Over huidige flowcytometers en nieuwe software. Vincent H.J. van der Velden Afdeling Immunologie, Erasmus MC, Rotterdam

Over huidige flowcytometers en nieuwe software

Vincent H.J. van der Velden Afdeling Immunologie, Erasmus MC, Rotterdam

SKML, Woerden – 30 oktober 2008

Multicolor flowcytometry • Tot voor kort: 4 kleuren flow cytometrie • Sinds enige jaren: nieuwe flowcytometers • 3-4 lasers • 6-17 kleuren • Digitale electronica • Waarom ≥6 kleuren analyses? • Waar moet je op letten? Wat zijn de valkuilen? • Wat verandert er in de analyse?

Department of Immunology, Erasmus MC

Waarom multicolor flowcytometry? • Minder buizen nodig • Minder reagentia • Sneller (inzettijd en meettijd) • Meer informatie per buis (1x 6 kleuren = 15x 2 kleuren) • Betere karakterisatie van (sub)populaties • Betere analyse van differentiatie routes • Efficiënter gebruik van monsters met een klein volume (zoals CSF, FNA)


Waar moet je op letten? •

Welke fluorochromen?

•

Instrument set-up: • PMT instellingen • Compensatie

•

Samenstellen van antistofpanels




•


•



Fluorochromen Excitatie 488 nm

Emissie (nm)

Excitatie 633 nm

Emissie (nm)

FITC

518

APC

660

Alexa Fluor® 488

519

Alexa Fluor® 647

668

R-PE

575

Cy5

670

PE-Texas Red

615

APC-Cy5.5

690

PE-Alexa Fluor® 610

628

Alexa Fluor® 700

723

PE-Cy5

670

APC-Cy7

785

PE-Cy5.5

690

APC-H7

785

PerCP-Cy5.5

690

PE-Cy7

760

En nog veel meer…

Excitatie 405 nm

Emissie (nm)

Alexa Fluor® 405

421

Pacific Blue®

455

AmCyan

491

Alexa Fluor® 430

541

Pacific Orange®

551 Department of Immunology, Erasmus MC

Fluorochromen •

Er is veel keus!

•

Keuze o.a. afhankelijk van • Type apparaat (lichtbron en optiek) • Intensiteit fluorochroom • PerCP ≈ FITC << PerCP-Cy5.5 ≈ APC-Cy7 < PE ≈ PE-Cy7< APC = PE-Cy5 • Nieuwe fluorochromen vaak zwak

CD56-APC

CD56-A700


Fluorochromen •

Valkuilen: • Achtergrondkleuring (APC-Cy7 relatief ‘plakkerig’) • Achtergrondkleuring PE-Cy7 (BD>Coulter) • Instabiliteit tandemfluorochromen o.i.v. licht (APC-Cy7 APC-H7)

CD19-PE-Cy7 BD

CD19-PC7 Coulter

Data verkregen van Juan Flores, Salamanca



•

Instrument set-up:

•

•

PMT instellingen

•

Compensatie



Waar moet je op letten? 275000 250000 225000 200000

PB: FIXED

MFI beads

PB: CST

Automatische correctie door gebruik CS&T beads (Cytometer Setup and Tracking; BD)

175000

Verloop in violette laser 150000 125000 PE: FIXED

100000

PE: CST 75000 50000 PE-Cy7: FIXED 25000

PE-Cy7: CST

0

dagen Department of Immunology, Erasmus MC

Compensation 4-color Relatief eenvoudig

FITC FITC PE

PE

PerCP

APC

28

0

0

17

0

0,9

PerCP

0

0

APC

0

0

7 3,5


Compensation 8-color Complex!

FITC FITC

PE 15,4

PerCP

PE-Cy7

APC

A-680

3,05

0,29

0,01

0,04

0

6,83

27,39

2,06

0,02

0,03

0

0,22

7,42

10

2

0

0,01

0,07

0,04

0

0,06

1

0,08

0,07

0,01

0,01

PE

1,45

PerCP

0,01

0

PE-Cy7

0,31

1

4,72

APC

0,08

0,04

4,97

0,77

A-680

0,01

0

1

0,15

31,68

PB

0,26

0,01

0,05

0,01

0

0,08

AmCyan

12,3

1,68

0,33

0,07

0

0,02

PB

AmCyan

23,93 23,12


Compensatie instellen Instellen van de flowcytometer: • Stel de PMT voltages in met ongekleurde cellen • Stel de compensatie in met enkelvoudig-gekleurde cellen of CompBeads • Cellen: positieve en negatieve cellen nodig; autofluorescentie van beide populaties moet gelijk zijn • BDTM Anti-mouse/Rat IgG CompBeads: toepasbaar voor elke antistof • Software stelt automatisch de compensatie matrix samen

• Stel voor iedere antistof met tandem fluorochromen de compensatie apart in (lot-verschillen)


Compensatie, digitale data en data spreiding Enkelvoudige kleuring met CD4-PerCP-Cy5.5

ongecompenseerd

gecompenseerd

10000

6000

3000

4000

6000

-3000

Digitale data processing data spreiding Department of Immunology, Erasmus MC

Data spreiding Spectrale overlap in: PE-Cy7

APC

APC-Cy7

Antistof/fluorochroom: CD4 PerCP-Cy5.5

CD4 PE

1. Fluorochroom afhankelijk (algemeen: hogere λ, meer spread) 2. De resolutie is afhankelijk van zowel de achtergrond als de data spread van de negatieve populatie Department of Immunology, Erasmus MC

Effect 10% verandering in PMT AmCyan Spectrale overlap van CD45-AmCyan in FITC kanaal, gecompenseerd

Originele MFI waarde CD45

-10 % MFI waarde CD45

Data verkregen van Tomas Kalina, Praag

Effect 10% verandering in PMT AmCyan Spectrale overlap van CD45-AmCyan in FITC kanaal, gecompenseerd

Originele MFI waarde CD45

+10 % MFI waarde CD45

Data verkregen van Tomas Kalina, Praag

Spectrale overlap van fluorochromen • Grootste spectrale overlap: • PE PerCPCy5.5

30,1%-38,9%

• Pacific Blue AmCyan

24,3%-31%

• AmCyan FITC

24%

• PerCPCy5.5 PC7

15,9%-18,8%

• Meer fluorochromen meer data spreiding verlies van resolutie • Nog relatief weinig bekend over meest optimale combinatie! • Combinatie FITC en Pacific Orange beter dan FITC en AmCyan




•


•



Principes voor fluorochrome/marker selectie • Gebruik de sterkste fluorochromen met de minste spectrale overlap problemen (i.e. PE of APC) voor de zwakste antigenen (zoals activatie markers).

• Gebruik de zwakkere fluorochromen (o.a. PE-Cy7 en APC-Cy7) met de grootste spectrale overlap problemen voor goed-gekarakteriseerde celpopulaties die danwel positief of negatief zijn (zoals CD3, CD19, …). • Gebruik de zwakkere fluorochromen (FITC, PerCP) voor antigenen die sterk tot expressie komen (zoals CD4, CD45, …). • Gebruik de fluorochroom-paren met significante compensatie effecten en data spreiding (i.e. APC/APC-Cy7, PE/PE-Cy5.5) voor antigenen die binnen een populatie beiden positief of negatief zijn (zoals CD19 en CD20). Department of Immunology, Erasmus MC

Conclusie – 1 • 8 kleuren flowcytometrie is handig, maar ook complex! • Keuze van fluorochromen • Instellen van de flowcytometer, m.n. compensatie • Robuustheid van de lasers • Keuze antistofpanels

EuroFlow netwerk • Ontwerp van gestandardiseerde 8-kleuren panels voor alle hematologische maligniteiten en normale hematopoietsiche cellen • AML; MDS; voorloper-B-ALL; T-ALL; NHL; CLL; rijpe T/NK-celmaligniteiten; plasmacelmaligniteiten; screeningsbuizen) • Definitieve panels gereed eerste helft 2009

Leeds

(8 academic centers and 2 companies)

Kiel Zabrze Rotterdam Prague Paris

Salamanca Lisbon


Wat verandert er in de analyse van data? • Enorme toename van de hoeveelheid data

Analyse van data – 4 kleuren


Analyse van data – 8 kleuren


Wat veranderd er in de analyse van data? • Enorme toename van de hoeveelheid data

• 8-kleuren flowcytometrie vraagt om echte multidimensionele analyse

• Nieuwe software voor data analyse nodig

Pedreira et al, Cytometry 2008;73:834

Infinicyte: fuseren van data files FILE

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

2

3

4

5

6

7

8

9

FSC-HEIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

SSC-HIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CD11b-FITC

TUBE

FILE TUBE

1 1

2

3

4

5

6

7

8

9

FSC-HEIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

SSC-HIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

R

CD11b-FITC

R

CD13-PE

R

CD13-PE

R

CD45-PerCP

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CD45-PerCP

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CD34-APC

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CD34-APC

C

C

C

C

C

C

C

C

C

HLADR-FITC

R

R

CD117-PE

R

CD2-FITC

R

CD2-FITC

R

CD56-PE

R

CD56-PE

R

HLADR-FITC

R

CD117-PE

R

CD123-PE

R

R

CD123-PE

R

CD15-FITC

R

CD15-FITC

R

CD16-PE

R

CD16-PE

R

CD22-FITC

R

CD22-FITC

R

CD25-PE

R

CD25-PE

R

CD65-FITC

R

CD65-FITC

R

7.1-PE

R

7.1-PE

R

CD61-FITC

R

CD61-FITC

R

CD33-PE

R

CD33-PE

R

CD71-FITC

R

CD71-FITC

R

Glyphorin-PE

R

Glyphorin-PE

R

www.infinicyt.com

Nine 4-color tubes


Infinicyte: fuseren van data files Labelingen: 1. CD16-CD13-CD45-CD34-CD117-CD11b 2. CD36-CD33-CD45-CD34-CD11b-CD14 3. CD15-CD64-CD45-CD34-HLADR-CD11b → Gemeenschappelijke parameters: FSC-SSC-CD45-CD34

Tube 3 Tube 2 Tube 1

www.infinicyt.com


Fuseren van data files: eenmalig ‘gaten’

Eén keer ‘gaten’ voor 5 verschillende data files Pedreira et al, Cytometry 2008;73:834

Simultane weergave van immunofenotype


Multicolor analyse: “bar code” normaal

MDS CD36 CD36

CD33

Blast cellen (CD34+/CD117+) Department of Immunology, Erasmus MC

Infinicyte: benadering van data FILE TUBE

FILE

1 1

2

3

4

5

6

7

8

9

FSC-HEIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

SSC-HIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

CD11b-FITC CD13-PE CD45-PerCP CD34-APC

2

3

4

5

6

7

8

9

FSC-HEIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

SSC-HIGHT

C

C

C

C

C

C

C

C

C

R

CD11b-FITC

R

E

E

E

E

E

E

E

E

R

CD13-PE

R

E

E

E

E

E

E

E

E

C

C

C

C

C

C C C C C C 21 parameters x

C

C

C

E

E

E

E

E R events E E E E 900.000

E

E

E

C

C

C

CD45-PerCP

C C C C C C C 6 parameters x

C

C

CD34-APC

CD2-FITC CD56-PE

1

9C Files x C C C C

C

TUBE

R

CD2-FITC

R 100.000 events

HLADR-FITC

R

CD117-PE

R

CD123-PE

1

1 CFile x C C C E

R

E

E

E

CD56-PE

R

R

HLADR-FITC

E

E

R

R

E

E

E

E

E

CD117-PE

E

E

R

E

E

E

E

E

E

CD123-PE

E

E

E

R

E

E

E

E

E

CD15-FITC

R

CD15-FITC

E

E

E

E

R

E

E

E

E

CD16-PE

R

CD16-PE

E

E

E

E

R

E

E

E

E

CD22-FITC

R

CD22-FITC

E

E

E

E

E

R

E

E

E

CD25-PE

R

CD25-PE

E

E

E

E

E

R

E

E

E

CD65-FITC

R

CD65-FITC

E

E

E

E

E

E

R

E

E

7.1-PE

R

7.1-PE

E

E

E

E

E

E

R

E

E

CD61-FITC

R

CD61-FITC

E

E

E

E

E

E

E

R

E

CD33-PE

R

CD33-PE

E

E

E

E

E

E

E

R

E

CD71-FITC

R

CD71-FITC

E

E

E

E

E

E

E

E

R

Glyphorin-PE

R

Glyphorin-PE

E

E

E

E

E

E

E

E

R

www.infinicyt.com

one 19-color tube

Infinicyte: benaderen van data

Echte data

Benaderde data

Labelingen: 1. CD16-CD13-CD45-CD34-CD117-CD11b 2. CD36-CD33-CD45-CD34-CD11b-CD14 3. CD15-CD64-CD45-CD34-HLADR-CD11b www.infinicyt.com


CD36-FITC (buis 2)

CD15-FITC (buis 3)

Infinicyte: gefuseerde en benaderde data

CD16-FITC (buis 1) www.infinicyt.com

CD16-FITC (buis 1) Pedreira et al, Cytometry 2008;73:834

Automatische identificatie van populaties Multidemsionele analyse: Automated Separation among different cell Populations (APS view)

www.infinicyt.com


Automatische identificatie van populaties CD8+ T-lymfocyten

Monocyten

B-cellen

CD4+ T-lymfocyten www.infinicyt.com

Neutrofielen

NK-cells Department of Immunology, Erasmus MC

Automatische identificatie van populaties APS representatie van 3 pathologische populaties (gefuseerde file van 3 patienten)

Typical B-CLL

FL MCL www.infinicyt.com


Automatische identificatie van populaties APS representatie van 3 pathologische populaties (gefuseerde file van 3 patienten)

Voeg een nieuwe gefuseerde en benaderde patient toe Typical B-CLL

Best passen bij een typische B-CLL

FL MCL www.infinicyt.com


Conclusie – 2 • Data analyse van 8 kleuren flowcytometrie is complex!

• Echter: nieuwe software met echte multiparameter analyse zal interpretatie ondersteunen

• Door objectievere analyse mogelijk meer standarisatie mogelijk

• Door fuseren en benaderen geen noodzaak meer voor >8 kleuren

Een kleurrijke toekomst voor de immunofenotypering! Department of Immunology, Erasmus MC

Met dank aan: Immunologie, Erasmus MC Claudia Hagens Romana Jugooa Celia Berenguer Perez Jeroen te Marvelde Henk Wind Herbert Hooijkaas Jacques van Dongen

Kiel Leeds Lisbon Paris

Coordinators - J.J.M. van Dongen - A. Orfao

- M. Kneba et al - S. Richards et al - P. Lucio et al - E. MacIntyre et al

Prague Rotterdam Salamanca Zabrze

- O. Hrusak et al - V. van der Velden et al - A. Orfao et al - S. Szczepanski et al

[email protected]

Over huidige flowcytometers en nieuwe software. Vincent H.J. van der Velden Afdeling Immunologie, Erasmus MC, Rotterdam

Recommend Documents