká většina organismů včetně všech rostlin

a živočichů není schopna syntetizovat enzym nitrogenázu a je tedy odkázána na příjem dusíku

v podobě různých sloučenin. Přítomnost tohoto enzymu v organismu však poskytuje možnost přežití v takových podmínkách, kde by jiné organismy mohly jen těžko existovat (např. v oblastech, kde je koncentrace dusíku v prostředí, v jiné podobě než N2, velice nízká).

Diazotrofové jsou organismy žijící buď samostatně, nebo od různě volných až po

mutualistické soužití (symbiózu) s jiným organismem.

5.1 Volně žijící organismy fixující molekulární dusík

Mezi tyto organismy řadíme bakterie a sinice žijící jak heterotrofně tak autotrofně;

aerobně, fakultativně anaerobně, mikroaerofilně i anaerobně; organismy fotosyntetizující či

nikoli (Tab. 2). Mikroorganismy žijící ve volném prostředí si stejně tak jako organismy žijící

v symbióze musí vytvořit pro průběh fixace molekulové dusíku vhodné – anaerobní prostředí.

Tvoří jej např. pomocí obalových struktur či změnou metabolického systému buňky (př. sinice (rod Anabaena) – heterocyty).

Biologická fixace u symbiotických systémů využívá energii získanou rostlinnou

fotosyntézou a u volně žijících organismů z organických látek v půdě. Dostatečný přísun

energeticky bohatých látek je tedy vzhledem k poměrně vysoké energetické náročnosti biologické fixace jejím rozhodujícím činitelem. Volně žijící fixátoři vzdušného dusíku jsou schopni za rok fixovat 8 – 120 kg dusíku/ha (Procházka a kol., 1998).

Nejčastěji zmiňovaným organismem v souvislosti s volně žijícími fixátory dusíku jsou

gramnegativní bakterie rodu Azotobacter. Řadí se do čeledi Azotobacteraceae třídy

Gamaproteobacteria. Zástupci tohoto rodu mají tyčkovitý až pleomorfní tvar, většinou jsou

pohyblivé (často peritrichálně obrvené). Nacházejí se v půdě, vodě a ojediněle na kořenech rostlin. Slouží jako modelový organismus pro výzkum alternativní nitrogenázy.

Dalšími častými mikroorganismy vyznačujícími se schopností vázat N2 jsou bakterie rodu

Pseudomonas a Xanthomonas (třída Gamaproteobacteria), Beijerinckia a Xanthobacter

(třída Alfaproteobacteria). První dva zmíněné rody patří do čeledi Pseudomonadaceae – jsou to gramnegativní rovné až mírně zakřivené tyčky, pohyblivé pomocí polárního bičíku, striktně

aerobní, žijící v širokém rozmezí teplot (4 – 43 °C). Dalším zástupcem je rod Beijerinckia – samostatný rod třídy Alfaproteobacteria. Jeho zástupci mají tvar tyčky, někteří mohou tvořit

25

kapsulu, mohou být obrvené i bez bičíků. Vyskytují se v půdě tropických oblastí. Zástupci

rodu Xanthobacter se vyznačují pleomorfním tvarem buněk, tvorbou žlutého pigmentu a

výskytem v promáčených půdách (tedy v půdách obsahujících velké množství organického materiálu).

Tab. 2. Volně žijící organismy schopné fixace molekulárního dusíku. Volně žijící Vztah k energii baktérie a sinice heterotrofní

Vztah ke kyslíku aerobní

Mikroorganismus Azobacter, Azomonas, Acetobacter, Azotococcus, Pseudomonas, Beijerinckia, Derxia, Xanthobacter, Nocardia, Pullalaria

mikroaerofilní

Azospirillum, Aquaspirillum, Campylobacter, Herbaspirillum, Arthrobacter, Thiobacillus, Rhizobium, Frankia, Baggiatoa, Thiothrix

fakultativně anaerobní

fakultativně anaerobní autotrofní

fotosyntetizujícíaerobní

fotosyntetizujícíanaerobní

nefotosyntetizujícíaerobní nefotosyntetizujícíanaerobní

Upraveno podle Šimek (1993).

Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Vibrio, Achromobacter Clostridium, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Propionispira Anabaena, Calothrix, Nostoc, Gleothece, Cylindrospermum, (aj. sinice, celkem asi 40 druhů) Chromatium, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium, Rhodocyclus, Chlorobium Methylococcus Methanobacterium, Methylosinus, Methanosarcina, Methanococcus

5.2 Symbioticky žijící organismy fixující molekulární dusík

Symbiózu mezi bakteriemi fixujícími molekulární dusík a rostlinami lze rozdělit na

symbiózu asociativní, nodulující a nenodulující.

26

Organismy žijící v mutualistickém vztahu s vyššími rostlinami jsou schopni ročně fixovat

45 – 400 kg N/ha. V případě asociativní symbiózy je to pouze 3 – 10 kg N/ha (Procházka

a kol., 1998). Množství fixovaného dusíku zástupci rodu Rhizobium je uvedeno v Tab. 4.

Z uvedených údajů vyplývá, že právě díky mutualistickému způsobu života je baktérie schopna vázat dusík se značnou efektivitou. 5.2.1 Asociativní symbióza

Asociativní symbióza je v podstatě synergický vztah ustavující se mezi půdními

mikroorganismy a rostlinou (př. bakteriální rody Azotobacter, Beijerinckia, Arthrobacter

a Pseudomonas a kořeny rostlin s fotosyntetickou drahou typu C4). Tento druh symbiózy je

hojně rozšířen především v subtropických a tropických oblastech, kde se právě rostliny s touto drahou vyskytují (dokáží lépe využít světelnou intenzitu a vyšší teploty prostředí). Příklady dalších asociativních symbióz jsou uvedeny v Tab. 3.

Některé rostliny vytváří a transportují do kořenů zvýšené množství uhlíkatých látek, které

částečně vylučují ve formě kořenových exudátů do půdy. Tyto exudáty představují lehce dostupný zdroj energie a uhlíku pro bakterie fixující N2. Tab. 3. Příklady asociativních systémů. Asociativní systémy

bakterie r. Azospirillum bakterie bakterie, sinice

Upraveno podle Šimek (1993).

tropické rostliny (Paspalum notatum) vyšší rostliny (v rhizosféře) rostliny (v nadzemních částech)

5.2.2 Nodulující symbióza

Jedná se o symbiózu mezi rostlinami čeledi Fabaceae (motýlokvěté) s bakteriemi rodu

Rhizobium, dále pak Mimosaceae (citlivkovité) a Caesalpiniaceae (saponovité) s bakteriemi

rodu Rhizobium, Bradyrhizobium, Phyllobacterium (tzv. hlízkovité bakterie) nebo aktinomycety rodu Frankia.

Hlízkovité bakterie jsou běžnou součástí mikrobiálního společenstva půdy. Žijí-li však

v půdě volně a upřednostňují saprotrofický způsob života, přičemž většinou dusík nefixují

(Gade, 2004). Tyto bakterie přesto zásobují rostlinu dusíkem a dokáží svou aktivitou pokrýt až 80 % nároků rostliny na dusík.

První tři jmenované rody patří do čeledi Rhizobiaceae třídy Alfaproteobacteria. Jsou to

vesměs pleomorfní tyčkovité organismy, většinou pohyblivé, mohou tvořit extracelulární

27

sacharidová pouzdra. Jako symbiont vyšších rostlin se nejčastěji uplatňují baktérie rodu Rhizobium (Tab. 4). Bakterie rodu Bradhyrhizobium jsou za určitých podmínek schopny fixovat vzdušný dusík i mimo hlízku. Phyllobacterium je rodem, jehož zástupci tvoří uzliny na listech vyšších rostlin, především v tropických oblastech.

Tab. 4. Zástupci rodu Rhizobium žijící v symbióze s bobovitými rostlinami. Rostliny

jetel (Trifolium) fazol (Phaseolus) čočka (Lens) hrách (Pisum) Vlčí bob (Lupinus) vojtěška (Medigago)

Druhy rodu Rhizobium R.trifolii R.phaseoli R.leguminosarum R.leguminosarum R.lupini

Množství fixovaného dusíku(kg/ha/rok) 45 - 340 63 - 340 88 - 114 52 - 77 142 - 203

R.meliloti

90 - 340

Upraveno podle Pocházka a kol. (1998). 5.2.3 Nenodulující symbióza

Příkladem tohoto typu symbiózy může být soužití sinic rodu Anabaena nebo Nostoc

s houbami, kapraďorosty nebo mechorosty, přičemž si sinice zachovávají schopnost vázání N2.

Symbióza sinic s houbami se vyskytuje přibližně u 8% druhů lišejníků. V tropech je velmi

rozšířená symbióza sinice Anabaena s vodní kapradinou Azolla. Často se hojně vyskytují na

povrchu rýžových polí, kde svou aktivitou zajišťují až 75% nároků rýže na dusík (Procházka

a kol., 1998). Ostatní možnosti nodulující i nenodulující symbiózy jsou uvedeny v tabulce 5. Tab. 5. Příklady symbiotických systémů. Symbiotické systémy

Mikroorganismus Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium Frankia sinice sinice sinice

Upraveno podle Šimek (1993).

Rostlinný symbiont leguminózy (byliny i dřeviny, více než 280 druhů) olše (Alnus), Myrica, Eleagnus aj. (více než 25 rodů z 8 čeledí) houby => lišejníky kapradina (Azolla) řasy, játrovky, rostliny řádu Cycadales, krytosemenné rostliny

28

6. Nesymbiotická fixace molekulového dusíku Výčet organismů, které nevystupují jako symbionti v mutualistickém vztahu s jiným

organismem a přesto dokáží fixovat vzdušný dusík je uveden v tabulce 1. (Kapitola 5).

Mikroorganismy schopné fixace N2 syntetizují výše zmíněný enzym nitrogenázu, jež je

ireverzibilně inhibován kyslíkem, a proto je třeba jej před ním chránit. Organismům

vystupujícím jako symbionti většinou „pomáhá“ hostitel. Bakteriím rodu Rhizobium pomáhají

buňky kořene luskovin tím, že kódují protein, jež reguluje koncentraci kyslíku v kořenových

buňkách, tzv. leghemoglobin. Nesymbiotický způsob fixace tedy může probíhat pouze u organismů, kteří jsou schopni si koncentraci kyslíku ve svém okolí uhlídat samy, typickým příkladem jsou sinice. 6.1 Azotobacter

Aerobní bakterie rodu Azotobacter jsou schopny v kyslíkatém prostředí v laboratorních

podmínkách fixovat až 30 kg dusíku/ha/rok. V přirozených podmínkách je množství nižší, okolo 5 – 10 kg dusíku na 1 ha za rok (Němec, 1986). Azotobacter je ve své činnosti limitován faktory vnějšího prostředí, i v dobře obdělávaných černozemích je jeho výskyt poměrně nízký, pohybuje se v rozmezí 103 – 104 v 1 mg půdy. Jako zdroj uhlíkaté výživy

využívá cukry, alkoholy i organické látky, je však velmi náročný na dostatečnou koncentraci kyslíku ve svém prostředí. Vyžaduje půdy, které jsou dobře provzdušněné, mají vhodnou

vlhkost a neutrální až alkalické pH. Dalším faktorem ovlivňujícím růst a fixaci N2 u této bakterie je přítomnost jiné půdní mikroflóry (prospěšný vztah se sinicemi, řasami, prvoky, pseudomonádami, bakteriemi schopnými rozkladu celulózy, aj.).

Mladé buňky spotřebují 70 – 90 % vázaného dusíku na syntézu bílkovin, zbývající

množství je transportováno do vnějšího prostředí. Během generační doby stoupá množství transportovaného dusíku vně buňky (Němec, 1986). 6.2 Clostridium

Klostridia jsou mikroorganismy schopné fixace vzdušného dusíku v anaerobních

podmínkách (jsou to striktně anaerobní bakterie). Mezi nejvýznamnější druhy patří Clostridium pasteurianum. Energii potřebnou pro fixaci N2 získává zkvašováním cukrů na kyselinu máselnou a octovou (Němec, 1986).

Mezi druhy tohoto rodu vyznačujícími se schopností fixace dusíku patří Cl. aceticum, Cl.

acetobutyricum, Cl. beijerinckii, Cl. butyricum, Cl. perfringens, Cl.felsineum, aj. Jsou

29

rozšířeny v půdách obdělávaných a podzolových i v rašeliništích a bahnech a to díky toleranci

k pH prostředí (pH optimum se pohybuje v rozmezí 6,9 – 7,3). Fixace těmito organismy jsou významné především v lesních a kyselých půdách. 6.3 Fixace N2 u sinic

U cyanobacterií dochází ke střetu dvou v podstatě neslučitelných pochodů. Ve všech

vegetativních buňkách probíhá fotosyntéza, která vede k uvolňování molekul kyslíku. Ty jsou

však neslučitelné s vázáním N2. Z tohoto důvodu se u sinic vyvinuly strategie prostorové

a časové separace fotosyntézy a fixace N2. U vláknitých sinic pododdělení Nostocales a

Stigonematales

dochází

při

nedostatku

dusíkatých

látek

k diferenciaci

buněk

specializovaných na fixaci – heterocytů. Informace uvedené v této podkapitole byly převzaty z http://www.sinicearasy.cz. 6.3.1 Prostorová separace

Během přetváření vegetativní buňky v heterocyt dochází ke změnám ve struktuře i funkci

celé buňky. Jako první se ukládá trojvrstevná stěna vně původní buněčné stěny. Vnitřní vrstva

je tvořena glykolipidem, střední polysacharidem a vnější nekompaktními vlákny téhož polysacharidu. Tento krok je na buňce patrný již po 6–12 hodinách od započetí

“diferenciace“. Výsledkem je stále metabolicky aktivní buňka se silnou buněčnou stěnou – proheterocyt.

Následuje řada dalších biochemických změn, během nichž je systém thylakoidů uvnitř

buňky zcela přestavěn v nový membránový systém. Zcela mizí fotosystém II s OEC (centrum pro štěpení vody a uvolňování kyslíku), zatímco fotosystém I i s chytochromálními komplexy

jsou zachovány. Fotosystém I slouží k uskutečňování cyklického procesu, který vede ke generaci ATP a na cytochromech probíhá dýchací řetězec, což je další z prostředků, který vede ke snížení hladiny O2. Z buňky také mizí enzym Rubisco.

Posledním krokem je syntéza vlastních enzymů provádějících reakci – nitrogenáza (U sinic

se většinou vyskytuje FeMo-nitrogenáza. Byly však izolovány i kmeny např. Anabaena obsahující alternativní V-nitrogenázu), GS-glutamin syntetázu (přenáší amonný iont na glutamát) a GOGAT (enzym zajišťující regeneraci glutamátu).

Celý proces „diferenciace“ je striktně regulován a obvykle trvá 12 – 20 hodin, může však

trvat až 30 hodin. Zralý heterocyt komunikuje se sousedními vegetativními buňkami pomocí

sept v místě styku s nimi (tzv. polární noduly). Jde o pór se složitou strukturou, který je

30

perforovaný několika desítkami mikroplasmodesmat, jimiž dochází k transportu dusíkatých látek okolním buňkám a „dodávce“ redukčních ekvivalentů NADH z okolních buněk.

Podobný systém prostorové separace se uskutečňuje ještě u několika dalších rodů sinic.

Příkladem může být mořský rod vláknitých sinic Trichodesmium. Tyto sinice na svém vlákně

tvoří úsek asi 5 vegetativních buněk, ve kterých přestává fungovat fotosyntéza, avšak dýchání probíhá dále. Tyto buňky se nazývají diazocyty. 6.3.2 Časové oddělení fixace N2 a fotosyntézy

Toto oddělení obou dějů se vyvinulo u řady vláknitých ale i kokálních typů sinic. Během

dne dochází ve vegetativních buňkách k fotosyntéze, čímž se získává energie potřebná pro růst a akumulaci NADP a ATP. V noci pak v důsledku snížení fotosyntézy, ale stále stejně

efektivně probíhajícímu dýchání, se snižuje hladina kyslíku uvnitř buňky a tedy k vytvoření

prostředí vhodného k fixaci dusíku. (Dynamika procesu je naznačena na Obr. 8). Tento způsob byl prokázán např. u sinic Plectonema boryanum a Aphanothece. Obr. 8. Dynamika fixace N2 u různých typů sinic.

noc

Vysvětlivky:

den

noc

Nitrogenázová aktivita je uvedena v katalech = množství enzymu, které přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu.

Upraveno podle http://www.sinicearasy.cz.

31

7. Symbiotická fixace molekulového dusíku Symbiotická fixace N2 je podmíněna vznikem oboustranně výhodného soužití mezi

některými druhy rostlin a bakteriemi nebo houbami. Bakterie (včetně sinic) vystupují jako

fixátoři dusíku a houby poskytují rostlinnému hostiteli živiny rozpuštěné ve vodě (Pawlowski a Bisseling, 1996).

V případě hlízkovitých bakterií, mykorrhizy a podvojného organismu (lišejníku) mluvíme

o tzv. mutualistickém vztahu. Mutualismus je trvalé a nezbytné soužití obvykle dvou druhů organismů, kteří mají ze soužití prospěch a jsou na sobě závislí. V případě asociativní

symbiózy půdních mikroorganismů na kořenech vyšších rostlin mluvíme o protokooperaci. Tento vztah je volnější než mutualismus. (Populace A a populace B jsou v prospěšném, nikoliv nutném soužití.) Vzájemné vztahy organismů jsou uvedeny v tabulce 6. Tab. 6. Vzájemné vztahy organismů.

Typ vztahů Neutralismus Konkurence Amensalismus Parazitismus Predace Komensalismus Protokooperace Mutualismus

Vliv na druh A 0 – – + + + + +

Vliv na druh B 0 – 0 – – 0 + +

Vysvětlivky:

- populace je ovlivněna negativně, + populace je ovlivněna pozitivně, 0 populace není ovlivněna

Symbióza mezi rostlinou a mikroorganismem může být několika typů: asociativní,

nenodulující a nodulující (s leguminózami nebo s jinými rostlinami). 7.1 Nodulující (hlízkovité) symbiózy

Nejvýznamnější symbiotický vtah, vzhledem k množství fixovaného dusíku, se vytváří

mezi leguminózní rostlinou a rhizóbii. Vnějším znakem vytvoření tohoto vztahu je tvorba hlízek na jejich kořenech. Hlízkovité bakterie se vyznačují vysokou specifitou ve vztahu k

32

hostiteli, např. rhizobia izolovaná z hlízek na kořenech fazole nejsou schopna vytvářet hlízky na hrachu a naopak (Němec, 1986). Nodulující

symbiotická

fixace

není

výsadou

pouze

mutualistického

vztahu

leguminóza – rhizobium, ale vytváří se i u jiných organismů, např. Alnus, Casuarina, Coriaria, Elaeagnus, Hippophae, Shepherdia, Myrica, aj.

Také některé tropické rostliny z čeledí Rubiaceae a Myrsinaceae vytváří útvary podobné

hlízkám. Rozdíl od leguminóz je v jejich umístění – netvoří se na kořenech, ale na listech. Bakterie tvořící tyto „hlízky“ jsou schopné fixovat dusík i mimo hostitelskou rostlinu a byly zařazeny do rodu Klebsiella a Chromobacterium.

Tvorby kořenových hlízek jsou schopné i sinice rodu Anabaena, Nostoc či Chlorococcum

a to v případě, že žijí v symbiotickém vztahu s rostlinnými zástupci Cycadales. 7.2 Nenodulující symbióza - lišejníky (Lichenes)

Lišejníky bývají označovány jako duální organismy. Jde totiž o symbiotickou spolupráci

dvou (někdy i více) rozdílných typů organismů: houby (mykobiont) a zelené řasy nebo sinice

(fotobiont). Počet druhů je odhadován na 13 500 až 17 000, rostoucích od tropů až po polární oblasti. Některé druhy rostou dokonce na kůře stromů jako epifyty (většinou v tropických deštných pralesích). 7.2.1 Mykobiont

Několik málo druhů hub (asi 20 druhů) tvořících součást lišejníků patří do skupiny hub

Basidiomycota, ale většinu představují zástupci skupiny Ascomycota, které často vytvářejí

fruktifikační orgány – ascocarpy (jsou to obvykle útvary diskovitého tvaru nazývané apothecia). Téměř polovina všech hub vyskytujících se na zemi patří mezi Ascomycota a velké procento z nich se vyskytuje pouze jako součást lišejníku. Ačkoliv jsou jejich spóry

(uvolňované z fruktifikačních orgánů) rozptýleny do prostředí, nejsou schopny samostatného života. Jsou to pomalu rostoucí organismy, kterým navíc chybí enzymový systém pro degradaci komplexů polymerů.

Mykobiont má v principu dvě funkce: chrání fotosyntetického partnera před přímým

slunečním světlem a vysoušením a absorbuje ve vodě rozpuštěné minerální látky z podloží. Je také schopen vázat atmosférické kontaminanty (Deacon, 2005).

Hyfa houby obvykle vytváří krátké větve, které penetrují buněčnou stěnu řasy. Tyto útvary

se nazývají haustoria a slouží houbě k absorpci živin z řasy. V případě, že je fotobiont sinice

33

(např. lišejník rodu Peltigera), houba nevytváří haustoria, ale produkuje tenkostěnné výčnělky, které penetrují hydrofilní gelovitý obal obklopující buňku sinice. 7.2.2 Fotobiont

V porovnání s množstvím hub tvořících součást lišejníků, existuje pouze okolo 100

fotosyntetických partnerů. Nejběžnější je jednobuněčná zelená řasa rodu Trebouxia. Tato řasa

roste samostatně jen zřídka. Jiným také běžným fotosymbiontem je vláknitá zelená řasa rodu Tretepohlia rostoucí výhradně ve středomořských a tropických oblastech. Tento rod zelených

řas se v přírodě vyskytuje pouze jako součást lišejníku (Deacon, 2005).

Fotosyntetickým partnerem mohou být i sinice – vyskytují se asi u 10 % lišejníků.

Nejčastěji se vyskytujícím rodem je Nostoc. U některých druhů lišejníků obsahujících jako

fotosymbionta zelenou řasu není výjimkou, že mají na svém povrchu i sinici (vytvářející bradavičnaté struktury). Struktura lišejníku je znázorněna na Obr. 9.

Funkce fotosymbionta spočívá v syntéze organických látek z CO2, může také fixovat

vzdušný dusík (lišejník druhu Collema tenax) a poskytovat mykobiontu fosfor. Díky možnosti fixovat dusík se zvětšuje jejich šance na přežití i v opravdu nevhodných podmínkách. Obr. 9. Struktura lišejníku.

Upraveno podle Němec (1986).

34

8. Fixace molekulového dusíku u leguminózních a neleguminózních rostlin Kořenové hlízky, ve kterých úspěšně dochází k fixaci N2 byly dosud nalezeny u 10

rostlinných čeledí zahrnujících jak byliny tak i stromy a keře. Tyto rostliny tvoří nejčastěji symbiotický (mutualistický) vztah s bakteriemi rodu Rhizobium a Frankia.

Pojmem leguminózní (opak neleguminózní) jsou myšleny vikvovité rosliny mezi než patří

i Medicago sativa nebo Lotus japonicus, které souží jako modelové organismy pro analýzy

genů nezbytných pro symbiotickou fixaci N2.

8.1 Vzájemná výměna signálů mezi mikroorganismem a leguminózní rostlinou

Začátkem 90. let biologové rozluštili chemické signály, které spouští rannou symbiotickou

reakci. Kořeny hostitelských rostlin produkují flavonoidy - luteolin, apigenin, daidzein,

naringenin (Obr. 10), betainy (trigonellin, stachydrin a další) nebo kyselinu aldonovou. V nízkých koncentracích tyto látky působí jako signál pro chemotaxi bakterie. Avšak ve vyšších

koncentracích, blíže k povrchu kořene, spouští expresi plazmidových nod genů pro tvorbu lipochitooligosacharidových molekul tzv. Nod faktorů (Catoira, 2000). Každý rostlinný druh vylučuje specifickou směs flavonoidů. To zajišťuje, že jeho chemický signál bude přijat „správným“ bakteriálním druhem.

Navíc rostlina tvoří na povrchu svých kořenových vlásků lektiny (bílkoviny specificky

vážící oligosacharidové řetězce), které usnadňují vazbu a průnik bakterie do vlásku (Parniske, 2004).

Obr. 10. Struktura 7,4´- dihydroxyflavonu.

Základem molekuly Nod faktoru je tři až pět β – 1,4 – N – acetyl – D – glukozaminových

řetězců. Tyto řetězce mají redukující a neredukující konec. Na neredukující koncové oblasti

jsou N – acylovány řetězci mastných kyselin a redukující koncová oblast oligosacharidové

páteře molekuly bývá modifikována druhově specifickými skupinami, mezi něž patří sulfát, acetát, fruktóza nebo arabinóza (Obr. 11).

35

Obr. 11. Struktura Nod faktoru.

Nod faktory jsou rostlinou vnímány díky receptorovým komplexům uloženým

v plazmatické membráně epidermálních buněk kořene (Madsen a kol., 2003; Radutoiu a kol.,

2003). Tyto komplexy jsou tvořeny extracelulární a intracelulární oblastí. Vnější oblast obsahuje LysM domény, jež byly nalezeny již dříve v proteinech vázajících peptidoglykany (Bateman a Bycroft, 2000).

Produkty genů NRF1 a NRF5 (nodulation-specific Nod-factor receptor) jsou vhodnými

kandidáty na pozici receptorů Nod faktorů, protože obsahují LysM motivy, které dokáží vázat molekuly obsahující N- acetyl-glukosamin (Parniske, 2004).

Intracelulární doménou je

serin/treoninové kináza, která po zachycení signálu mění svoji aktivitu a v roli enzymu

pozměňuje aktivitu dalších bílkovin v buňce (dochází ke spuštění signální receptorové kaskády). Důležitou úlohu v přijmu signálu rostlinou mají DMI1, DMI2, DMI3 geny (z ang. DOESN´T MAKE INFECTIONS). V Medicago truncatula se předpokládá iontový kanál kódovaný DMI1 (běžný SYM gen) (Parniske, 2004)., který vykonává svoji činnost proti

transportu vápenatých iontů (stejně tak jako DMI2). Naproti tomu DMI3 je aktivován po směru transportu vápenatých iontů (Wais a kol. 2000; Oldroyd a Long, 2003).

36

8.1.1 Reakce rostliny na bakteriální Nod faktory

Nod faktory umožňují bakteriím infikovat kořen hostitelské rostliny a iniciovat celou

soustavu kroků vedoucí k tvorbě kořenové hlízy a rozvoji symbiotické fixace N2. Baktérie kontaktující kořen rostliny způsobuje morfologické změny v jeho epidermálních buňkách. Tyto změny probíhají v několika krocích (Obr. 12): 1. Deformace a stáčení kořenového vlásku. 2. Tvorba infekčního vlákna a jeho růst. 3. Vznik kořenové hlízky. 4. Tvorba bakteroidů.

Obr. 12. Průběh infekce hostitelské rostliny.

37

8.1.1.1 Deformace a stáčení kořenového vlásku

Prvními morfologickými změnami, které jsou indukovány produkty genetické exprese

v rhizobiích jsou deformace a stáčení kořenového vlásku. Vlásek se pod jejich vlivem stane

na několik sekund propustný pro ionty. Dochází k depolarizaci plazmatické membrány způsobené importem Ca2+ a H+. Z buňky jsou současně vylučovány ionty draslíkové

a chloridové. Po prvním influxu vápníku následuje ještě série menších. Tato oscilace

koncentrace vápníkových iontů má za následek spuštění exprese celé řady rostlinných genů,

jejichž produkty jsou nutné pro další kroky a k vyvolání změny v postavení aktinových filament.

Deformace kořenových vlásků se ve většině případů vyskytuje jen u těch, které právě

ukončily svůj přirozený růst (Heidstra a kol., 1994). Je u nich nově indukován izotropní růst. Jeho směr je vždy určen oblastí vlásku, která zachytila Nod faktor a která je atakována bakteriemi (Esseling a kol., 2003). Tímto způsobem se vlásek otočí o 360° a tím bakterii

uzavře do vzniklého prostoru (tzv. vaku). Funkce této izolace není ještě dostatečně objasněna.

Nejspíše je důležitá pro vytvoření dostatečného turgorového tlaku potřebného pro vstup bakterie do buňky (Esseling a kol., 2003).

Množství infekčních bakterií, které vstupují do buněk kořene si musí rostlina regulovat

sama, kdyby tomu tak nebylo, mohlo by se stát, že by bakterie rostlinu „zahltily“ a později

vytvořily velké množství hlízek, které by ji nutričně zcela vyčerpaly. Jedním z regulátorů je

etylén, který tlumí odpověď rostliny na Nod faktory. Kromě jiného je schopen zastavit také vápníkovou oscilaci (Petr, 2004).

8.1.1.2 Tvorba infekčního vlákna

V místě buněčné stěny, která je v kontaktu s bakterií, dochází během vytvoření vaku

z kadeře vlásku k její hydrolýze. Plazmatická membrána se vchlipuje dovnitř rostlinné buňky a tvoří tubulární strukturu

- infekční vlákno (Endre a kol., 2002). Látky, které tvoří

membránu a obsah infekčního vlákna jsou produkovány hostitelskou rostlinou i bakteriemi. Infekční vlákno prorůstá k primární kůře kořene, kde se indukuje tvorba primordia (Van

Spronsen a kol., 1994). Uvnitř infekčního vlákna se rhizobia množí a rostou. Při styku s buňkou nodulu se membrána infekčního vlákna rozpouští, bakterie se uvolní do

mezibuněčného prostoru a následně vstupuje do buněk obalena membránou odvozenou z plazmatické membrány buňky hostitelské rostliny (Heidstra a kol., 1994).

38

8.1.1.3 Vznik kořenové hlízky

Základ hlízky (primordium) tedy vzniká ve vnějších nebo vnitřních vrstvách primární

kůry, především v blízkosti xylémových částí centrálního radiálního cévního svazku. Pokud základ nodulu vzniká v hlubších vrstvách, buňky primární kůry mění uspořádání cytoplazmy a připravují infekčnímu vláknu k základu nodulu cestu, tím že se v prostoru mezi buněčnými

stěnami tvoří cytoplazmatický most, kterým infekční vlákno prostupuje, jak je znázorněno na Obr. 12. a 13. (Yang a kol., 1994). Během iniciace tvorby hlízky se u rostliny exprimuje cyklin CycA2, jehož nadměrná tvorba vlivem přítomnosti Nod faktorů aktivuje buněčný

cyklus (mitózu) a obnovuje dělení již diferencovaných buněk (Roudier a kol., 2000). Auxin (rostlinný hormon) také ovlivňuje buněčné dělení, tím že jej stimuluje a působí na diferenciaci

buněk, proto se ve velkém množství akumuluje v hlízkovém primoridiu (Dutis a kol., 1993;

Whightman a kol., 1980). Koncentrace auxinu v kořenech může být regulována jeho transportem z kořene ven nebo oxidací (Bandurski a kol., 1995; Lomax a kol., 1995). Obr.13. Endosymbiotický vstup do rostlinné buňky.

a) Intracelulární penetrace u leguminózních rostlin

b) Intercelulární penetrace u neleguminózních rostlin

Upraveno podle Pawlowski a Bisseling (1996).

39

8.1.1.4. Vytvoření bakteroidů

Bakteriální buňky tedy vstupují do prostoru hlízkovitého primordia procesem podobným

endocytóze. Membrána obklopující bakterii je nazývána peribakteriální membránou a vzniká

z cytoplazmatické membrány buňky nodulu i proteinů bakteriálního původu a má některé složky i vlastnosti tonoplastu (Vercher, 1989). Zde se bakterie mění na bakteroid – formu, která je schopna fixace molekulového dusíku (schopna syntetizovat enzym nitrogenázu) (Brewin, 1991).

Peribakteriální membrána zajišťuje transport látek a signálů mezi bakterií a rostlinou.

Z nodulu do cytosolu hostitelské buňky je transportován NH4+. Zpětně jsou transportovány

především organické látky (dikarboxylové kyseliny a pyruvát), H2O (specifickým typem aquaporínů) i potřebné produkty asimilace NH4+. Amoniový iont je transportován díky

specifickému a netypickému transportéru, tzv. SAT1, s jednou transmembránovou doménou,

kódovanou hostitelskou rostlinou (Oke a Long, 1999).

Vstup kyslíku do buňky je regulován specifickým proteinem s hemovou prostetickou

skupinou – leghemoglobinem, který je syntetizován hostitelskou buňkou. Noduly jsou dvojího

typu – nedeterminované a determinované. V nedeterminovaném tzv. meristematickém typu nodulů se buňky v jeho apikální části dělí a infikují, v bazální potom stárnou a odumírají. Tvoří je především druhy rostlin mírného pásma exportující amidy. V determinovaným

nodulech dělení buněk ustává, hlízka se jako celek zakládá, vyvíjí, zraje, stárne a poté odumírá. Tento typ vytváří tropické druhy rostlin čeledi Fabaceae, které exportují amidy a ureidy.

Hlízky přetrvávají na kořenech do té doby, než rostlina začne vytvářet plody (Vercher,

1989).

8.2 Fixace N2 u neleguminózních rostlin

Zástupci rodu Rhizobium nejsou jedinými mikroorganizmy, které mohou žít jako

endosymbionti v kořenech rostlin (ve většině případů motýlokvětých). Tuto schopnost mají

i jiné mikroorganismy, např. actinomycety rodu Frankia, které žijí v symbiotickém vztahu

s vytrvalými neleguminózními rostlinami mezi něž patří olše (Alnus), olivy, přesličník

(Casuarina), tamaryšek (Myrica), jilm (Ulmus) a další (Berry a Sunell, 1990). Frankia je

bakteriální rod patřící mezi actinomycéty, které jsou charakteristické svým pomalým růstem

a vysokým procentuálním zastoupením guaninu a cytosinu v DNA (Benson and Silvestr, 1993).

40

Je znám však i případ, kdy se vytváří mutualistický vztah mezi neleguminózní rostlinou

(Parasponia) a bakterií rodu Rhizobium.

8.2.1 Infekce neleguminózní rostliny bakteriemi

Geny potřebné k infekci rostliny jsou velice podobné genům umožňujícím symbiózu:

leguminózní rostlina – Rhizobium. Časné nodulační geny jsou exprimovány před započetím

fixace dusíku – jsou důležité pro infekci rostliny, pro vznik a vývoj hlízky, zatímco pozdní nodulační geny slouží k diferenciaci metabolických aktivit, nutných pro správnou funkci kořenové hlízky.

Infekce může probíhat dvojím způsobem: intercelulárně a intracelulárně. Intercelulární

infekce byla popsána pouze u rodu hlošina (Elaeagnus); (Diouf a kol., 2003) a v tomto případě proces není spojen se vznikem prenodule, s výjimkou rodu Ceanothus, u něhož byla zaznamenána nízká mitotická aktivita bez buněčné expanze nebo infekce (Diouf a kol., 2003).

Intracelulární infekci zahajují dosud neurčené signály, které produkují bakterie

a vyvolávají tak stáčení kořenového vlásku (Prin a Rougier, 1987). Bakterie proniká do deformovaného kořenového vlásku, který je lokalizován u základu postranního kořene a zde

indukuje hydrolýzu buněčné stěny. Poté, co bakterie vstoupí do korové buňky, je obdána membránou odvozenou z plazmalemy buňky (obsahuje celulózu, pektiny a hemicelulózy)

(Newcomb a Wood, 1987; Smith a Smith, 1990). Tento proces je spojen s posunem jádra

rostlinné buňky, pohybem cytoplazmy a objevením se struktury podobné fragoplastu (útvar objevující se v rostlinných buňkách při nepřímém dělení buněčného jádra, tam kde vzniká přehrádka). Infekční vlákno obsahující bakterie nejdříve kolonizuje (infikuje) dělící se buňky

kořenové kůry za vniku prenodule. Prenodule se už ve zralou hlízku nepřeměňuje. Buňky Frankia, které pronikly do prenodule, zahajují fixaci dusíku (Laplaze a kol., 2000). Rozvoj

procesu fixace v prenoduli spustí mitotickou aktivitu v buňkách pericyklu (v oblasti proti

protoxylému) a vytvoří se primordium (Obr. 13, 14). Prenodule by mohla představovat „prekuzor“ pro kořenovou hlízku (Laplaze a kol., 2000). Hlízky jsou obvykle tvořeny velkým počtem „laloků“, z nichž každý přestavuje pozměněný postranní kořen bez kořenové čepičky

(Benson a Silvestr, 1993), mají nedeterminovaný růst a mohou nebo nemusí vytvářet „hlízkovitý“ kořen (Diouf a kol., 2003). Fixace probíhá v přítomnosti leghemoglobinu (stejně

jako v případě symbiózy: Rhizobium – leguminózní rostlina), který kóduje Frankia (Fleming

a kol., 1987).

Ještě předtím než bakterie infikuje rostlinu (žije v tzv. volném stádium) je schopna

syntetizovat nitrogenázu. Vytváří totiž na konci vláken měchýřky, uvnitř kterých je tento 41

enzym lokalizován a chráněn před přístupem kyslíku vícevrstevnou lipidovou membránou. (Berry, 1994).

Obr. 14. Infekce a časná organogeneze kořenové hlízky (laloku) v aktinorhizální rostlině.

Upraveno podle Obertello a kol. (2003). 8.2.2 Symbiotický vztah: neleguminózní rostlina - Rhizobium

Pouze v jednom případě dochází ke změně prenodule v pravou kořenovou hlízku, a to při

infekci rosliny rodu Parasponia (Ulmaceae) bakteriálním rodem Rhizobium. Rhizobia se však

na rozdíl od symbiózy s leguminózními rostlinami, nediferencují v bakteroidy. Primordium

vzniká stejně jako při infekci rodem Frankia v pericyklu kořene. Přetrvávající infekční vlákno

je obklopeno a uzavřeno cytoplazmatickou membránou a fibrilárním materiálem (Pawlowski, 1997). Infikovaná zóna kořenové hlízky je složena ze dvou buněčných populací – infikovaných a neinfikovaných. Neinfikované buňky mají zatím neznámou funkci.

42

9. Arbuskulární mykorhizální symbióza a fixace molekulového dusíku Termín mykorhiza je označení pro symbiotický vztah cévnaté rostliny a houby. Rostlina je

v tomto mutualistickém (oboustranně výhodném) vztahu nazývána fykobiontem a houba mykobiontem. Více než 80 % suchozemských rostlin vytváří arbuskulárně mykorhizní (AM)

symbiózu, která zlepšuje jejich nutriční příjem (zejména relativně nepohyblivého fosforu) (Parniske, 2004). Arbuskulární mykorhiza není přítomna jen u několika málo rostlin, a to především vodních, mokřadních a ruderálních. Tato symbióza je typem endomykorhizním,

tzn. hyfy houby vstupují do kortikálních buněk kořenů hostitelské rostliny a vytváří zde typické útvary – arbuskuly a vesikuly. Některé skupiny hub vytváří pouze arbuskuly.

Rostlina z tohoto vztahu získává především vodu a minerální látky (může ale získat

i některé vitamíny a růstové látky) a houbě poskytuje sacharidy a lipidy (Bago a kol., 2003). Všechny houby vytvářející AM symbiotický vztah s rostlinami patří do oddělení

Glomeromycota (např. rody: Glomus, Gigaspora, Acaulosprora a Sclerocystis) – jde většinou o skupiny hub, které se na Zemi objevily před více jak 450 milióny lety a jejíž zástupci se podíleli na kolonizaci souše rostlinami (Remy a kol., 1994).

Symbiotický vztah totiž umožňuje vývoj rostliny i za nedostatku živin a různých stresových

podmínek (Parniske, 2004).

Hlavními kroky, které se musí udát, aby došlo k úspěšné kolonizaci a vzniku arbuskulární

mykorhizy, jsou:

1. Germinace spóry.

2. Růst hyfy a její větvení. 3. Vznik appresoria.

4. Průnik houbového vlákna do kořene rostliny a vytvoření arbuskule. 9.1 Germinace spóry; vzájemná výměna signálů mezi hyfou a rostlinou

Pro vyklíčení spóry nejsou důležité rostlinou produkované signální molekuly, ale

důležitější se zdají být abiotické faktory. První rostlinné rozpoznávací signály vnímá houba až v době, kdy ze spóry vyklíčila v hyfu (Novero a kol., 2002).

Houba tedy reaguje na látky vylučované do půdy kořenem rostliny. Reakcí na ně je

započetí větvení volně žijící houbové hyfy, aby se zvětšila pravděpodobnost jejího setkání s kořenem rostliny (Diouf a kol., 2003) a také syntéza difuzibilních signálů. Chemická

struktura látek vylučovaných budoucím rostlinným hostitelem, tzv. „branching factors“, byla popsána zatím jen částečně (Buee a kol., 2000) a nebyla dosud zcela dokumentována.

43

Difuzibilní signály rozpoznávané rostlinou jsou zachycovány extracelulárními LysM

doménami transmembránových receptorů v plazmatické membráně buněk kořene. Dále jsou

převáděny přes komplexy receptorů do nitra buňky, kde vedou k aktivaci exprese genů, které jsou důležité pro rozvoj symbiotického vztahu (Catoira a kol., 2000). 9.2 Vznik apresoria, průnik hyfy do kořene a vznik arbuskule

Vlákna hub vytváří nejprve v místě styku s povrchem kořene apresoria (Obr. 15), které se

však netvoří na nekompatibilních rostlinách. Z apresorií vyrůstají hyfy hub a postupně

kolonizují celý povrch kořene. Zároveň produkují hydrolytické enzymy, které slouží

k narušení buněčné stěny. Teprve potom může dojít k jeho penetraci. Penetraci napomáhá

sama rostlina tím, že produkuje pektinolytické látky. Vlákno houby pokračuje v růstu a postupně proniká přes exodermální buňky do buněk vnitřní kůry kořene. Vlákna se dále větví a v hlubších vrstvách vnitřní kůry se vytvářejí symbiotické útvary – arbuskule. Dále se mohou tvořit vezikuly - ztluštěniny obsahující zásobní látky jako jsou lipidy nebo smyčky

(tělíska) z hyf (Nagahashi a Douds, 1997; Novero a kol., 2002). Tvorba vezikul může začít až

po vytvoření arbuskul. Vezikuly mohou ve srovnání s abruskulemi přetrvávat na rostlině podstatně déle. Vezikuly a spóry jsou reprodukční a také jsou velice tolerantní k nepříznivým podmínkám (Diouf a kol., 2003).

Obr. 15. Apresoria na povrchu rostlinného kořene.

9.3 Výměna živin mezi houbou a rostlinou

Arbuskule se v buňce vyskytují v podobě rozvětveného vlákna, které obklopuje membrána

odvozená od plazmatické membrány rostlinné buňky. Je také místem, kde dochází k výměně

látek (živin a vody) mezi houbou a hostitelskou rostlinou (Obr. 16). Houba rostlině poskytuje vodu a anorganické látky, kterými je nejčastěji organický fosfor. Mykorhizní houba produkuje fosfatázu potřebnou pro jeho utilizaci. Fosfát se dostává do cytoplazmy rostliny z půdního

44

prostředí přes transportní bílkoviny v symbiotické membráně. Rostlina také může přijímat

sodík, hořčík, vápník, železo, měď a síru. Naproti tomu symbiont od rostliny získává glukózu a fruktózu (Roth, 1988).

Houba má také protektivní účinky – chrání rostlinu před některými patogeny žijícími

v půdě. Houba chrání rostlinu jednak fyzickou bariérou (tvorba pochev), jednak produkcí antimikrobiálních látek (Duchesne a kol., 1989; Morin a kol., 1999).

Obr. 16. Hyfy houby tvořící mykorhizální struktury v kořeni rosliny.

Upraveno podle Diouf a kol. (2003). 9.4 Arbuskulární mykorhizální symbióza vs. fixace molekulového dusíku; ektomykorhiza

Houby vystupující v AM symbiotickém vztahu nefixují atmosférický dusík. Nicméně jsou

schopny produkovat enzymy jako jsou nitrátreduktáza a glutaminsyntetáza pro příjem

dusičnanů a amoniaku (Diouf a kol., 2003). U mnoha rostlin je možné najít i velmi složitý symbiotický vztah např. rostlina – Frankia - houba. V tomto vztahu jsou obsaženy dva

mutualistické vztahy, které se vzájemně doplňují a jejich výsledkem je fixace N2 a výměna

živin rostlina-houba (Diouf a kol., 2003).

Vliv na příjem dusíku z půdy mají houby žijící v ektomykorhitickém vztahu s kořeny

vyšších rostlin. Mají na příjem N2, především ve formě amonných iontů, pozitivní vliv (Charlot a Braun, 1998).

45

10. Význam fixace molekulového dusíku v biosféře

Význam biologické fixace dusíku spočívá především v tom, že je hlavním mechanismem, kterým se získává dusík z pro většinu organismu nedostupné formy – N2 (z atmosféry).

Symbiotická i nesymbiotická asociace mezi rostlinami a mikroorganizmy hrají důležitou

roli v úrodnosti půdy, zlepšení růstu rostlin a jejich minerální výživy, přičemž v těchto interakcích vystupují 2 skupiny mikroorganismů – bakterie a houby (Obr. 17).

Obr. 17. Rozšíření organismů schopných fixovat molekulový dusík a množství dusíku jimi fixovaného během jednoho roku.

10.1 Význam fixace dusíku v zemědělských systémech

Potřeba dusíku v zemědělství je primárně pokrývána chemickými hnojivy, např. chilský

ledek (NaNO3) nebo dusičnan amonný (NH4NO3). I přesto fixace molekulového dusíku hraje klíčovou roli v zemědělské výrobě. Výzkum v této oblasti se zaměřuje na rozvoj ekologicky

udržitelného zemědělského systému, pro který je nutné udržení stávající zemědělské produktivity s ohledem na neustále se zvyšující počet obyvatel naší planety. Jedním z hlavních faktorů udržitelnosti zemědělské produktivity je efektivní řízení dusíku v prostředí.

Velkou výhodou vyplývající z možnosti biologické fixace N2 je jeho využití přímo

z atmosféry,

kontrola

onemocnění

zemědělských

rostlin

jako

důsledek

zavedení

leguminózních rostlin do osevního kalendáře (střídání pěstovaných plodin) a tolerance rostlin k nepříznivým půdním a klimatickým podmínkám.

Další výhodou vyžití „biologického“ dusíku z ekologického hlediska je nahrazení

chemických hnojiv. Tímto krokem by se snížilo znečištění povrchových i podzemních vod.

Splachováním zbytků dusíkatých a fosforečných hnojiv do řek, jezer a rybníků, které 46

znamená snadno dostupné živiny pro vodní sinice a řasy, jejich neúměrný rozvoj a v konečném důsledku vznik tzv. mrtvých vod (eutrofizace vod). Navíc v případě využití biologické fixace N2 dochází k významné redukci produkce skleníkových plynů.

Dusík fixující leguminózy jsou významnou složkou mnoha zemědělských systémů.

Olejnaté leguminózy zabírají 6 % obdělávané půdy, luštěniny pak asi 5 % půdy a pastviny společně s pícninami jsou pěstovány na více než 14 % (Diouf a kol., 2003). Bobovité rostliny pěstované jako užitkové rostliny jsou uvedeny v tabulkách 7. a 8.

Tab. 7. Zástupci čeledi bobovitých pěstované jako zdroj potravy nebo krmivo v mírném pásu. Čeleď Fabaceae (bobovité) rostoucí v mírném pásu Bob koňský Fazol obecný Hrachor setý Lupina žlutá Vikev huňatá Vojtěška setá

Cizrna beraní Hrách rolní (peluška) Lupina bílá Seradela (Ptačí noha) Vikev panonská Jetel plazivý

Čočka jedlá Hrách setý Lupina proměnlivá Sója luštinatá Vikev setá Jetel luční

Tab. 8. Zástupci čeledi bobovitých pěstované jako zdroj potravy nebo krmivo v tropickém pásu.

Čeleď Fabaceae (bobovité) rostoucí v tropickém pásu Cizrna beraní Čočka jedlá Podzemnice olejná Bob setý Bob obecný Fazol obecný Další odrůdy bobu a fazolu

10.1.1 Azolla a produkce rýže

Rýže (Oryza sativa) je jedním z nejdůležitějších zdrojů lidské obživy a právě vodní

kapradina rodu Azolla hraje v její produkci podstatnou roli. Zmíněný rostlinný rod žije

v symbiotickém vztahu se sinicí schopnou fixace dusíku – Anabaena. Spojení těchto dvou

organismů je využíváno především v Číně a asijských zemích jako zelené hnojivo pro zúrodňování rýžových polí a zvýšení výnosů. Jen v Číně rýžová pole hnojená tímto způsobem

zabírají plochu 3,2 miliónů akrů (1 akr = 0,45 hektaru), což představuje 100 000 tun dusíkatého hnojiva ročně v přepočtu za 60 milónů dolarů. Velkou výhodou je, že rýže může být na tom samém místě pěstovaná každoročně a dokonce několikrát za rok s minimálním poklesem produktivity (Ladha a Reddy, 2003).

47

Azolla se však nevyužívá jen k zúrodňování, ale byla také pěstována jako krmení pro ryby,

k čištění vody, případně jako součást lidské potravy (saláty). 10.1.2 Cukrová třtina ~ Acetobacter diazotrophicus

Acetobacter diazotrophicus je dusík fixující endofytická bakterie, primárně izolovaná

z rhizosféry cukrové třtiny (Saccharum officinarum). Postupně byla zjištěna ve všech částech rostliny - stonku, kořeni i listech. Tato rostlina má veliký ekonomický význam, protože je pěstována ve velkém množství především v Brazílii, Mexiku, Austrálii i Indii. A pokud by

neexistovalo její soužití s mikroorganismy, spotřebovala by jako mnoho jiných plodin velké

množství syntetického dusíku, což by se nepříznivě odráželo i ve zvýšení finančních nákladů

potřebných pro její pěstování. Rostlina mikroorganismu poskytuje především sacharózu. Mikroorganizmus je schopen existence i v prostředí, kde se koncentrace sacharózy pohybuje okolo 30 % a pH okolo 5,5. Třtina získává od mikroorganizmu zejména potřebný dusík.

V některých oblastech v Brazílii je cukrová třtina pěstována více jak 100 let bez přídavku

syntetických dusíkatých hnojiv do půdy a to právě díky soužití těchto dvou organismů (Dong a kol., 1994). V Indii, kde cukrová třtina zabírá více jak 4 milióny hektarů, je ve velkém zájmu využití mikroorganismů namísto chemických hnojiv – opět je důvodem jejich zvyšující se finanční nákladnost a neustále se snižující peněžní podpora na ně (Suman a kol., 2005). 10.1.3 Sója luštinatá (Glycine max)

Sója luštinatá je jednoletá východoasijská rostlina, patřící mezi nejrozšířenější

a nejvýznamnější luskovinu. Je pěstována v subtropech a v teplých oblastech mírného pásu. Může ale růst i v tropickém pásu. V roce 1995 byla touto plodinou oseta plocha více jak 60 miliónů hektarů s produkcí 120 miliónů tun (Nicolás a kol., 2002). Je jedním z hlavních zdrojů potravy a krmiva, patří k významným olejnatým rostlinám. Plody obsahují velké množství proteinů a tuků.

Sója vytváří symbiotický vztah s Bradyrhizobium japonicum, B. elkarii, B. liaoningense

a Sinorhizobium fredii za tvorby kořenových hlízek. V roce 2004 byly prováděny s touto rostlinou experimenty s cílem prokázat její schopnosti fixovat molekulový dusík i v postředí se zvýšenou koncentrací CO2 a O2. Bylo zjištěno, že pokud žila pouze v bakteriální symbióze,

nitrogenázová aktivita byla nízká nebo dokonce žádná. Jestliže se však na povrchu kořenů

vytvořil biofilm sestávající s bradyrzizobií a hyf houby (v tomto případě Penicillium spp.),

nitrogenázová aktivita byla velmi vysoká. Význam biofilmu ale také spočíval v ochraně

48

kořene

rostliny

před

jinými

půdními

mikroorganismy,

především

patogeny

(Jayasinghearachchi a Seneviratne, 2004). Tohoto poznatku by se mohlo využít v oblastech s vysokou koncentrací skleníkových plynů.

10.2 Lišejníky a jejich význam v prostředí

Přestože lišejníky ani zdaleka nepatří mezi zemědělské plodiny, je také jejich význam pro

ekologii značný. Tyto duální organismy se vyznačují tím, že osidlují i “nehostinná“ prostředí.

Rostou na ochlazené lávě i holých kamenech, čímž pomáhají v procesu vzniku půdy (pedogeneze). Mohou se vyskytovat i na pouštních píscích, kde zpevňují povrch a obohacují

jej o živiny. Existují i typy lišejníků, které hojně rostou v tundře, kde poskytují zdroj obživy pro různá zvířata např. pro soby v arktické a subarktické oblasti (Deacon, 2005).

Lišejníky však mohou mít i negativní vliv: jsou schopny růst jako parazité na nebo

v dlouholetých listnatých rostlinách, které jsou ekonomicky významnými tropickými plodinami – kávovník, kakaovník nebo kaučovník (Deacon, 2005).

10.3 Inokulace hospodářsky významných leguminóz bakteriálními kmeny rodu Rhizobium

V souvislosti s možností využití leguminóz v osevním kalendáři se stále více pozornosti

obrací na možnost využití mikrobiálních inokulantů při pěstování rostlin. Dnes se využívají

komerčně dostupná inokula různých druhů bakterií rodu Rhizobium, kterými lze obohatit

půdu nebo obalovat semena bobovitých rostlin. Příkladem může být očkovací látka Nitrazon, která je připravována pro jednotlivé druhy hospodářských plodin, především pro jetel, vojtěšku, štírovník, hrách, vikev, pelušku, čočku, bob, fazol, sóju, lupinu a další (Němec,

1986). Očkování osiva leguminóz odpovídajícími kmeny rhizobií znamená zvýšení výnosu minimálně o 5 %, v závislosti na podmínkách (Němec, 1986). Efektivita inokulace je ovlivněna mnoha faktory, mezi něž patří: odlišnosti v genetické výbavě daného druhu rostliny

a symbiotické bakterie, virulence a specifita bakterií, odlišné půdní či klimatické podmínky,

rozdíly v obhospodařování, aj. Velký význam má také to, zda v půdě, kde je bobovitá rostlina

pěstována, jsou přítomny druhově odpovídající symbiotické bakterie, případně jiné

mikroorganismy (např.arbuskulo-mykorhizní houby). Mycelium AM hub, které infikuje rhizosférní půdu a kořeny rostlin je v těsném kontaktu s ostatní půdní mikrobiotou. V různých

systémech mikrosymbiont-luskovina může kompatibilní kombinace mikrobiálních inokulantů (např. rhizobia fixující vzdušný dusík a AM houby) zvýšit jejich pozitivní účinek na rostliny

(Plšková a kol., 2004). Z výsledků studie Plšková a kol. publikované v roce 2004 dále 49

vyplývá, že rostliny sóji (Glycine max) kombinovaně inokulované AM houbou Glomus

mosseae a hlízkovitými bakteriemi B. japonicum měly na kořenech vyšší procento

mykorhizní infekce a vytvořily více rostlinné biomasy než rostliny samostatně inokulované nebo neinokulované vůbec. Přesto nejvyšší nitrogenázová aktivita rhizobií byla u rostlin

samostatně inokulovaných hlízkovitými bakteriemi (důvodem může být vyšší procento mykorhizní kolonizace kořenů).

50

Závěr Schopnost

syntetizovat

enzym

nitrogenázu,

tedy

schopnost

biologické

fixace

molekulárního dusíku, dává mikroorganismům jedinečnost a zároveň možnost přežití

v podmínkách, kde je existence organimů neschopných této syntézy téměř nemožná. Problematika tohoto procesu je rozkrýváná pomocí nových biochemických, molekulárně-

biologických a genetických metod a technik, které umožňují stále hlubší pochopení struktury, funkce a regulace nitrogenázy a to především z důvodu své významnosti pro člověka.

Na význam tohoto procesu lze pohlížet z mnoha hledisek (dnes je upřednostňováno

především hledisko ekologické a ekonomické). Z ekologického hlediska jde především to, že lidstvo výrazně zasáhlo do celého koloběhu dusíku. Ročně fixace molekulárního dusíku dosahuje v přírodě řádově 120*109 kg. K tomuto množství je nutno připočítat fixaci způsobenou antropogenní činností: 80*109 kg dusíku/rok při výrobě průmyslových hnojiv,

25*109 kg oxidů dusíku/rok vznikajících ve spalovacích motorech a asi 30*109 kg dusíku

fixovaného kulturními plodinami (Kohout a kol. 2002). Důsledky jsou různé: zvyšování oxidů

dusíku v atmosféře, likvidace dlouhodobých rezerv dusíku spalováním biomasy (lesů

i organické hmoty v půdě), uvolňování nitrátů do spodních vod, aj. (Kohout a kol., 2002). Tyto důvody vedou mimo jiné ke snaze snížit výrobu průmyslových hnojiv a omezit jejich

užívání v zemědělství a tím snížit možná zdravotní a environmentální rizika vyplývající z nadměrných vstupů chemických látek do půdy.

51

Použitá literatura Bago, B., Pfeffer, P. E., Abubaker, J., Jun, J., Allen, J. W., Brouillette, J., Douds, D. D., Lammers, P. J., Shachar-Hill, Y. (2003): Carbon export from arbuscular mycorrhizal roots involves the translocation of carbohydrate as well as lipid. Plant. Physiol. 131: 1496 – 1507 Bascónes, E., Imperiál, J., Ruiz-Argüeso, T., Palacios, J. M. (2000): Generation of New Hydrogen-Recycling Rhizobiaceae Strains by Indroduction of a Novel hup Minitransposon. Appl. Environ. Microbiol. 4: 4292 - 4299 Bandurski, R. S., Cohen, J. D., Slovin, J. P., Reinecke, D. M. (1995): Auxin biosynthesis and metabolism. In: Davies PJ, ed. Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. pp. 39 – 65 Bateman, A., Bycroft, M. (2000): The structure of LysM domain from E. coli membrane - bound lytic murein transglycosylase D (MltD). J. Mol. Biol. 299: 1113 – 1119 Benson, D. R., Silvestr, W. B. (1993): Biology od Frankia strains, actinomycete symbonts of actinorhizal plants. Microbiol. Rev. 57: 297 – 319 Berry M. A. (1994): Recent developmnets in the actinorhizal symbioses. Plant. Soil. 161: 135 – 145 Berry M. A., Sunell A. L. (1990): The infection process and nodule development. In The Biological of Frankia and actinorhizal plants, (ed) by Schwintzer, R. C., Tjepkema, DJ. pp. 61 – 81 Bishop, P. E., Joerger, R. D. (1990): Genetics and molecular biology of alternative nitrogen fixation systeme. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 41: 109 - 125 Catoira, R., Galera, C., de Billy, F., Penmetsa, R. V., Journet, E. P., Maillet, F., Rosenberg, C., Cook, D., Gough, C., Denarie, J.(2000): Four genes of Medicago truncatula controlling components of a nod factor transduction pathway. Plant. Cell. 12: 1647 – 1666 Deacon, J. (2005): The Microbial World (Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh) Diouf, D., Diop, T. A., Ndoye, I. (2003): Actinorhizal, mycorhizal and rhizobial symbioses: how much do we know? Afr. J. Biotechnol. 2: 1 – 7 Dong, Z., Canny, M. J., McCully, M. E., Roboredo, M. R., Cabadilla, C. F., Ortega E., Rodés, R. (1994): A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems; A new Role for The Apoplast. Plant. Physiol. 105: 1139 – 1147 Duschesne, L.C., Peterson, R. L., Ellis, B. E. (1989): The future of ectomycorrhizal fungi as biological control agens. Phytoprotection. 70: 51 – 57 Endre, G., Kereszt, A., Kevei, Z., Mihacea, S., Kalo, P., Kiss, G. B. (2002): A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development. Nature. 417: 962 – 966 52

Esseling, J. J., Lhuissier F. G., Emons, A. M. (2003): Nod factor-induced root hair curling: continuous polar growth towards the point of nod factor application. Plant. Physiol. 132: 1982 – 1988 Fleming, A. I., Wittenberg, J. B., Wittenber, B. A., Dudman, W. F., Apoleny, C. A. (1987): The purification, characterization and ligand-binding kinetice of hemoglobins from root nodules of the non-leguminous Casuarina glauca-Frankia symbiosis. Biochem. Biophys. Acta. 911: 209 – 220 Gade, D. J. (2004): Infectin and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68: 280 – 300 Golden, J. W., Mulligan, M. E., Haselkorn, R. (1987):Different recombination site specifiky of developmentally geonome rearragements. Nature. 327: 526 – 529 Heidstra, R., Geurts, R., Franssen, H., Spaink, H. P., Van Kammen, A., Bisseling, T. (1994). Root hair deformation activity of nodulation factors and their fate on Vicia sativa. Plant. Physiol. 105: 787 – 797 Charlot, M., Braun, A. (1998): Physiology of organic nitrogene aquisition by ectomycorrhizal fungi and ectomycorrhizas. FMES Microbiol. rev. 22: 21 – 44 Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. (2004): A bradyrhizobial - Penicillium spp. Biofilm with nitrogenase activity improves N2 fixing symbiosis of soybean. Biol. Fertil. Soils. 40: 432 – 434

Kang, R. J., Shi, D. J., Cong, W., Cai, Z. L., Ouyang, F. (2005): Regulation of CO2 on heterocyst differentiation and nitrate uptake in the cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120. J. Appl. Microbiol. 98: 693 -705 Kohout, V. a kolektiv autorů (2002): Zemědělské soustavy, ČZU Praha Ladha, J. K., Reddy, P. M. (2003): Nitrogen fixation in rice systems: state of knowledge and future prospects. Plant. and Soil. 252: 151 – 167 Lancelle, S. A., Torrey, J. G. (1984): Early development of Rhizobium induced root nodules of Parasponia rigida I. Infection and early nodule initiation. Protoplasma. 123: 26 – 37 Laplaze, L., Duhou, E., Franche, C., Frutz, T., Svistoonoff, S., Bisseling T., Bogusz, D., Pawlowski, K. (2000): Casuarina glauca prenodule cells display teh same differentiation as the corresponding nodule cells. Mol. Plant. Mikrobe. Interact. 13: 107 – 112 Leigh, G. J. (1988): Chemical models and nitrogenase. J. Mol. Catal. 47: 363 – 379

Lomax, T. L., Mudry, G. K., Rubery, P. H. (1995): Auxin transport. In: Davies PJ, ed. Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. pp.509 – 531

53

Madsen, E. B., Madsen, L. H., Radutoiu, S., Olbryt, M., Rakwalska, M., Szczyglowski, K., Sato, S., Kaneko, T., Tabata, S., Sandal, N., Stougaard, J. (2003): A receptor kinase gene of the LysM type is involved in legume perception of rhizobial signals. Nature. 425: 637 – 640 Macháčková, A. (2001): Možnosti využití bobu v současném zemědělství. Farmář. 3: 79 - 82

Morin, C., Samson, J., Dessureault, M. (1999): Protection of black spruce seedlings against Cylidrocladium root with ectomycorrhizal fungi. Can. J. Bot. 77: 169 – 174 Nagahashi, G., Douds, D. D. (1997): Appressorium formation by AM fungi on isolated cell walls of carrot roots. New Phytol. 136: 299 – 304 Němec, M.: (1986): Ekologie mikroorganismů I., Praha, Státní pedagogické nakladatelství Němec, M., Horáková D. (2002): Základy mikrobiologie. 1. vydání, Brno, Vydavatelství MU Nicolás, M. F., Arrabal Arias, C. A., Hungria, M. (2002):Genetics of nodulation and nitrogen fixation in Brazilian soybean cutivars. Biol. Fert. Soils. 36: 109 – 117 Novero, M., Faccio, A., Genre, A., Stougaard, J., Webb, J. K. (2002): Dual requirement of the LjSym4 gene for mycorrhizal development in epidermal and cortical cells of Lotus japonicus roots. New. Phytol. 154: 741 – 749 Obertello, M., Oureye, M., Laplaze, L., Santi, C. Svistoonoff, S., Auguy, F., Bogusz, D., Franche, C. (2003): Actinorhizal nitrogen fixing nodules: infection process, molecular biology and genomics. Afr. J. Biotechnol. 2: 528 – 538 Oke, V., Long, S. R. (1999): Bacteroid formation in the Rhizobium - legume symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 2: 641 – 646 Oldroyd, G. E., Long, S. R. (2003): Identification and characterization of nodulation-ignaling path way 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant. Physiol. 131: 1027 – 32 Parniske, M. (2004): Molecular genetics of the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Curr. Opin Plant. Biol. 7: 414 – 421 Pawlowski, K., Bisseling, T. (1996): Rhizobial and actinorhizal symbioses; What are the shared features. Plan. Cell. 8: 1899 – 1913 Petr, J. (2004): Kořenové symbiózy. ScienceWorld. 9:36-38

Plšková, M., Kieu, T. V., Mikanová, O., Šimon, T. (2004): Vliv kombinovaných mikrobiologických přípravků na produkci biomasy sóji (Glycine max). Ústav půdoznalství a mikrobiologie, Agronomická fakulta MZLU v Brně Postgate, J., Kent. H. M., Robson, R. L. (1986): DNA from diazotrophic Desulfovibrio strains is homologous to Klebsiella pneumoniae structural nif DNA and can be chromosomal or plasmid-bone. FEMS Microbiol. Let. 33: 159 - 163 54

Prin, Y., Rougier, M. (1987): Preinfection events in the extablishment of Alnus-Frankia symbiosis: study of the root hair deformation step. Plant. Physiol. 6: 99 – 106 Procházka S., Macháčková, I., Krehule, J., Šebánek,J. (1998): Fyziologie rostlin, 1. Vydání, Praha, Academia Radutoiu, S., Madsen, L. H., Madsen, E. B., Felle, H. H., Umehara, Y. Gronlud, M. Sato, S., Nakamura, Y., Tabata, S., Sandal, N., et al. (2003): Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases. Nature. 425: 585 – 592 Remy, W., Taylor, T. N., Hass, H., Kerp, H. (1994): Four hundred-million-year-old vesicular arbuscular mycorrhizae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 11841 – 11843 Roth, E., Jeon, K., Stacey, G. (1988): Homology in endosymbiotic systems: The term "symbiosome". In Molecular Genetics of Plant Microbe Interactions, R. Palcios and D. P. S. Verma, eds (St. Paul, MN: American Phytopathological Society Press), pp. 220 – 225 Roudier, F., Fedorova, E., Gyorgyey, J., Dehet, A., Brown, S., Kondorosi, A., Kondorovi, E. (2002): Cell cycle function of a Medicago sativa A2-type cyclin interacting with a PSTAIREtype cyclin-delendent kinase and a retinoblastoma protein. Plant. J. 23: 73 – 83 Suman, A., Gaur, A., Shrivastava, A. K., Yadav, R. L. (2005): Improving sugarcane growth and nutrient uptake by inoculating Gluconacetobacter diazotrophicus. Plant Growth Regul. 47: 155 – 162 Šimek, M. (1993): Nitrogenáza - unikátní enzym fixátorů N2. Biol. list. 4: 241 - 256 Škára, B., Ferenčík, M. (1983): Biochemie, Bratislava, Alfa Špaček, J. (1999): Hlenky, houby, řasy, 1. vydání, Brno, Vydavatelství MU Van Spronsen, P. C., Bakhuzian, R., Van Brusel, A. A. N., Kijne, J. W. (1994): Cell wall degradation during infection thread formation by the root nodule bacterium Rhizobium leguminasorum is a two step process. Eur. J. Cell. Biol. 64: 88 – 94 Vercher, Y., Carrasco, P., Carbonell, J. (1989): Biochemical and histochemical detection of endoprotolytic activities involved in ovary senescence or fruit development in Pisum sativum. Physiol. Plant. 76: 405 – 411 Wais, R. J., Galera, C., Oldroyd, G., Catoira, R., Penmetsa, R. V., Cook, D., Gough, C., Denarie, J., Long, S. R. (2000): Genetic analysis of calcium spiking responses in nodulation mutants of Medicago truncatula. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA. 97: 13407- 13412 Wightman, F., Schneider, E. A., Thimman, K.V. (1980): Hormonal factors controlling the initiation and developmnet of lateral roots. Physiol. Plant. 49: 304 - 314 Wightman, F., Schneider, E. A., Thimman, K.V. (1980): Hormonal factors controlling the initiation and developmnet of lateral roots. Physiol. Plant. 49: 304 – 314

55

Yanng, W. C., de Blank, C., Meskiene, I., Hirt, H., Akker, J., van Kamen, A., Franssen, H., Bisseling, T. (1994): Rhizobium nod factors reactivate the cell cycle drung infection and nodule primordium formation, but the cycle is only completed in primordium formation. Plant. Cell. 6: 1415 – 1426 Zehr, J. P., Turner, P. J. (2001): Nitrogen fixation: Nitrogenase and gene expression. Meth. Microbiol. 30: 271 - 286 Internetové odkazy:

http://www.sinicearasy.cz http://www.microbialworld.com http://www.af.mendelu.cz/mendelnet2003/obsahy/fyto/plskova.pdf

56