3. gyakorlat: nukleinsav-tisztítás, polimeráz láncreakció
A vírus genetikai anyagának vizsgálata (direkt víruskimutatási módszer) biztosítja a legrészletesebb és legspecifikusabb információkat a kimutatott kórokozóról. A nukleinsav vizsgálata számos módszerrel lehetséges, a gyakorlaton a (hagyományos) polimeráz láncreakciót (polymerase chain reaction [PCR]) mutatjuk be.
A PCR egy vagy néhány DNS-molekula mesterséges megsokszorozására (amplifikációjára) használható módszer, mellyel a DNS meghatározott szakaszáról milliós nagyságrendű másolat készíthető. A PCR használata a virológiai diagnosztikában számos előnnyel és hátránnyal is jár.
Előnyök: - gyors eljárás, 24-48 óra alatt eredményt biztosít, - specifikus: a „specifikus” primerek használatával a mintában levő vírus azonosítható, - érzékeny: kis mennyiségű DNS is kimutatható, akár károsodott (autolizált) mintából, - a genom vizsgálatával részletes adatok nyerhetők a vírusról, melyek felhasználhatók a
vírus
azonosításában,
rendszertani
besorolásában,
vírus-változatok
összehasonlításában, vírusok evolúciójának vizsgálatában, molekuláris járványtani vizsgálatokban… stb.
Hátrányok: -
különleges eszközöket, berendezéseket igényel
-
célzott vizsgálat (Csak azokat a vírusokat tudjuk kimutatni a mintából, amelyek detektálására alkalmas primereket használunk a reakcióban)
-
érzékeny: a kontamináció elkerülésére különös gondot kell fordítani!
-
fals negatív eredményeket kaphatunk (pl. a minta károsodott nukleinsavat tartalmaz, vagy inhibitorok vannak a mintában, mutáció lépett fel a vírusban: ezek mind befolyásolják a primerek tapadását)
-
fals pozitív eredményt kaphatunk (a primerek nem a megfelelő szakaszt erősítették fel; ezért az eredménynek önmagában nincs diagnosztikai értéke, csak kiegészítő vizsgálatként használható)
A PCR-vizsgálatban a mintából kivont, tisztított nukleinsavat (NS) használjuk.
1. Nukleinsav-tisztítás (kivonás) - A minta proteináz K-val történő emésztése után a virális nukleinsav kivonásához speciális szűrőket, géleket vagy gyöngyöket is használhatunk, melyek kereskedelmi forgalomban, „kitekben” megvásárolhatók. Bár ez az eljárás jelentősen több műanyag-hulladékkal jár, mégis gyors és egyszerű, a DNS és RNS elkülönítetten vonható ki a mintából, illetve lehetőség van csak vírus-nukleinsav kivonására.
A kromatográfiás eljárás általános leírása: A sejtek és vírus-részecskék fehérjéinek emésztéséhez proteináz K-t keverünk a vírusszuszpenzióhoz. Rövid inkubációs idő után a nukleinsavat tömény etanol hozzáadásával kicsapjuk, és a keveréket egy silica-filtert tartalmazó csőbe mérjük. Az ezt követő centrifugálás során a folyadék szűrőn való áthaladása során a vírus-nukleinsav specifikusan kötődik a filterhez. A szűrőn mosófolyadékot centrifugálunk át, mellyel a PCR-t esetlegesen akadályozó, emésztett fehérje-molekulákat, sókat, lipideket távolítjuk el. Az utolsó lépésben egy speciális, DNáz- és RNáz-mentes ún. „eluáló” pufferrel a filterről lemossuk a kötődött nukleinsavat. Az így előállított NS-szuszpenzió a PCR-ben közvetlenül felhasználható, illetve felhasználásig vagy a vizsgálatot követően -80 °C-on tárolható.
A NS-tisztítás lépései
DNS izolálás szövettenyészet-felülúszóból 1. Egy Eppendorf csőbe mérjünk 20 µl Proteináz K enzimet. 2. Mérjünk hozzá 200 µl szövettenyészet-felülúszót. 3. Adjunk az elegyhez 200 µl AL puffert. Néhányszori átfordítással keverjük össze a csőben levő elegyet. 4. Inkubáljuk szobahőmérsékleten 5 percig. 5. Adjunk 200 µl 100%-os etanolt az elegyhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 6. Mérjük a csőben levő elegyet (620 µl) a szilika-oszlopot tartalmazó centrifuga csőbe. 7. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 8. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 9. Mérjünk 500 µl AW1-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 10. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 11. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 12. Mérjünk 500 µl AW2-es mosópuffert a centrifuga csőbe.
13. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 14. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy tiszta Eppendorf csőbe. 15. Mérjünk 200 µl AE puffert a centrifuga csőben levő szilika-filterre. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. Az Eppendorf csőben összegyűlt DNS-t tartalmazó elegyet használjuk a PCR reakcióban. RNS izolálás szövettenyészet felülúszóból 1. Mérjünk 140 µl szövettenyészet-felülúszót az Eppendorf csőben levő 560µl AVL pufferhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 2. Inkubáljuk az elegyet szobahőmérsékleten 5 percig. 3. Adjunk 560 µl 100%-os etanolt az elegyhez, és néhányszori átfordítással keverjük össze a cső tartalmát. 4. Mérjünk 630 µl folyadékot a szilika-oszlopot tartalmazó centrifuga csőbe. 5. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 6. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 7. Ismételjük meg a 4-6. lépéseket. 8. Mérjünk 500 µl AW1-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 9. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 10. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy új gyűjtőcsőbe. 11. Mérjünk 500 µl AW2-es mosópuffert a centrifuga csőbe. 12. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. 13. Dobjuk el a használt gyűjtőcsövet, és a centrifuga csövet helyezzük egy tiszta Eppendorf csőbe. 14. Mérjünk 60 µl AVE puffert a centrifuga csőben levő szilika-filterre. 15. Centrifugáljunk maximális fordulatszámon 1 percig. Az Eppendorf csőben összegyűlt RNS-t tartalmazó elegyet használjuk az RT-PCR reakcióban.
2. PCR A PCR a reakcióelegy hőmérsékletének ciklikus változásán alapul. A reakció különböző hőmérsékleten lezajló lépései során a DNS két szála szétválik, és a reakcióelegyhez adott polimeráz enzim a nukleinsav egy meghatározott szakaszáról másolatot készít. A reakció későbbi szakaszában a további másolatok készítéséhez az újonnan keletkezett DNS-darabok is templátként szolgálnak (láncreakció). Optimálsi körülmények között, amennyiben korlátlan mennyiségű szubsztrát és reagens áll az enzim rendelkezésére, minden ciklusban megduplázódik a DNS mennyisége a reakcióelegyben, mely végeredményben a DNS mennyiségének exponenciális növekedését jelenti. Az eljárás igen érzékeny, segítségével kis mennyiségű DNS is kimutatható a mintából.
A PCR fajlagossága (specifikussága) a reakcióelegyhez adott ún. „primereken” múlik. A primerek rövid, 18-25 nukleotidból álló szimpla szálú nukleinsav darabok, melyek a kimutatni kívánt vírus genomjának meghatározott részén egy 18-25 nukleotid hosszú szakasszal komplementerek. A primer-tervezéshez számítógépes programokat használunk, mely a
génbanki adatbázisból kiválasztott vírus-nukleinsav szekvenciáját végigelemezve bizonyos paraméterek alapján (pl. GC-arány, szekvencia) primerként alkalmazható rövid szakaszokat választ ki. Mivel a primereket a kimutatni kívánt vírus genomszekvenciája alapján tervezzük, egy adott PCR-reakcióban csak azt a vírust tudjuk kimutatni, amelynek 18-25 nt hosszú genom-szakaszaival a primer komplementer. A primer a polimeráz-enzim munkáját segíti: a primer tapadási helye jelöli ki a DNS-másolás kezdőpontját a genomon.
A PCR-reakcióelegy („master mix”) komponensei: -
templát DNS: a vírus DNS-e a mintában, melyet amplifikálni kívánunk.
-
Primerpár, melynek egyik tagja a kódoló, másik tagja a komplementer DNS-szál 18-25 nt hosszú szakaszával megegyezik.
-
Hő rezisztens polimeráz enzim , melynek optimális működési hőmérséklete kb. 70 °C. RNS PCR esetén a reakcióelegyhez adott enzim-keverék a DNSpolimerázon kívül az RNS DNS-sé alakításához szükséges reverz transzkriptázt is tartalmazza.
-
Deoxinukleoid trifoszfátok (dNTP-mix): az új DNS-molekulák „építőköveiként” szolgáló nukleotidok keveréke.
-
Puffer, mely összetétele révén az enzim működését segíti és stabilitását szolgálja
-
DNáz- és RNáz-mentes víz
-
RNáz PCR esetén a reakcióelegyhez RNáz inhibitort is adunk, mely az esetlegesen a mintába / reakcióelegybe kerülő RNS-bontó enzimeket inaktiválja.
A reakcióelegyet 10–200 µl térfogatú, vékonyfalú műanyag csövekbe adagoljuk (0.2–0.5 ml / cső), melyeket speciális készülékbe (PCR gép, thermocycler) helyezünk. A gép meghatározott időtartamokra, előre beprogramozott sorrendben a reakció egyes lépéseiben szükséges hőmérsékletre melegíti vagy hűti az elegyet.
PCR-reakcióelegy (master mix) pontos összetétele (a számokat nem kell megtanulni!) DNS-vírusokhoz Polimeráz láncreakció (PCR) 2× × (µl)
Master-Mix (∑=25µl/reakció) 1× (µl) 14.5
29
5× ×Puffer
5
10
dNTPs (10 nM)
1
2
Primer F+R (40 pmol/µl)
1
2
Taq polimeráz
1
2
Templát DNS
2.5
2.5 (minta) / 2.5 (K+)
H2 O
Primerek: - Equine herpesvírus 1:
EHV1_1f – EHV1_2r
- Canine parvovírus: CPV_1f – CPV_2r - Aujeszky-betegség vírus:
PHV1_1f – PHV1_2r
RNS-vírusokhoz: Reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT-PCR)
1× (µl)
2× × (µl)
13,5
27
5× ×Puffer (RN-áz In
5
10
dNTPs (10 nM)
1
2
Primer F+R (50 pmol/µl)
1
2
RN-áz inhibitor
1
2
Enzim-mix
1
2
2.5
2.5 (minta) / 2.5 (K+)
Master-Mix (∑=25µl/reakció) H2 O
Templát RNS
Primerek: - Parainfluenza 3:
PI3_1f – PI3_2r
- Baromfipestis:
NDV_1f – NDV_2r
- Madárinfluenza:
AIV_1f – AIV_2r
A reakcióban a mintákat tartalmazó csövek mellett kontrollokat is alkalmazunk, melyek a vizsgálat megbízhatóságát igazolják. A pozitív kontroll csőbe templátként a vizsgálni kívánt vírusra korábban pozitívnak talált mintából származó nukleinsavat adunk. A pozitív kontrollal a reakció körülményeinek megfelelőségét teszteljük: amennyiben a pozitív kontrollt az eredmény ellenőrzésekor negatívnak találjuk, az hibát jelez. Ebben az esetben a reakciót meg kell ismételni, a minták eredményeit nem szabad valódi eredménynek tekinteni. A pozitív kontrollt (amennyiben pozitív) a mintákból előállított PCR-termékek (amplikonok) azonosítására is használhatjuk: a reakció eredményének ellenőrzésekor az agarózgélelektroforézis végén a mintákban előállított amplikonok méretét a pozitív kontrollban képződött PCR-termékek méretéhez hasonlítjuk. Amennyiben ezek megegyező méretűek (mivel ugyanazokat a specifikus primereket használtuk a minta és a kontroll esetében is), biztosak lehetünk abban, hogy a pozitív kontrollal megegyező (azaz a vizsgálni kívánt) vírust mutattuk ki a mintában. Ha a minta és a pozitív kontroll amplikonja eltérő méretű termék, a minta nem tartalmazza a vizsgálni kívánt, illetve pozitív kontrollal megegyező vírust.
Annak biztosítására, hogy a pozitív kontroll cső és a minta-cső (a templát nukleinsavon kívül) ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazza, 2 adagnyi reakcióelegyet keverünk össze egy csőben, majd a kétadagnyi elegyet a templát NS hozzáadása előtt két csőbe szétosztjuk, az egyikhez a mintából izolált, a másikhoz a pozitív kontroll nukleinsavat adjuk.
A PCR folyamata
A polimeráz láncreakció általában 20-40-szer ismételt, rendszerint 3, különböző hőmérsékleten lezajló lépésből összetevődő ciklusból áll. Az első ciklust egy magas hőmérsékleten (94–96 °C) 1–15 percig tartó bevezető lépés előzi meg, melyre a reakcióelegyhez adott DNS-polimeráz aktiválásához van szükség.
A tulajdonképpeni láncreakció (ciklusok) 3, ismétlődő lépései: 1. Denaturáció: 94–98 °C-on, 20–60 mp-ig, a hidrogén-hidak felbontásával a két DNS-szál szétválását eredményezi.
2. Az annealing (primer-kötődés) - 50–65 °C (a primerek tulajdonságaitól függ), 20–60 mp során
a
primerek
komplementer
a
DNS-szálak
szakaszaihoz
velük
tapadnak
(hidrogénkötések alakulnak ki köztük). 3. Extenzió: a reakcióban használt DNS polimeráz optimális hőmérsékletén (75 –80 °C; Taq-polimeráz:
72
°C)
játszódik
le.
A
polimeráz enzim a primer-tapadással kijelölt DNS-pozícióban megkezdi az eredeti DNS szál másolását, azaz egy komplementer szál építését. A lépés időtartama az amplifikálni kívánt DNSszakasz hosszától függ: optimális esetben az enzim percenként 1000 nt beépítésére képes.
Az utolsó ciklust követő lépésben (70–74 °C, 5–15 percig) lehetőséget adunk arra, hogy az enzim befejezze a megkezdett DNS-szálak felépítését, majd 4 °C-ra hűti, és ezen a hőmérsékleten tárolja a reakcióelegyet, amíg a csöveket ki nem vesszük a gépből.
A gyakorlaton használt PCR program DNS vírusok kimutatásához: PCR
Lépés
Hőmérséklet
Időtartam
Ciklus száma
95 °C
5 perc
1×
94 °C
40 másodperc
55 °C
50 másodperc
Extenzió
72 °C
1 perc
Végső extenzió
72 °C
7 perc
1×
Tárolás
4 °C
∞
1×
program Polimeráz aktiválása DNS-szálak szétválasztása Polimeráz láncreakció
Primerek
40×
kötődése
RNS vírusok vizsgálata esetében reverz transzkripciós polimeráz láncreakciót (RT-PCR) használunk. Ez a reakcióelegy összetételén kívül a reakció első lépésében különbözik a DNS
PCR-től: az 50 °C-on 30 percig tartó reverz transzkripció során a reverz transzkriptáz enzim a minta RNS-ét DNS-sé írja át. Ez a DNS szolgál templátként a következő (bevezető) lépéssel kezdődő, a DNS PCR-rel a továbbiakban megegyező reakcióban.
A gyakorlaton alkalmazott RT-PCR lépései:
RT-PCR
Lépés
Hőmérséklet
Időtartam
Ciklus száma
RT
50 °C
30 perc
1×
RTáz
95 °C
15 perc
1×
94 °C
40 másodperc
55 °C
50 másodperc
Extenzió
72 °C
1 perc
Végső extenzió
72 °C
7 perc
1×
Tárolás
4 °C
∞
1×
program Reverz transzkripció
denaturálása DNS-szálak szétválasztása Primerek Polimeráz láncreakció
40×
kötődése
A PCR eredményének ellenőrzésére a legegyszerűbb módszer az agarózgél-elektroforézis, mely a 4. gyakorlat egyik témája lesz.
