2.4.29. Omega-3-savakban gazdag zsíros olajok…
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.6 - 1
01/2010:20429
2.4.29. OMEGA-3-SAVAKBAN GAZDAG ZSÍROS OLAJOK ZSÍRSAVÖSSZETÉTELE A meghatározás alkalmazható EPS- és DHS-tartalom kvantitatív meghatározására omega-3-savat tartalmazó halolajtermékekben, különböző koncentrációk esetében. A módszer mind trigliceridekre, mind etil-észterekre alkalmazható; az eredményeket trigliceridekben vagy etil-észterekben egyaránt megadhatjuk, az adott esetnek megfelelően. EPS ÉS DHS Gázkromatográfia (2.2.28). A műveleteket a lehető leggyorsabban, bomlást előidéző fénytől védve, oxidálószerek, oxidációt katalizáló szerek (pl. réz, vas) és levegő kizárásával végezzük. A vizsgálandó anyagban az (all-Z)-ejkoza-5,8,11,14,17-pentaénsav (EPS; 20:5 n-3) és az (all-Z)-dokoza-4,7,10,13,16,19-hexaénsav (DHS; 22:6 n-3) metil-, illetve etilésztereit határozzuk meg. Belső standard. R metil-trikozanoát. Vizsgálati oldat (a). A. A vizsgálandó mintának a 2.4.29.–1. táblázatból leolvasható mennyiségét, kb. 70,0 mg belső standarddal együtt, R butil-hidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldjuk. 2.4.29.–1. táblázat EPS + DHS együttes mennyisége megközelítőleg (%)
A bemérendő minta mennyisége (g)
30 – 50
0,4 – 0,5
50 – 70
0,3
70 – 90
0,25
Etil-észterek esetében az így készített oldat további előkészítés nélkül vizsgálható; trigliceridek esetében azonban előbb a B. pont szerinti előkészítés is szükséges. B. Az A. pont szerint készített oldat 2,0 ml-ét kvarccsőbe mérjük és az oldószert R nitrogén lassú áramoltatásával elűzzük. A maradékhoz 1,5 ml-t mérünk R nátrium-hidroxid R metanollal készített oldatából (20 g/l). A légteret
2.4.29. Omega-3-savakban gazdag zsíros olajok…
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.6 - 2
megtöltjük R nitrogénnel, a kémcsövet teflonbevonatú kupakkal szorosan lezárjuk és – miután tartalmát összekevertük – 7 percre vízfürdőre helyezzük. Lehűlés után 2 ml R metanolos bór-triklorid–oldatot adunk az oldathoz, ismét megtöltjük a légteret R nitrogénnel, és a kupakot szorosan visszahelyezzük. Ezután a kémcsövet – miután tartalmát összekevertük – 30 percre vízfürdőre helyezzük, majd 40 – 50 °C-ra lehűtjük, 1 ml R trimetilpentánt adunk hozzá, lezárjuk és legalább 30 másodpercig erőteljesen rázogatjuk, majd késedelem nélkül 5 ml R telített nátrium-klorid–oldatot öntünk hozzá, ismét megtöltjük a légteret R nitrogénnel, és lezárva, legalább 15 másodpercig erőteljesen rázogatjuk. A felső fázist átemeljük egy másik kémcsőbe. A metanolos fázist még egyszer összerázzuk 1 ml R trimetilpentánnal, az egyesített trimetilpentános kivonatokat 2×1 ml R vízzel mossuk, majd R vízmentes nátrium-szulfáttal szárítjuk. Valamennyi mintából 3 oldatot készítünk. Vizsgálati oldat (b). A vizsgálandó minta 0,300 g-ját R butil-hidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldjuk. A továbbiakban az a) vizsgálati oldatra leírtak szerint járunk el. Összehasonlító oldat (a1). kb. 70,0 mg belső standardot és 90,0 mg CRS ejkozapentaénsav-etil-észtert R butil-hidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a2). 60,0 mg CRS dokozahexaénsav-etil-észtert, kb. 70,0 mg belső standardot és 90,0 mg CRS ejkozapentaénsav-etil-észtert R butilhidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldunk. Ha etil-észtereket vizsgálunk, akkor a továbbiakban az a) vizsgálati oldat A. pontja szerint járunk el az a1) és a2) referenciaoldat esetében egyaránt. Trigliceridek vizsgálata esetén az a) vizsgálati oldat B. pontjában leírtak szerint folytatjuk a vizsgálatot, olymódon, hogy minden egyes mintából 3 oldatot készítünk. Összehasonlító oldat (b). R metil-palmitát, R metil-sztearát, R metil-arachinát és R metil-behenát 0,3–0,3 mg-jainak keverékét 10 ml-es mérőlombikban R butilhidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldjuk. Összehasonlító oldat (c). Egy kb. 55,0 mg R dokozahexaénsav-metil-észterből és 5,0 mg R tetrakoz-15-énsav-metil-észterből álló mintát 10 ml-es mérőlombikban R butil-hidroxitoluol R trimetilpentánnal készített oldatával (50 mg/l) 10,0 ml-re oldunk. Oszlop: −
anyaga: kvarc,
−
méretei: l = legalább 25 m, Ø = 0,25 mm,
−
állófázis: kémiailag kötött R makrogol 20000 (filmvastagsága 0,2 μm).
Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hidrogén vagy R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 1 ml/perc;
2.4.29. Omega-3-savakban gazdag zsíros olajok…
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.6 - 3
Mintaáram-elosztási arány: 1:200, vagy mintaáram elosztás nélkül hőmérsékletszabályozással. Ilyenkor a minta-oldatokat injektálás előtt R butilhidroxitoluol R trimetilpentánnal készített, 50 mg/l töménységű oldatával kétszázszorosára kell hígítani. Hőmérséklet:
Oszlop
Idő (perc)
Hőmérséklet (°C)
0–2
170
2 – 25,7
170 → 240
25,7 – 28
240
Injektor
250
Detektor
270
Detektálás: lángionizáció. Injektálás: 2×1 μl. Rendszeralkalmasság: −
a b) összehasonlító oldat kromatogramján a százalékos csúcsterületnek a következő sorrendben kell növekednie: metil-palmitát, metil-sztearát, metil-arachinát, metil-behenát; a metil-palmitát és a metil-behenát csúcsterületei között a százalékos különbség kisebb legyen, mint 2% területegység.
−
csúcsfelbontás: legalább 1,2, a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható dokozahexaénsav-metil-észter és tetrakoz-15-énsav-metil-észter között.
−
az a) vizsgálati oldat kromatogramján a metil-trikozanoátnak, valamint a henejkozapentaénsav metil- ill. etil-észterének (C21:5) megfelelő csúcsok − ha utóbbiak jelen vannak – a b) vizsgálati oldat kromatogramjával összehasonlítva jól különüljenek el egymástól (különben korrekciós faktort kell alkalmazni).
Az EPS és a DHS százalékos mennyiségét – a referenciaanyagokra megadott értékek figyelembevételével – a következő összefüggés alapján számoljuk ki: Ax ⋅
ahol
A3 m1 m x,r 1 ⋅ ⋅ ⋅ ⋅ C ⋅100 m3 A1 Ax,r m 2
2.4.29. Omega-3-savakban gazdag zsíros olajok…
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.6 - 4
m1 =
a belső standard tömege az a) vizsgálati oldatban, milligrammban,
m2 =
a minta tömege az a) vizsgálati oldatban, milligrammban,
mx,3 =
a belső standard tömege az a1) összehasonlító oldatban (EPSmeghatározás), ill. az a2) összehasonlító oldatban (DHS-meghatározás), milligrammban,
mx,3 =
a CRS ejkozapentaénsav-etil-észter, ill. a CRS dokozahexaénsav-etil-észter tömege az a) összehasonlító oldatban, milligrammban,
Ax =
az ejkozapentaénsav-észter, ill. a dokozahexaénsav-észter csúcsterülete az a) vizsgálati oldat kromatogramján,
Ax,r =
az ejkozapentaénsav-észter csúcsterülete az a1) összehasonlító oldat kromatogramján, ill. a dokozahexaénsav-észter csúcsterülete az a2) összehasonlító oldat kromatogramján.
A1 =
a belső standard csúcsterülete az a) vizsgálati oldat kromatogramján,
Ax,3 =
a belső standard csúcsterülete az a) összehasonlító oldat kromatogramján,
C =
konverziós faktor az etil-észterek és a trigliceridek között, etil-észterekre C = 1,00, EPS-re C = 0,954, DHS-re C = 0,957.
ÖSSZES OMEGA-3-SAV Az EPS és a DHS tartalmi meghatározása alapján – a következő összefüggés segítségével és a kromatogramokon megjelenő csúcsokat azonosítva – kiszámoljuk az összes omega-3-sav százalékos mennyiségét:
EPS + DHS +
An −3 ( EPS + DHS ) , AEPS + ADHS
ahol EPS
= az EPS százalékos mennyisége,
DHS
= a DHS százalékos mennyisége,
An-3
= a C18:3 n-3, a C18:4 n-3, a C20:4 n-3, a C21:5 n-3 és a C22:5 n-3 észtereknek megfelelő csúcsterületek összege a b) vizsgálati oldat kromatogramján,
AEPS
= az EPS-észternek megfelelő csúcsterület a b) vizsgálati oldat kromatogramján,
2.4.29. Omega-3-savakban gazdag zsíros olajok…
ADHS
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.6.6 - 5
= a DHS-észternek megfelelő csúcsterület a b) vizsgálati oldat kromatogramján.
