FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
Oppuntstelling van miRNA-isolatie bij pancreasletsels
Milan VANSEVENANT
Promotor: Pof. Dr. Stéphanie Laurent Co-promotor: Dr. Sc. Nancy Van Damme
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2010 - 2011
Oppuntstelling van miRNA-isolatie bij pancreasletsels
Milan VANSEVENANT
Promotor: Prof. Dr. Stéphanie Laurent Co-promotor: Dr. Sc. Nancy Van Damme
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
“De auteur en de promotor geven de toelating dit afstudeerwerk voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit dit afstudeerwerk.”
Datum: 6 mei 2011
Milan Vansevenant
Prof. Dr. Stéphanie Laurent
Voorwoord
Een aantal mensen verdienen een bedanking na het schrijven van deze scriptie. Eerst wil ik mijn promotor Prof. Dr. Stéphanie Laurent bedanken bij wie ik deze scriptie geschreven heb. Dr. Ercan Cesmeli vermeld ik hierbij eveneens in wiens doctoraat deze scriptie kadert. Daarnaast wil ik Ellen Terrie bedanken voor alle hulp en begeleiding in het laboratorium van de Gastro-Enterologie. Ook doctoraatsstudente Evi Mampaey bedank ik voor de hulp in het laboratorium van de GastroEnterologie en voor de berekeningen die zij maakte samen met doctoraatsstudente Joni Van der Meulen. De dienst Pathologie, Medische Genetica en Gastro-Enterologie van het Universitair Ziekenhuis Gent verdienen hier ook een vermelding voor het ter beschikking stellen van hun infrastructuur en kennis. Maar mijn grootste woord van dank is voor Dr. Sc. Nancy Van Damme bestemd. Zonder haar was deze scriptie nooit geworden wat ze nu is. Ik bedank haar voor al haar tijd, raad en geduld die zij voor mij over had. Tenslotte verdienen ook mijn ouders en vrienden een bedanking voor hun geduld en steun.
Bedankt allemaal! Milan Vansevenant
Inhoudstafel 1
ABSTRACT ___________________________________________________________ 1
2
INLEIDING ___________________________________________________________ 2
2.1
Anatomie en fysiologie van de pancreas ___________________________________ 2
2.2
Incidentie en risicofactoren pancreaskanker _______________________________ 3
2.3
Chronische pancreatitis als differentiaaldiagnose___________________________ 3
2.3.1 Chronische pancreatitis versus pancreaskanker _____________________________ 3 2.3.2 Diagnostiek chronische pancreatitis ______________________________________ 4 2.4
Diagnostiek pancreaskanker ____________________________________________ 4
2.4.1 Klinische kenmerken _________________________________________________ 4 2.4.2 Tumormerkers ______________________________________________________ 5 2.4.3 Beeldvormingstechnieken _____________________________________________ 5 2.4.4 Cytologisch onderzoek ________________________________________________ 7 2.5
Therapie van pancreaskanker___________________________________________ 7
2.6
microRNA’s in het menselijk lichaam ____________________________________ 8
2.7
Rol van microRNA’s in de pathologie ____________________________________ 9
2.8
microRNA’s bij pancreaskanker _______________________________________ 10
2.9
Doelstellingen _______________________________________________________ 10
3
METHODOLOGIE ____________________________________________________ 12
3.1
Celmateriaal ________________________________________________________ 12
3.2
RNA-extractie _______________________________________________________ 12
3.2.1 Protocol miRNeasy kit®______________________________________________ 12 3.2.1.1 RNA-extractie van de FNA stalen __________________________________ 13 3.2.1.2 RNA-extractie van het resectiemateriaal ______________________________ 14
3.2.1.3 Het verdere gemeenschappelijk protocol _____________________________ 14 3.2.2 Protocol mirVana miRNA Isolation Kit® ________________________________ 15 3.3
Bepaling van de RNA-concentratie _____________________________________ 17
3.3.1 Spectrofotometer ___________________________________________________ 17 3.3.2 NanoDrop® _______________________________________________________ 18 3.3.3 Experion®_________________________________________________________ 19 3.3.3.1 Principe _______________________________________________________ 19 3.3.3.2 Protocol _______________________________________________________ 21 3.4
Expressie van de geïsoleerde microRNA’s ________________________________ 22
3.4.1 Principe ___________________________________________________________ 23 3.4.2 Protocol ___________________________________________________________ 26 4
RESULTATEN _______________________________________________________ 29
4.1
FNA-stalen _________________________________________________________ 29
4.2
Resectiestukken _____________________________________________________ 32
4.3
Experion® grafieken _________________________________________________ 35
4.3.1 FNA-stalen ________________________________________________________ 35 4.3.2 Resectiestukken ____________________________________________________ 36 4.4
miRNA-expressie ____________________________________________________ 38
5
DISCUSSIE __________________________________________________________ 45
6
REFERENTIES _______________________________________________________ 47
7
BIJLAGE ____________________________________________________________ 50
Lijst met afkortingen A: absorbantie APD: anatomopathologische diagnose cDNA: complementair DNA CNS: central nervous system CT: computed tomography DNA: desoxyribonucleïnezuur dsDNA: double stranded DNA EUS: endoscopic ultrasonography EUS-FNA: endoscopic ultrasonography – fine needle aspiration FNA: fine needle aspiration miRNA: micro ribonucleïnezuur MRI: magnetic resonance imaging mRNA: messenger ribonucleïnezuur PACC: pancreatic acinar cellcarcinoma PCR: polymerase chain reaction PDAC: pancreatic ductal adenocarcinoma pri-miRNA: primair micro ribonucleïnezuur RISC: RNA induced silencing complex RNA: ribonucleïnezuur RQI: RNA quality indicator RT: reversed transcription / reversed transcriptase snoRNA: small nucleolar RNA UTR: untranslated region
1 Abstract Introductie: Pancreaskanker is en blijft één van de dodelijkste kankers. Slechts zeer weinig vooruitgang is de laatste decennia geboekt op het gebied van overleving. Een belangrijke factor hierin is de late diagnose van deze kanker. Meer dan de helft van de patiënten heeft namelijk al metastasen op het ogenblik van de diagnose. De meeste pancreaskankers zijn ductale adenocarcinoma’s. De differentiaaldiagnose met chronische pancreatitis is anatomopathologisch niet altijd even duidelijk. Om therapie te kunnen geven die beter aansluit bij de patiënt en voor een eenvoudigere diagnostiek, is het belangrijk te zoeken naar nieuwe merkers. Methodologie: Bij 15 patiënten met pancreaskanker werd een FNA-staal afgenomen en retrospectief werd van 17 patiënten resectiemateriaal van pancreastumoren gebruikt om daaruit miRNA te isoleren. Voor het resectiemateriaal was er telkens een stuk weefsel van de tumor en een stuk van het normale, omliggende weefsel van dezelfde patiënt. De FNA’s en het resectiemateriaal werden bewaard in RNAlater® aan -80° C. De RNA-extracties gebeurden met de miRNeasy kit® van QIAGEN en de mirVana miRNA Isolation Kit® van Ambion. Daarna werden concentratie en kwaliteit van het geïsoleerde RNA bepaald door middel van de klassieke spectrofotometer, de NanoDrop® en de Experion®. Tenslotte werd de expressie van een aantal miRNA’s onderzocht door middel van de Multiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assays van Applied Biosystems. Resultaten: De concentratie en de integriteit van het geïsoleerde RNA gaven vaak slechte resultaten. Frequent was de concentratie zeer laag of was er veel degradatie van het RNA. Dit belette niet dat er wel degelijk miRNA’s gevonden werden in de stalen. Bij slechts één van de onderzochte miRNA’s was er een duidelijk verschil in expressie tussen tumorweefsel en het normale weefsel. Dit was zo voor miR-196a. Het was wel enkel zichtbaar bij de resectiestukken en niet bij de FNA’s. Discussie: Het belang van een hoge concentratie en een lage degradatie van het RNA is nog niet zo duidelijk. Wel staat vast dat miRNA kan terug gevonden worden. Er zal in de toekomst nog verder moeten gezocht worden naar expressie van andere miRNA’s bij pancreaskanker. Isolatie van RNA uit enkel tumorcellen zou hierbij kunnen helpen om een duidelijker expressiepatroon te krijgen.
1
2 Inleiding 2.1 Anatomie en fysiologie van de pancreas De pancreas is een retroperitoneaal gelegen orgaan met zowel een endocriene als een exocriene functie. Het orgaan bestaat uit een kop, een lichaam en een staart. Het klierweefsel (de acinaire cellen) is gegroepeerd in lobuli die met hun afvoer een ductaal systeem vormen en samenvloeien in de ductus pancreaticus. Ter hoogte van de Papil van Vater mondt de ductus pancreaticus samen met de ductus choledocus (common bile duct) uit in het duodenum. (zie figuur 1) Verspreid over de pancreas liggen de eilandjes van Langerhans. Dit zijn groeperingen van A, B, D, PP en enterochromaffine cellen. (1)
Figuur 1: Schets van de pancreas met zijn ductus pancreaticus en van de lever de ductus choledocus. Rond de pancreas ligt het duodenum met erachter de arteria hepatica en de vena porta. (2)
De acinaire cellen zorgen voor de exocriene functie van de pancreas. Dit houdt in: de productie van digestieve enzymen zoals amylase, lipase, colipase, phospholipase en proteasen (trypsinogeen en chymotrypsinogeen). Exocytose door deze cellen is gereguleerd door cephalische (CNS), gastrische (distentie van de maag) en intestinale (eiwitten, vetten en maagzuur in het duodenum) stimuli. (1) De cellen van de eilandjes van Langerhans zorgen voor de endocriene functie van de pancreas. Dit zijn hoofdzakelijk B-cellen die insuline produceren. Daarnaast zijn er nog de A-cellen voor
2
glucagonproductie, de D-cellen voor somatostatineproductie, de PP-cellen voor pancreatic polypeptideproductie en de enterochromaffine cellen voor serotonineproductie. (1)
2.2 Incidentie en risicofactoren pancreaskanker Naar schatting zijn er jaarlijks 42 470 nieuwe gevallen en 35 240 overlijden van pancreaskanker per jaar in de Verenigde Staten. Pancreaskanker is de vierde doodsoorzaak door kanker in de Verenigde Staten. De prevalentie ligt echter veel lager. Pancreaskanker staat slechts op de tiende plaats als oorzaak van kanker. Doordat pancreaskanker veel hoger scoort als doodsoorzaak dan als oorzaak van kanker, is pancreaskanker één van de meest letale kankers waarmee men getroffen kan worden. Meer dan de helft van de patiënten (52%) gediagnosticeerd met pancreaskanker zit in een stadium met uitzaaiingen op afstand (stadium IV). (3) Er is in de laatste decennia slechts weinig vooruitgang geboekt op het gebied van de overleving van patiënten met pancreaskanker. De vijfjaarsoverleving bedroeg in de periode van 1984-1986 3% ten opzichte van 5% in de periode van 1996-2004. (3) Conventionele therapieën zoals chirurgie, radiotherapie, chemotherapie of een combinatie van vorige geven slechts een kleine kans op langer leven na diagnose van pancreaskanker. (4) Ook ondanks nieuwe chirurgische technieken is er slechts weinig vooruitgang geboekt op overleven. (5) De meeste patiënten overlijden binnen de 1 à 2 jaar. (6) Het grote metastaserende vermogen van pancreaskanker is een belangrijke oorzaak hiervan. (7) Het grootste deel van deze kankers (95%) zijn exocrien van het pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)-type. Endocriene tumoren maken slechts een klein deel uit van de pancreastumoren (1% tot 2%). Pancreatic acinar cellcarcinoma’s (PACC) maken tenslotte het kleinste deel uit (1%). (8) De grootste risicofactoren om pancreaskanker te krijgen zijn leeftijd, het roken van tabak, familiale aanleg en chronische pancreatitis. Beschermende factoren zijn het eten van verse groenten en vers fruit. Voor de rest is weinig geweten over risicofactoren die de ziekte veroorzaken. Mannen zijn vatbaarder voor pancreaskanker dan vrouwen. (4, 9)
2.3 Chronische pancreatitis als differentiaaldiagnose 2.3.1 Chronische pancreatitis versus pancreaskanker Een moeilijke differentiaaldiagnose van pancreaskanker is chronische pancreatitis. (6) Vooral PDAC lijkt er histologisch sterk op. Daarnaast veroorzaakt een PDAC ook vaak een secundaire chronische pancreatitis en chronische pancreatitis is ook een risicofactor op het ontwikkelen van pancreaskanker 3
waardoor eigenschappen van beide aandoeningen zichtbaar kunnen zijn. (10) Uit onderzoek bleek zelfs dat patiënten met chronische pancreatitis 50 keer meer kans hebben op het ontwikkelen van pancreaskanker. (9) Klinisch wordt chronische pancreatitis eerder verwacht bij een patiënt van minder dan 40 jaar en PDAC eerder bij een patiënt van meer dan 50 jaar zonder een geschiedenis van alcoholisme. (9, 11) Chronische pancreatitis wordt in de westerse wereld meestal veroorzaakt door alcohol. In ontwikkelingslanden ligt de oorzaak eerder bij malnutritie. Er is ook een erfelijke component die zorgt voor aanleg tot chronische pancreatitis. Hierdoor wordt in de pancreas op een ongecontroleerde wijze trypsine geactiveerd in de pancreas. Trypsine is een enzym dat eiwitten afbreekt. Deze eiwitten slaan neer in de ductus pancreaticus. Vervolgens calcificeren de eiwitten wat zorgt voor obstructie en ductale hypertensie met verdere pancreasschade. Ook een benigne of maligne massa kan een obstructie van de ductus pancreaticus veroorzaken met chronische pancreatitis tot gevolg. (1)
2.3.2 Diagnostiek chronische pancreatitis Het meest voorkomende symptoom van chronische pancreatitis is epigastrische pijn, uitstralend naar de rug en kan in episoden verlopen. Exacerbaties van de pijn kunnen volgen op verder alcoholgebruik. Door de abdominale pijn treedt anorexie op met soms ernstig gewichtsverlies en cachexie tot gevolg. In ernstige gevallen kunnen exocriene en endocriene functies van de pancreas verstoord raken, net als geelzucht secundair aan galwegobstructie. De malnutritie wordt verder in de hand gewerkt door de verstoring van de exocriene functie. Frequent treedt ook een vervelende steatorrhoea op. Bij verstoring van de endocriene functie kan diabetes optreden. Deze diabetes kan in sommige gevallen al aanwezig zijn voor er tekenen zijn van verstoring van de exocriene functie. (1, 12) De dilataties van de ductus pancreaticus en de calcificaties bij chronische pancreatitis kunnen aangetoond worden door middel van een CT-scan (computed tomography) met contrast. In sommige gevallen is een MRI-scan (magnetic resonance imaging) en EUS (endoscopic ultrasound) noodzakelijk om een meer gedetailleerd beeld te verkrijgen van de letsels. Het beeld van chronische pancreatitis is niet altijd duidelijk te onderscheiden van een maligniteit in de pancreas. Daarom gaat men op zoek naar een gelokaliseerde massa, lokale invasie en vergroting van de lymfeklieren. (1)
2.4 Diagnostiek pancreaskanker 2.4.1 Klinische kenmerken Klinisch komen pas laat symptomen van pancreaskanker op de voorgrond. Deze symptomen kunnen zijn: algemene malaise, abdominale pijn die eventueel uitstraalt naar de rug, gewichtsverlies, een vaag
4
abdominaal ongemak, abdominale zwelling, ascites, nausea, geelzucht, diabetes mellitus, dyspepsie, malabsorptie, depressie of tekenen van metastasen. Meestal begint het met aspecifieke symptomen die makkelijk genegeerd kunnen worden door arts en patiënt. Een minder voorkomend eerste symptoom is een pancreatitis, veroorzaakt door obstructie van de ductus pancreaticus. (4, 13, 14) De symptomen kunnen een idee geven van de lokalisatie van de tumor. Wanneer eerder pijnloze geelzucht op de voorgrond staat, wordt eerder gedacht aan een carcinoma van de kop van de pancreas met bijgevolg obstructie van de ductus choledocus. Wanneer daarentegen eerder abdominale pijn en anorexie met gewichtsverlies op de voorgrond staan, zal eerder gedacht worden aan een carcinoma van het lichaam of de staart van de pancreas. (1)
2.4.2 Tumormerkers De enige serum-biomerker die in zekere mate van nut is, is CA 19-9. Die kan door verschillende andere oorzaken dan pancreaskanker verhoogd zijn. Cholangiocarcinoma is een andere maligne oorzaak; cholangitis en chronische pancreatitis zijn benigne oorzaken van een gestegen CA 19-9. (15) Gewoonlijk worden verhoogde concentraties bij pancreaskanker gevonden bij tumoren van meer dan 3 cm diameter (niet meer resectabel). Daarentegen is bij een groot deel van deze patiënten deze merker niet verhoogd. CA 19-9 is vooral nuttig om patiënten met een gekende pancreaskanker op te volgen na resectie en chemotherapie of voor de prognose, maar dit kan enkel gebeuren indien de waarde initieel verhoogd was. (14)
2.4.3 Beeldvormingstechnieken Initieel wordt meestal een transabdominale echografie uitgevoerd bij een patiënt met geelzucht of symptomen die zouden kunnen wijzen op pancreaskanker. Vaak is de pancreas echter moeilijk te lokaliseren via echo, alsook een eventuele laesie en de afmetingen ervan. (14) Uit voorafgaand echografisch onderzoek kan men dan besluiten of een CT-scan en/of andere onderzoeken noodzakelijk zijn om de klachten van de patiënt te verklaren. Met behulp van een CTabdomen met contrast kan vervolgens aangetoond worden of er zich inderdaad een laesie ter hoogte van de pancreas bevindt bij patiënten met een vermoeden van pancreaskanker. Eveneens is de verhouding van een eventuele tumorale massa ten opzichte van de omliggende weefsels beoordeelbaar, net zoals de omliggende lymfeklieren. Het al dan niet aanwezig zijn van metastasen in de lever is ook van belang. Kleine lever of periportale metastasen kunnen echter wel onopgemerkt blijven. MRI-onderzoek heeft meestal geen diagnostisch voordeel ten opzichte van de huidige CTbeelden in de diagnostiek. (1, 4, 7, 13, 14, 16) De “definitieve” diagnose van pancreaskanker steunt dan op een biopsie van de pancreaslaesie door middel van een EUS-FNA (endoscopic ultrasound-guided – fine needle aspiration) punctie (zie figuur 2). Naast het bekomen van weefsel voor pathologisch onderzoek, kunnen ook de aanliggende 5
lymfeklieren beoordeeld worden op metastasen. De relatie van de tumor ten opzichte van het omliggende weefsel kan ook op deze manier gevisualiseerd worden (zie figuur 3). EUS is de gevoeligste techniek op dit ogenblik om tumoren (zeker voor deze van minder dan 3 cm diameter) op te sporen. (4, 14, 16-18) Voordat de techniek waarbij celmateriaal via een FNA kan bekomen worden ontwikkeld was, was een heelkundige ingreep nodig om de laesie te biopsiëren. Op het weefsel bekomen door de biopsie, werd dan de definitieve cytologische diagnose gesteld. Dit bracht veel achteraf gebleken onnodige operaties met zich mee voor patiënten die in een te ver stadium zaten om nog een chirurgische behandeling te krijgen. Een diagnostische laparoscopie wordt enkel gedaan indien geen cytologische diagnose gesteld kan worden door middel van een FNA. Een ander nadeel van zo’n open biopsie, is dat er ook een risico op besmetting van gezond weefsel rondom de tumor kan optreden. Met FNA is het risico op deze “seeding” van tumorweefsel geminimaliseerd. (4, 14, 16, 18-20)
Figuur 2: Schematische voorstelling van een EUS-FNA van een laesie van de pancreaskop. Onder echogeleide kan met de naald door de duodenumwand een punctie gedaan worden van de pancreaslaesie in de kop. Laesies van het lichaam of staart van de pancreas worden bereikt via de proximale maag. Ook de omliggende lymfeklieren kunnen op deze wijze in beeld gebracht en gepuncteerd worden. (19)
6
Figuur 3: Het endoscopisch echobeeld dat een massa in de pancreaskop aantoont met zijn relatie tot de omliggende structuren. (14) CBD = ductus choledocus, HA = arteria hepatica, PV = vena porta
2.4.4 Cytologisch onderzoek Beeldvorming alleen is niet voldoende om te differentiëren tussen maligne en benigne letsels. Daarom is het celmateriaal bekomen door middel van de EUS-FNA essentieel voor de diagnose. De interpretatie van dit materiaal is echter moeilijk aangezien slechts een geringe hoeveelheid celmateriaal meekomt met de punctie en het punctaat bloederig kan zijn. Het punctaat wordt dan later door een patholoog geanalyseerd. Het voordeel bij een diagnostische operatie is dat in één tijd een curatieve operatie kan gedaan worden indien dit volgens het cytologisch onderzoek mogelijk blijkt. (18, 21) Het cytologische subtype (en differentiatiegraad) bepaalt namelijk voor een groot deel de behandeling. (4) Voor de differentiaaldiagnose met chronische pancreatitis blijkt echter dat diagnose op histologisch materiaal na een biopsie wel beter is dan diagnose op materiaal bekomen via een FNA. (20, 22)
2.5 Therapie van pancreaskanker Uit voorgaande onderzoeken komen 3 groepen van patiënten voort. Ten eerste de patiënten die resectabel zijn. Ten tweede is er de groep die lokaal gevorderd is. De laatste groep is de groep waarbij 7
er al metastasen opgetreden zijn. De laatste 2 groepen kunnen enkel nog palliatief behandeld worden. Een resectie is namelijk de enige curatieve behandeling op dit moment. De mediane overleving van de resectabele groep patiënten is 20 tot 22 maanden, terwijl deze van de niet resectabele groep slechts 9 tot 10 maanden is. (13) Slechts 5% tot 25% van de patiënten met pancreaskanker behoort na grondig onderzoek bij de resectabele groep. (7) Niet bij elke patiënt heeft adjuvante therapie hetzelfde effect. Daarom is het belangrijk nieuwe merkers te hebben die kunnen voorspellen of de tumor gevoelig zal zijn aan een bepaalde therapie. Op die manier kunnen nodeloze toxische bijwerkingen van therapieën vermeden worden. (23)
2.6 microRNA’s in het menselijk lichaam MicroRNA’s werden voor het eerst in 1993 beschreven. Het zijn niet-coderende RNA-fragmenten van ongeveer 22 nucleotiden die essentieel zijn voor vitale celfuncties zoals proliferatie, differentiatie, groei, inflammatie, angiogenese en invasie. Ze reguleren meer dan 30% van het genoom door te binden met de 3’ untranslated regions (UTR). Hier tegenover staat dat ze slechts 1% tot 3% van het menselijke genoom uitmaken. Hun biogenese staat beschreven in figuur 4. (24-27) Opvallend is dat de helft van de gekende miRNA’s zich bevinden in of in de buurt van kwetsbare plaatsen op het DNA. De functie van miRNA’s kan verloren gaan door verschillende mechanismen zoals deleties, mutaties, epigenetische silencing en/of veranderingen in verwerking van miRNA’s. Op deze manier kunnen miRNA’s kanker induceren als zij instaan voor de regulatie van translatie van oncogenen of tumor-suppressorgenen. (25) De eerste onderzoeken op expressie van miRNA’s werden uitgevoerd bij patiënten met leukemie. (27)
8
Figuur 4: miRNA biogenesis. Eerst zorgt polymerase II voor transcriptie van het miRNA-gen tot primiRNA dat verschillende kilobasen groot is. Daarna bewerkt het Drosha-enzym het pri-miRNA tot pre-miRNA van ongeveer 70 nucleotiden in de nucleus. Exportin 5 zorgt vervolgens voor transport van het pre-miRNA naar het cytoplasma waar het gebonden wordt aan het RNase Dicer en het RNAgeïnduceerd silencing complex (RISC). Hieruit komt een matuur miRNA van 22 nucleotiden, gebonden aan het RISC. Het mature miRNA herkent dan een complementaire sequentie in de 3’ untranslated region van het target-mRNA. De translatie van het mRNA tot een eiwit gaat hierdoor niet door en het mRNA wordt gedegradeerd. Op deze manier doen deze miRNA’s aan genregulatie en wordt er minder of geen eiwit waarvoor dat specifieke mRNA codeerde, geproduceerd. (25)
2.7 Rol van microRNA’s in de pathologie Voor verschillende pathologieën werden al miRNA-patronen gevonden die het verschil aantonen tussen tumorale en normale cellen. Dit gebeurde onder andere al voor chronische lymfatische leukemie, acute myeloïde leukemie, borstkanker en neuroglioblastoom. Elk type tumor heeft zijn eigen miRNA-handtekening. MiRNA profilering kan van onschatbare waarde zijn voor het classificeren van moeilijk te diagnosticeren tumoren. In sommige gevallen kan de expressie van miRNA’s ook een voorspellende waarde hebben in de prognose en evolutie van kanker. (25, 26)
9
Het expressiepatroon van miRNA’s blijkt een betere methode van diagnostiek te zijn dan het expressiepatroon van mRNA’s. Met het expressiepatroon van 217 miRNA’s kunnen even accuraat tumoren geclassificeerd worden als met ongeveer 16 000 mRNA’s. Daarnaast zijn miRNA’s ook korter dan mRNA’s, wat ze meer weerstandig maakt aan de afbraak door ribonucleases. (26-28) De miRNA’s geven beter de evolutie van de ontregeling in de cel weer, zowel op het vlak van het stadium waarin de tumor zich bevindt als van de soort tumor, dan het mRNA. Eveneens is er een onderscheid van pancreaskanker met chronische pancreatitis mogelijk door middel van 8 miRNA’s die upgereguleerd of downgereguleerd zijn met een accuraatheid van 93%. (26, 28) MiRNA als een aangrijpingspunt voor de therapie van kanker behoort ook tot de mogelijkheden. Dit kan gebeuren door middel van upreguleren of downreguleren van miRNA’s. Hiervoor is nog verder onderzoek noodzakelijk. (25)
2.8 microRNA’s bij pancreaskanker Er wordt een grote rol toegeschreven aan miRNA’s in de pathogenese van pancreaskanker. Een duidelijk verschil in miRNA expressie tussen normaal weefsel en miRNA expressie in weefsel van een PDAC werd gevonden. Het miRNA expressiepatroon van chronische pancreatitis ligt dichter bij normaal weefsel dan het miRNA expressiepatroon bij een PDAC. (27-31) Overexpressie van miR-21 in pancreascellen bijvoorbeeld, wordt gerelateerd aan verhoogde celproliferatie, invasie en chemoresistentie tegen gemcitabine (het klassieke chemotherapeuticum bij de behandeling van pancreascarcinoom) in vergelijking met normale cellen. Patiënten met deze overexpressie hebben inderdaad een verhoogde kans op het krijgen van levermetastasen. Deze patiënten blijken een slechtere prognose te hebben, ook al zijn de omgevende lymfeklieren nog negatief en is de lever nog niet aangetast. (26, 32) Het tegenovergestelde werd beschreven bij cellen waarin het miR-21 uitgeschakeld werd. De expressie van miR-21 correleerde niet met de tumorgrootte, tumordifferentiatie of de status van de lymfeklieren. MiR-21 expressie is laag bij patiënten met chronische pancreatitis. Dit suggereert dat het waarschijnlijk gerelateerd is aan maligniteit. (26, 32)
2.9 Doelstellingen In dit huidig onderzoek wordt nagegaan of er uit het celmateriaal bekomen uit een endoscopic ultrasound-guided - fine needle aspiration (EUS-FNA) voldoende RNA van een goede kwaliteit kan
10
verkregen worden om het miRNA expressiepatroon te bepalen. Daarnaast werd ook van resectiestukken van pancreastumoren RNA geïsoleerd. Met het miRNA expressiepatroon zou men dan een accurate diagnose kunnen stellen die van belang zijn voor de behandeling en prognose van de patiënt met pancreaskanker.
11
3 Methodologie 3.1 Celmateriaal Bij patiënten met pancreaskanker die een EUS-FNA ondergingen voor standaard histologisch onderzoek, werden er een aantal bijkomende aspiraties gedaan voor dit onderzoek. Dit celmateriaal uit deze puncties werd vervolgens onmiddellijk in RNAlater® (Applied Biosystems/Ambion, Austin, Texas, Amerika) gebracht. RNAlater® is een waterig, niet toxisch reagens om weefsel in te bewaren. Het inhibeert RNases die snel het RNA aanwezig in het celmateriaal zouden afbreken. Tenslotte werd het staal opgeslagen in een -80° C vriezer tot de RNA-extractie kon gebeuren. RNA werd voor dit onderzoek niet enkel van FNA-celmateriaal geïsoleerd, maar ook van resectiestukken van pancreassen. Er was telkens een tumor en een normaal staal van dezelfde patiënt. Dit resectiemateriaal werd eveneens aan -80° C bewaard in RNAlater®. Deze onderzoeken werden goedgekeurd door het Ethisch Comité van het Universitair Ziekenhuis Gent met nummers 2009/557: “De bijdrage van echo-endoscopie met aspiratiebiopsie (FNA) aan microRNA onderzoek bij pancreaspathologie” en 2010/209: “Belang van micro-RNA onderzoek bij de diagnose en prognose van operabele pancreaspathologie”.
3.2 RNA-extractie De RNA-extractie van de meeste FNA’s en alle resectiestukken werd uitgevoerd met de miRNeasy kit® (QIAGEN, Benelux B.V., Venlo, Nederland). Voor het overige FNA-celmateriaal gebeurde de extractie met de mirVana miRNA Isolation Kit® (Applied Biosystems/Ambion). De miRNeasy kit® werd gekozen omdat er gewoonlijk met deze kit gewerkt wordt in het laboratorium van de GastroEnterologie. De mirVana miRNA Isolation Kit® werd ook uitgetest omdat deze in de literatuur al gebruikt was voor RNA-extractie uit FNA’s van pancreasweefsel. (30) Overal in de omgeving zijn er enzymen die RNA afbreken, de RNases. Daarom is het belangrijk de werkomgeving vrij van RNases te maken om de afbraak van RNA tot een minimum te beperken. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van de spray RNAseZap® (Applied Biosystems/Ambion). Hieronder volgen de protocols die werden gebruikt voor de RNA-isolatie. 3.2.1
Protocol miRNeasy kit®
Bij het eerste gebruik van de kit dienen de RDD- en RPE-buffers klaargemaakt te worden. Daarvoor wordt 100% ethanol toegevoegd aan de buffers geleverd door de fabrikant.
12
De QIAzol Lyse Reagent® (QIAGEN) en chloroform (Sigma-Aldrich, Bornem, België) zijn toxische producten. Voor de stappen waarbij deze producten gebruikt worden, is het aanbevolen onder een trekkast te werken. Om geen tijd te verliezen en geen fouten te maken tijdens het uitvoeren van het protocol (zie ook figuur 5), wordt best eerst al het nodige materiaal bijeengezocht. Daarnaast worden ook al alle epjes en tubes nodig tijdens het protocol gemerkt met de naam van het staal. (33)
Figuur 5: Schematische voorstelling van het miRNeasy kit® protocol. (33)
3.2.1.1 RNA-extractie van de FNA stalen -
De werkruimte RNase vrij maken met RNAseZap® en werken met RNase vrij materiaal
-
Het FNA staal laten ontdooien op ijs
-
5 minuten centrifugeren aan 370 g bij 4° C
-
De RNAlater® verwijderen die nu boven de gevormde pellet van pancreasmateriaal drijft door middel van pipetteren
-
Pellet losmaken door op de tube te tikken
-
Pellet overbrengen op een 1,5 ml epje door middel van pipetteren
13
-
700 μl QIAzol Lyse Reagent® toevoegen om de cellen te lyseren (vernietigen van de cellen, het genomisch DNA en de grote celcomponenten) en mengen door op en neer te pipetteren
Vanaf dan verder het gemeenschappelijk protocol onder 3.2.1.3
3.2.1.2 RNA-extractie van het resectiemateriaal -
De werkruimte RNase vrij maken met RNAseZap® en werken met RNase vrij materiaal
-
Tumor en normaal staal van dezelfde patiënt laten ontdooien op ijs
-
Klein stukje van het weefsel afsnijden met een mesje en een scalpel, eerst het normale weefsel en dan het tumorweefsel. Indien dit omgekeerd gedaan wordt, dan zou er contaminatie van het normale weefsel met het tumorweefsel kunnen gebeuren. (het snijmateriaal eerst reinigen met RNAseZap®)
-
Het weefsel in aparte epjes brengen en onmiddellijk 700 μl QIAzol Lyse Reagent® toevoegen
-
Het weefsel pletten met een speciaal stampertje dat in de epjes past
-
Het weefsel lyseren met injectienaald en spuit (van grote naald (roos, 18G), naar middelgrote naald (groen, 21G), naar kleine naald (blauw 23G))
Vanaf dan verder het gemeenschappelijk protocol onder 3.2.1.3
3.2.1.3 Het verdere gemeenschappelijk protocol -
Homogeniseren door te vortexen gedurende 1 minuut
-
Homogenaat op de bench laten staan bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten
-
140 μl chloroform toevoegen om het homogenaat te scheiden in 3 fasen: a. de onderste organische (rood/roze) fase met proteïnen b. de middelste (witte) fase met het DNA c. de bovenste (waterige en kleurloze) fase met het RNA
-
Tube zorgvuldig sluiten en krachtig schudden gedurende 15 seconden
-
Homogenaat op de bench laten staan bij kamertemperatuur gedurende 2 à 3 minuten
-
15 minuten centrifugeren aan 12 000 g bij 4° C
-
Centrifuge op kamertemperatuur brengen
-
De bovenste, waterige fase (ongeveer 350 μl) overpipetteren in een nieuw epje
-
Voeg 1,5 volume (ongeveer 525 μl) van 100% ethanol toe en meng door op en neer te pipetteren (NIET centrifugeren)
-
700 μl van het mengsel (de rest houden) overbrengen op een RNeasy Mini kolom die geplaatst is op een 2 ml verzamelbuis
-
15 seconden centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur
-
Lysaat verwijderen uit verzamelbuis en de rest van het mengsel op de kolom brengen
-
15 seconden centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur 14
-
350 μl RWT buffer toevoegen aan de RNeasy Mini kolom
-
15 seconden centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur
-
Lysaat verwijderen
-
Mix van 70 μl RDD-buffer en 10 μl DNAse (= 80 μl Mix) toevoegen op de kolom om de overgebleven DNA fragmenten af te breken
-
15 minuten laten incuberen
-
350 μl RWT buffer toevoegen op de kolom
-
20 seconden centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur
-
De RNeasy Mini kolom overbrengen op een nieuwe 2 ml verzamelbuis
-
500 μl RPE buffer toevoegen
-
15 seconden centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur
-
Lysaat verwijderen
-
500 μl RPE buffer toevoegen
-
2 minuten centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur om het membraan te drogen
-
RNeasy Mini kolom overbrengen op nieuwe 2 ml tube en 1 minuut centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur
-
RNeasy Mini kolom overbrengen op een 1,5 ml epje en 30 μl nuclease vrij water rechtstreeks op de kolom brengen
-
1 minuut centrifugeren aan 10 000 g om het RNA te elueren
Het epje bevat nu 30 μl nuclease vrij water met de RNA fragmenten in opgelost. Dit wordt nu ingevroren bij -80° C. (33)
3.2.2 Protocol mirVana miRNA Isolation Kit® Bij het eerste gebruik van de kit dienen de miRNA Wash Solution 1 en Wash Solution 2/3 klaargemaakt te worden. Daarvoor wordt ethanol 100% toegevoegd aan de Wash Solutions geleverd door de fabrikant. De Lysis/Binding Solution (Applied Biosystems/Ambion) en Acid-Phenol:Chloroform (Applied Biosystems/Ambion) zijn toxische producten. Voor de stappen waarbij deze producten gebruikt worden, is het aanbevolen onder een trekkast te werken. Om geen tijd te verliezen en geen fouten te maken tijdens het uitvoeren van het protocol, wordt best eerst al het nodige materiaal bijeengezocht. Daarnaast worden ook al alle epjes en tubes nodig tijdens het protocol gemerkt met de naam van het staal.
15
Figuur 6: Schematische voorstelling van het mirVana miRNA Isolation Kit® protocol. Hier werd het totale RNA geïsoleerd. (34)
Het protocol: (zie ook figuur 6) -
De werkruimte RNase vrij maken met RNAseZap® en werken met RNase vrij materiaal
-
Het FNA staal laten ontdooien op ijs
-
5 minuten centrifugeren aan 370 g bij 4° C
-
De RNAlater® verwijderen die nu boven de gevormde pellet van pancreasmateriaal drijft door middel van pipetteren
-
Pellet losmaken door op de tube te tikken
-
Pellet overbrengen op een 1,5 ml epje
-
600 μl Lysis/Binding Solution toevoegen om de cellen te lyseren
-
Homogeniseren door te vortexen gedurende 1 minuut
-
1/10 volume van het mengsel miRNA Homogenate Additive toevoegen en goed mengen door te vortexen
-
Het mengsel gedurende 10 minuten laten incuberen op ijs
-
Een even groot volume Acid-Phenol:Chloroform toevoegen als het volume van het mengsel voor de toevoeging van het miRNA Homogenate Additive
-
Vortexen gedurende 30 tot 60 seconden om te mixen
-
5 minuten centrifugeren aan maximale snelheid op kamertemperatuur om het mengsel te scheiden in een organische en waterige fase 16
-
De bovenste waterige fase overpipetteren in een nieuw epje
-
1,25 volumes 100% ethanol van de oorspronkelijke waterige fase toevoegen en goed mixen
-
700 μl van het mengsel overbrengen op een Filter Cartridge
-
15 seconden centrifugeren aan 10 000 g
-
Lysaat verwijderen uit verzamelbuis en de rest van het mengsel op de kolom brengen
-
15 seconden centrifugeren aan 10 000 g
-
700 μl miRNA Wash Solution 1 op de filter brengen
-
5 tot 10 seconden centrifugeren aan 10 000 g
-
Lysaat verwijderen
-
500 μl Wash Solution 2/3 op de filter brengen
-
5 tot 10 seconden centrifugeren aan 10 000 g
-
Lysaat verwijderen
-
500 μl Wash Solution 2/3 op de filter brengen
-
5 tot 10 seconden centrifugeren aan 10 000 g
-
Lysaat verwijderen
-
1 minuut centrifugeren aan 10 000 g om de residuele vloeistof te verwijderen
-
De Filter Cartridge op een nieuw 1,5 ml epje plaatsen en 100 μl voorverwarmde (95° C) Elution Solution toevoegen
-
20 tot 30 seconden centrifugeren aan maximale snelheid om het RNA te elueren
Het epje bevat nu 30 μl Elution Solution met de RNA fragmenten in opgelost. Dit wordt nu ingevroren bij -80° C. (34)
3.3 Bepaling van de RNA-concentratie Er bestaan verschillende meetmethoden om de concentratie van het RNA te bepalen. Hier werd gebruik gemaakt van de spectrofotometer, de NanoDrop® (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA) en de Experion® (Bio-Rad, Hercules, Amerika).
3.3.1 Spectrofotometer Voor dit onderzoek werd gebruik gemaakt van de Biowave DNA® spectrofotometer (Biochrom, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). (zie figuur 7) Via de techniek van fotospectrometrie kan de hoeveelheid geïsoleerd RNA bepaald worden. Dit is een meting om concentratie te bepalen in een oplossing. Hiervoor pipetteert men 2 μl van het staal samen met 70 μl TE buffer in een epje waardoor men een verdunning van 1/35 krijgt. Wanneer geen verdunning gebruikt wordt, zou een te grote hoeveelheid van het staal verloren gaan. 17
Deze verdunde oplossing wordt vervolgens overgebracht in een cuvet. Na kalibratie van het toestel, wordt de cuvet in het meettoestel geplaatst. Een lichtbron in het meettoestel geeft licht af van een welbepaalde golflengte die dan door de cuvet straalt. Aan de andere kant van de cuvet staat een fotodetector die de hoeveelheid licht meet. Hieruit kan de absorptie van licht door de vloeistof gemeten worden door middel van de wet van Lambert-Beer. Hoe meer licht geabsorbeerd wordt, hoe hoger de concentratie. De golflengtes van belang voor de concentratie en zuiverheid van nucleïnezuren zijn 260 nm en 280 nm. Met de absorbantie van licht met een golflengte van 260 nm (de golflengte waaraan RNA licht absorbeert) wordt de concentratie ( in ng/μl) bepaald. Met de verhouding van absorbantie van licht met een golflengte van 260 nm ten opzichte van licht met een golflengte van 280 nm (A260/A280) wordt de zuiverheid van het staal berekend. Met zuiverheid wordt bedoeld of het staal al dan niet gecontamineerd is met eiwitten. Eiwitten absorberen namelijk licht bij een golflengte van 280 nm. Om zuiver RNA te hebben dient A260/A280 ongeveer 2 te zijn. (35)
Figuur 7: De Biowave DNA® spectrofotometer van Biochrom®. (35)
3.3.2 NanoDrop® Een andere techniek gebruikt in dit onderzoek om de concentratie en de zuiverheid van de stalen te bepalen is de NanoDrop®. (zie figuur 8a) Dit toestel maakt gebruik van dezelfde principes als de fotospectrometer. Bij deze techniek is slechts 1 μl van het staal nodig. Er dient ook geen cuvet gebruikt te worden. Een druppel van het staal wordt op een onderste optisch plaatje gelegd waarna het toestel dichtgeklapt wordt. Daardoor komt boven het onderste een bovenste optisch plaatje met daartussen een vloeistofkolom van 1 mm van het staal. (zie 18
figuur 8b) De concentratie, absorbanties en A260/A280 ratio worden dan berekend door een softwarepakket. (36) De metingen met deze NanoDrop® werden uitgevoerd op de dienst Medische Genetica van het Universitair Ziekenhuis Gent.
a. Figuur 8:
a. Het NanoDrop® toestel.
b.
b. De vloeistofkolom tussen de 2 optische plaatjes. (36)
3.3.3 Experion® 3.3.3.1 Principe Met de Experion® (zie figuur 9) wordt de concentratie van de verschillende RNA-fragmenten van klein naar groot gemeten. Eveneens wordt de totale concentratie gemeten. Deze concentratie is echter minder betrouwbaar dan de concentratie bekomen door middel van de NanoDrop®. Naast de concentratie wordt de kwaliteit en integriteit van het RNA door het toestel en de software bepaald. Dit wordt omschreven door de parameter RQI (RNA quality indicator). De Experion® is eigenlijk een geautomatiseerd elektroforesesysteem met hetzelfde werkingsmechanisme als de klassieke gelelektroforese. Het toestel doet de stappen elektroforese, kleuring, ontkleuring, detectie van de verschillende banden en beeldopname allemaal in 1 stap voor de gebruiker. (37)
19
Figuur 9: Links is het Experion® Electrophoresis System afgebeeld. In het midden een afbeelding van de Priming Station en rechts een afbeelding van de Vortex Station. (37)
Het staal wordt geanalyseerd in een Experion® RNA StdSens of HighSens chip. (zie figuur 10) Op een StdSens chip kunnen tot 12 stalen simultaan geanalyseerd worden. Bij een HighSens chip zijn dat er 11. Concentraties tussen 5 en 500 ng/μl zijn meetbaar met behulp van StdSens chips. HighSens chips meten tussen 100 en 5 000 pg/μl. Er bestaan ook chips voor de bepaling van DNA of voor de bepaling van proteïnen, maar deze zijn niet nodig voor dit onderzoek. (38)
Figuur 10: Afbeelding van een Experion® RNA StdSens en HighSens chip. (38)
Na de analyse geeft de software van de Experion® een grafiek weer met op de x-as de tijd en op de yas de fluorescentie. Hoe hoger de fluorescentie, hoe meer RNA-materiaal er aanwezig is. Het is dus een maat voor concentratie. Hoe langer de tijd nodig om een bepaalde afstand af te leggen, hoe groter het RNA-fragment. De verschillende pieken op de grafiek geven dus verhoudingsgewijs de concentratie weer van de RNA-fragmenten met verschillende grootte. Twee belangrijke pieken van 20
bekende RNA-fragmenten dienen aanwezig te zijn: de piek van de 18S ribosomale eenheid en de piek van de 28S ribosomale eenheid. Hierbij is normaal gezien de 18S-piek groter dan de 28S-piek. Naast weergave van een grafiek kan eveneens een virtueel beeld verkregen worden van een klassieke gelelektroforese met fluorescentiebanden. De RQI-waarde die de Experion® software berekent, is een getal tussen 1 en 10. Dit getal is het resultaat van een vergelijking met gestandaardiseerde RNA-stalen. De concentratie kan mogelijk te laag zijn voor een RQI berekening. Een 1 wil zeggen dat het RNA gedegradeerd is, een 10 wil zeggen dat het RNA intact is. Voor de interpretatie wordt gewerkt met 3 categorieën: tussen 7 en 10 is er een aanvaardbare kwaliteit, tussen 4 en 6 is de kwaliteit mogelijk nog aanvaardbaar en tussen 1 en 3 is de kwaliteit onvoldoende. (37)
3.3.3.2 Protocol Eerst dienen alle producten nodig voor de elektroforese te worden ontdooid of opgewarmd tot kamertemperatuur: -
Haal de ladder uit de -70° C vriezer en laat ontdooien op ijs
-
Haal de loading buffer, gel en kleurstof uit de koelkast (4° C) en laat gedurende ongeveer 15 minuten op kamertemperatuur komen
-
Vortex de loading buffer, gel en kleurstof kort
Reiniging van het Experion® Electrophoresis System moet voor elke run gebeuren: -
Breng 800 μl Experion® electrode cleaner op een Cleaning chip en plaats hem gedurende 2 minuten in het gesloten Experion® elektroforesetoestel
-
Verwijder de Cleaning chip en plaats een Cleaning chip met 800 μl DEPC-behandeld water
-
Sluit het Experion® elektroforesetoestel gedurende 5 minuten met de Cleaning chip
-
Open het Experion® elektroforesetoestel en laat de elektroden gedurende 1 minuut drogen
Vervolgens worden de chips voorbereid en geladen met de stalen: -
Maak de gel klaar door 600 μl over te pipetteren op een epje met een filter en centrifugeer 10 minuten aan 1 500 g
-
Maak de gel-kleurstof oplossing door 65 μl van de gefilterde gel en 1 μl van de kleurstof te pipetteren in een nieuw epje
-
Vortex en draai de oplossing kort af
-
Breng minimum 2 μl van de stalen in een nieuw epje
-
Breng minimum 2 μl van de ladder in een nieuw epje
-
Laat de epjes met de stalen en de ladder 2 minuten incuberen aan 70° C
21
-
Laat de epjes met de stalen en de ladder 5 minuten afkoelen op ijs
-
Draai de epjes met de stalen en de ladder af
-
Bewaar de epjes met de stalen en de ladder opnieuw op ijs
-
Prime de chip door de gel-kleurstof oplossing op de priming well te brengen en de chip in de Experion® Priming Station te plaatsen
-
Start het toestel en verwijder de chip wanneer voltooid
-
Inspecteer de chip op eventuele luchtbellen die erin gevangen zitten
-
Pipetteer 9 μl gel-kleurstof oplossing in de tweede GS well
-
Pipetteer 9 μl gefilterde gel in de G well
-
Pipetteer 5 μl loading buffer in elke well voor de stalen (1 tot 12 voor StdSens en tot 11 voor HighSens) en in de L well (laat geen enkele well leeg)
-
Pipetteer 1 μl ladder in de L well
-
Pipetteer 1 μl van het staal in de 12 (voor StdSens) of 11 (voor HighSens) wells voor de stalen (pipetteer 1 μl TE buffer of DEPC-behandeld water in ongebruikte wells voor stalen)
-
Plaats de chip in de Experion® Vortex Station en vortex gedurende 1 minuut
Nu kan de chip in het Experion® elektroforesetoestel geplaatst worden. De elektroforese moet nu binnen de 5 minuten gestart worden door de Experion® software. Na de elektroforese wordt de chip verwijderd en het Experion® elektroforesetoestel met DEPC water gereinigd zoals hoger beschreven. (39) De resultaten van de elektroforese kunnen ten slotte opgeslagen worden door de Experion® software in pdf-formaat. De metingen met deze Experion® werden uitgevoerd op de dienst Medische Genetica van het Universitair Ziekenhuis Gent.
3.4 Expressie van de geïsoleerde microRNA’s Op 2 FNA stalen en op een tumor en normaal resectiestuk van dezelfde patiënt werd uitgetest of het wel degelijk mogelijk was miRNA’s te detecteren. Daarvoor werden uit de literatuur een aantal miRNA’s weerhouden die van belang kunnen zijn in de diagnostiek van pancreaskanker ten opzichte van normaal pancreasweefsel. Volgende miRNA’s werden daarvoor geselecteerd: miR-132, miR-181, miR-18a, miR-196a, miR-203, miR-204, miR-21 en miR-222. Voor de expressie van de miRNA’s werd gebruikt gemaakt van de Multiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assays (Applied Biosystems, Foster City, Amerika).
22
3.4.1 Principe Om de expressie van de verschillende miRNA’s te weten te komen, wordt van verschillende technieken gebruik gemaakt in de Multiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assays. Bij stap 1 wordt gebruik gemaakt van de techniek “reversed transcription”. Aan de miRNA’s aanwezig in het staal wordt door het reversed transcriptase complementair DNA (cDNA) gevormd. Dit doet het reversed transcriptase door het verlengen van de looped RT primer die zich gebonden heeft aan het 3’ uiteinde van het oorspronkelijke miRNA. (zie figuur 11) Hierna volgt stap 2 die gebruik maakt van een andere techniek: de PCR (polymerase chain reaction) techniek. Bij het smelten van de RNA-DNA streng zal ook de lus aan het 5’ uiteinde van de looped RT primer zich uitstrekken. Daardoor is om een complementaire streng te maken slechts één miRNAspecifieke primer noodzakelijk. De andere primer is dan complementair aan de looped RT primer. De 2 primers worden verlengd door een polymerase waardoor men nu 2 dubbelstrengige DNA moleculen verkrijgt. Deze 2 DNA moleculen zijn complementair aan het oorspronkelijke miRNA. (zie figuur 11) Verschillende PCR-cycli volgen hierop om een grotere hoeveelheid DNA te verkrijgen. Er gebeurt dus een amplificatie van het DNA.
23
Figuur 11: Bovenaan is de eerste stap met de reversed transcription afgebeeld. Een DNA streng complementair aan het RNA wordt gevormd door het verlengen van de looped RT primer die zich gebonden heeft aan het 3’ uiteinde van het miRNA. Onderaan is stap 2 afgebeeld waarbij door middel van PCR dsDNA (double stranded DNA) gevormd wordt, complementair aan het originele miRNA. De forward primer is miRNA-specifiek en de reverse primer is specifiek voor de looped RT primer. (40)
Tijdens de PCR worden TaqMan® MGB probes gebruikt. Deze probes zijn opgebouwd uit een stuk DNA dat dezelfde sequentie heeft als een deel van het miRNA. Aan het 5’ uiteinde van de probe zit een “reporter”. Dit is een fluorescerende molecule. Aan het 3’ uiteinde van de probe zit een “quencher”. Een quencher heeft de eigenschap dat hij de fluorescentie van de reporter absorbeert. Wanneer het polymerase de probe gebonden aan het DNA tegenkomt, dan zal de reporter loskomen van de probe. Op die manier kan de quencher de fluorescentie van de reporter niet meer onderdrukken aangezien ze niet meer naast elkaar zitten. De mate van hoeveelheid miRNA wordt dan gedetecteerd in functie van de snelheid van het stijgen van de fluorescentie. Het polymerase kan geen reporter splitsen van een probe indien deze niet gebonden is aan een DNA molecule. Hierdoor kan nietspecifieke amplificatie niet gedetecteerd worden. (zie figuur 12)
24
Figuur 12: Wanneer het DNA-polymerase de reporter tegenkomt, dan zal deze afbreken en zal de quencher de fluorescentie niet meer kunnen onderdrukken. De minor groove binder dient om de TaqMan® MGB probe zo klein te kunnen produceren maar heeft geen invloed op de fluorescentie. (40) P = polymerase, R = reporter, NFQ = nonfluorescent quencher, MGB = minor groove binder
Veel factoren zorgen ervoor dat de concentratie en dus ook de maat van fluorescentie niet voldoende informatie geven over de expressie van het miRNA. In elk staal zit een wisselende hoeveelheid cellen waaruit het miRNA geïsoleerd is. Factoren bij de FNA stalen zijn het aantal puncties en de concentratie van cellen in het punctaat. Er kan namelijk een grote hoeveelheid van een cyste bijvoorbeeld meegekomen zijn. Voor de resectiestukken is de grootte van het resectiestuk en het aantal cellen in het resectiestuk van belang. Daarom wordt vergeleken met de fluorescentie van miRNA’s of snoRNA’s (small nucleolar RNA, helpt waarschijnlijk bij het verkrijgen van de structuur van ribosomaal RNA, transport RNA,… in de nucleolus van de celkern) die in alle weefsels ongeveer tot dezelfde expressie komen. Deze methode
25
geeft wel een idee over de mate van expressie van welbepaalde miRNA’s. Dit wordt normalisatie van de miRNA-expressie genoemd. (40)
3.4.2 Protocol
Figuur 13: Schematische voorstelling van het Multiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assays protocol. (40) a) Synthese van het cDNA Benodigdheden: -
dNTP mix en 10x RT-buffer uit kit laten ontdooien
-
enzym MultiScribe™ Reverse Transcriptase en enzym RNase inhibitor op ijs laten ontdooien
-
primers
-
epjes van 0,2 ml voor de stalen
-
epjes van 0,5 ml voor de mastermix 26
Werkwijze: -
Primerpool maken: steeds ¼ primer verdunnen (van 250 mM naar 62,5 mM) Volgende primers worden gebruikt: 25 µl miR-132, 25 µl miR-181, 25 µl miR-18a, 25 µl miR-196a, 25 µl miR-203, 25 µl miR-204, 25 µl miR-21, 25 µl miR-222, 25 µl RNU24, 25 µl RNU58B, 25 µl RNU43 Droogdampen op 50° C en heroplossen in 100 μl
-
0,2 ml epjes klaarzetten op ijsblok
-
1 μl (10 ng/μl) van het staal + 3 μl water in een nieuw epje doen
-
Mastermix maken: op ijsblok, 16 μl per staal Per staal: o
0,4 μl dNTP mix
o
4 μl MultiScribe™ Reverse Transcriptase
o
2 μl 10x RT-buffer
o
0,25 μl RNase inhibitor enzym
o
5,35 μl water
o
4 μl primerpool
-
Mastermix lichtjes vortexen en afdraaien
-
16 μl mastermix toevoegen aan elk epje en goed op en neer pipetteren
-
Programma MyCycler opstarten: “Multiplex RT” + Block Measurement
b) PCR Benodigdheden: -
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate met barcode (Applied Biosystems, Foster City, USA)
-
Nuclease vrij water (Sigma-Aldrich, Bornem, België)
-
MicroAmp™ Optical Adhesive Film (Applied Biosystems, Foster City, USA)
27
Werkwijze: -
Mastermix maken per miRNA in epje, 7 μl per staal Per staal: o
4 μl TaqMan® 2*(ABI) mix
o
0,2 μl TaqMan® probe
o
2,8 μl nuclease vrij water
-
1 μl cDNA staal per well toevoegen
-
Vortexen en kort afdraaien
-
Pipetteer de mastermix in de MicroAmp™ plaat met barcode en zet er de datum en staalnaam op
-
Kleef een MicroAmp™ Optical Adhesive Film op de plaat
-
Plaats in de qPCR robot en zet het toestel aan
-
Start de SDS 2.1 software en geef aan op welke lokalisatie de platen gezet zijn
-
Start de queue (40)
De metingen met deze Multiplex RT for TaqMan® MicroRNA Assays werden uitgevoerd op de dienst Medische Genetica van het Universitair Ziekenhuis Gent.
28
4 Resultaten 4.1 FNA-stalen Bij 15 patiënten werd RNA geïsoleerd uit een FNA-staal. Stalen FNA 1 tot FNA 13 werden gedaan met de miRNeasy kit®. Stalen FNA 14 en FNA 15 werden gedaan met de mirVana miRNA Isolation Kit®. De beginstappen van de RNA-extractie om een pellet van het staal te verkrijgen, gaven wisselende resultaten. Bij FNA-stalen 2, 3, 8 en 15 was er een duidelijke en vaste pellet. FNA-stalen 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 en 15 hadden een minder duidelijke pellet. Bij stalen 6, 7 en 15 moest er wel 2 keer gecentrifugeerd worden. Staal 7 had dan weliswaar een pellet, maar nog steeds wat debris in het supernatans. Daarom werd het supernatans van FNA-staal 7 opnieuw gecentrifugeerd aan maximale snelheid. De pellet hieruit bekomen werd dan FNA 7* genoemd. Bij FNA-stalen 1 en 4 werd er zelfs geen pellet verkregen na opnieuw centrifugeren. De elutie van FNA-stalen 14 en 15 gebeurde in 2 stappen van telkens 50 μl Elution Solution. Hierdoor werd telkens een A- en een B-staal verkregen. Er werd voor de FNA-stalen ook een cytologische diagnose van de punctie aangevraagd op de dienst pathologie van het Universitair Ziekenhuis Gent. De resultaten van de RNA-extractie staan samengevat in Tabel 1. Er is een duidelijke discrepantie te zien tussen de resultaten van de fotospectrometrie en de NanoDrop®. Aangezien de NanoDrop® nauwkeuriger is, werden de volgende stalen enkel nog gemeten op de NanoDrop®. Niet alle stalen waren door middel van StdSens chips meetbaar op de Experion®. Daarom werden de metingen voor de FNA-stalen herhaald met HighSens chips. Sommige FNA-stalen bleken met een HighSens chip eveneens onmeetbaar te zijn. FNA 14 en FNA 15 werden onmiddellijk op een HighSens chip gemeten. De resultaten van deze tweede meting op een HighSens chip staan in Tabel 2.
29
Staal
APD
Kit
[RNA] in
A260/
[RNA] in
A260/
[RNA] in
RQI
ng/μl
A280
ng/μl
A280
ng/μl
Experion
Experion®
®
spectrofot.
NanoDrop®
FNA 1
T
A
32,2
1,211
3,53
2,10
2,19
NM
FNA 2
T
A
682,0
2,055
661,88
2,04
701,84
7,5
FNA 3
T
A
1 259,0
2,067
1 236,28
2,06
1 535,89
9,5
FNA 4
T
A
51,3
1,321
18,74
2,68
6,38
NM
FNA 5
T
A
21,0
1,000
2,59
3,66
3,47
NM
FNA 6
T
A
130,0
1,860
63,05
2,01
86,35
7,8
FNA 7
GT
A
56,0
1,481
23,91
1,98
30,41
2,7
A
75,6
1,385
/
/
21,33
2,7
FNA 7* FNA 8
T
A
136,0
1,672
108,51
2,01
65,11
3,0
FNA 9
T
A
/
/
14,14
1,68
11,19
3,0
FNA 10
T
A
/
/
23,12
1,87
24,19
3,5
FNA 11
T
A
/
/
4,54
1,42
1,61
NM
FNA 12
T
A
4,2
1,5
4,11
1,31
2,84
NM
FNA 13
T
A
16,8
1,714
18,83
1,85
4,53
NM
FNA 14 A
T
B
/
/
16,29
1,62
/
/
/
/
8,46
1,15
/
/
/
/
2,18
1,56
/
/
/
/
3,08
1,29
/
/
FNA 14 B FNA 15 A
T
FNA 15 B
B
Tabel 1: Resultaten RNA-extractie van de FNA-stalen. De resultaten van de Experion® zijn met een StdSens chip bekomen. T = tumorcellen aanwezig, GT = geen evidentie voor maligniteit, Kit A = miRNeasy kit®, Kit B = mirVana miRNA Isolation Kit®, / = niet gemeten, NM = niet meetbaar
30
[RNA] in ng/μl
RQI Experion®
[RNA] in pg/μl
RQI Experion®
Experion® StdSens
StdSens
Experion® HighSens
HighSens
FNA 1
2,19
NM
14,21
NM
FNA 2
701,84
7,5
768,39
2,2
FNA 3
1 535,89
9,5
511,25
4,5
FNA 4
6,38
NM
219,17
3,3
FNA 5
3,47
NM
786,52
2,7
FNA 6
86,35
7,8
536,38
3,6
FNA 7
30,41
2,7
442,35
2,4
FNA 7*
21,33
2,7
/
/
FNA 8
65,11
3,0
607,00
2,7
FNA 9
11,19
3,0
822,52
2,7
FNA 10
24,19
3,5
766,81
7,3
FNA 11
1,61
NM
586,57
2,7
FNA 12
2,84
NM
NM
NM
FNA 13
4,53
NM
NM
NM
FNA 14 A
/
/
3,70
NM
FNA 14 B
/
/
32,44
NM
FNA 15 A
/
/
15,92
NM
FNA 15 B
/
/
7,11
NM
Staal
Tabel 2: Resultaten van de metingen van de FNA-stalen met de Experion® op StdSens en HighSens chips. FNA 14 en FNA 15 werden onmiddellijk met een HighSens chip gemeten. NM = niet meetbaar, / = niet gemeten
31
FNA 14 en FNA 15 waren met de HighSens chips ook niet te bepalen. De concentratie en de RQI was respectievelijk laag en onmeetbaar. We kunnen uit deze metingen besluiten dat de mirVana miRNA Isolation Kit® waarschijnlijk minder geschikt is om uit een FNA-staal miRNA te isoleren. In deze Tabel 2 valt op dat er soms grote verschillen zijn tussen de meting op de StdSens chip en de meting op de HighSens chip. Dit is heel duidelijk voor de RQI bij FNA 3. De RQI op de StdSens is 9,5 en de RQI op de HighSens daarentegen is 4,5. Eveneens voor de concentratie zijn er grote verschillen tussen HighSens en StdSens.
4.2 Resectiestukken Van 17 patiënten werden retrospectief resectiestukken van pancreasweefsel onderzocht. Er was telkens van dezelfde patiënt een resectiestuk van de tumor (T) en een resectiestuk van het omliggende normale weefsel (N). De RNA-extractie werd voor alle resectiestukken met de miRNeasy kit® uitgevoerd. Opvallend bij de RNA-extractie was dat het weefsel vaak hard en moeilijk te lyseren was. Wanneer dit het geval is, helpt het om eerst het weefsel in de epjes te pletten met een stampertje vooraleer de spuit en naald te gebruiken. Soms lukt het dan nog niet om het weefsel door de blauwe naald te krijgen. Het protocol werd dan gewoon verder gevolgd. De hardheid van het weefsel bleek geen verband te hebben met het feit of het al dan niet tumorweefsel is. De resultaten van de RNA-extractie staan samengevat in Tabel 3. Uit deze tabel blijkt dat de concentraties gemeten op de NanoDrop® veel hoger zijn. Een oorzaak hiervan kan zijn dat er veel meer celmateriaal ter beschikking is in een resectiestuk dan in een FNApunctaat. Hieruit volgt dat er ook meer RNA geïsoleerd kan worden. Daarnaast blijkt ook dat de RQI beter is bij de resectiestukken dan bij de FNA-stalen. Het RNA wordt dus beter bewaard en wordt minder gedegradeerd wanneer het onder de vorm van een resectiestuk uit pancreasweefsel is gehaald dan onder de vorm van een FNA-punctaat.
32
Staal
[RNA] in
A260/
[RNA] in
A260/
[RNA] in ng/μl
RQI
ng/μl
A280
ng/μl
A280
Experion®
Experion®
spectrofot.
NanoDrop®
11039/09 T
1 260,0
2,041
1 284,8
2,07
670,32
1,8
11039/09 N
1 145,0
2,060
1 167,95
2,02
1 010,82
1,0
7672/09 T
757,0
2,004
1 091,54
2,05
1 318,12
6,5
7672/09 N
381,0
1,929
399,64
2,02
242,55
1,8
11986/09 T
126,0
1,837
136,3
2,03
134,84
7,0
11986/09 N
641,0
2,082
1 091,54
2,03
1 067,10
1,0
12177/09 T
111,0
1,740
16,74
1,67
80,25
1,9
12177/09 N
34,6
2,077
11,35
1,48
42,61
7,4
17062/07 T2
12,6
3,000
193,84
2,06
172,94
2,6
17062/07 N2
18,2
1,625
9,35
1,91
7,34
NM
16179/07 T
512,0
2,068
960,39
2,04
1 008,46
8,8
16179/07 N
882,0
2,079
607,24
1,68
1 060,32
3,2
10108/09 T2
2 590,0
2,074
1 982,3
2,04
3 227,18
NM
10108/09 N
459,0
2,050
/
/
3 230,12
NM
12406/07 T
108,0
2,406
107,29
2,06
121,00
8,6
12406/07 N
588,0
2,029
585,61
2,05
568,16
2,3
9156/09 T
631,0
2,078
759,41
2,07
792,18
7,8
9156/09 N
578,0
2,086
565,62
2,10
674,61
2,9
18095/07 T
183,0
2,079
181,92
2,04
183,66
2,0
18095/07 N
2 230,0
2,077
2 292,79
2,09
979,68
1,0
16576/09 T
71,4
1,962
7,57
1,80
55,75
8,2
33
16576/09 N
217,0
1,937
66,47
2,06
57,17
7,2
16646/09 T
739,0
2,023
34,31
1,93
58,64
8,8
16646/09 N
883,0
2,028
75,73
1,91
54,51
6,4
416/10 T
/
/
17,65
1,95
/
4,6
416/10 N
/
/
243,18
2,07
48,63
1,9
6429/10 T
/
/
137,59
2,05
46,70
2,0
6429/10 N
/
/
153,64
2,08
32,05
2,7
6458/10 T
/
/
59,29
2,08
5,16
NM
6458/10 N
/
/
61,12
2,02
40,40
2,4
1438/10 T
/
/
100,18
2,01
74,13
8,5
1438/10 N
/
/
236,80
2,09
21,67
10,0
Tabel 3: Resultaten van de resectiestukken. Voor de resultaten van de Experion® werd gebruik gemaakt van StdSens chips. NM = niet meetbaar, / = niet gemeten
34
4.3 Experion® grafieken Bij elke run met de Experion®, wordt ook een ladder gemaakt. Daarin zitten transcripten met gekende grootte waarmee kan vergeleken worden voor de stalen in dezelfde run. Een ladder van één van de StdSens runs staat in figuur 14. Hetzelfde principe wordt gebruikt bij de HighSens.
Figuur 14: De ladder van een StdSens chip. De eerste piek is een merker. De overige pieken komen overeen met transcripten met gekende grootte. Hiermee kan de Experion®-software vergelijken om de grootte van de fragmenten in de stalen te bepalen.
4.3.1 FNA-stalen Bij veel FNA-stalen is er een grote hoeveelheid RNA-degradatie. Dit was al duidelijk bij de wisselende RQI-waarden. In figuren 15 en 16 staan de grafieken van een weinig en een sterk gedegradeerd staal.
Figuur 15: (staal FNA 3 StdSens) 2 mooie pieken, weinig afbraak, kreeg dan ook een hoge RQIwaarde van 9,5. 35
Figuur 16: (staal FNA 7 StdSens) geen pieken, vooral afbraak te detecteren, had ook een lage RQI van 2,7.
4.3.2 Resectiestukken Deze wisselende hoeveelheid RNA-degradatie is ook bij de resectiestukken aanwezig. Bij figuren 17 en 18 staan de grafieken met een goede en een slechte RQI van stalen van een tumor en bij figuren 19 en 20 staan de grafieken met een goede en een slechte RQI van stalen van normaal weefsel.
Figuur 17: (staal 1438/10 T StdSens) 2 duidelijke pieken, weinig afbraak, hoge RQI van 8,5.
36
Figuur 18: (staal 17062/07 T2 StdSens) 2 subtiele pieken, zeer veel afbraak, ook een zeer lage RQI.
Figuur 19: (staal 16576/09 N StdSens) 2 duidelijke pieken, ook wat afbraak, RQI van 7,2.
Figuur 20: (staal 6429/10 N StdSens) geen pieken, veel afbraak, lage RQI.
De Experion® grafieken van alle FNA-stalen en alle resectiestukken zijn ter beschikking in bijlage (pagina 50).
37
4.4 miRNA-expressie Van 4 stalen werd de miRNA-expressie bepaald. Dit zijn stalen FNA 6, FNA 7, 416/10 N en 416/10 T. De miRNA-expressie werd vergeleken met de expressie van RNU24 en RNU58B. Deze komen bij alle 4 de stalen ongeveer gelijk ter expressie. (zie figuur 21 en 22) RNU43 komt vooral bij 416/10 N tot expressie en in veel mindere mate bij de andere 3 stalen. Hierdoor is RNU43 niet geschikt om de expressie van de miRNA’s hiermee te normaliseren. (zie figuur 23) RNU24, RNU58B en RNU43 zijn 3 snoRNA’s.
RNU24 1,6
1,4
A.U.
1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0 416N
416T
FNA6
FNA7
Figuur 21:De expressie van RNU24
38
RNU58B 1,6 1,4 1,2 A.U.
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 416N
416T
FNA6
FNA7
FNA6
FNA7
Figuur 22: De expressie van RNU58B
RNU43 1,2 1
A.U.
0,8 0,6 0,4 0,2 0 416N
416T
Figuur 23: De expressie van RNU43. Het verschil in expressie is te groot waardoor het niet kan gebruikt worden voor de normalisatie.
39
Hieronder staan de resultaten van de expressie van de verschillende miRNA’s. Uit de APD-verslagen blijkt evenwel dat in FNA 7 geen tumorcellen gevonden zijn.
miR-132 3 2,5
A.U.
2 1,5
1 0,5 0 416/10T
416/10N
FNA6
FNA7
Figuur 24: miR-132
miR-181 2,5
A.U.
2 1,5 1 0,5 0 416/10T
416/10N
FNA6
FNA7
Figuur 25: miR-181
40
A.U.
miR-18a 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 416/10T
416/10N
FNA6
FNA7
FNA6
FNA7
Figuur 26: miR-18a
miR-196a 35 30
A.U.
25 20 15
10 5 0 416/10T
416/10N
Figuur 27: miR-196a
41
A.U.
miR-203 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 416/10T
416/10N
FNA6
FNA7
FNA6
FNA7
Figuur 28: miR-203
miR-204 3 2,5
A.U.
2 1,5 1 0,5 0 416/10T
416/10N
Figuur 29: miR-204
42
miR-21 4 3,5 3 A.U.
2,5 2 1,5 1 0,5 0 416/10T
416/10N
FNA6
FNA7
FNA6
FNA7
Figuur 30: miR-21
A.U.
miR-222 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 416/10T
416/10N
Figuur 31: miR-222
43
Er worden dus wel degelijk miRNA’s teruggevonden in de stalen. In figuur 27 staat de expressie van miR-196a. Daaruit blijkt duidelijk dat miR-196a tot expressie komt in tumorweefsel en niet in normaal weefsel. Over de expressie in de FNA-stalen kunnen geen besluiten genomen worden. De expressie is in beide stalen zeer laag. Bij de andere miRNA’s is het verschil in expressie tussen tumorweefsel en normaal weefsel niet zo duidelijk en eenduidig. Deze berekeningen werden uitgevoerd door doctoraatsstudente Evi Mampaey en doctoraatsstudente Joni Van der Meulen.
44
5 Discussie Pancreaskanker is en blijft één van de dodelijkste kankers. Slechts zeer weinig vooruitgang is in de laatste decennia geboekt op het gebied van overleving. Een belangrijke factor hierin is de late diagnose van deze kanker. Meer dan de helft van de patiënten heeft al metastasen op het ogenblik van diagnose. (3) Ongeveer 95% van deze pancreaskankers zijn ductale adenocarcinoma’s. (8) Een niet altijd eenvoudige anatomopathologische differentiaaldiagnose hiervan is chronische pancreatitis. (6) Klinisch is onderscheid ook moeilijk te maken, net zoals met behulp van bloeduitslagen en beeldvorming. (1, 4, 14, 15) Momenteel wordt meestal via een EUS-FNA celmateriaal bekomen dat vervolgens door een patholoog microscopisch na kleuring beoordeeld wordt. (4, 14, 16-18) Het is uitermate belangrijk voor de behandeling te weten over welk soort tumor het gaat. Niet alle tumoren reageren even goed op een behandeling. (23) Dit onderstreept nogmaals het belang van een goede diagnostiek bij pancreaskanker. Nieuwe merkers zijn hierbij onontbeerlijk geworden. MiRNA’s zouden hierin een belangrijke rol kunnen spelen. Zij hebben reeds bewezen een belangrijke rol te spelen in het ontstaan en onderdrukken van kanker. Ook kunnen zij belangrijke informatie geven over de prognose. Er zijn in de literatuur al een aantal miRNA’s beschreven die hiervoor in aanmerking komen. Dit zijn onder andere miR-132, miR-181, miR-18a, miR-196a, miR-203, miR204, miR-21 en miR-222. (25-27) Het stellen van een diagnose met behulp van deze miRNA’s, maakt echter nieuwe technieken noodzakelijk die het mogelijk maken expressiepatronen te onderzoeken. De celopbrengst bij een FNA is niet zo groot als een resectiestuk. Daarom moet er slechts op lage concentraties van miRNA’s besluiten moeten gemaakt worden. Soms gebeurt het dat er naast een tumor geprikt wordt en er geen tumorcellen onderzocht kunnen worden. Dit wordt duidelijk wanneer er geen pellet kan gevormd worden of wanneer er geen RNA-concentraties gemeten kunnen worden. Ook is het moeilijk te beoordelen hoeveel procent van de cellen in het aspiraat normaal dan wel tumoraal zijn. Bij het onderzoek van de miRNA-expressie zitten de nucleïnezuren van deze 2 celsoorten vermengd. Op het eerste zicht lijken de resultaten van concentratie en RNA-kwaliteit zeer wisselend te zijn. Veel RNA-degradaties en zeer lage concentraties van RNA blijken geen uitzondering te zijn. Dit is zowel voor de FNA-stalen als voor de resectiestukken het geval. De mirVana miRNA Isolation Kit® bleek waarschijnlijk minder geschikt te zijn dan de miRNeasy kit® voor de extractie van miRNA uit FNAstalen. Aangezien de extractie slechts op 2 stalen gebeurde met de mirVana miRNA Isolation Kit®, is 45
het best hier nog geen definitieve conclusies uit te trekken. Daarenboven werden al onderzoeken uitgevoerd op miRNA dat geïsoleerd werd door de mirVana miRNA Isolation Kit® uit FNAcelmateriaal van de pancreas. (30) De invloed van de degradatie en lage concentratie op het feit of expressie goed gemeten kan worden is niet duidelijk. In de literatuur (28, 30) waarin al eerder expressie van miRNA bepaald werd, worden nooit cijfers gegeven over de concentratie of RQI. Enkel wordt beschreven dat in de meeste gevallen wel 18S en 28S pieken gevonden worden. Over hoe groot deze pieken zijn en of deze al dan niet vergezeld zijn van een grote hoeveelheid gedegradeerd RNA wordt niet besproken. Wanneer gekeken wordt naar de expressiepatronen van de miRNA’s blijkt dat ondanks lage concentraties en veel RNA-degradatie toch miRNA geïdentificeerd kan worden. Wel kon geen duidelijk verschil gezien worden voor de meeste miRNA’s tussen expressie bij de tumorstalen en de stalen van normaal weefsel. Enkel voor de expressie van miR-196a werd een verschil gezien tussen het tumorweefsel en het normale weefsel. In normaal weefsel is er namelijk geen expressie van miR-196a en wel in tumorweefsel. (31) Dit verschil in expressie van miR-196a werd ook gezien in eerdere onderzoeken op miRNA dat bekomen was door een FNA uit de pancreas. (30) Om al deze problemen te overwinnen zal in de toekomst nog veel onderzoek moeten gebeuren. Zo zal moeten onderzocht worden hoe het probleem kan opgelost worden om genoeg celmateriaal via de FNA te verkrijgen. Daarnaast dient ook gekeken te worden of de miRNA-expressie van de normale cellen in het aspiraat de miRNA-expressie van de tumorcellen niet teveel maskeert. Eventueel kunnen hiervoor door middel van Laser Capture Microdissectie specifiek tumorcellen geïsoleerd worden uit verse resectiestukken. Enkel het miRNA uit tumorcellen kan dan op deze manier geïsoleerd worden. Het onderzoek naar specifieke miRNA’s die up- of downgereguleerd zijn bij pancreaskanker dient ook verder gezet te worden. Dit zal in onderzoek volgend op deze scriptie gebeuren door het lopen van een Multiplex RT op alle stalen waarbij gezocht wordt naar de expressie van alle gekende miRNA’s.
46
6 Referenties 1.
Kumar P, Clark M. Kumar & Clark Clinical Medicine. 6th ed. Edinburgh: Elsevier Saunders; 2005.
2.
Gray H. Gray's Anatomy of the Human Body. 20th ed1918.
3.
Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. Cancer Statistics, 2009. A Cancer Journal for Clinicians. 2009 July 1, 2009;59(4):225-49.
4.
Li D, Xie K, Wolff R, Abbruzzese JL. Pancreatic cancer. The Lancet. 2004 Mar 27;363(9414):1049-57.
5.
Gudjonsson B. Pancreatic cancer: survival, errors and evidence. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 2009 Dec;21(12):1379-82.
6.
Chen Y, Zheng B, Robbins DH, Lewin DN, Mikhitarian K, Graham A, et al. Accurate discrimination of pancreatic ductal adenocarcinoma and chronic pancreatitis using multimarker expression data and samples obtained by minimally invasive fine needle aspiration. International Journal of Cancer. 2007 Apr 1;120(7):1511-7.
7.
Ducreux M, Boige V, Goéré D, Deutsch E, Ezra P, Elias D, et al. Pancreatic cancer: From pathogenesis to cure. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2007;21(6):9971014.
8.
Hosoda W, Takagi T, Mizuno N, Shimizu Y, Sano T, Yamao K, et al. Diagnostic approach to pancreatic tumors with the specimens of endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration. Pathology International. 2010 May;60(5):358-64.
9.
Raimondi S, Lowenfels AB, Morselli-Labate AM, Maisonneuve P, Pezzilli R. Pancreatic cancer in chronic pancreatitis; aetiology, incidence, and early detection. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology. 2010 Jun;24(3):349-58.
10.
Lowenfels AB, Maisonneuve P, Cavallini G, Ammann RW, Lankisch PG, Andersen JR, et al. Pancreatitis and the Risk of Pancreatic Cancer. New England Journal of Medicine. 1993;328(20):1433-7.
11.
Kloppel G, Adsay NV. Chronic pancreatitis and the differential diagnosis versus pancreatic cancer. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 2009 Mar;133(3):382-7.
12.
Braganza JM, Lee SH, McCloy RF, McMahon MJ. Chronic pancreatitis. The Lancet. 2011;377(9772):1184-97.
13.
Hidalgo M. Pancreatic cancer. New England Journal of Medicine. 2010 Apr 29;362(17):160517.
14.
Takhar AS, Palaniappan P, Dhingsa R, Lobo DN. Recent developments in diagnosis of pancreatic cancer. British Medical Journal. 2004 Sep 18;329(7467):668-73.
15.
Rustgi
AK.
Pancreatic
Cancer:
Novel
Approaches
to
Diagnosis
and
Therapy.
Gastroenterology. 2005;129(4):1344-7. 47
16.
Hartwig W, Schneider L, Diener MK, Bergmann F, Büchler MW, Werner J. Preoperative tissue diagnosis for tumours of the pancreas. British Journal of Surgery. 2009;96(1):5-20.
17.
Gress F, Gottlieb K, Sherman S, Lehman G. Endoscopic Ultrasonography–Guided FineNeedle Aspiration Biopsy of Suspected Pancreatic Cancer. Annals of Internal Medicine. 2001 March 20, 2001;134(6):459-64.
18.
Wilson JL, Kalade A, Prasad S, Cade R, Thomson B, Banting S, et al. Diagnosis of solid pancreatic masses by endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration. Internal Medicine Journal. 2009;39(1):32-7.
19.
Chang KJ, Nguyen P, Erickson RA, Durbin TE, Katz KD. The clinical utility of endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration in the diagnosisand staging of pancreatic carcinoma. Gastrointestinal Endoscopy. 1997;45(5):387-93.
20.
Di Stasi M, Lencioni R, Solmi L, Magnolfi F, Caturelli E, De Sio I, et al. Ultrasound-Guided Fine Needle Biopsy of Pancreatic Masses: Results of a Multicenter Study. American Journal of Gastroenterology. 1998;93(8):1329-33.
21.
Jhala N, Jhala D, Vickers SM, Eltoum I, Batra SK, Manne U, et al. Biomarkers in Diagnosis of Pancreatic Carcinoma in Fine-Needle Aspirates. American Journal of Clinical Pathology. 2006 October 1, 2006;126(4):572-9.
22.
Brugge WR. Endoscopic ultrasound-guided pancreatic fine-needle aspiration: A review. Techniques in Gastrointestinal Endoscopy. 2000;2(3):149-54.
23.
Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, Steinberg SM, Leon LG, Kim YT, et al. Identification of microRNA-21 as a biomarker for chemoresistance and clinical outcome following adjuvant therapy in resectable pancreatic cancer. PLoS One. 2010;5(5):e10630.
24.
Nana-Sinkam SP, Fabbri M, Croce CM. MicroRNAs in cancer: personalizing diagnosis and therapy. Annals of the New York Academy of Sciences. 2010;1210(1):25-33.
25.
Garzon R, Calin GA, Croce CM. MicroRNAs in Cancer. Annual Review of Medicine. 2009;60:167-79.
26.
Rachagani S, Kumar S, Batra SK. MicroRNA in pancreatic cancer: pathological, diagnostic and therapeutic implications. Cancer Letters. 2010 Jun 1;292(1):8-16.
27.
Seux M, Iovanna J, Dagorn JC, Dusetti NJ. MicroRNAs in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma: New Diagnostic and Therapeutic Clues. Pancreatology. 2009;9(1-2):66-72.
28.
Szafranska AE, Davison TS, John J, Cannon T, Sipos B, Maghnouj A, et al. MicroRNA expression alterations are linked to tumorigenesis and non-neoplastic processes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Oncogene. 2007;26(30):4442-52.
29.
Mees ST, Schleicher C, Mardin WA, Senninger N, Colombo-Benkmann M, Haier J. Analyzing miRNAs in Ductal Adenocarcinomas of the Pancreas. Journal of Surgical Research. 2009; Oct 25 [Epub ahead of print].
48
30.
Szafranska AE, Doleshal M, Edmunds HS, Gordon S, Luttges J, Munding JB, et al. Analysis of MicroRNAs in Pancreatic Fine-Needle Aspirates Can Classify Benign and Malignant Tissues. Clinical Chemistry. 2008 October 1, 2008;54(10):1716-24.
31.
Mardin WA, Mees ST. MicroRNAs: novel diagnostic and therapeutic tools for pancreatic ductal adenocarcinoma? Annals of Surgical Oncology. 2009 Nov;16(11):3183-9.
32.
Dillhoff M, Liu J, Frankel W, Croce C, Bloomston M. MicroRNA-21 is overexpressed in pancreatic cancer and a potential predictor of survival. Journal of Gastrointestinal Surgery. 2008 Dec;12(12):2171-6.
33.
miRNeasy
Mini
Handbook.
opgehaald
op
12
april
2011,
van
2011,
van
http://www.qiagen.com/literature/render.aspx?id=23770. 34.
mirVana
miRNA
Isolation
Kit.
opgehaald
op
12
april
http://www.ambion.com/techlib/prot/fm_1560.pdf. 35.
Spectrophotometer.
opgehaald
op
12
april
2011,
van
http://www.biochrom.co.uk/download/152/biochrom-wpa-spectrophotometer-andcolorimeter-product-range-brochure.html. 36.
NanoDrop. opgehaald op 12 april 2011, van http://www.nanodrop.com/Absorbance.aspx.
37.
Experion
toestel.
opgehaald
op
12
april
2011,
van
http://www3.bio-
rad.com/cmc_upload/Literature/84445/Bulletin_3140E.pdf. 38.
StdSens en HighSens chips.
opgehaald op 12 april 2011, van http://www3.bio-
rad.com/cmc_upload/Literature/79148/Bulletin_3170.pdf. 39.
Experion
protocol.
opgehaald
op
12
april
2011,
van
http://www3.bio-
rad.com/cmc_upload/Literature/198853/Bullettin_10004492.pdf. 40.
Multiplex
RT
protocol.
opgehaald
op
12
april
2011,
van
http://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/c ms_039307.pdf.
49
7 Bijlage Hieronder staan de grafieken van de Experion® van alle stalen, te beginnen met de FNA-stalen en daarna de resectiestukken. De FNA-stalen zijn zowel op StdSens chips als op HighSens chips gemeten.
FNA 1: StdSens, zeer lage concentratie, geen pieken (er was ook geen duidelijke pellet)
FNA 1: HighSens
FNA 2: StdSens, 2 mooie pieken, wel wat afbraak in het begin van de grafiek
FNA 2: HighSens
50
FNA 3: StdSens, 2 mooie pieken, weinig afbraak, kreeg dan ook een hoge RQI-waarde van 9,5
FNA 3: HighSens
FNA 4: StdSens, subtiel 2 pieken zichtbaar, lage concentratie, er was slechts een kleine pellet
FNA 4: HighSens
51
FNA 5: StdSens, geen pieken, zeer lage concentratie, er was slechts moeilijk een pellet bekomen
FNA 5: HighSens, hier meer afbraak gedetecteerd, geen pieken
FNA 6: StdSens, 2 mooie pieken, wel wat afbraak, er was nochtans geen duidelijke pellet
FNA 6: HighSens
52
FNA 7: StdSens, eerste pellet: geen pieken, vooral afbraak te detecteren
FNA 7: HighSens
FNA 7x: StdSens, tweede pellet: geen pieken, wel wat afbraak te detecteren (niet op HighSens gemeten)
FNA 8: StdSens, kleine pieken, heel veel afbraak waardoor ook een kleine RQI-waarde van 3,0, er was een grote pellet
53
FNA 8: HighSens
FNA 9: StdSens, geen pieken, wel wat afbraak te vinden
FNA 9: HighSens
FNA 10: StdSens, 2 kleine pieken, wel wat afbraak te vinden
54
FNA 10: HighSens, hier zijn de pieken duidelijker en is er meer afbraak
FNA 11: StdSens, geen pieken, zeer lage concentratie
FNA 11: HighSens, nu wel 2 kleine pieken maar vooral ook afbraak
FNA 12: StdSens, geen pieken, zeer lage concentratie
55
FNA 12: HighSens
FNA 13: StdSens, geen pieken, lage concentratie
FNA 13: HighSens FNA 14, FNA 15: geen meting op StdSens chip gebeurd
A
B
FNA 14 A en B: HighSens, geen pieken, zeer lage concentratie
56
A
B
FNA 15 A en B: HighSens, geen pieken, zeer lage concentratie
11039/09 T: StdSens, geen pieken en dus lage RQI, detectie van zeer veel afbraak
11039/09 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
7672/09 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, ook wat afbraak, hoge concentratie, RQI van 6,5
57
7672/09 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
11986/09 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, wat afbraak, RQI van 7,0
11986/09 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
12177/09 T: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
58
12177/07 N: StdSens, 2 kleine pieken, ook wat afbraak, RQI van 7,4
17062/07 T2: StdSens, 2 subtiele pieken, zeer veel afbraak, ook een zeer lage RQI
17062/07 N2: StdSens, 2 subtiele pieken, zeer lage concentratie
16179/07 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, ook wat afbraak te detecteren, hoge RQI van 8,8
59
16179/07 N: StdSens, 2 niet zo duidelijke pieken, veel afbraak en lage RQI
10108/09 T2: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak, zeer hoge concentratie, niet meetbare RQI
10108/09 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
12406/07 T: StdSens, 2 mooie pieken, wat afbraak, hoge RQI van 8,6
60
12406/07 N: StdSens, geen duidelijke pieken, zeer veel afbraak
9156/09 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, wat afbraak, RQI van 7,8
9156/09 N: StdSens, onduidelijke pieken, zeer veel afbraak
18095/07 T: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
61
18095/07 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak, zeer hoge concentratie
16576/09 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, wat afbraak, RQI van 8,2
16576/09 N: StdSens, 2 duidelijke pieken, wat afbraak, RQI van 7,2
16646/09 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, wat minder afbraak dan de vorige, hoge RQI van 8,8
62
16646/09 N: StdSens, 2 iets kleinere pieken, opnieuw wat meer afbraak, RQI van 6,4
416/10 N: StdSens, geen pieken, zeer veel afbraak
6429/10 T: StdSens, geen pieken, veel afbraak
6429/10 N: StdSens, geen pieken, veel afbraak
63
6458/10 T: StdSens, geen pieken, weinig materiaal
6458/10 N: StdSens, geen pieken, veel afbraak
1438/10 T: StdSens, 2 duidelijke pieken, weinig afbraak, hoge RQI van 8,5
1438/10 N: StdSens, moeilijk te beoordelen, veel afbraak, toch geeft de software een zeer hoge RQI van 10,0
64
