Nukleinsav alapú vizsgálatok a laboratóriumi medicinában Ujfalusi Anikó Laboratóriumi Medicina Intézet
Alapfogalmak DNS: biológiai információt hordozó örökítő anyag RNS: egyszálú polimer, fehérje szintézishez szükséges Gén: a tulajdonságok átörökítéséért felelős legkisebb DNS szakasz, amely fehérjék vagy RNS molekulák szerkezetét határozza meg Genom: egy szervezet teljes genetikai állománya (ember 3x109 bp)
Exom: a genom kódoló része (exonok összessége) Transzkriptom: érett RNS molekulák összessége Kromoszóma (chroma= szín és soma= test)
DNS + hiszton fehérjék + nem-hiszton fehérjék. Csak a sejtosztódás meghatározott fázisában látható fonalszerű képletek,amelyek a sejtmagban helyezkednek el.
Nukleinsav (DNS, RNS) alapú vizsgálatok Cél: Genetikai eredetű betegségek okainak felderítése. Mutációk kimutatása a génállományban.
Kutató laboratórium: genetikai eredet igazolása Diagnosztikai laboratórium: klinikai kép alapján feltételezett diagnózis megerősítése
Alkalmazott technikák (genetikai eltérés méretétől függ) Kromoszóma analízis (citogenetika) DNS, RNS izolálás PCR ( polimerase chain reaction) Szekvenálás (Sanger, újgenerációs) MLPA
RFLP CGH stb.
Citogenetikai laboratórium
Molekuláris genetikai laboratórium
Milyen betegségeket vizsgálnak a genetikai laboratóriumokban? Genetikai betegségek: a genomikus DNS szekvenciájának vagy a génexpressziónak megváltozása, illetve a normális genetikai kód megvalósulását akadályozó endogén vagy exogén hatások okozta betegségek (Oláh É.: Klinikai Genetika, 2015) Genetikai betegség
Genetikai betegség Öröklött Születés előtt (prenatalisan)
Szerzett Születés után (postnatalisan) Testi sejtek mutációja
Veleszületett rendellenesség, betegség (pl. Down szindróma, cisztás fibrózis)
Daganat (pl. leukémia, emlőrák)
Genetikai eltérések/mutációk méretskálája
https://www.jax.org
Citogenetikai laboratórium
A humán citogenetika születése Citogenetikai = citológia (sejt) + genetika 1879-1956 Egymástól eltérő vélemények az ember kromoszómáinak számát és alakját illetően. „Modern” citogenetika 1956-1970
1956 : a humán kromoszómaszám (2n) 46
Albert Levan
Joe Hin Tjio
1960
A Philadelphia kromoszóma (Ph1 ) felfedezése
Peter Nowell és David Hungerford
„ the first page of the first chapter of what is now called personalized medicine” Michale V. Seiden President of FCCC
Sejttenyésztés és kromoszóma preparálás technikájának fejlődése
1973
A t(9;22) transzlokáció felfedezése Janet Rowley Sávtechnikák fejlődése
Szerkezeti kromoszóma aberrációk felismerése
„ I did this at home on my dining room table Because I worked only three days a week. With my sons at school, I had the quiet I needed to concentrate on the chromosomes. The cells had the Ph chromosome, but they all had extra pale material at the end of the long arm of a chromosome 9. Dr. Janet D. Rowley received the Presidential Medal of Freedom in 2009 from President Obama. It could be a translocation!” She received the National Medal of Science from President Bill Clinton.
Citogenetikai vizsgálómódszerek
Hagyományos kromoszóma analízis
multicolor-FISH
I-FISH
mBAND
WCP-FISH
CGH
Array CGH
Citogenetika -kariotipizálás Egy sejt metafázisú kromoszómáinak vizsgálata • • • •
Teljes genom vizsgálata Számbeli és szerkezeti kromoszóma eltérések kimutatása Osztódó (metafázisú) sejteket igényel Korlátozott felbontóképesség (5-10Mb) 46,XX
G-sáv
Citogenetikai vizsgálathoz használt mintatípusok Sejtmaggal rendelkező élő sejteket tartalmazó minta ▪
Na(vagy Li)-heparinnal antikoagulált - perifériás vér: veleszületett eltérések kimutatása - csontvelő: hematológiai megbetegedések
▪ Fibroblasztok bőrbiopsziás mintából ▪ Solid tumor (biopszia)
▪
Prenatalis mintatípusok: - amniocentézis: amnionfolyadék sejtjei (16-18 terhességi hét) - chorionboholy ( 10-14 hét) - cordocentesissel vagy percutan umbilicalis mintavétellel magzati vérminta (>20 hét)
Citogenetikai vizsgálat
G0
G-sávozás
Idiogram
Mikroszkópos kép
46,XY,+21
Szerkezeti kromoszóma eltérések
deléció
transzlokáció
http://www.tokyo-med.ac.jp/genet/index-e.htm
inverzió
duplikáció
inszerció
FISH = molekuláris citogenetika Specifikus DNS szekvenciák meglétének, hiányának, lokalizációjának kimutatása interfázisú vagy metafázisú sejteken fluoreszcens jelölésű próbák alkalmazásával.
• • • • •
Felbontás: ~ 100 kb Osztódó és nem osztódó sejteken is alkalmazható Gyors, szenzitív Genetikai információ molekuláris és celluláris szinten Sokféle mintatípus
Fluoreszcens festékek, mikroszkópia
Multicolor-FISH 24-színű kariotipizálás
• Komplex kromoszóma átrendeződések kimutatása • Marker kromoszómák azonosítása
Multicolor-BAND Szerkezeti kromoszóma átrendeződések azonosítása
Szindrómák laboratóriumi diagnosztikája: Di George szindróma leggyakoribb mikrodeléciós szindróma prevalencia: 1:4-5000 22q11.21 régióban 1.5-3Mb deléciója TBX1 gén haploinszufficienciája Tünetek
Chr 22
- thymusaplasia - szájpadhasadék - hypocalcaemia - aortaív és truncus eltérései Fallot tetralogia, VSD - jellegzetes arckarakter (széles orrgyök, micrognathia) - nyelési és beszéd nehézségek - enyhe mentális retardáció - hypotonia - felnőtt korban pszichiátriai megbetegedések (pl.skizofrénia)
Leukémiák laboratóriumi diagnosztikája AML
Morfológia (FAB 1976) Immunfenotípus Immunhisztokémia
ALL
Genetika (WHO 2016) - diagnosztika - prognosztika - terápia megválasztása, monitorozása
Csontvelő
DNS alapú kariotipizálás – array comparative genomic hybridization (aCGH) - Teljes genomot vizsgál - Genetikai anyag többlet (amplifikáció) vagy hiány (deléció) kimutatása (copy number variations - CNV) - Mutáció kimutatás (Single Nucleotid Polymorphism - SNP)
Affymetrix rendszer
A genetikai eltérések méretskálája
https://www.jax.org
Molekuláris genetikai laboratórium
Molekuláris genetikai laboratórium - vizsgálómódszerek Cél: kisméretű mutációk kimutatása Alkalmazott vizsgálómódszer függ a mutáció méretétől • ismert, egy-két nukleotidot érintő szekvenciaváltozás - RFLP (ha a mutáció hasítási helyet érint) - szekvenálás (gold standard) - allélspecifikus PCR (ARMS) - reverz dot-plot - hidrolízis próbák (FRET) • inszerció, deléció - kapilláris elektroforézis
• egy-két exont érintő deléció, duplikáció - MLPA
1985
PCR - polimeráz láncreakció
Ismert szekvenciájú DNS szakasz megsokszorozása enzimatikus úton. PCR reakcióhoz szükséges: • Hőstabil DNS polimeráz (Taq) • Szekvenciaspecifikus primerek • Nukleotidok (dNTPs) • Templát DNS • Puffer
Kary B. Mullis Nobel díj: 1993
Agarózgélelektroforézis
PCR típusai, alkalmazási területei Előny: óriási sokszorozó képesség. Nagyon kis kiindulási DNS mennyiség is elegendő. 30 ciklus után x109 mennyiségű DNS.
Típusai: • • • • •
in situ PCR (vizsgálandó szövetmintán, in situ zajlik a reakció) RT-PCR (reverz transzkriptáz – PCR): egyszálú RNS átírása kettős szálú cDNS-re Q-PCR (kvantitatív – „real time”): PCR termékek mennyiségi meghatározása Multiplex PCR Hot start-, Inverse-, Long-, Nested-PCR
Alkalmazás -
Betegség specifikus mutációk kimutatása (pl. monogénes betegségek) Fertőző ágensek (vírusok, baktériumok) kimutatása Igazságügyi orvostan – személyek azonosítása Rokoni kapcsolatok megállapítása (pl. apasági teszt) Génexpresszió vizsgálatok Populációgenetika Gyógyszerkutatás
1977
Szekvenálás - Sanger
= nukleotid szekvencia meghatározás Gold standard Frederick Sanger
ABI310
ABI3500
2005 Szekvenálás – NGS (next generation sequencing)
http://sitn.hms.harvard.edu/flash/2017/strength-numbers-genetic-sequencing-large-populations-shaping-future-medicine/
