Nozokomiális fertõzéseket okozó multirezisztens baktériumok mikrobiológiai jellemzõi

Nozokomiális fertõzéseket okozó multirezisztens baktériumok mikrobiológiai jellemzõi Doktori értekezés

Dr. Kristóf Katalin

Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Interdiszciplináris Doktori Iskola 8/3 program: Mikroorganizmusok és anyagaik hatásának molekuláris, celluláris és organizmus szintû vizsgálata

Programvezetõ: Prof. Dr. Nagy Károly egyetemi tanár, Ph.D. Témavezetõ: Dr. Szabó Dóra egyetemi adjunktus, Ph.D. Hivatalos bírálók: Prof. Dr. Ludwig Endre egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Szabó Judit egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Pajor Attila egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Nagy Erzsébet egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Prof. Dr. Machay Tamás egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc.

Budapest 2010

TARTALOMJEGYZÉK

1. Rövidítések jegyzéke ……………………….………………………………………………4 2. Táblázatok, ábrák és képek jegyzéke ……………………………………………………….6 3. Bevezetés …………………………………………………………………………………...8 3.1. A nozokomiális fertõzések …...………………………………………………………...…8 3.1.1. Definíció ..……………………………………………………………………….8 3.1.2. Idõfaktor ………………………………………………………………………...8 3.1.3. Patogenezis ……………………………………………………………………...9 3.1.4. Prediszponáló tényezõk …………………………………………………………9 3.1.5.Klinikai megjelenési formák …………………………………………………...10 3.1.6. Epidemiológia …………………………………………………………………10 3.1.6.1. Nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája ………………………...10 3.1.6.2. A leggyakoribb nozokomiális fertõzések epidemiológiája .…………………12 3.2. A mikrobiológiai laboratórium szerepe a nozokomiális fertõzésekben …………………15 3.2.1. Kórokozó identifikálása és korrekt antimikróbás érzékenységének meghatározása .……………………………………………………………………….15 3.2.2. Infekciókontrollban való részvétel ……………………………….……………16 3.3. Nozokomiális fertõzések a neonatális intenzív centrumokban ……………………….…17 3.3.1. Általános epidemiológia ……………………..………….………………..……17 3.3.2. Diagnosztizálás nehézségei ……………………………………………………18 3.3.3. Rizikótényezõk ……………….……….………….……………………………18 3.3.4. Kórokozó mikróbák spektruma …………..……………………………………19 3.3.5. Mikrobiológiai diagnosztika szerepe a neonatális fertõzésekben …..…………20 3.4. Mikroorganizmusok jelentõsége a nozokomiális fertõzésekben …………..……………21 3.4.1. Gram-pozitív baktériumok ……………………………………….……………21 3.4.1.1. Meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus ………………………….…….22 3.4.1.2. Koaguláz-negatív staphylococcusok …………………………..…………….23 3.4.1.2.1. Staphylococcus haemolyticus …………………………………………..….23 3.4.2. Gram-negatív baktériumok …………………………...…………………….…24 3.4.2.1. Klebsiella speciesek …………………………………………………………24 3.4.2.2. Enterobacter speciesek ……………………………………..……………….25 3.4.2.3. Pseudomonas aeruginosa …………………………………………………...25 3.4.2.4. Acinetobacter baumanii …………………………………..…………………25 1

3.4.2.5. Stenotrophomonas maltophilia …………………..………………………….26 3.5. Fontosabb rezisztencia mechanizmusok a nozokomiális kórokozók körében …………..28 3.5.1. Meticillin rezisztencia …………………………………………………………28 3.5.2. Glikopeptid rezisztencia ……………………………………………………….29 3.5.3. Kiterjedt spektrumú -laktamáz termelés (ESBL) ...…………………………..30 3.5.4. Karbapenem rezisztencia ………………………………………………………32 3.5.5. Kinolon rezisztencia …………………………………………………………...33 4. Célkitûzések ……………………………………………………………………………….34 5. Módszerek …………………………………………………………………………………36 5.1. Baktériumtörzsek azonosítása, tárolása ………………………………………………....36 5.2. Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok …………………………………………………36 5.2.1. Korondiffúzióval végzett érzékenységi vizsgálatok …………………………..36 5.2.2 Minimális gátlókoncentráció (MIC) meghatározása …………………………...37 5.3. Speciális rezisztenciamechanizmusok vizsgálata fenotípusos módszerekkel …………...38 5.4. Antibiotikum rezisztencia mintázatok megállapítása ……………………………………41 5.5. A vizsgált törzsek genotípusos jellemzése ………………………………………………42 5.5.1. PCR amplifikálás és szekvenálás ……………………………………………...42 5.5.2. Pulzáló mezejû gélelektroforézis analízis ………………….………………….44 5.5.3. Plazmid vizsgálat ………………………………………………………………45 5.5.4. Analitikai izoelektromos fókuszálás …………………………………………..46 5.6. A vizsgált törzsek klinikai hátterének elemzése ………………………………………...46 5.7. Statisztikai elemzés ……………………………………………………………………...49 6. Eredmények ……………………………………………………………………………….50 6.1. Egyes nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája ……………………………...50 6.2. Staphylococcus aureus törzsek ………………………………..………………………...55 6.3. Staphylococcus haemolyticus törzsek …………………………………………………...59 6.4. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek ………………………………………………...……..66 6.5. Metallo- -laktamáz termelõ Klebsiella törzsek …...……………………..……………..71 6.6. Kinolon rezisztencia vizsgálatok ………………………………………….…………….74 6.7. Stenotrophomonas maltophilia törzsek …………………..……………………………..76 7. Megbeszélés ………………………………………………………………………………79 7.1. Egyes nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája ……………………………..79 7.2. Staphylococcus aureus törzsek ………………………………..……………………… 82

2

7.3. Staphylococcus haemolyticus törzsek …………………..……………………………….85 7.4. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek ……………………………………………………….87 7.5. Metallo- -laktamáz termelõ Klebsiella törzsek ……..……………………….………….90 7.6. Kinolon rezisztencia vizsgálatok ….…………………………………………………….93 7.7. Stenotrophomonas maltophilia törzsek ………………..………………………………..94 8. Következtetések …………………………………………………………………………...98 9. Összefoglalás …………………………………………………………………………….100 9. Summary …………………………………………………………………………………101 10. Irodalomjegyzék …………………………….…………………………………………..102 11. Saját publikációk jegyzéke ……...………………………………………………………126 12. Köszönetnyilvánítás

3

1. Rövidítések jegyzéke AP-PCR : arbitraly primed - polymerase chain reaction AUC : area under curve : görbe alatti terület BHI : brain heart infusion BSAC : British Society for Antimicrobial Chemotherapy BSI : blood stream infection : véráramfertõzés CA-MRSA : community aquired- methicillin resistant Staphylococcus aureus CDC : Centers of Disease Control and Prevention CFU : colony forming unit CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute CNS : coagulase-negative Staphylococci : koaguláz-negatív staphylococcusok DNS : dezoxiribonukleinsav EARSS : European Antimicrobial Resistance Surveillance System EDTA : etilén-diamin-tetraecetsav ELBW: extreme low birth weight: különösen alacsony születési súlyú EOS : early onset sepsis : korai kezdetû szepszis ESBL : extended spectrum -lactamase : kiterjedt spektrumú ß-laktamáz ESGNI : European Study Group on Nosocomial Infections EUCAST : European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing GBS : group B Streptococcus: B-csoportú Streptococcus GISA: glycopeptide-intermediate sensitive S. aureus ITO: intenzív osztály KPC : Klebsiella pneumoniae carbapenemase LA : Luria agar LB : Luria broth : Luria leves LOS : late onset sepsis : késõi kezdetû szepszis MBL : metallo-ß-laktamáz MDR : multidrug-rezisztens MH : Mueller-Hinton MIC : minimális gátlókoncentráció MLST : multi locus sequence typing MRSA : meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus

4

MSCRAMM : microbial surface components recognising adhesive matrix molecules MSSA : meticillin szenzitív Staphylococcus aureus NCCLS : National Committee for Clinical Laboratory Standards NHSN: National Healthcare Safety Network NICU: neonatale intensive care unit: neonatális intenzív centrum NNIS: National Nosocomial Infections Surveillance NNSR : Nemzeti Nosocomialis Surveillance Rendszer OEK : Országos Epidemiológiai Központ PAP : populáció analízis profil pI : izoelektromos pont PIA : polysaccharid intercellularis adhaesin PIC : perinatale intensive centrum: perinatális intenzív centrum PCR : polymerase chain reaction: polimeráz láncreakció PFGE : pulsed field gel electrophoresis : pulzáló mezejû gélelektroforézis RAPD : random amplified polymorphic DNA assay RFLP : restriction fragment lenght polymorphism RNS : ribonukleinsav SE : Semmelweis Egyetem SNP : single nucleoid polymorphism VISA : vancomycin-intermediate sensitive Staphylococcus aureus VLBW : very low birth weight : nagyon alacsony születési súlyú VRE : vancomycin rezisztens Enterococcus

5

2. Táblázatok, ábrák és képek jegyzéke 1. Táblázat. 1. ß-laktamáz enzimek fõbb csoportjai a különbözõ besorolási sémák, preferált szubsztrátok és specifikus gátlószerekkel való gátolhatóságuk alapján ……………….…….31 2. Táblázat. A vizsgált baktériumok speciális rezisztencia tulajdonságai genetikai hátterének vizsgálatakor alkalmazott primerek szekvenciái és a várható PCR termékek mérete ……….43 3. Táblázat. Véráramfertõzésekben izolált mikróbák gyakorisága százalékban európai (SENTRY, ESGNI) és hazai (OEK, SE) adatok alapján .……………………………………50 4. Táblázat. Késõi neonatális szepszisek a Semmelweis Egyetemen 2001-2007 ……………52 5. Táblázat. Laboratóriumunkban izolált multirezisztens kórokozók százalékos elõfordulási gyakorisága az összes adott izolált baktériumfaj függvényében ……………………………..53 6. Táblázat Húgyúti patogének eloszlása osztályok szerint ……………………………….....54 7. Táblázat. Az osztrák (AU), magyar (HU) és macedón (MA) MRSA törzsek MIC50, MIC90 értékei és MIC tartományai antistaphylococcalis szerek esetében …………………………..56 8. Táblázat. Az osztrák (AU), magyar (HU) és macedón (MA) MSSA törzsek MIC50, MIC90 értékei és MIC tartományai antistaphylococcalis szerek esetében …………………………..56 9. Táblázat. Staphylococcus aureus izolátumok eloszlása egy épületen belüli osztályok szerint ………...........................................................................................................................58 10. Táblázat. Staphylococcus aureusok elõfordulása osztályok szerint, az izolátumok számának csökkenõ sorrendjében ……………………………………………………………59 11. Táblázat. A véráram fertõzésekhez köthetõ patogének eloszlása a Semmelweis Egyetem klinikáin kezelt betegek esetében 2001. január és 2008. december között …………………..60 12. Táblázat. A Staphylococcus haemolyticus incidenciája a bakterémiás epizódokat okozó izolátumok között, osztályok szerint, 2001-2008. években ………………….………………60 13. Táblázat. Az antistaphylococcalis szerekkel szembeni rezisztencia prevalenciája az invazív Staphylococcus haemolyticus törzsekben ……………...…………………………….62 14. Táblázat. A Staphylococcus haemolyticus törzsek fõbb antibiotikum rezisztencia mintázatai ………………………………………………………………………………….....63 15. Táblázat. Az ESBL-termelõ Klebsiella oxytoca (ESBL-KO) és Klebsiella pneumoniae (ESBL-KP) törzsek által okozott fertõzések rizikófaktorainak összehasonlítása…………….67 16. Táblázat. A nem ESBL-termelõ Klebsiella oxytoca (nem ESBL KO) és Klebsiella pneumoniae

(nem

ESBL

KP)

törzsek

által

okozott

fertõzések

rizikófaktorainak

összehasonlítása………………………………………………………………………………67 17. Táblázat. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek antibiotikum érzékenysége ………………...69

6

18. Táblázat. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek jellemzése ………………………………….68 19. Táblázat. A K. pneumoniae KP3686, K. oxytoca KO5294/9, E. coli DH 5 transzformált E. coli DH 5

és

törzsek jellemzõi ……………………………………………..73

20. Táblázat. A qnr-pozitív törzsek által termelt -laktamáz enzimek jellemzõi és kinolon rezisztencia MIC értékei ……………………………………………………………………..76 21. Táblázat. A vizsgált Stenotrophomonas maltophilia törzsek adatai ……………………..77 22. Táblázat. Stenotrophomonas maltophilia törzsek korongdiffúziós és mikrodilúciós vizsgálattal nyert vizsgálati eredményei (24 és 48 órára) ……………………………………78

1. Ábra. Véráramfertõzésbõl izolált Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, sarjadzó gombák elõfordulási gyakoriságának dinamizmusa 2001-2009 során saját laboratóriumunk adatai alapján …………………………………………………………………………………51 2. Ábra. Véráramfertõzésekbõl leggyakrabban izolált mikróbák évenkénti változása saját laboratóriumunk adatai alapján (2001-2009) …………………………………………...……51 3. Ábra. Nozokomiális húgyúti fertõzésekbõl izolált E.coli antibiotikum érzékenysége az ellátó osztály függvényében ……………………………………………………………….....54 4. Ábra. A Staphylococcus haemolyticus törzsek kumulatív érzékenység/rezisztencia aránya glikopeptidekre ……………………………………………………………………………….63 5. Ábra. A vizsgált Staphylococcus haemolyticus törzsek dendrogramja ……………….…...65 6. Ábra. Az ESBL-termelõ Klebsiella izolátumok genotípusainak eloszlása ………………..70

1. Kép. ESBL-termelés fenotípusos szûrése korong diffúziós módszerrel …………………..38 2. Kép. MBL-termelés konfirmálása imipenem/imipenem+EDTA és meropenem/meropenem + EDTA korongokkal az általunk izolált K. pneumoniae KP3686 törzs esetén ……………..40 3. Kép. MBL-termelés konfirmálása módosított Hodge-teszttel az általunk izolált K. pneumoniae KP3686 törzs esetén ……………………………………………………………40 4. Kép. SmaI-emésztett genomiális DNS PFGE mintázatok Staphylococcus haemolyticus törzseknél …………………………………………………………………………………….64

7

3. Bevezetés 3.1. A nozokomiális fertõzések Semmelweis Ignác 1846-ban bejelentett felfedezése óta az orvostudomány diagnosztikus és gyógyító eszközrendszere óriási fejlõdésen ment keresztül. Paradox módon mégis a fejlõdés által rendelkezésre álló lehetõségek egyben a legfontosabb tényezõi a mai nozokomiális fertõzéseknek.

3.1.1. Definíció Definíció szerint „nozokomiális infekció az a helyi vagy szisztémás kóros állapot, amelyet egy kórokozó vagy annak toxinja vált ki, és amelyre vonatkozóan nincs semmi bizonyíték, hogy manifeszt vagy lappangó állapotban jelen lett volna a kórházba való felvételkor”. (Centers of Disease Control and Prevention (CDC) meghatározása alapján) (NNIS Manual 1992, Böröcz K és mtsai 2002). A név eredete: kórházban szerzett fertõzés (nosokomeion görög eredetû szó, „kórház”; nosos = betegség, komeo = ápolni). Általában összemosódik, illetve egyenértékûként használatos a iatrogén fertõzés elnevezés, amely speciálisan a kórházi kezelés során alkalmazott invazív vagy non-invazív eljárások, ellátás következtében jön létre. Nem nozokomiális fertõzés a kolonizáció, baktériumok és gombák jelenléte egy bizonyos területen, amikor a beteg nem mutat fertõzést igazoló tüneteket. Ebben az esetben a szisztémás antibiotikum kezelés nem fogja a „nem kívánt” baktériumot eliminálni, a gyulladásos tünetek nélkül az antibiotikum nem fog az adott helyen kumulálódni. Az ilyenkor alkalmazott antibiotikum adás veszélye, hogy rezisztens mikróba egyedek szelekcióját eredményezi.

3.1.2. Idõfaktor Definíció szerint nozokomiálisnak tekintendõ az a fertõzés, amely a kórházba kerülést követõ 48 órán túl keletkezik. Sokszor azonban nehéz megítélni, hogy egy lappangó folyamat lobban-e fel, vagy friss fertõzés jött létre. Különösen nehéz az idõt meghatározni az újszülött fertõzõdése a szülõcsatornán való áthaladás esetében (korai szepszis - késõi szepszis között 48 h vagy 168 h legyen a határ). Sokszor a kórházból való távozás után alakulnak ki a fertõzés tünetei. Ezek elõfordulásáról, esetszámáról csak becsült adatok vannak.

8

3.1.3. Patogenezis A fertõzés eredete lehet endogén vagy exogén. Primer endogén fertõzések a beteg saját, normál flórájából származó mikróbák által okozott fertõzések, rendszerint egy héten belül alakulnak ki. Secunder endogén fertõzések forrása az elpusztult normál flóra helyett a kórházi környezetben a beteg által felvett „új” mikróbák. Ha elpusztul a normál flóra, más, a környezetbõl felvett baktériumok foglalják el a helyet (bélflóra változás, mesenteriális hipoxia, baktériumok transzlokációja a bélfalon kívülre, szepszis). Intenzív osztályon kezelt betegek 70 %-ában az ápolás 3. napjától Gram-negatív bélbaktériumok találhatóak a garatban. Tercier endogén fertõzések a higiénés szabályok nem megfelelõ betartása esetén alakulnak ki. Az utóbbi két esetben már szelektálódott, gyakran multirezisztens mikróbák által okozott fertõzésekkel találkozunk. A környezetben bizonyos baktériumok hosszú ideig túlélnek, fogékony ember szervezetében infekciót okoznak. Az általuk okozott exogén fertõzések általában tárgyak, az invazív ellátásban alkalmazott eszközök közvetítésével alakulnak ki. Itt külön kell hangsúlyozni, hogy a kézmosás, higiéniai szabályok korrekt betartásával ezek a fertõzések jelentõsen csökkenthetõk lennének. A fertõzés terjedhet közvetlen kontaktussal, cseppfertõzéssel, esetleg aerogén módon. Közvetlen kontaktus leggyakrabban direkt módon, a kórokozót ürítõ vagy hordozó betegrõl, indirekt módon az ápolás közben a személyzet által használt eszközökkel, kezével történik. A tárgyakra passzívan is kerülhet a kórokozó, pl. katéter, vérvételi eszköz, endoszkóp kontamináltsága felelõs az ilyen eredetû fertõzések 40 %-áért. Közös fertõzött tárgyak útján kialakuló fertõzés halmozódásokhoz, járványokhoz vezethet, mert több beteg is érintkezésbe kerülhet velük (pl. élelmiszer, víz, gyógyszer). Cseppfertõzés esetlegesen, fõleg légúti vírusok által jöhet létre csecsemõ-, gyerekosztályon. Az aerogén terjedés nem jellemzõ, mert jelentõs távolság van a fertõzõ forrás és a fogékony szervezet közt (Losonczy és Szalka 2001, Jurányi 2002, Reese és Betts 2003).

3.1.4. Prediszponáló tényezõk Intrinsic rizikófaktorok a kórházi beteg általános állapota, ill. fennálló alapbetegsége, melyek a kórházba kerülés elõtt is fennálltak. Kiemelendõk az idõskor, a koraszülöttség, tudatzavar, diabetes mellitus, rosszindulatú daganat, malignus hematológiai kórképek. Extrinsic rizikófaktorok az ezen állapotok ellátásával szükségesen együtt járó vizsgálatok és kezelések, az invazív diagnosztikus beavatkozások, pl. a mesterséges lélegeztetés, 9

tracheostomia, húgyúti katéterezés, a sürgõsségi mûtét, az immunreakciókat befolyásoló gyógyszeres kezelés. Ide tartoznak a helytelen antibiotikum kezelés, a rosszul fertõtlenített eszközök, a kontaminált kéz, fertõzött élelmiszer.

3.1.5. Klinikai megjelenési formák Nozokomiális fertõzések fõ csoportjai 1. Húgyúti fertõzések 2. Sebfertõzések 3. Pneumónia 4. Véráram fertõzések 5. Csont és ízületi fertõzések 6. Központi idegrendszer fertõzései 7. Kardiovaszkuláris rendszer fertõzései 8. Szem-, fül-, orr-, garat-, szájüreg- és felsõ légúti fertõzések 9. Alsó légúti fertõzések (a pneumóniákat kivéve) 10. Gyomor- és bélrendszeri megbetegedések (pl. Clostridium difficile toxinja által okozott klinikai képek, különbözõ etiológiájú gastroenteritisek, hepatitisek) 11. Genitális fertõzések 12. Bõr- és lágyrész fertõzések 13. Szisztémás fertõzések (CDC definitions of nosocomial infections 1996) A nozokomiális fertõzések igen különfélék lehetnek, de az esetek 80-90 %-át az elsõ négy csoportba tartozó infekció teszi ki. Az egyes típusú fertõzések dominanciája jellegzetesen más, ha a különbözõ profilú osztályokat nézzük. Pl. a patológiás újszülötteket és koraszülötteket ellátó PIC-eken, ahol köztudomásúan igen magas a kórházi infekciók aránya – a bakterémiák a vezetõ nozokomiális infekciók, utánuk pedig gyakorisági sorrendben a pneumónia, a conjunctivitisek és a nekrotizáló enterocolitisek következnek.

3.1.6. Epidemiológia

3.1.6.1. Nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája A nozokomiális fertõzések mintegy 96-98 %-a sporadikusan, vagy endémiásan fordul elõ. A járványok keretében jelentkezõ infekciók az összesnek mindössze 2-4 %-át teszik ki (Bennett és Brachman 1992, Kende 1992, Losonczy és Szalka 2001). 10

A sporadikus és endémiás kórházi fertõzések gyakoriságát világszerte prevalencia, vagy incidencia arányokkal adják meg; ezek a morbiditást két különbözõ aspektusból vizsgálják. Az incidencia az újonnan fellépõ nozokomiális fertõzési esetek gyakoriságát jelenti egy meghatározott idõtartam alatt egy bizonyos betegpopuláció körében. A prevalencia ezzel szemben a betegpopulációban észlelhetõ összes létezõ kórházi fertõzés elõfordulását adja meg egy meghatározott idõpontban, vagy egy meghatározott idõtartam alatt, függetlenül attól, hogy az infekció mióta áll fenn (Emmerson 1995). A kórházi fertõzések prevalenciája az ellátott betegek számához viszonyítva világszerte 3.5 % és 12.2 % között mozog. A leggyakoribb értékek 6 és 10 % között vannak és a magyarországi elõfordulást is kb. ennyinek tartják. A különbözõ klinikai profilú osztályokon más és más a nozokomiális fertõzések elõfordulásának valószínûsége. Irodalmi adatok alapján prevalenciájuk a sebészeteken 3-10%, belgyógyászati osztályokon 2-5 %, intenzív osztályokon (ITO) 10-20 %, speciálisan perinatális intenzív osztályokon (PIC) 10-15 %.

CDC adatok A CDC 1946 óta kezdte a nozokomiális fertõzésekkel kapcsolatos adatok gyûjtését. A National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) keretében 1990-tõl 2004-ig, majd 2005tõl a szélesebb területet felölelõ, internet alapú, a képzési programokat könnyen elérhetõvé tevõ National Healthcare Safety Network (NHSN) keretén belül. Legfontosabb feladatának tekinti a veszélyes rezisztenciák elterjedésének feltérképezését, ennek megállítását. Elemzéseik szerint a nozokomiális fertõzések teljes körû, egész kórházra vonatkoztatott incidenciája 1975-76-ban 4.5 %, 1990-ben pedig 3 % volt. Adataik alapján 1.7 millió ember évente valamilyen nozokomiális fertõzést szenved el, ebbõl 99 000 meghal (300 millió lakos). Ez 4.5 fertõzés/100 elbocsátott beteget, 9.3 infekció/1000 ápolási napot az ITO-n, 2 sebészi fertõzés/100 mûtét, 10 000 $ (~ 2 000 000 Ft)/ 1 nozokomiális véráram fertõzést, 111 000 $ (~ 22 000 000 Ft / 1 rezisztens kórokozó okozta infekciót jelent a transzplantált betegekben. (NNIS System Report 2004, Edwards et al. 2009, Rosenthal et al. 2010) Európai, magyarországi helyzet Az Európai Unió 2004-ben hozta létre a European Centre for Disease Prevention and Controlt. Az Országos Epidemiológiai Központ (OEK) vezetésével 2005-tõl mûködik a Nemzeti

Nosocomialis

Surveillance

Rendszer

(NNSR),

melyhez

laboratóriumok csatlakozhatnak, adataikat összevethetik az európai helyzettel.

11

mikrobiológiai

Magyarországi adatok elemzése alapján valószínûsíthetõ, hogy nem teljes körû a felmérés, a bejelentési fegyelem nem teljes. Kb. 200 000 ember/év a nozokomiális fertõzések aránya, ebbõl becsülten 10.000-20.000 véráramfertõzés. A letalitás becsülten 3000 ember/év. A specifikus nozokomiális járványok száma enyhe emelkedést mutat (2006-ban 26; 2007-ben 30; 2008-ban 35 járvány). A NNSR 2008 évi jelentés adatai alapján a 35 járvány megoszlása a következõ volt: véráramfertõzés 12, sebfertõzés 5, légúti fertõzés 5, enterális 1, kevert fertõzés 12 (www.oek.hu / NNSR eredményei).

3.1.6.2. A leggyakoribb nozokomiális fertõzések epidemiológiája

Nozokomiális húgyúti fertõzések Nozokomiális húgyúti fertõzések elõfordulási valószínûsége 40 % általában. A húgyúti katéterrel összefüggõ fertõzések legfontosabb rizikófaktorai a katéterezés ideje (<30 nap: 15 %, >30 nap: 90 %), az urinométer alkalmazás hiánya, a vizeletgyûjtõ zsák bakteriális kolonizációja, diabetes mellitus, antibiotikum mentes állapot, nõi nem, kóros szérum kreatinin szint, a katéter kezelés hibái. Katéterezéstõl független nozokomiális húgyúti infekció esetében legfontosabb rizikótényezõk az idõs kor, a nõi nem, a megelõzõ húgyúti infekció. A nozokomiális húgyúti fertõzések, mint általában a húgyúti fertõzések, az esetek több mint 95 %-ában aszcendáló jellegûek. A katéterrel összefüggõ esetekben a 30 napon belüli katéterezés esetén fõleg Esherichia coli, egyéb Enterobacteriaceae család tagja, sarjadzó gomba, 30 napot meghaladó katéterezés esetén fõleg proteusok, pseudomonasok elõfordulásával kell számolni. Különösen veszélyesek az ureáz-termelõ és biofilmképzõ baktériumok, melyek a katéterek elzáródását is okozhatják. Az esetek kb. 5 %-ában a bakteriúria hematogén eredetû. Ilyenkor a kórokozó spektrum jellegzetesen más, fõleg Staphylococcus aureus, Candida, Salmonella, Pseudomonas a kóroki tényezõ. Minden nozokomiális húgyúti fertõzés esetén problémát jelentenek a multirezisztens mikróbák által okozott fertõzések.

Nozokomiális sebfertõzések Sebfertõzések elõfordulási gyakoriságát alapvetõen a mûtétek típusa határozza meg. El kell fogadnunk azt a tényt, hogy a legnagyobb odafigyelés esetén is bizonyos mûtéti típusoknál a fertõzéses szövõdmények nem elõzhetõk meg teljes mértékben. Úgynevezett tiszta mûtéteknél az infekciós gyakoriság 5 % alatti, tiszta kontaminált mûtéteknél 5-10 %, kontaminált mûtéteknél 20 %, fertõzött mûtéteknél 40 %. A fertõzéseket elõsegítik a beteggel 12

kapcsolatos kockázati tényezõk, infekciós endocarditis veszélye, implantátumok jelenléte, immunszuppresszió, diabetes mellitus, obezitás, alultápláltság, lokális keringési zavar a mûtéti területen, súlyos májmûködési zavar, alkoholizmus, veseelégtelenség, lymphoedema, gyógyszerabúzus. Nozokomiális sebfertõzéseknél is problémát jelent, hogy gyakran antibiotikumok széles körére rezisztens, szelektálódott kórházi törzsekkel történik. Leggyakrabban S. aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus spp., E. coli, Klebsiella pneumoniae, meticillinrezisztens S. aureus (MRSA) a kóroki tényezõ.

Nozokomiális pneumónia Az betegek 15-20 %-ában elõforduló nozokomiális pneumónia esetében az egyéb prediszponáló tényezõk mellett mind a fertõzõ ágensek, mind az elõfordulás gyakoriságát meghatározza, hogy lélegeztetett, vagy nem lélegeztetett beteg pneumóniájáról van szó. Az elõbbinél az idõfaktor is döntõ, azaz korai (a lélegeztetés kezdete után 2-4 nappal) vagy késõi (a lélegeztetés utáni 5. naptól) pneumóniáról van szó. Nem lélegeztetett betegek letalitása meghaladja a 30 %-ot, míg a lélegeztetett betegekben kialakuló pneumónia letalitása elérheti a 70 %-ot. Nozokomiális pneumónia hátterében 5 nap után a hospitalizált beteg felsõ légutait kolonizáló Gram-negatív baktériumok és S. aureus a vezetõ kóroki ágens. Az empirikus antibiotikum választáskor az osztály flórájának ismerete szükséges. Speciális lehet a kórokozó spektrum, eleve rezisztens kórokozók jelenlétét kell feltételezni: P. aeruginosa, S. aureus, Enterobacter spp., Klebsiella spp., E. coli, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Streptococcus pneumoniae, anaerobok, gombák, egyéb Gram-negatív baktériumok, vírusok, Legionella spp.

Nozokomiális véráram fertõzések Nozokomiális véráram fertõzéseknél megkülönböztetünk bakteriológiai vizsgálattal igazolt véráram fertõzést és szepszis szindrómát - pozitív vértenyésztés nélkül. Speciális entitás a centrális katéterrel összefüggõ véráramfertõzés, amikor a kanül behelyezés 48 órával korábban történt (vagy régebben) és a betegnek klinikailag szepszise van. Rezisztens mikróbák által okozott fertõzéseket okoz, ha a fertõzött/kolonizált beteg felvétele során bekerül az osztályra a multirezisztens mikroorganizmus, illetve ha újonnan alakul ki a multirezisztencia az antibiotikumok szelekciós nyomására (pl. kiterjedt spektrumú ß-laktamáz termelés, fluorokinolon rezisztencia). Járványhoz/klonális terjedéshez hozzájárul a nem 13

megfelelõ kézmosás, nem megfelelõ izoláció, környezeti tényezõk/vektorok figyelmen kívül hagyása. Nozokomiális véráramfertõzések incidenciája, a kórokozók spektruma különösen függ a klinikai osztály jellegétõl, a meglevõ/kialakuló prediszponáló tényezõktõl. Mindent összevetve az átlagos elõfordulás 7-8 %-ra tehetõ. Magyarországon jellemzõen kevés hemokultúrát vesznek a klinikusok, így számos véráramfertõzés mikrobiológiailag nem alátámasztott. A hazai összesített véráramfertõzések incidenciája, illetve az incidencia sûrûsége elmarad a nemzetközi irodalmi adatok alapján becsülhetõ értékektõl. Az NNSR 2008-as adatai alapján a véráramfertõzések eredetük szerinti megoszlása: 651 eset (53.6 %) primer – azaz centrális érkatéterrel összefüggõ véráramfertõzés volt; 412 eset (34 %) szekunder, ahol a véráram fertõzés egy elõzetes fertõzés szövõdménye volt. A véráramfertõzés eredete ismeretlen maradt 151 esetben (12.4 %). Leggyakrabban pneumónia és alsó légúti fertõzések együttesen (40.1 %) okoztak szekunder véráram fertõzést. Ezt követõen húgyúti fertõzések (12.6 %), tápcsatorna fertõzések (6.8 %), sebfertõzések (5.6 %), bõr és lágyrész fertõzések (4.6 %) okoztak szekunder véráram fertõzést. Az amerikai CDC által több száz kórházban koordinált, évtizedek óta folyó NNIS/NHSN adatai, és számos európai ország nagy kórházi beteganyagára támaszkodó tenyésztési eredmények (SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, European Study Group on Nosocomial Infections (ESGNI)) alapján a kórokozó-spektrum, amely ezekbõl elénk tárul, meglehetõsen egységes. Az egyes évtizedeknek a leggyakrabban izolált nozokomiális kórokozók vonatkozásában általában megvolt a maguk jól felismerhetõ trendje. Az ötvenes években és a hatvanas évek elején a S. aureus vezette a gyakorisági listát. Ezután a legkülönbözõbb Gram-negatív baktériumok törtek az élre, majd – kb. a nyolcvanas évek közepétõl kezdve – újra gyakoribbá váltak a Gram-pozitív coccusok, elsõsorban a koaguláznegatív staphylococcusok, legújabban pedig az enterococcusok. Tapasztalható még a Candida albicans mint nozokomiális kórokozó elõretörése, a Gram-pozitív anaerobok megjelenése az elsõ tíz leggyakrabban izolált baktérium közt. Ugyanakkor megfigyelhetõ a P. aeruginosa, az Enterobacter spp., s az Acinetobacter spp. kivételével a Gram-negatív baktériumok százalékos arányának csökkenése. Minden kórokozó faj esetében jellemzõ a multirezisztens törzsek számának emelkedése. Hangsúlyozni kell, hogy egyes mikróbák nozokomiális jelentõsége, kórokozó szerepének megítélése, elõfordulási gyakorisága terén a továbbiakban is állandóan várhatók változások. A technikai fejlõdéssel, a kórokozók, vagy antigénjeik könnyebb, rutinszerû kimutatásával eltolódhatnak az arányok és a legionellák, chlamydiák nozokomiális 14

jelentõsége növekedhet, ugyanígy egyes vírusoké is. (Jones et al. 2000, Bouza et al. 2001, Fluit et al. 2001, Fluit et al. 2001, Mathai et al. 2001, Losonczy és Szalka 2001, Jones 2003, NNIS System Report 2004, Bouza et al. 2005, Munoz et al. 2005, Edwards et al. 2009, Rosenthal

et

al.

2010,

www.oek.hu/Antibiotikum

rezisztencia,

www.oek.hu/NNSR

eredményei)

3.2. A mikrobiológiai laboratórium szerepe a nozokomiális fertõzésekben

3.2.1. Kórokozó identifikálása és korrekt antimikróbás érzékenységének meghatározása A CDC kritériumok alapján „… a kezelõorvos fertõzést diagnosztizál. A kezelõorvos az érintett terület fertõzése ellen adekvát kezelést kezd.” A diagnosztikai vizsgálatoknak abban kell segíteni, hogy a klinikus adekvátan tudja kezelni a beteget. A fertõzés meghatározása és osztályozása klinikai, laboratóriumi és egyéb vizsgálatokra kell, hogy épüljön. Ide tartozik a klinikum oldaláról a direkt megfigyelés, kórlapok, lázlapok tanulmányozása. Ezt egészítik ki a képalkotó eljárások (röntgen, ultrahang, CT, MR, szövettan) és az általános laboratóriumi vizsgálatok, melyek a fertõzés következtében kialakuló szervi károsodások mértékét jelzik (máj, vese-, keringési károsodás klinikai laboratóriumi paraméterei), valamint a gyulladásos paraméterek (vérkép, akut fázis proteinek) meglétét. A mikrobiológiai laboratóriumoknak a kórházi fertõzések megelõzésében és leküzdésében játszott szerepét nem lehet eléggé hangsúlyozni. A kórokozó pontos ismerete minden nozokomiális fertõzésnél alapvetõ kérdés. Ezek eredményei alapján dönthetõ el, hogy egy kórházi osztályon egy idõben elõfordult nozokomiális fertõzéseknél járványról van-e szó, vagy nem; így kereshetõ a környezetben a kóroki szerepû baktérium, így erõsíthetõ vagy cáfolható az eredeti klinikai diagnózis és nem utolsósorban így lehetséges a megfelelõ terápia megválasztása. Elengedhetetlen a minél szélesebb körû mikrobiológiai vizsgálatok (mikroszkópos, tenyésztéses, antigén- és antitest vizsgálatok, egyéb azonosító módszerek) végzése. A mintavevõ felelõssége, hogy a megfelelõ helyrõl és a megfelelõ módon vegye a mintát, a mikrobiológus felelõssége, hogy erre lankadatlanul felhívja a figyelmet. Megfelelõ mintavételi protokollok készítése a vizsgáló mikrobiológiai laboratórium feladata.

15

3.2.2. Infekciókontrollban való részvétel Nem akadályozható meg az összes kórházi fertõzés kialakulása, de azokban a kórházakban ahol megfelelõ infekciókontroll politika mûködik, a nozokomiális infekciók 1/3a megelõzhetõ (SENIC –”Study of the Efficacy of Nosocomial Infection Control” – CDC 1970). A mikrobiológiai vizsgálatok során fel kell figyelni a kórokozók antibiotikum rezisztenciájának

kedvezõtlen

alakulására,

egy

adott

mikroorganizmus

halmozott

elõfordulására egy adott osztályon, melyek között kapcsolat feltételezhetõ. Részt kell vállalni a lehetséges kolonizáltak leszûrésében és bizonyos epidemiológiai vizsgálatok végzését is fel kell vállalni.

A mikroorganizmusok epidemiológiai tipizálása Egy törzs bizonyított klonalitása lehetõséget biztosít a beteg és a kérdéses mikroorganizmus

terjesztõje,

esetleg

forrása

közötti

kapcsolat

igazolására.

Egy

halmozódásból vagy egy beteg infekciójából származó azonos specieshez tartozó izolátumok nagy valószínûséggel kapcsolatban vannak egymással. A mikrobiológiai laboratóriumban a tradícionális módszerek mindenképpen elvégezhetõk: biotipizálás, antibiogram, szerotipizálás. Referencia laboratóriumokban végezhetõk a fág-, colicin tipizálás. A molekuláris alapú technikák közül az egyszerûen elvégezhetõ, gyors, de megbízható eredményt adóak elvégzése is be kell, hogy kerüljön a „rutin” laboratóriumi feladatok közé. A nemzeti, nemzetközi összehasonlításokat lehetõvé tevõ, komolyabb eszközök alkalmazását (és sajnos nagyobb anyagi ráfordítást) igénylõk továbbra is a nemzeti referencia laboratóriumok feladata. Fontos azonban a mikrobiológiai laboratóriumoknak ezekkel való jó kapcsolata, a vizsgálatra szánt izolátumok biztonságos megõrzése ezen vizsgálatok számára. A leggyakrabban alkalmazott molekuláris vizsgálatok közül protein alapúak: immunoblot fingerprinting, celluláris proteinek poliakrilamid gélelektroforézise, multilocus enzimelektroforézis; dezoxiribonukleinsav (DNS), ribonukleinsav (RNS) vizsgálatok: riboszomális RNS tipizálás, plazmid profil analízis, restrikciós endonukleáz analízis, southern hibridizációs analízis, AP-PCR (arbitraly primed-polymerase chain reaction), RAPD (random amplified polymorphic DNA assay), RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), DNS chip, DNS sequentia és a legnagyobb körben ismert pulzáló mezejû gélelektroforézis (PFGE).

16

3.3. Nozokomiális fertõzések a neonatális intenzív centrumokban

3.3.1. Általános epidemiológia A koraszülés különleges kihívást jelent mind a klinikusoknak, mind egyéb egészségügyi dolgozóknak, így a mikrobiológusoknak is. A szervezet éretlen védelmi mechanizmusai lehetõvé teszik a születés utáni 3 napon belül jelentkezõ, korai kezdetû szepszis (Early Onset Sepsis: EOS) kialakulását, amely nagyon súlyos lehet, igen magas letalitással. Noha az elmúlt évszázadra jellemzõ volt, hogy mind az idõre, mind az idõ elõtt születettek körében csökkent a GBS okozta szepszisek száma, a korai kezdetû szepszisek száma sok helyen továbbra sem csökkent, sõt számos esetben a szepszisek számának növekedését találták. A szakértelem és az ellátás fejlõdése következtében a magas kockázatú újszülöttek túlélési aránya megnövekedett. Ezzel együtt az alkalmazott invazív eljárások száma is megnõtt. Így azonban a harmadik életnaptól kezdõdõen jelentkezõ, késõi kezdetû szepszis (Late Onset Sepsis: LOS) és különösen a kórházi eredetû véráram fertõzések (Blood Stream Infection: BSI) jelentenek újabb kihívást, amely befolyásolja a morbiditást, a hospitalizáció idõtartamát, az ellátás költségeit és a halálozási arányokat. Fõleg a nagyon alacsony születési súlyú (Very Low Birth Weight: VLBW; születési súly: 1000-1499 g) újszülöttek vannak kitéve súlyos szisztémás fertõzéseknek kórházi tartózkodásuk kezdeti szakaszában. A multirezisztens mikróbák és a Candida fajok által okozott szepszisek incidenciája növekszik, sõt ezek lettek a koraszülöttek halálozásának legfõbb okai. A neonatális intenzív centrumokba (Neonatal Intensive Care Unit: NICU) kerülõ újszülöttek esetében nagyobb a kockázata a neonatális szepszis kialakulásának. A NICU-kon kialakuló neonatális fertõzések incidenciáját 1 és 8.6 közöttinek írják le, 1000 élveszületésre vonatkoztatva, igaz, ezek a jelentések gyakran alulbecsülik ezen értékeket. A nozokomiális szepszis gyakorisága a NICU-kon 5 és 30 között volt 100 betegre vonatkoztatva (Bizzarro et al. 2005). Általában a LOS mortalitása jóval alacsonyabb, mint az EOS esetén (Berger et al. 1998, Haque et al. 2004). A klinikai jellegzetességek és a korai halálozási arányok a LOS kialakulásáért felelõs patogén típusa szerint változnak (Tseng et al. 2002, Jiang et al. 2004). A koaguláz negatív staphylococcusok a korai halálozás 2-17.3 %-áért felelõsek (Makhoul et al. 2005, Gastmeier et al. 2007). A Klebsiella fajok okozta neonatális fertõzések halálozási aránya 13-68 % közötti (Zaidi et al. 2005). Számos tanulmányban, az összes mikróba között a Pseudomonas okozta LOS esetén a legnagyobb a letalitás, a páciensek 17-75 %-a meghal (Stoll et al. 1996, Karlowitz et al. 2000, Makhoul et al. 2005, Makhoul et al. 2005).

17

A hasonló pácienseket fogadó centrumok endémiás nozokomiális fertõzések gyakoriságának változékonysága arra utal, hogy az egészségügyi ellátás szabályainak szigorú betartása és a prediszponáló tényezõk jelenléte jelentõsen befolyásolja a nozokomiális infekciós arányokat.

3.3.2. Diagnosztizálás nehézségei Újszülöttekben a fertõzések gyakran szepszissel együtt jelennek meg, a helyi fertõzés jeleivel vagy anélkül. A szepszis korai jelei gyakran nem specifikusak, mint pl. a testhõmérséklet instabilitása, letargia, étvágytalanság, apnoe, bradycardia, respirációs elégtelenség, hányás, hasmenés, hasi görcsök, idegesség, görcsök vagy csak egy nem magyarázható hyperbilirubinaemia. Ráadásul, mivel a diagnosztikai eljárások eltérnek az egyes neonatális intenzív osztályokon, az ilyen jellegû fertõzések 1 év alatti gyermekekre vonatkozó CDC kritériumai kevésbé használhatók e betegek körében (Horan et al. 2004). Az új (kora-) szülöttekre vonatkozó meghatározások még mindig hiányoznak. A NICU-ban történõ nozokomiális infekciókra vonatkozó standardizált meghatározások hiánya és a különbözõ NICU-k beteganyaga közti jelentõs eltérés miatt a neonatális infekciók incidenciájáról szóló tanulmányok összehasonlítása nehéz (Gastmeier et al. 1989, Stoll et al. 2002). Néhány szerzõ kísérletet tett hasznosíthatóbb pontozási rendszer kidolgozására annak elõrejelzésére, hogy melyik újszülöttnek van neonatális szepszise (The International Neonatal Network 1993, Vidyasagar et al. 2000, van der Zwet et al. 2005). Több mint egy évtizeddel ezelõtt a CDC azt javasolta, hogy a NICU rátákat eszközhöz kötött, eszköz-nap gyakoriságban fejezzék ki és finomítsák a születési súllyal is, pl. <1000 g, 1001-1500 g, 1501-2500 g, és >2500 g (Couto et al. 2007).

3.3.3. Rizikótényezõk A koraszülötteknek speciális rizikótényezõi vannak nozokomiális fertõzésekre. Az intrinsic rizikófaktorok közé tartozik például az újszülött viszonylagos immundeficienciája, a lehetséges patogének behatolási kapuinak védtelensége beleértve a bõr és az emésztõrendszer éretlen barrier funkcióját. A különösen alacsony születési súlyú (Extremely Low Birthweight: ELBW; születési súly: 500-999 g) gyermekek éretlen és törékeny bõre szegényes epidermális barriert jelent a kolonizáló baktériumok inváziójának megelõzésére. Nozokomiális szepszis az újszülöttekben leggyakrabban az endogén flórából kiindulóan alakul ki, sõt a normál flórát tartják a potenciális patogének legfõbb forrásának. Az antimikróbás szerek alkalmazása, az 18

elhalasztott enterális táplálás és az elhúzódó hospitalizáció mind olyan tényezõk, amelyek a NICU-n ápolt gyermekek normál flórájának megváltozásához vezetnek, összehasonlítva egészséges, idõre született gyermekekkel (Stoll et al. 1996, Bizzarro et al. 2005, van der Zwet et al. 2005). Az endogén flóra változásában szerepe lehet a személyzet kezével vagy kontaminált felszereléssel bekerülõ multirezisztens mikroorganizmusoknak is. Számos tanulmány szerint a kórtermek zsúfoltsága, nõvér:páciens arány <1:1, a higiénés szabályok be nem tartása (kézmosás!) a kórházban szerzett fertõzések nagyobb gyakoriságát eredményezi (Archibald et al. 1997, Harbarth et al. 1999, Andersen et al. 2002, Crivaro et al. 2006, Von Dolinger et al. 2007). Az extrinsic rizikófaktorok közé az orvosi kezelések, az intravaszkuláris eszközök és egyéb invazív eljárások tartoznak. Umbilikális és egyéb centrális kanülök alkalmazása szignifikáns összefüggést mutatott a fertõzési gyakorisággal, míg a fertõzés gyakorisága együtt növekedett a centrális vénás katéter alkalmazásának idõtartamával (Gastmeier et al. 1998, Crump et al. 2000, Jiang et al. 2004, Bizzarro et al. 2005, Mireya et al. 2007). Az endotracheális intubáció, a gépi lélegeztetés és a sebészeti eljárások (sebészeti sebek és drének jelenléte) szintén fontos rizikófaktorai a LOS-nak (Stoll et al. 1996, Tullu et al. 2000). A nozokomiális fertõzés bekövetkezhet kontaminált intravénás oldatok infúziójával (különösen lipidalapú vagy magas glükóztartalmú oldatok esetén) vagy kontaminált tápszerekkel is (Gastmeier et al. 2007).

3.3.4. Kórokozó mikróbák spektruma Az idõk során megváltozott a neonatális szepszisért döntõ mértékben felelõs baktériumok köre. A Yale Egyetem jelentése szerint (Stoll et al. 2002) a negyvenes évek vége és a hatvanas évek közepe között a neonatális szepszis leggyakoribb kórokozói a Gramnegatív baktériumok voltak, különösen az E. coli. Napjainkban jellegzetes különbség van a fejlõdõ és a fejlett országok között. A fejlõdõ országokban továbbra is a Gram-negatív baktériumok a neonatális szepszis leggyakoribb kórokozói (fõleg Klebsiella fajok, E. coli és P. aeruginosa) (Couto et al. 2007), azonban a fejlett országokban a Gram-pozitív mikroorganizmusok izolálásának meredek emelkedése tapasztalható. A LOS kóroki tényezõjeként kiemelendõk a koaguláz-negatív staphylococcusok, amelyek néhány tanulmány szerint akár 83 %-os incidenciát is elérhetnek (Haque et al. 2004, Makhoul et al. 2005). A fejlett és fejlõdõ országok közötti különbségek okai nem egyértelmûek. Feltételezések szerint ez az erõsen kontaminált környezeti forrásoknak, a kereszt-kontamináció gyakoriságának és a

19

neonatális ápolás nem megfelelõ módjának, a szegényes aszeptikus gyakorlatnak tulajdonítható (Sabui et al. 1999, Stoll et al. 2002, Zaidi et al. 2005). Az antibiotikum-éra kezdete óta, a gyakori kóroki tényezõk változásához vezethetett az is, hogy az idõk során bakteriális rezisztencia fejlõdött ki és új antibiotikumokat is alkalmazni kezdtek. Leírták a kórházi patogének megoszlásának ciklikus változását is. Egy beszámolóban kimutatták, hogy a Gram-pozitív és a Gram-negatív mikroorganizmusok váltakozó dominanciával fordulnak elõ (Weinstein et al. 2001). A sarjadzógombák egyre fontosabbá váló patogének, amelyek véráramfertõzést okozhatnak (9-12 %), különösen az alacsony születési súlyú újszülöttekben (Bindayna et al. 2006).

3.3.5. Mikrobiológiai diagnosztika szerepe a neonatális fertõzésekben A klinikai diagnózist alátámaszthatja a mikrobiológiai laboratórium korrekt, minõségi és gyors eredménye. A laboratórium lehet az elsõ helyszín, ahol az infekció kontroll problémáit detektálják (Wilson et al. 1999). Fontos elemezni a neonatális szepsziseket annak érdekében, hogy a folyamatokban és a rizikótényezõkben bekövetkezõ változások szorosan követhetõk legyenek, hogy adatokat nyerjünk, amelyekre az empirikus antibiotikum terápiát alapozhatjuk, és hogy gyorsan reagálni tudjunk az érzékenységi mintázat és a járványok gyakoriságának változására. A trendek felismerése alapot nyújthat a racionális empirikus antibiotikum terápiához. A nozokomiális fertõzések diagnosztizálása mellett szükség van a multidrug-rezisztens (MDR)

Gram-negatív

pálcákkal

történõ

kolonizáció

szûrésére

aktív

követéses

tenyésztésekkel, hogy azonosítható legyen terjedésük forrása, és elkerülhetõ legyen a betegek közötti szóródás (Jaballah et al. 2007). Ha egy adott patogén által okozott csoportos fertõzést találunk, követéses tenyésztéseket kell annak érdekében végezni, hogy az összes olyan újszülöttet kiszûrjük, akiben a járványt okozó törzs kolonizál. Emellett, ha korábban kolonizált koraszülött fertõzés tüneteit mutatja, az antibiogram segít a klinikusnak a megfelelõ empirikus antibiotikum terápia kiválasztásában, amíg a végsõ tenyésztési eredmények nem ismeretesek (Goldmann 1988). Mindazonáltal ezeknek a tenyésztéseknek nem az egyes Gram-negatív baktérium azonosítása a célja, hanem az adott osztályon felbukkanó antibiotikum-rezisztens Gram-negatív baktériumok detektálása. Születés után harmadik naptól kezdve és hetente ismételve javasolt surveillance: felszíni (torok-, vagy orr-, esetleg bõr) minták tenyésztése, a széklet tenyésztése, valamint lélegeztetett újszülöttek tracheális aspirátumának minõségi és mennyiségi tenyésztése,

20

kiegészítve a festett kenet mikroszkópos értékelésével (Goldmann 1988, Slagle et al. 1989, Lau et al. 1991, Kollef et al. 1999, Szabo et al. 2005). A követéses tenyésztések pozitív prediktív értéke nagyon alacsony, mivel igen nagyszámú baba kolonizálódik sokféle nozokomiális patogénnel anélkül, hogy valaha is megbetegednének. Másrészrõl viszont lehetséges, hogy azoknak a gyermekeknek, akikben kialakul a „normál” baktériumflóra jóval kisebb a kockázata arra, hogy nozokomiális infekció alakul ki, mint akik „patogénekkel” kolonizálódnak. Ez megemeli a negatív prediktív értékét a követéses tenyésztéseknek (Goldmann 1988). Fontos azonban, hogy a negatív eredményû felszíni tenyésztések nem jelentik a fertõzés hiányát. A CNS, különösen a S. epidermidis a mucocutan régiókban és a nasopharynxban jellemzõen megtalálható baktériumok az élet elsõ hetében. Prevalenciájuk 9 %-ról 78 %-ra növekszik az élet második hete során. A béltraktus kolonizációja 8 vagy több napig is elhúzódhat, de nagyon gyakran 60 ill. 91 %-ban kolonizálódnak az újszülöttek 15 ill. 30 nap hospitalizáció után. Az anaerob baktériumok sokkal ritkábban fordulnak elõ (<5 %), míg a Gram-negatív baktériumok dominánsak lehetnek az emésztõtraktusban. A Klebsiella, Enterobacter és egyéb fajokkal történõ fertõzõdés kockázata emelkedett azoknál a gyermekeknél, akik több mint 3 napos antibiotikum kezelésben részesülnek és azoknál, akik hosszabb ideig tartózkodnak a NICU-n (von Baum et al. 2004, Gastmeier et al. 2007). Az orr, a torok és a bõr szintén kolonizálódhat ezekkel a potenciális patogénekkel. Candida kolonizáció történhet a gasztrointesztinális traktusban, a bõrön és a légzõrendszerben, és a gyermekek megközelítõleg 19-23 %-ának kolonizálódott az emésztõrendszere is (Jolley et al. 1993, Saiman et al. 2006).

3.4. Mikroorganizmusok jelentõsége a nozokomiális fertõzésekben

3.4.1. Gram-pozitív baktériumok A Gram-pozitív nozokomiális patogének sorában kiemelkedõ jelentõséggel bírnak a koaguláz negatív staphylococcusok, a meticillin-rezisztens S. aureus és a vancomycinrezisztens enterococcusok (VRE). A VRE tekintetében a világirodalmi adatokból egyre riasztóbb helyzet ábrázolódik, hiszen az elmúlt tíz évben egyre nagyobb számban izoláltak olyan, elsõsorban Enterococcus faecium törzseket, melyek vancomycinre és teicoplaninra is rezisztensek. E törzsek elterjedése nem invazivitásuk miatt okoz gondot, hanem azért, mert pillanatnyilag nincs igazán hatékony antibiotikum ellenük. Magyarországon 1 % alatt van az Enterococcus törzsek vancomycin 21

rezisztenciája, de várható emelkedésük. 2005-ben írták le az elsõ hazai vancomycinrezisztens E. faecium által okozott epidémiát (Böröcz et al. 2005)

3.4.1.1. Meticillin-rezisztens Staphylococcus aureus A S. aureus az egyik legjelentõsebb nozokomiális kórokozó, minden klinikai típusú fertõzést képes okozni. A meticillin-rezisztens S. aureus (MRSA) világszerte súlyos gondot jelent. Az MRSA törzsek incidenciája országról országra igen változó: Észak-Európában <1 %, míg dél- és nyugat-európai országokban >40 % is lehet, Romániában és NagyBritanniában a S. aureus törzsek akár 50 %-a is meticillin rezisztens (Tiemersma et al. 2004). Magyarországon az elsõ MRSA által okozott járványt 1993-ban igazolták, azóta több mint száz igazolt esetrõl tudunk, illetve magas a sporadikus esetek száma is. A saját és más hazai mikrobiológiai laboratóriumok adatai is azt mutatják, hogy növekvõ tendenciát mutat az MRSA által okozott fertõzések száma. Az European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) kiadványai alapján 2001 és 2005 között az MRSA által okozott véráramfertõzések aránya 5 %-ról közel 20 %-ra emelkedett. Komoly erõfeszítésre van szükség, hogy legalább késleltessük a már számos európai országra jellemzõ magas MRSA incidencia kialakulását. Jelentõségük növekedését az is igazolja, hogy nõ a kórházban epidémiákat okozó baktériumok invazív jellege, azaz nõ azon súlyos kórképek aránya, amelyekben az MRSA az etiológiai tényezõ. Nõ az MRSA által okozott pneumóniák, véráramfertõzések száma a sebfertõzések és húgyúti fertõzések mellett. Egy nemzetközi multicentrikus tanulmány szerint a legmagasabb MRSA elõfordulást az intenzív osztályokon látni. Az alsó légúti mintákból izolált törzsek mutatkoztak leginkább rezisztensnek és a hemokultúra izolátumok mutatták a legalacsonyabb rezisztencia szintet (Zinn et al. 2004). Az utóbbi évtizedekben a S. aureus kevésbé gyakori okozója a neonatális szepszisnek, mint az ötvenes és a hetvenes évek között, amikor incidenciája a legmagasabb volt. Mindazonáltal (fõleg az MRSA) különleges nozokomiális patogén lehet a NICU-kon. Túlzsúfoltság, korlátozott hely, a felszerelés nem megfelelõ tisztítása és az alapos kézmosás alapvetõ hiánya vélhetõen hozzájárulnak az MRSA terjedéséhez (Archibald et al. 1997, Andersen et al. 2002, Usukara et al. 2003, Jiang et al. 2004). Külön aggodalomra ad okot, hogy a sokáig csak nozokomiális patogénnek tartott MRSA ma már elõfordul otthon szerzett infekciókban is. Az ilyen community-acquired MRSA (CA-MRSA) törzsek a 1990-es évek közepén jelentek és világszerte elterjedtek.

22

Különösen súlyos, rapid lefolyású sebfertõzéseket okoznak, feltételezhetõen speciális virulencia faktorokkal.

3.4.1.2. Koaguláz-negatív staphylococcusok A Gram-pozitív coccusok növekvõ szerepét a nozokomiális véráram fertõzésekben világszerte több nagy tanulmány megerõsítette. A különbözõ surveillance vizsgálatok adatait elemezve a S. aureus mellett a koaguláz-negatív staphylococcusok (CNS) bizonyultak a leggyakoribb vérbõl izolált baktériumoknak (Souvenir et al. 1998, Karchmer et al. 2000, Fluit et al. 2001, Decousser et al. 2003, Klinkenberg et al. 2007, Natoli et al. 2009). A CNS szinte állandóan jelenlévõ, jellegzetesen kórházi fertõzéseket okozó baktériumok, melyek vagy bizonyos betegcsoport(ok) fertõzéseire jellemzõk vagy speciális fertõzések kórokozói. Jellegzetesen az intravaszkuláris katéterekhez kapcsolódó szepszisek, egyéb eszközös beavatkozást, beültetett idegen anyagokat követõ fertõzések, ebbõl kiinduló véráram fertõzések elsõszámú kórokozói, fõleg a valamilyen okból immunszupprimált betegek körében. A koraszülöttek különösen fogékonyak az általa okozott invazív fertõzésre, sok intézményben manapság már a CNS a neonatális bakterémiák legfõbb oka, a véráram fertõzések >50 %-át okozva (Brodie et al. 2000, Mahieu et al. 2001, Aziz et al. 2005, Brady et al. 2005, van der Zwet et al. 2005, Mireya et al. 2007, Von Dolinger et al. 2007). Ugyanakkor a CNS valódi kóroki szerepét a morbiditásban és letalitásban nehéz felderíteni. A CNS okozta véráram fertõzések miatt nem emelkedik a letalitás, de mind a morbiditási arányokat, mind pedig a hospitalizáció idejét és a kezelés összköltségét emelik. Ezen kívül az intenzív osztályon kezelt betegekbõl izolált nozokomiális CNS nagy része rezisztens számos antibiotikumra, többek közt a penicillináz-stabil penicillinekre is (Tabe et al. 1998, Sanches et al. 2000, Petinaki et al. 2001, John et al. 2002, Nunes et al. 2006, Koksal et al. 2009). Ezért a ciklikus glikopeptidek (vancomycin és teicoplanin) ajánlottak a CNS okozta súlyos fertõzésekben, mint elsõ empirikus terápiás szerek, ugyanakkor körükben egyre gyakrabban igazolható a vancomycin, teicoplanin csökkent érzékenység, akár rezisztencia is.

3.4.1.2.1. Staphylococcus haemolyticus Több tanulmány kimutatta, hogy a S. epidermidis a domináns species a hemokultúrából izolált CNS között és a S. haemolyticus a második leggyakoribb (Low et al. 1992, Isaac et al. 1993, Souvenir et al. 1998, Tabe et al. 1998, Perl et al. 1999, Szewczyk et al. 2000, Petinaki et al. 2001, Klinkenberg et al. 2007).

23

A S. haemolyticus törzsek általában multirezisztensek, így egyértelmûen a glikopeptidek az ellenük választandó antibiotikumok. Azonban a S. haemolyticus volt az elsõ Gram-pozitív patogén, mely glikopeptid rezisztenciát szerzett (korábban, mint bármely más Staphylococcus vagy Enterococcus species) és feltehetõen az egyéb CNS-hoz képest sokkal nagyobb mértékben képes glikopeptid rezisztenciát kialakítani (Froggatt et al. 1989, Biavasco et al. 2000, Rodrigez-Aranda et al. 2009). Fontos kérdés virulencia faktorainak vizsgálata, fõleg a biofilm képzésé (de Silva et al. 2002, Fredheim et al. 2009). Már egy korai kísérlet kimutatta, hogy a S. haemolyticus törzsek kompakt telepeket képeznek lágy agarban és sajátos hidrofób sejtfelszínnel bírnak (Godó et al. 1997). Azóta számos molekuláris szintû vizsgálat bizonyította a biofilmképzésért felelõs gének meglétét az invazív fertõzésekbõl izolált baktériumokban. Emellett számosan felvetik, hogy a S. haemolyticus, potenciális patogénként, rezisztencia gének donora is lehet az olyan virulensebb speciesek számára, mint a S. aureus.

3.4.2. Gram-negatív baktériumok

3.4.2.1. Klebsiella speciesek A kórházi betegekben fellépõ Klebsiella spp. okozta légúti infekciók különösen jelentõsek, mert a csökkent védekezõképességûeknél könnyen szisztémássá válhat, akár halálos kimenetellel. A betegeket hamar kolonizálják, egyéb szervekben is nozokomiális fertõzés forrásává válnak (elsõsorban húgyúti-, sebfertõzések). A Klebsiella fajok fontos szerepe a perinatális intenzív osztályokon kialakuló fertõzésekben régóta ismert. A Gram-negatív pálcák (fõleg Klebsiella fajok) voltak a leggyakoribb kórokozók a fejlett országokban 3 évtizeddel ezelõttig (Park et al. 2007), mostanság pedig a fejlõdõ országokban leggyakrabban izolált kórokozók (Shah et al. 1999, Zaidi et al. 2005). A kórokozó túlél a környezetben és átmenetileg megtalálható az ápolószemélyzet kezén is, ami elõsegíti az újszülött-újszülött átvitelt. A Klebsiella fajok okozta neonatális fertõzések incidenciája 2.9 és 12.3 között változik 100 felvételre vonatkoztatva, magas letalitással (Zaidi et al. 2005). Míg néhány kórház klinikai mikrobiológiai laboratóriumában elérhetõk molekuláris epidemiológiai eszközök, mint a pulzáló mezejû gélelektroforézis (PFGE), a legtöbb laboratórium számára ez nem megoldott. Ezért a Klebsiella-fertõzések dinamikája egyes kórházi egységekben, például a PIC-eken teljesen felderítetlen lehet. A klebsiellák jellegzetes rezisztencia tulajdonsága az ESBL (kiterjedt spektrumú ßlaktamáz) termelés, mely azt jelenti, hogy a karbapenemek kivételével egyetlen ß-laktám 24

antibiotikumnak sincs terápiás hatékonysága. Riasztó, hogy Magyarországon is sikerült izolálnunk már a karbapenemekre is rezisztens egyedeket.

3.4.2.2. Enterobacter speciesek Az Enterobacter cloacae a gépi lélegeztetéshez társuló tüdõgyulladás, véráramfertõzések és húgyúti fertõzések során gyakran izolált baktérium a hospitalizált betegek körében. A fõleg ezen család fajaira jellemzõ tulajdonságú ún. stabilan derepresszált törzsek kezelésére hatástalan az összes ß-laktám antibiotikum, kivéve a karbapenemeket és a negyedik generációs cefalosporinokat. A cefalosporin - ceftriaxon, a cefotaxim vagy a ceftazidim – kezelés során megjelenõ cefalosporin rezisztenciáért az ampC gén expressziójának fokozódásához vezetõ mutációk a felelõsek. Koraszülöttek nozokomiális fertõzéseiben is jelentõs patogének, magas letalitású nozokomiális szepszis kialakulásához vezethetnek (Haque et al. 2004, Makhoul et al. 2005), különösen az alacsony születési súlyú és koraszülött gyermekek esetén. A zsúfoltság szintén hozzájárulhat az E. cloaceae fertõzések kitöréséhez. Az Enterobacter fajok aggasztó mértékû rezisztenciát mutatnak (Tseng et al. 2002, NNIS 2004, Bindayna et al. 2006). A

multirezisztens

fermentáló

baktériumok

jelentõségét

növeli,

hogy

kellõ

hatékonyságú infekció kontroll hiányában nozokomiális epidémiákat okozhatnak.

3.4.2.3. Pseudomonas aeruginosa A Gram-negatív, ún. nemfermentáló baktériumok közül kiemelkedõ nozokomiális kórokozó a multi/pánrezisztens P. aeruginosa, mely fõleg a lélegeztetett betegek pneumóniáiból,

égett

vagy

egyéb

okból

csökkent

védekezõképességû

betegek

sebfertõzéseibõl izolálható. Koraszülöttek fertõzéseiben az egészségügyi személyzet keze is fontos rezervoárnak bizonyult (Foca et al. 2000, Ladhani et al. 2002). Az antibiotikumok nagy százalékával szemben természetes rezisztenciát mutat, és másodlagos rezisztenciát is könnyen kifejleszt akár az összes szóbajöhetõ antibiotikummal szemben is (Tseng et al. 2002). Ezen törzsek által okozott infekciók kezelése korrekt mikrobiológiai vizsgálat (antibiotikum érzékenységi vizsgálat) nélkül könnyen terápiás kudarchoz vezet.

3.4.2.4. Acinetobacter baumannii A másik jellegzetes ún. nemfermentáló nozokomiális patogén az A. baumannii, mely a P. aeruginosához hasonló antibiotikum rezisztencia tulajdonságokkal bír. A hospitalizált betegek kolonizációja jelentõs lehet. Így az intenzív ellátás keretében történõ beavatkozások 25

(mechanikus lélegeztetés, katéterek, kanülök tartós használata) lehetõvé teszik súlyos infekciók kialakulását fõleg csökkent védekezõképességû betegek körében. Leggyakrabban okozott nozokomiális fertõzések a húgyúti infekciók, pneumónia és szepszis. Napjainkban nõnek azon beszámolók, mely e speciesek karbapenemekkel (imipenem, meropenem) szemben is rezisztenciát mutató törzsei által okozott fertõzésekrõl számolnak be (Tseng et al. 2002, Bindayna et al. 2006).

3.4.2.5. Stenotrophomonas maltophilia A S. maltophilia a legkorábbi irodalmak szerint mérsékelt patogenitású, az elmúlt évtizedben azonban fontos nozokomiális patogénné vált. Az egyéb extrinsic rizikófaktorok közül kiemelendõ a megelõzõ, leginkább széles spektrumú antibiotikumok használata - fõleg a karbapenemeké -, melyek szelekciós nyomást gyakorolva a mikróbákra, a kommenzális mikroorganizmusokat

elpusztítva

fontos

prediszponáló

tényezõ

az

általa

okozott

kolonizációra, majd fertõzésre (Morrison et al. 1986, Elting et al. 1990, Villarino et al. 1992, Victor et al. 1994, Laing FPY 1995). A klinikai szindrómák spektruma egyre szélesedik. Számos törzs izolálható a kórházi környezetbõl, ezek gyakran jellemzõen különböznek a klinikai mintákból izolálható törzsektõl. Emiatt azt tartják, hogy a fertõzés bekövetkezte inkább sokféle környezeti törzs valamelyikétõl alakul ki, mint keresztfertõzés miatt. Az irodalomban kevés számú nozokomiális járványt (kontaminált dializáló katéter által okozott, kontaminált jégkocka) írtak le, a betegrõl-betegre való terjedés igen ritka, de megtalálható (Viedma et al. 1999). A leggyakoribb megbetegedés a pneumónia és a véráramfertõzés. Mind a kettõ magas halálozással jár (69-41 %). Európai surveillance adatok alapján pneumóniában négyszer gyakrabban lehetett izolálni, mint bakterémiában. Figyelemre méltó, hogy a vizsgált periódus alatt a S. maltophilia izolálási gyakorisága nõtt (Gales et al. 2001). A kórokozónak tulajdonítható letalitás tekintetében pontos adatok nehezen nyerhetõk, mert az érintett betegek súlyos alapbetegségben szenvednek és gyakran egyéb mikróbákkal együtt tenyészik ki a kórokozó. Egy retrospektív vizsgálat a csak S. maltophilia által okozott monobakteriális véráramfertõzéseket vizsgálva 26 %-os letalitási értéket talált (Senol et al. 2002). Speciális a bakterémiához társuló metasztatikus cellulitis, mely lehet ecthyma gangrenosum megjelenésû (P. aeruginosához hasonló), vagy noduláris bõrelváltozás, melyet leukémiás betegekben írtak le, mint rossz prognosztikai jelû, disszeminált gombafertõzéshez hasonló kórképet. Cisztikus fibrózisban szenvedõk köpetmintáiból hosszasan izolálható, mint kolonizáló, különösen a mukoid fenotípusú, biofilmképzõ törzsei (O’Brien et al. 1982, Krzewinski et al. 2001). 26

Egyéb fertõzések is valamilyen prediszponáló tényezõ megléte, a S. maltophilia törzsek speciális virulencia faktorai (biofilmképzés) miatt alakulnak ki: endocarditis, szemészeti fertõzések, húgyúti fertõzések, peritonitis. Magasfokú természetes rezisztencia jellemzõ rá szerkezetileg különbözõ családba tartozó szélesspektumú antibiotikumokra. A S. maltophilia veleszületett ß-laktám és karbapenem rezisztenciájáért a konstitutíve és indukálhatóan is termelõdõ kromoszomális L1 és L2 ß-laktamáz felelõs, mely rezisztencia genetikai háttere rendkívül összetett, heterogén. Vannak, akik kísérletesen igazolták, hogy nem zárható ki az L1 és L2 enzim(ek) plazmidos átvitele lehetõsége sem (Avison et al. 2001). Korábban feltételezték, hogy mivel a különbözõ ß-laktamázok kísérletesen szinkron indukálhatók, ez feltételez egy közös regulációs rendszert, mások azonban kizárták ennek lehetõségét (Avison et al. 2002). Aminoglikozidokkal szembeni teljes rezisztenciájáért a csökkent felvétel, a hõmérsékletfüggõen megváltozott külsõ membrán, lebontó enzimek termelése (6’-Nacetyltranszferáz,

O-nucleotidyltranszferáz)

a

felelõs.

Kinolonokkal

szembeni

rezisztenciához a külsõ membrán proteinek mennyiségi és minõségi változása vezet mutációs háttérrel. Jellemzõ a kezelés során kinolon-rezisztens törzsek szelektálódása, kérdéses a klinikai hatékonysága, bár az újabb származékok, különösen a levofloxacin és moxifloxacin kecsegtetõek (Rolston et al. 2005). Kloramfenikollal, tetracyclinnel szembeni rezisztencia hátterében effluxmechanizmus bizonyított. Számos multidrug efflux rendszert identifikáltak S. maltophilia izolátumokból, mely mechanizmusokkal minden antibakteriális szerrel szembeni rezisztencia kialakulhat (Zhang et al. 2001, Li XZ 2002). „Drug of choice”- ként hagyományosan a trimethoprim-sulfamethoxazol választható, sajnálatosan azonban nõ az ezzel szemben is rezisztens egyedek száma. Számos egyedi és nagyszámú összefoglaló vizsgálat eredménye számol be a multirezisztens S. maltophilia izolátumok megjelenésérõl, számuk aggasztó növekedésérõl (Gales et al. 2001). Definíció szerint multirezisztens a S. maltophilia izolátum, ha rezisztens trimethoprim-sulfamethoxazolra is. A rezisztenciavizsgálatok késõbb ecsetelt nehézségei miatt gyakran retrospektív vizsgálatokon és anekdótákon alapul a kezelés. Összességében keveset tudunk róla, különösen virulencia-faktorairól.

Nagyfokú

antibiotikum-rezisztenciája,

annak

meghatározási

problémája állandóan arra serkenti a mikrobiológusokat, hogy találjuk meg a legmegfelelõbb módszert antibitikum-érzékenységi vizsgálatához és derítsük fel a terjedési mechanizmusát környezetünkben.

27

3.5. Fontosabb rezisztencia mechanizmusok a nozokomiális kórokozók körében

3.5.1. Meticillin rezisztencia A meticillin és egyéb -laktamáz stabil penicillinek bevezetése a klinikai gyakorlatba a meticillin-rezisztens S. aureus megjelenését eredményezte. Az elsõ MRSA törzset 1961-ben izolálták Angliában. Egy meticillin-érzékeny S. aureusnak a mec Staphylococcus kromoszómális kazettán (SCCmec) elhelyezkedõ mecA gént kell akvirálnia ahhoz, hogy MRSA-vá alakuljon. A SCCmec egység hordozza a mec gén komplexet, mely a mecA gént és regulátorait (mecI, mecR1) tartalmazza, valamint a ccr gén komplexet, mely a helyspecifikus rekombinázokat (ccrA and ccrB) kódolja. Ezek a SCCmec mobilitásában játszanak szerepet és biztosítják a gén kicserélõdés lehetõségét a Staphylococcus speciesek és törzsek között. Eddig hat különbözõ SCCmec típust azonosítottak. A kórházi MRSA (hospital aquired HA-MRSA) törzsek általában a SCCmec I, II vagy III típusát hordozzák, míg a közösségi MRSA (community aquired CA-MRSA) törzsek leggyakrabban a SCCmec IV vagy V típusát. Újabban több vizsgálat is kimutatta a SCCmec IV típusú MRSA törzsek növekvõ elõfordulását egészségügyi környezetben, vagyis egy dinamikus változás tapasztalható a CAés HA-MRSA törzsek között. A mecA gén által kódolt módosult penicillinkötõ fehérje, a PBP2a (PBP2’) funkciója a S. aureus peptidoglikán szintézisében a transzpeptidáz aktivitás. A PBP2a kötõdési affinitása a

-laktám antibiotikumokhoz csökkent, ezért a peptidoglikán szintézist a

-laktámok

jelenlétében is lehetséges. Minden mecA gén pozitív S. aureus törzs rezisztenssé válik minden -laktám antibiotikummal szemben. Az MRSA törzsek heterogén populációkból származnak, melyben fõleg meticillin érzékeny, valamint borderline-rezisztenciájú és csak kis mértékben meticillin rezisztens S. aureus szubpopulációk vannak. A magas meticillin rezisztenciát mutató mutánsok gyakorisága 1 a 104 vagy 105-hez. Ezt a rezisztencia mintázatot hívják heterorezisztenciának. Az MRSA és az MSSA törzsek közötti különbségek alapján – tekintve a sejtproliferációs kinetikát, a celluláris struktúrát, a slime és biofilm képzést, a sejtfelszíni adhezineket, az enzimkészletet, a szuperantigén exotoxinokat és a citotoxinokat (különösen a Panton-Valentin leukocidint és az

-, - és -variáns-haemolysineket) – felmerül a kérdés,

hogy a meticillin rezisztens törzsek virulensebbek-e a meticillin érzékenyeknél. A válasz nehéz, hiszen több szempontot kell figyelembe venni, köztük az ellentmondásos kísérleti eredményeket is (Rozgonyi et al. 2007, Kocsis et al. 2010).

28

A fõ különbség az MRSA és MSSA coccusok között az antibiotikum érzékenységi mintázat. Az MRSA gyakran egyéb antibiotikummal/antibiotikum családdal szemben is rezisztenciát

mutat,

jellegzetesen

makrolidokkal,

linkozamidokkal,

kinolonokkal,

aminoglikozidokkal szemben is, méltán kiérdemelve a polirezisztens nevet. Eddig még a magyarországi MRSA törzsek a trimethoprim-sulfamethoxazolra, illetve a glikopeptidekre (vancomycin, teicoplanin) megõrizték érzékenységüket.

3.5.2. Glikopeptid rezisztencia Az antibiotikum használat által indukált rezisztencia megjelenésére jó példa, hogy 1997-ben, Japánban izolálták az elsõ vancomycinre már csökkent érzékenységet mutató S. aureust (vancomycin intermediate sensitive S. aureus: VISA; GISA: glycopeptide intermediate sensitive S. aureus) egy krónikus fertõzés miatt többhetes vancomycin kezelést kapott betegbõl. A magas szintû glikopeptid rezisztencia ritka, különösen a S. aureus törzsekben, melyekbõl ez idáig csak néhányat izoláltak. A glikopeptid rezisztencia általában heterorezisztencia formájában jelenik meg. A tartós, nem megfelelõ szérum koncentrációt biztosító glikopeptid terápia fontos szelekciós tényezõ a rezisztencia megjelenésében. Egyelõre nem tudni, hogy milyen mértékben terjednek el, illetve bukkannak fel máshol, de hatásos kezelési lehetõség hiányában megjelenésük súlyos következményekkel járhat. Az elsõ hazai hetero-VISA törzset, melyet egy fatális kimenetelû fertõzésbõl izoláltak, 2008-ban írták le (Tóth et al. 2008). A glikopeptidekkel szembeni rezisztencia és csökkent érzékenység gyakoribb a CNS törzseknél, mint S. aureus-okban. A glikopeptid rezisztencia in vitro vizsgálatai szerint a rezisztencia érintheti az egyes glikopeptideket külön-külön, de megnyilvánulhat rezisztencia egyszerre mindkét glikopeptiddel szemben is. Különösen a CNS-nél detektálhatunk viszonylag gyakrabban teicoplanin mérsékelt érzékenységet vagy rezisztenciát, megtartott vancomycin rezisztencia mellett. A glikopeptid rezisztencia hátterében nem azok a gének (pl. vanA, vanB) állnak, amelyek az enterococcusok glikopeptid rezisztenciájáért felelõsek, bár izoláltak már ilyen Staphylococcus törzseket is. A staphylococcusok alacsony szintû glikopeptid rezisztenciája valószínûleg multifaktoriális eredetû, nem teljesen tisztázott mechanizmusokból összetevõdõ rezisztencia. Hátterében a baktériumok sejtfalában bekövetkezõ szerkezeti változásoknak – sejtfal vastagodása, csökkent mennyiségû és megváltozott szerkezetû keresztkötések kialakulása, fals antibiotikum kötõhelyek megjelenése és ezekhez való fokozott kötõdés,

29

sejtfal prekurzorok fokozott termelése – lehet elsõsorban szerepe, egyes vizsgálatok a PBP2 koncentrációjának emelkedését is detektálták.

3.5.3. Kiterjedt spektrumú -laktamáz termelés (ESBL) A széles spektrumú cefalosporinokra kiterjedõ rezisztencia a Gram-negatív baktériumok között, különös tekintettel az Enterobacteriaceae család tagjaira, az egész világra kiterjedõ problémává vált a kiterjedt spektrumú ß-laktamázok (extended spectrum lactamase, ESBL-ek) és az AmpC-típusú ß-laktamázok megjelenését követõen. Ma már több mint 300 különbözõ ESBL enzim ismert. Ezek az enzimek világszerte jelen vannak, elsõsorban plazmid által kódoltak, és az Enterobacteriaceae család tagjai között elterjedtek, de P. aeruginosa törzsekben is megfigyelték õket. Jelenleg a TEM- és SHV-típusú ESBL-ek között több mint 260 variánst, a CTX-M ESBL-nél több mint 65 típust és az ún. minor ESBLek (VEB, GES, PER, SFO-1, TLA-1, TLA-2, BES-1, BEL-1) esetében több mint 20-félét írtak le. Az ESBL enzimek hidrolizálják a Gram-negatív ellenes penicillin származékokat, az elsõ, második, harmadik és negyedik generációs cephalosporinokat és a monobaktámokat. Nem képesek hidrolizálni a cephamycineket és a karbapenemeket. Aktivitásuk különbözõ enzim

gátlószerekkel

-

klavulánsav,

tazobaktám,

szulbaktám

-

jól

gátolható.

Csoportosításukra számos besorolási sémát írtak le, leggyakrabban az úgynevezett Bush-féle módszert alkalmazzák (1. táblázat). Az ESBL-termelõ mikroorganizmusok gyakran többféle ß-laktamáz enzimet termelnek. Ez jelentheti különbözõ ESBL enzimek és nem ESBL enzimek termelését, többféle azonos típusú ESBL enzim termelését (például többféle TEM-típusú ESBL termelését egyazon izolátumban), vagy egy kromoszómálisan kódolt SHV-1 és egy SHVtípusú ESBL termelését. Egy általunk vizsgált Enterobacter cloacae izolátumban AmpC, TEM-1, SHV-7 és SHV-30 ß-laktamázok együttes termelését mutattuk ki. Ez volt az elsõ igazolása az SHV-30 termelésnek Enterobacter izolátumban és az elsõ beszámoló két különbözõ SHV enzimet termelõ E. cloacae izolátumról (Szabó et al. 2005). Számos módon elkülöníthetõk a különbözõ ß-laktamáz típusok egyetlen izolátumban. Az analitikai izoelektromos fókuszálás segítséget nyújthat az adott izolátum által termelt ßlaktamáz enzimek jelenlétének és izoelektromos pontjának (pI) meghatározásában. A blaSHV, blaTEM és blaCTX-M stb. gének amplifikálása és szekvenálása a leggyakrabban alkalmazott eljárás a speciális enzim-termelés genetikai meghatározásában. Az azonos típusba tartozó többféle ß-laktamáz detektálásához megfelelõ módszer a bla gének nagymértékû klónozása és szekvenálása. 30

1. Táblázat. -laktamáz enzimek fõbb csoportjai a különbözõ besorolási sémák, preferált szubsztrátok és specifikus gátlószerekkel való gátolhatóságuk alapján BushJacoby- 1989 Bush Richmond- Molekuláris Medeiros Syles osztály csoport 1 1 Ia, Ib, Id C

Preferált szubsztrátok

Gátlószerek Ca EDTA

Cefalosporinok

-

-

2a

2a

NI

A

Penicillinek

+

-

2b 2be

2b 2b'

III NI

A A

+ +

-

2br 2c 2d 2e

NI 2c 2d e

NI II, V V Ic

A A D A

Penicillinek, cefalosporinok Penicillinek, szûk és kiterjedtspektrumú cefalosporinok, monobaktámok Penicillinek Penicillinek, carbenicillin Penicillin, cloxacillin Cefalosporinok

+

-

2f

NI

NI

A

+

-

3

3

NI

B

Penicillinek, cefalosporinok, karbapenemek Legtöbb ß-laktám, beleértve a karbapenemeket is

-

+

Penicillinek

-

?

4 4 NI NI: nem tartalmazza, Ca: klavulánsav

ND

31

+

Enzimek

Gram-negatív baktériumok AmpC enzimei Gram-pozitív baktériumok penicillinázai TEM-1, TEM-2, SHV-1 TEM-, SHV-, CTX-M és az ún. minor ESBL-ek TEM-30, TEM-36, TRC-1 PSE-1, PSE-3, PSE-4 OXA-1, OXA-11, PSE-2 (OXA-10) Proteus vulgaris indukálható cefalosporináza Enterobacter cloacae NMC-A enzim, Serratia marcescens Sme-1 enzim MBL-enzimek (VIM, IMP, GIM, stb), Stenotrophomonas maltophilia L1, Bacteroides fragilis CcrA enzim Pseudomonas cepacia penicillináza

3.5.4. Karbapenem rezisztencia ESBL-termelõ,

multirezisztens

Enterobacteriaceae

törzsek

terjedésével

a

karbapenemek váltak a Gram-negatív baktériumok okozta súlyos fertõzések antibiotikum terápiájának egyik utolsó hatékony eszközévé. Azonban a megemelkedett karbapenem használat következtében egyre gyakoribbak az e szerekkel szemben is rezisztens baktériumok. A karbapenem rezisztens nem-fermentáló Gram-negatív kórokozók (Pseudomonas spp., Acinetobacter spp.) megjelenése után, karbapenem rezisztens Enterobacteriaceae törzseket is izoláltak már. A legjelentõsebb karbapenemázok a szerin típusú KPC (K. pneumoniae carbapenemase) enzimek, melyek klavulánsavval gátolhatók; illetve a metallo- -laktamázok (MBL), melyek aktivitása EDTA-val (etilén-diamin-tetraecetsav) függeszthetõ fel. Az MBL csoport legjelentõsebb tagjai a VIM-, IMP- típusú MBL-ek. Mióta az elsõ VIM típusú metallo- -laktamázt termelõ P. aeruginosa törzset izolálták Veronában (Lauretti et al. 1999), ezt az enzimet világszerte gyakran kimutatják P. aeruginosa és Acinetobacter fajokban. Az elsõ VIM-termelõ K. pneumoniae törzset 2002-ben azonosították Görögországban (Giakkoupi et al. 2003). Azóta a VIM-típusú metallo- laktamázokat már több Enterobacteriaceae fajban is identifikálták, fõleg K. pneumoniae fajokban. Miután az elsõ VIM-4-et detektálták P. aeruginosa-ban 2001-ben Görögországban (Pournaras et al. 2002), egy importált VIM-4 termelõ P. aeruginosa került felfedezésre Magyarországon is 2002-ben, melyet egy görög betegbõl izoláltak. A 2005-ben végzett multicentrikus hazai felmérés kimutatta, hogy a VIM-4 termelõ P. aeruginosa törzsek a vizsgált 85 kórházból hétben már megtalálhatók voltak. Egy VIM-4 termelõ Aeromonas hydrophilát is azonosítottak hazánkban 2005-ben, ami ezen fajban világszerte az elsõ kimutatott MBL termelõ volt (Libisch et al. 2006, Libisch et al. 2008).

32

3.5.5. Kinolon rezisztencia A kinolon-rezisztencia bélbaktériumok körében, fõleg E. coli esetén tapasztalt magas prevalenciáját már leírták Európában, Amerikában és Ázsiában. Az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumokban a kinolon-rezisztencia általában a kromoszómálisan kódolt II. típusú topoizomerázok, efflux pumpák vagy porin-kapcsolt fehérjék génjében történt mutációk következménye. K. pneumoniae és E. coli esetén a kinolon-rezisztencia gyakrabban fordul elõ plazmidon kódolt ESBL termelõ törzsek között, mint ESBL-negatív törzseknél, ami az egyes rezisztencia mechanizmusok koordinált expressziójának tulajdonítható. A közelmúltban megfigyeltek átvihetõ, plazmidon elhelyezkedõ kinolon-rezisztencia géneket — qnrA, qnrB, qnrS, az aac(6’)-Ib cr változata, qepA és oxqB — klinikai izolátumokban, leggyakrabban plazmid-mediált ESBL-termelõ törzsekben. A Qnr determinánsok három fõbb csoportját, a QnrA-t, QnrB-t és QnrS-t különbözõ bélbaktérium fajokban azonosították világszerte. A Qnr egy 218 aminosavból álló fehérje, amely a pentapeptid-repeat családba tartozik és azáltal védi a DNS-t, hogy gátolja a kinolonok kötõdését a girázhoz és a topoizomeráz IV-hez.

33

4. Célkitûzések 1. A különbözõ baktériumok izolálási gyakorisága (a rezisztenciája mellett) nagyon függ a betegpopulációtól, a kezelõ osztályoktól, sõt a geográfiai helytõl is. Ezt kívántuk demonstrálni

a

nozokomiális

fertõzésekbõl

származó

különbözõ

klinikai

minták

laboratóriumunkban végzett mikrobiológiai vizsgálatával nyert eredmények összegzésével. Célunk volt feltérképezni az elmúlt tíz év során megfigyelhetõ változásokat a kórokozó mikróbák spektrumában és a rezisztencia mértékében, különös tekintettel a perinatális intenzív centrumokban ápolt betegek késõi szepszisének hátterében. Célunk volt továbbá a nozokomiális húgyúti fertõzések prevalenciájának és az uropatogének antibakteriális rezisztenciájának megállapítása, illetve a betegpopulációtól való függõségének vizsgálata. 2. Az MRSA és MSSA törzsekre vonatkozó rezisztencia adatok külön-külön történõ megadása kiemelkedõen fontos. Ezen túl a betegpopulációtól, geográfiai helytõl való különbség is jellegzetes lehet. Az összehasonlítás érdekében célunk volt elvégezni saját laboratóriumunkban izolált, valamint Ausztriából és Macedóniából származó MSSA és MRSA törzsek mikrobiológiai vizsgálatait, illetve retrospektív epidemiológiai analízisét. 3. Mivel jelentõs számú kolonizációt és súlyos fertõzést okozó S. haemolyticus törzset azonosítottunk a Semmelweis Egyetem klinikáinak intenzív osztályain kezelt betegek mintáiban és különösen aggasztónak találtuk a neonatális intenzív osztályon kezelt betegek hemokultúráiból izolált, csökkent teicoplanin érzékenységet mutató S. haemolyticus törzsek megemelkedett számát, célul tûztük ki, hogy felmérjük a Semmelweis Egyetem klinikáin 2001 és 2008 között kezelt betegek véráram fertõzéseiben szerepet játszó S. haemolyticus törzsek epidemiológiáját. Emellett célunk volt, hogy meghatározzuk a S. haemolyticus törzsek antistaphylococcalis szerekkel, különösen a teicoplaninnal szembeni rezisztenciájának arányát és mértékét, kimutassuk az epidémiás fenotípusos antibiotikum rezisztencia mintázatokat, és megvizsgáljuk a PFGE genotípusok és fenotípusos rezisztencia mintázatok összefüggését. 4. A TEM- és SHV-típusú ESBL-t termelõ K. pneumoniae törzsek fontos kórokozókká váltak a kórházi fertõzésekben, multirezisztenciájuk miatt, illetve mert egyre több járványt okoznak a kórházakban, elsõsorban a koraszülött intenzív osztályokon. Ezért célunk volt egy ötéves követéses molekuláris epidemiológiai vizsgálat során meghatározni az ESBL-termelõ Klebsiella fajok molekuláris epidemiológiáját a Semmelweis Egyetem II. számú Perinatális Intenzív Centrumában. Egyidejûleg, retrospektív módon vizsgálni kívántuk a fertõzések rizikófaktorait és a mortalitást is.

34

5. A metallo- -laktamáz termelõ P. aeruginosa és Acinetobacter speciesek mellett világszerte egyre növekvõ problémát jelentenek MBL-termelõ Enterobacteriaceae törzsek is. 2009-ben imipenem vagy meropenem nem-érzékeny Klebsiella spp. nem került izolálásra, de két karbapenem érzékeny Klebsiella törzsrõl a szûrõ és konfirmáló tesztek alapján bebizonyosodott, hogy MBL-termelõ. Célunk volt jellemezni az elsõ magyar MBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca izolátumokat. 6. Annak ellenére, hogy a kinolon rezisztencia általában kromoszómán kódolt, világszerte emelkedik a ciprofloxacin rezisztens ESBL-termelõ törzsek aránya. Az utóbbi években több plazmidon kódolt kinolon rezisztencia gént (qnrA, qnrB, qnrS és aac(6’)-Ib-cr) írtak le. Célunk volt a qnrA, qnrB, qnrS és aac(6’)-Ib-cr gének prevalenciájának meghatározása magyarországi ESBL-termelõ izolátumok között. 7. A S. maltophilia fontos nozokomiális humán patogén. Nagyfokú antibiotikumrezisztenciája, annak meghatározási problémája miatt célunk volt a laboratóriumunkban izolált törzsek különbözõ módszerekkel történõ antibiotikum érzékenységi vizsgálata, az egyes módszerek összehasonlítása, különös tekintettel a magyar klinikusok számára hozzáférhetõ antibakteriális szerek vonatkozásában.

35

5. Módszerek

5.1. Baktériumtörzsek azonosítása, tárolása A vizsgált baktérium törzsek species szintû azonosítása laboratóriumunkban a fajnak megfelelõ klasszikus biokémiai próbák (kataláz, oxidáz, stb.) mellett identifikáló automata/félautomata rendszerekkel történtek: ATB és API rendszerek, VITEK I, VITEK II (BioMerieux). A baktérium törzseket 20 % glicerint tartalmazó Tryptic Soy Broth-ban (TSB) tároltuk -80oC-on a késõbbi feno- és genotípusos vizsgálatokig. A fagyasztócsövekbe szilárd véresagar lemezen nõtt éjszakás tenyészetekrõl szuszpendáltuk a baktériumokat vatta tampon segítségével, a csöveket vortexeltük, majd a fagyasztás elõtt egy óra hosszat 37oC-on állni hagytuk.

5.2. Antibiotikum érzékenységi vizsgálatok Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatokat a Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards (CLSI/NCCLS), valamint a European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) aktuális évi, érvényben lévõ nemzetközi ajánlásai alapján végeztük és interpretáltuk. A vizsgálatok kivitelezése az ajánlásoknak megfelelõen kontroll törzsekkel, ellenõrzött táptalajokon, nemzetközi standardoknak megfelelõ körülmények között történtek, korongdiffúziós és mikrodilúciós módszerekkel, valamint E-teszttel.

5.2.1. Korondiffúzióval végzett érzékenységi vizsgálatok A Kirby-Bauer-féle korongdiffúziós vizsgálatok során a fajspecifikusan az alábbi antibiotikum-tartalmú korongokat alkalmaztuk: ampicillin (10

g), aztreonam (30

g),

cefixim (5 g), cefepim (30 g), cefoxitin (30 g), cefotaxim (30 g), cefpodoxim (10 g), ceftazidim (30 g), ceftriaxon (30 g), amoxicillin-klavulánsav (20/10 g), ertapenem (10 g), imipenem (10

g), meropenem (10

g), norfloxacin (10

g), nalidixsav (30

g),

ofloxacin (5 g), levofloxacin (5 g), gatifloxacin (5 g), ciprofloxacin (5 g), moxifloxacin (5 g), tetracyclin (30 g), chloramphenicol (30 g), streptomycin (10 g), trimethoprimsulfamethoxazol (1.25/23.75 g), gentamicin (10 g), tigecyclin (10 g), polymyxin B (10 g), colistin (10

g). A kapott zónaátmérõt a kontroll törzsekkel végzett, standardizált

körülmények között kapott eredményekhez hasonlítva, érzékeny, mérsékelten érzékeny és rezisztens eredményt kaptunk. Az epidemiológiai összegzéseknél a baktériumoknak az adott

36

antimikróbás szerre való érzékenységének megadásakor két kategóriát használtunk: érzékeny és nem érzékeny (mérsékelten érzékeny és rezisztens).

5.2.2 Minimális gátlókoncentráció (MIC) meghatározása

MIC érték meghatározása E-teszttel A cefotaxim, cefotaxim-klavulánsav, ceftazidim, ceftazidim-klavulánsav, cefepim, cefoxitin, nalidixsav, ciprofloxacin, levofloxacin, trimethroprim-sulfamethoxazol, colistin, imipenem és meropenem, gentamicin és amikacin MIC-értékeket az antibiotikumokat meghatározott koncentrációgradiensben tartalmazó csíkokkal, a gyártó elõírásainak megfelelõen

alkalmazva

(AB

Biodisk,

Solna,

Svédország)

határoztuk

meg

az

Enterobacteriaceae törzsek esetében.

MIC érték meghatározása mikrodilúciós módszerrel A MIC értékek meghatározásához a CLSI/NCCLS ajánlásainak megfelelõen kationnal kiegészített Mueller-Hinton (MH) levest alkalmaztunk (BioRad) mikrotitráló lemez vájulataiban, 0.1 ml végtérfogatban. A hígítási sorozatot úgy terveztük meg, hogy a kiinduló koncentráció a várható MIC-értéknél 3-4-szer nagyobb, illetve a sorozat utolsó hígításának koncentrációja a várható legkisebb MIC-értéknél 3-4-szer kisebb legyen. Minden esetben méréseink a vizsgált baktériumoknak megfelelõ kontroll törzsekkel párhuzamosan történtek. A kontroll törzsek a következõk voltak: S. aureus ATCC 29213 (MSSA), E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, P. aeruginosa ATCC 27853 , K. pneumoniae ATCC 700603 (ESBL-pozitív), S. aureus ATCC 33591 (MRSA). A S. haemolyticus törzsek oxacillin, vancomycin, teicoplanin, erythromycin, clindamycin, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol, doxycycline, ciprofloxacin és linezolid érzékenységét, a S. aureus törzsek oxacillin, vancomycin, amikacin, gentamicin, clindamycin, clarithromycin, ciprofloxacin, levofloxacin és moxifloxacin érzékenységét határoztuk meg mikrodilúciós módszerrel. Klebsiella spp. izolátumaink ceftazidim, cefotaxim, cefepim, imipenem, meropenem, ciprofloxacin, gentamicin és amikacin antibiotikumokra vonatkozó MIC értékének meghatározása is ezzel a módszerrel történt. A S. maltophilia törzsek esetében a ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, colistin, polymyxin B, trimethoprim-sulfamethoxazol, tigecyclin, doxycyclin vizsgálata történt mikrodilúciós módszerrel. Az egyértelmû nemzetközi ajánlások hiánya miatt a különbözõ 37

antibiotikumok MIC–einek értékelése 24 és 48 óra elteltével is megtörtént. Szintén ezen ok miatt a rezisztens/mérsékelten érzékeny/rezisztens kategóriák meghatározásánál nemcsak a CLSI, hanem az EUCAST és a BSAC (British Society for Antimicrobial Chemotherapy) ajánlásait is figyelembe vettük, illetve jellemeztük az ezeknek megfelelõ interpretációs különbségeket.

5.3. Speciális rezisztenciamechanizmusok vizsgálata fenotípusos módszerekkel

ESBL termelés fenotípusos vizsgálata Izolátumaink ESBL termelésének fenotípusos szûrését, illetve az ESBL termelés megerõsítését a CLSI nemzetközi ajánlása alapján végeztük. ESBL-termelés szûrésére végzett kettõs korong diffúziós teszt során a MH agaron elkészített baktériumpázsitra egymástól 20-30 mm-re (középpont a középponttól) helyezünk klavulánsavat tartalmazó korongot és ceftazidim, cefepim, ceftriaxon, cefotaxim, aztreonam korongot. Az inkubációs idõ után a

-laktám antibiotikumok körüli gátlási zóna jellemzõ

torzulása („kulcslyuk” jelenség) jelzi ESBL jelenlétét. (1. Kép)

1. Kép ESBL-termelés fenotípusos szûrése korong diffúziós módszerrel. AMC: amoxicillin/klavulánsav, ATM: aztreonam, CTX: cefotaxim, CRO: ceftriaxon, CAZ: ceftazidim ESBL termelés fenotípusos megerõsítésére konfirmáló tesztként a cefalosporin mellett klavulánsavat is tartalmazó speciális (kettõs, kombinált) korongokat alkalmaztuk: ceftazidimklavulánsav, cefotaxim-klavulánsav, ceftriaxon-klavulánsav (minden esetben 30/10 µg; BioRad). Pozitív eredménynek vettük, ha az antibiotikumot önmagában tartalmazó korong 38

körül mért gátlási zónához képest (ceftazidim 30 g, cefotaxim 30 g, ceftriaxon 30 g) az antibiotikum-klavulánsav körüli gátlási zóna átmérõje több mint 5mm-rel nõtt. E-teszttel is meghatároztuk a pozitív kettõs korongdiffúziós tesztet eredményezõ törzsek esetén a cefotaxim, a ceftazidim és a cefepim MIC-értékét és összehasonlítottuk a ceftazidimklavulánsav, cefotaxim-klavulánsav és a cefepim-klavulánsav tartalmú E-tesztcsíkok esetén kapott értékekkel. A kombinált antibiotikum használata esetében a legalább hármas léptékû MIC koncentráció csökkenést értékeltük pozitívnak.

MBL termelés fenotípusos vizsgálata Az MBL-termelés szûrésére végzett kettõs korong diffúziós teszt során technikailag ugyanúgy jártunk el, mint az ESBL-szûrésnél, azonban cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem korongokat helyeztünk 20 és 30 mm távolságra (középpont a középponttól) az EDTA-t tartalmazó korongtól. Itt is a „kulcslyuk” jelenséget tekintettük pozitívnak. Az MBL-termelés megerõsítésére végzett teszt során technikailag ugyanúgy jártunk el, mint az ESBL-szûrésnél, azonban cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem korongokra cseppentettünk az EDTA-t (5 µl-t 0. 05M-os oldatból). Párhuzamosan csak EDTA-t tartalmazó korong körül is lemértük a gátlási zónát, hogy az EDTA baktériumnövekedésre gyakorolt gátló hatását is figyelembe vegyük. Akkor tekintettük MBL termelésre pozitívnak az izolátumot, ha az antibiotikum - cefepim, ertapenem, imipenem és meropenem – és EDTA kombinációs korong körül kialakult gátlási zóna átmérõje legalább 5 mm-rel meghaladta az antibiotikumot önmagában tartalmazó korong körül és EDTA-t önmagában tartalmazó korong körül mért gátlási zóna átmérõjének összegét. (2. Kép) Az MBL-termelés megerõsítésére módosított Hodge-tesztet is alkalmaztunk. A vizsgálat elve, hogy a karbapenemáz termelõ törzs a közvetlen környezetében képes bontani a karbapenemeket, és ebben a szûk zónában képes kinõni az ATCC 25922 E. coli törzs is. Imipenem, meropenem és ertapenem (10 µg) korongok mellett vizsgáljuk a karbapenemáztermelésre gyanús törzseket, a fent említett E. coli törzs növekedését figyelembe véve. Pozitív eredmény esetén a vizsgált törzs csíkja mellett a karbapenem korong irányába E. coli benövés látható. (3. Kép)

39

2. Kép MBL-termelés konfirmálása imipenem/imipenem+EDTA és meropenem/meropenem+EDTA korongokkal az általunk izolált K. pneumoniae KP3686 törzs esetén

KP3686

KP3686

KP ATCC BAA-1705

KP ATCC BAA-1706

3. Kép MBL-termelés konfirmálása módosított Hodge-teszttel az általunk izolált K. pneumoniae KP3686 törzs esetén. Pozitív kontroll: K. pneumoniae ATCC BAA-1705. Negatív kontroll: K. pneumoniae ATCC BAA-1706.

40

Glikopeptid érzékenység speciális vizsgálata A S. haemolyticus törzseknél a vancomycin és teicoplanin MIC értékek mérése mellett 6 µg/ml vancomycin tartalmú Brain Heart Infusion (BHI) agart használtunk a glikopeptidre csökkent érzékenységet mutató törzsek kiszûrésére, a CLSI irányelvei szerint (CLSI 2009). Módosított populáció analízis profilt (PAP) szintén végeztünk (Walsh módszere alapján), hogy meghatározzuk a törzsek vancomycin heterorezisztenciáját (Walsh et al. 2001). Minden teszt minta vizsgálata a kontrollként szolgáló Mu 3 (vancomycinre heterogén rezisztencia tulajdonságú nemzetközi MRSA kontroll törzs) és ATCC 29213 S. aureus törzsekkel együtt történt. A vizsgálat során az adott törzs pontosan beállított sûrûségû (104 CFU/ml és 107 CFU/ml) szuszpenzióit kentük ki a különbözõ vancomycin tartalmú (0, 0.5, 1, 2, 2.5, 4, 8 µg/ml) táptalajokra. 48 órás inkubáció után az egyes táptalajokon kinõtt telepeket (Colony Forming Unit: CFU) megszámolva ki lehet számolni az adott koncentrációjú antibiotikumot túlélõ sejtek arányát a populációban. Ezeket fél-logaritmikus skálán az antibiotikum koncentráció függvényében ábrázolva kapjuk a populáció analízis eredményét. A kiértékelésnél a vizsgált törzsekhez tartozó görbék alatti területet (Area Under Curve: AUC) hasonlítjuk össze a Mu3 (ATCC 700698) pozitív kontroll törzs görbe alatti területével. Ha a kettõ aránya

0.9, akkor nincs rezisztencia vancomycinre nézve, 0.9 és 1.3 közötti

értéknél vancomycinre heterorezisztens az izolátum, ha > 1.3, akkor rezisztens (Wootton et al. 2001). Minden kísérletet kétszer ismételtünk.

5.4. Antibiotikum rezisztencia mintázatok megállapítása A S. haemolyticus törzsek rezisztencia fenotípusát egy számmal valamint egy alsó indexben lévõ betûvel határoztuk meg. A szám mutatja azon antibiotikumok számát, melyekre a törzs rezisztens a következõk közül: oxacillin, erythromycin, clindamycin, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol, doxycycline, ciprofloxacin, az alsó indexben lévõ betû jelzi a pontos antibiotikum kombinációt, melyre az izolátum rezisztens volt az antimikrobiális szerekkel szembeni rezisztencia alapján. A mérsékelt érzékenységet mutató izolátumokat rezisztensként kezeltük. A glikopeptidekkel szembeni nem-érzékenységet nem használtuk ebben a differenciálásban, mivel ezek hatékonyságának meghatározása több speciális vizsgálati módszert igényel. A multirezisztencia a következõként lett definiálva: az oxacillin rezisztencia mellett még legalább két, nem ß-laktámok antibiotikum osztállyal szembeni rezisztencia megléte.

41

5.5. A vizsgált törzsek genotípusos jellemzése

5.5.1. PCR amplifikálás és szekvenálás A Klebsiella törzsek esetén minden izolátumból egyetlen telepet elszuszpendáltunk 400 µl vízben és 15 percig forraltuk. A keletkezett felülúszót használtuk bakteriális templát DNS-ként a PCR-hez. A primer párok a korábban már leírtak voltak: blaTEM (Essack et al. 2001), blaSHV (Rasheed et al. 1997), blaCTX-M (Bonnet et al. 2000). (2. Táblázat) Az amplifikációt Progene Techne thermocycler géppel végeztük. Az amplifikált termék nukleotid-szekvenciáját az ABI 3700 és ABI 3100 genetikai analizátorok (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) segítségével, a gyártó leírása alapján határoztuk meg. A szekvencia analízis a Lasergene DNASTAR Sequencing Analysis program (DNAStar, Madison, Wis.) használatával történt. A S. haemolyticus és S. aureus törzsek meticillin rezisztenciáját a mecA gén PCR kimutatásával konfirmáltuk (Ünal et al. 1992). A baktérium törzsek egyéjszakás véres agar tenyészetébõl 6-8 telepet szuszpendáltunk el 300µl PBS (phosphate buffer solution) oldatba, majd centrifugálás történt 2 percig 14.000x fordulatszámon. A szedimenthez 50 µl lysostaphint (100 µg/ml) (Sigma-Aldrich), majd 10 perces 37 °C-os inkubálás után 50 µl proteinase-K-t (100 µg/ml) (Sigma-Aldrich), 150 µl TRIS puffert (0.1M TRIS, pH:7.5) adtunk. Inkubáció: 37 °C-on 10 percig. A proteinase-K inaktiválása céljából a mintákat TECHNE DRI-BLOCK PB2P thermo blokkban 10-15 percig forraltuk. Egy reakcióhoz a PCR keverék 1 µl DNS-t, 12.5 µl Red Taq Ready Mix-et, 0.5 µl forward primert, 0.5 µl reverse primert és 10.5 µl desztillált vizet tartalmazott. Az elektroforézishez 1.5%-os agaróz gélt készítettünk („Agarose for Routine Use„; Sigma -Aldrich) 1xTEA (2M TRIS, 1M EDTA, 28,55 ml acetic acid glacial) pufferrel. A PCR termékbõl 10 µl-t és a markerbõl 3 µl-t mértünk a gél zsebeibe. A mintákat 120 V-on 30 percig elektroforetizáltuk. A gélt etidiumbromid oldattal festettük és a gének jelenlétét UV fénnyel tettük láthatóvá. A gélképeket digitális fényképezõgéppel rögzítettük. Mivel a S. haemolyticus törzsek egy nagy része fenotípusosan teicoplanin rezisztens volt, a vanA és vanB géneket kerestük bennük PCR módszerrel (Dutka-Malen et al. 1995). Klebsiella törzsek esetén a PCR vizsgálatokhoz a blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaVIM és egyéb rezisztencia génekre (blaOXA-1, tetA, tetC, aac(3)-II, és aac(6)-Ib-cr) specifikus primereket, valamint a class 1 integronok 5’ és 3’ konzervatív régiójára specifikus primereket használtuk. A nukleotid szekvenciát ABI 3100 Genetic Analyzers segítségével határoztuk meg és az NCBI BLAST programmal (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/) elemeztük. 42

A kinolon rezisztencia felderítésére az ESBL-termelõ baktériumokban megvizsgáltuk a qnrA, qnrB, qnrS és aac(6’)-Ib cr gének jelenlétét PCR-rel. A qnr gén allélek megkülönböztetésére a PCR terméket tisztítás után BstF5I restrikciós enzimmel emésztettük meg és az eredményt szekvenálással erõsítettük meg. Az aac(6')-Ib-cr variánsban nincs a BstF5I enzimnek restrikciós helye, ellentétben a vad típussal. A vizsgálatokhoz alkalmazott primerek specifikációinak összefoglalását a 2. táblázatban adjuk meg.

2. Táblázat A vizsgált baktériumok speciális rezisztencia tulajdonságai genetikai hátterének vizsgálatakor alkalmazott primerek szekvenciái és a várható PCR termékek mérete

Gén bla TEM

Primer szekvencia (5' - 3') ATGAGTATTCAACATTTCCGTG TTACCAATGCTTAATCAGTGAG

PCR termék mérete 861 bp

bla SHV

GGTTATGCGTTATATTCGCC TTAGCGTTGCCAGTGCTC

867 bp

CGCTTTGCGATGTGCAG ACCGCGATATCGTTGGT

553 bp

mecA

GTTGTAGTTGTCGGGTTTGG CCACCCAATTTGTCTGCCAGTTTCTCC

180 bp

vanA

GGGAAAACGACAATTGC GTACAATGCGGCCGTTA

732 bp

vanB

ATGGGAAGCCGATAGTC GATTTCGTTCCTCGACC

635 bp

qnrA

TCAGCAAGAGGATTTCTCA GGCAGCACTATTACTCCCA

627 bp

qnrB

GATCGTGAAAGCCAGAAAGG ACGATGCCTGGTAGTTGTCC

469 bp

qnrS

ACGACATTCGTCAACTGCAA TAAATTGGCACCCTGTAGGC

417 bp

TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA CTCGAATGCCTGGCGTGTTT

482 bp

bla CTX-M

aac(6)-Ib

43

5.5.2. Pulzáló mezejû gélelektroforézis analízis

Klebsiella izolátumok A Klebsiella törzsek PFGE vizsgálat a korábban leírtaknak megfelelõen történt (Paterson et al. 2003). A genomiális DNS-t izoláltuk, majd emésztettük XbaI-gyel (New England Biolabs, Beverly, Mass.). A PFGE-t a CHEF III rendszerrel végeztük (Bio-Rad), 535 s kapcsolási és 30 h futtatási idõvel. A dendrogramok a BioNumerics (Bio-Rad) segítségével történt a Dice együttható, az „unweighted pair group method with arithmetic means” (UPGMA) felhasználásával és 1.3 % pozíció toleranciával. Az izolátumok összefüggését Tenover kritériumai alapján határoztuk meg (Tenover et al. 1995). A késõbb MBL-termelõnek bizonyult K. pneumoniae törzs XbaI-emésztett genomiális DNS-ének PFGE vizsgálatát a Damjanova és munkatársai által korábban leírtak szerint végeztük (Damjanova et al. 2008). A törzs MLST vizsgálata, hét housekeeping génnel, Diancourt és munkatársai szerint történt (Diancourt et al. 2005). Az allél szekvenciák és a szekvencia típusok megerõsítéséhez a http://pubmlst.org/kpneumoniae weboldalt használtuk. Staphylococcus haemolyticus izolátumok A S. haemolyticus törzsek PFGE vizsgálatát egy CNS-re kialakított belsõ protokoll szerint végeztük (Bradford et al. 2006). A S. haemolyticus törzsek 16 órán át 37°C –on véres agaron növekedtek. A DNS kivonás a sejtek lysostaphin-lízisével történt. A DNS restrikciót SmaI enzimmel végeztük, 25°C-on 3 órán át. A PFGE-hez 1%-os agaróz gélt használtunk. A gélfuttatás TBE pufferes közegben (1X Tris–borát-EDTA, pH:8.3) CHEF-DR-II géppel (BioRad) történt. Minden gélen az elsõ oszlopában lévõ Lambda DNA PFGE marker szolgált DNS méret standardként. Az elektroforézis a következõ beállításokkal történt: hõmérséklet 14 °C, idõ 21 óra, pulzus idõ 5 – 60 másodperc, szög 120°, feszültség 6 V/cm. A géleket etidium-bromid oldattal festettük és UVI tec készülékkel digitalizáltuk. A kapott DNS mintázatokat vizuálisan is értékeltük és a Diversity Database software 2.2.0 változatával is. A dendrogramok UPGMA osztályozással készültek, mely a sav-illesztés Dice koefficiensein (tolerancia

1%,

optimalizáció

1%)

alapulú

hasonlósági

rendszerrel

dolgozik.

A

megkülönböztethetetlen vagy nagyon hasonló sávmintázatot mutató izolátumokat ( 6 sáv különbség, >80% hasonlóság) Tenover és társai javaslata szerint feltehetõen klonális rokonságban lévõnek tekintettük (Tenover et al. 1995).

44

Staphylococcus aureus izolátumok A S. aureus izolátumok egyéjszakás véres agar tenyészetébõl egy kacsnyi baktériumot szuszpendáltunk 200 µl EC-Lysis pufferbe (1M NaCl, 100 mM EDTA, 6 mM Tris, 0.5% Brij58, 0.2% deoxycholate, 0.5% N-lauroyl sarcosine, pH:7,6) majd 100 µl lysozymet (20 mg/ml) (Sigma-Aldrich) és 17 µl lysostaphint (1 mg/ml) adtunk. 200 µl 2%-os EC-Lysis pufferben készített Low melting agarose-t (Bio-Rad) adtunk hozzá, agar blokkokat öntöttünk. Az agar blokkokat 37 °C-on 3 ml EC-Lysis pufferben 24 órán át inkubáltuk. Az ECLysis puffert leöntve ESTN pufferhez (0,5M EDTA, 1% N-lauroyl sarcosine, 10 mM Tris, 20 mM NaCl, pH:8.0) 10 µl 20 mg/ml koncentrációjú proteinase-K-t (Sigma-Aldrich) mértünk. Az agar blokkokat 24 órán át 50 °Con inkubáltuk. A proteinase-K inaktiválásához 7 µl PMSF-t (100 mM) (Sigma-Aldrich) használtunk TE pufferben 30 percig 50 °C-on. Az agar blokkokat háromszor mostuk TE pufferrel. Az agar blokkokat megfelezve 10 U SmaI (Sigma-Aldrich) restrictiós enzimmel emésztettük 25 °C-on 24 órán át. A fragmenteket 1% PFGE Certified Agarose-ban (Bio-Rad) 0.5xTBE pufferrel (45 mM Tris, 2 mM EDTA, 45 mM boric acid) CHEFDR II (Bio-Rad) készülékben futtattuk a megadott paraméterekkel (block 1: 6 V/cm, 515 s, 10 óra; block 2: 6 V/cm, 15-60 s, 11 óra). A gélt etidium-bromid oldattal festettük, és a DNS mintázatot UV-fénnyel tettük láthatóvá. A gélképeket digitális fényképezõgéppel rögzítettük.

5.5.3. Plazmid vizsgálat A konjugációs kísérletekhez, plazmid kimutatási, illetve izolálási kísérletekhez a baktériumokat Luria levesben (LB) illetve Luria agaron (LA) növesztettük. A Klebsiella törzsekbõl a plazmidokat plazmid extrakciós kit segítségével nyertük ki (Wizard Plus Minpreps, DNA Purification System; Promega, Madison, Wis), néhány módosítással. Az extrakió során forró vizet és nagyobb térfogatot (10 ml) használtunk a tenyészetbõl, hogy az alacsony kópiaszámú plazmidokat is detektálhassuk. Nem definitív módszerként alkalmaztuk ezt a plazmid izolálási technikát az összes plazmid azonosítására, inkább mint egy járulékos módszert a genotipizáláshoz a kisebb plazmidok azonosítására mivel ezek kisebb valószínûséggel transzferálhatók és ezért diagnosztikus értékûek lehetnek az egyes genotípusokra. EcoRI-t és HindIII-t (BioLabs) használtunk a plazmid DNS restrikcióhoz a gyártó elõírásainak megfelelõen. A két MBL-termelõ Klebsiella törzs plazmid analízise és a rezisztencia génjeik transzfer vizsgálata a Damjanova és társai által korábban leírtak szerint történt. Escherichia coli K12J5-3Rif és Escherichia coli DH5 törzseket használtunk recipiensként. A 45

transzformált sejteket a következõ antibiotikumokat tartalmazó MH táptalajon vagy LB-ben próbáltuk kitenyészteni. Abban az esetben, ha ESBL-termelõ törzs plazmidját próbáltuk transzformálni, akkor ceftazidimet és/vagy cefotaximot tettünk a táptalajba 2 µg/ml-es koncentrációban. Abban az esetben, ha MBL-termelõ törzs plazmidját próbáltuk transzformálni, akkor meropenemet használtunk szintén 2 µg/ml-es koncentrációban. Konjugálás során attól függõen, hogy milyen használtunk donorként, egyrészt a fent említett

-laktamázt termelõ törzseket

-laktám antibiotikumokat használtuk

szelektáló szerként, illetve abban az esetben, ha rifampicin rezisztens E. coli J53/2 törzset használtunk recipiensként akkor 100 µg/ml rifampicint adtunk a táptalajhoz, ha azid rezisztens E. coli J53/2 törzset akkor 200 µg/ml Na-azidot. A fingerprint analízishez a plazmid DNS-t QIAprep Spin Miniprep Kit segítségével vontuk ki a transzkonjugánsokból, majd PstI (BioLabs) és EcoRI (Promega) emésztést követõen gélelektroforézissel (0.7 % agarose, 110 V, 2 h) vizsgáltuk. Mindkét MBL-termelõ törzs class I integronjának elhelyezkedésének tisztázásához használt módszerek – DNS hibridizáció, konjugáció vizsgálat, transzformáció – alkalmazása a korábban leírtak szerint történt (Damjanova et al. 2008). Konjugációs próbákat végeztünk az összes qnr-pozitív izolátum esetén is, szelektáló szerként a táptalajban 30 µg/ml nalidixsavat használva.

5.5.4. Analitikai izoelektromos fókuszálás Minden Klebsiella izolátummal kétszer végeztük el az izoelektromos fókuszálást (Paterson et al. 2001). Az elektroforézist pH 3-10 poliakrilamid gélen végeztük (BioRad, Hercules, Calif.). Az enzimaktivitást nitrocefin (500 µg/ml) használatával vizsgáltuk a fókuszálás utáni gélen és vizuálisan értékeltük.

5.6. A vizsgált törzsek klinikai hátterének elemzése Vizsgálataink

zömmel

a

mikrobiológiai

laboratóriumunkban

kitenyésztett,

karakterizált és törzsbankba tett mikróbákra irányultak. Amikor más laboratóriumban történtek az izolálások, azt a vizsgálat leírásánál jelezzük. A törzsek klinikai hátterének vizsgálata retrospektíven az egyetemi számítógépes adatbázisban rögzített adatok feldolgozásával, speciális esetekben klinikus kollégákkal folytatott megbeszélések alapján történtek.

46

Véráramfertõzések kórokozó spektruma Az egyik legfontosabb nozokomiális fertõzés, a véráramfertõzésekben izolált mikróbák gyakoriságának, esetleges kórokozó spektrumának változásához áttekintettük a laboratóriumunkba érkezõ hemokultúrák tenyésztési adatait. A vizsgált tíz éves periódus 2001. január 1. és 2009. december 31. között volt. Összegzésünkhöz elvégeztük az adatok megfelelõ tisztítását: egy beteg pozitív tenyésztési eredménye egy bakterémia során egyszer szerepel a felmérésben; kizártuk a feltehetõen kontaminációnak tekinthetõ mikróbákat (corynebacteriumok, propionobacteriumok, micrococcusok, stb.). Speciális kérdés volt a CNS patogén szerepének megítélése. A nemzetközi ajánlásoknak megfelelõen csak akkor fogadtuk el valós patogénként szerepüket, ha ugyanazon mikróba azonos biokémiai és antibakteriális spektrummal tenyészett legalább kettõ különbözõ idõben vagy különbözõ helyrõl vett hemokultúrás palackból és a hozzáférhetõ klinikai adatok alapján a beteg szepszis tüneteit mutatta. Koraszülöttek esetében különösen nehéz a definiálás, hiszen az esetek közel 80%ában csak egy alkalommal történt vérvételbõl volt izolátumunk. Ilyenkor minden esetben a klinikussal való konzultáció döntött a valódi infekciót okozó szerep és kontamináns kategória meghatározásában. Szintén speciális eset volt a primer véráramfertõzés. Ilyenkor a hemokultúrából izolált CNS valós patogén szerepét akkor is elfogadtuk, ha az biokémiailag és antibiotikum érzékenységi vizsgálata alapján azonos volt a párhuzamosan tenyésztésre küldött centrális kanül tenyésztési eredményeivel.

Multirezisztens kórokozók gyakorisága Mikrobiológiai adatbázisunkat tekintettük át, hogy meghatározzuk 2004 és 2009 években a kórokozók körében a multirezisztencia mértékét, a változás mértékét. Egy beteg adott fertõzésébõl izolált mikróba egyszer szerepel a felmérésben. Az eredmények összegzésénél a Nemzeti Nosocomiális Surveillance Rendszer (NNSR) multirezisztens kórokozók által okozott nozokómiális fertõzések alrendszerébe bejelentésre kötelezett multirezisztens kórokozók speciális definícióit vettük alapul (Epinfo 2009. év IX. évf.4. szám).

Nozokomiális húgyúti fertõzések epidemiológiája 2006. január és 2008. december között a Semmelweis Egyetem hét klinikájáról (Gyermekgyógyászati, Nõgyógyászat, Belgyógyászati, Urológiai, Ortopédiai, Szívsebészeti Klinika, Perinatális Intenzív Centrumok) gyûjtött vizelet minták pozitív tenyésztési eredményei kerültek elemzésre. 47

Meticillin-rezisztens és meticillin- érzékeny Staphylococcus aureus törzsek vizsgálata A meticillin-érzékeny és meticillin-rezisztens S. aureus törzsek antibiotikum érzékenységi vizsgálatának összehasonlítására a Semmelweis Egyetem betegeinek mintáiból 2001 januárja és 2005 decembere között izolált 122 MSSA és 153 MRSA törzset válogattunk ki.

A

nemzetközi

összehasonlíthatóságot

az

ugyanezen

idõperiódusban,

a

helyi

laboratóriumokban izolált 115 osztrák (Bécsi Orvostudományi Egyetem), illetve 47 macedón (Egyetemi Klinikai Központ, Scopje) MSSA törzs és 40 osztrák, illetve 81 macedón MRSA törzs tette lehetõvé. A magyar és macedón izolátumok fiziológiásan steril testfolyadékokból, alsó légúti mintákból, sebfertõzésekbõl és felsõ légúti mintákból kerültek izolálásra. Az osztrák törzsek mindegyike hemokultúra izolátum volt. A S. aureus, illetve MRSA epidemiológiáját illetõen hároméves retrospektív analízissel elemeztük a S. aureus, fõleg az MRSA fertõzéseket, a Skopjében lévõ egyetemi klinikai központban.

Staphylococcus haemolyticus törzsek 2001. január 1. és 2008. december 31. között véráram fertõzésbõl izolált, valós kóroki szerepû, 184 S. haemolyticus törzs mikrobiológiai vizsgálatát végeztük el. Infekciót kiváltó szerepük megítélésekor a korábban leírt, viszonylag szigorú kritériumokat alkalmaztuk

ESBL-termelõ Klebsiella spp. ötéves követéses molekuláris epidemiológiai vizsgálata A Klebsiella fajokat a Semmelweis Egyetem II. Szülészeti és Nõgyógyászati Klinika PIC-en ápolt újszülöttek klinikai mintáiból izoláltuk 2001. január és 2006. december között. Évente rendszeresen történt környezeti vizsgálat steril sóoldattal megnedvesített vattával, vizsgálva a munkafelületeket, mosogatókat, inkubátorokat, oldatokat, illetve az intubálás és az enterális táplálás során használt eszközöket. Felmérésünkben megkülönböztettünk fertõzött és a kolonizált betegcsoportot. A Klebsiella fajok által okozott fertõzéseket úgy határoztuk meg, hogy bármely beteg, aki a fertõzés jelét vagy tünetét mutatja, és akinek a vérébõl, vizeletébõl, agy-gerincvelõi folyadékából,

bronchoalveolaris

lavage-ából

vagy

bármilyen

egyéb

sterilen

vett

testfolyadékából Klebsiella faj volt izolálható. A Klebsiella fajokkal való kolonizációt úgy határoztuk meg, hogy Klebsiella faj izolálható olyan páciens surveillance mintájából, aki nem mutatja fertõzés klinikai jeleit vagy tüneteit (Gamer et al. 1996). A

Klebsiella-fertõzéseket

retrospektív

módon

elemeztük

a

kórtörténetek

áttekintésével. A demográfiai és klinikai adatokat minden egyes újszülöttre vonatkozóan 48

összegyûjtöttük, beleértve a szülés módját, az egyedüli vagy ikerterhességet, a nemet, a kort, a születési súlyt, polimikróbás fertõzések bekövetkeztét, a gépi lélegeztetést és a fertõzés kimenetelét. Minden klinikai esetben ampicillin+gentamicin kombinációt alkalmaztak empirikusan,

amelyet

meropenemre

változtattak,

amennyiben

az

ESBL-termelés

bebizonyosodott.

Metallo- -laktamáz termelés Klebsiella speciesekben Az MBL-termelõ K. pneumoniae törzset (KP3686) egy krónikus obstruktív tüdõbetegségben

szenvedõ,

intenzív

osztályon

kezelt

beteg

bronchoalveolaris

mosófolyadékából izoláltuk, 2009. februárban. Az MBL-termelõ K. oxytoca törzset (KO5294/9)

egy

csontvelõ

transzplantációs

osztályon

kezelt

beteg

székletének

szûrõvizsgálata során izolálták a Fõvárosi Egyesített Szent István és Szent László Kórház mikrobiológiai laboratóriumában, 2009. júliusában.

Kinolon rezisztencia vizsgálatok A fluorokinolon rezisztenciáért felelõs géneket 2002. január 1. és 2006. december 31. között

az

Állami

Egészségügyi

Központban,

valamint

saját

mikrobiológiai

laboratóriumunkban izolált 70 ESBL-termelõ E. coli, 101 ESBL-termelõ K. pneumoniae, 5 ESBL-termelõ Citrobacter freundii és 61 ESBL-termelõ Enterobacter spp. törzsben vizsgáltuk.

Stenotrophomonas maltophilia törzsek 2009. január 1. és 2009. december 31. között laboratóriumunkba érkezett klinikai mintákból izolált S. maltophilia törzsek antimikróbás érzékenységi vizsgálatait végeztük el különbözõ módszerekkel.

5.7. Statisztikai elemzés Az arányok összehasonlítására ?2-analízist alkalmaztunk, a 0.05-nél kisebb P értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. SPSS szoftvercsomagot használtunk ezekhez az elemzésekhez.

49

6. Eredmények 6.1. Egyes nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája

Véráramfertõzések kórokozó spektruma A nozokomiális véráramfertõzések incidenciája és kórokozó-spektruma folyamatosan változik. Ennek bizonyítására a véráramfertõzésekben izolált mikróbák gyakoriságát európai (SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, ESGNI) és hazai (OEK) adatok alapján elemeztük és vetettük össze a Semmelweis Egyetem (SE) mintáiból adódó saját vizsgálati eredményeinkkel. (3. táblázat) (Biedenbach et al. 2004, Munoz et al. 2004, www.oek.hu / NNSR eredményei) A laboratóriumunkban vizsgált véráramfertõzésekbõl izolált mikróbák évenkénti gyakoriságát és a mikróba-spektrum változását a 1. és 2. ábra szemlélteti. Az 5.3. és 5.4. fejezetben részletezett neonatális kórokozók mellett felmértük a koraszülöttek

nozokomiális

véráramfertõzésében

jelentõséggel

bíró

egyéb

mikroorganizmusok incidenciáját is. A neonatális késõi szepszisek kórokozóinak spektrumát és azok gyakoriságát 2001. és 2007. között a 4. táblázatban foglaltuk össze.

3. Táblázat. Véráramfertõzésekben izolált mikróbák gyakorisága százalékban európai (SENTRY, ESGNI) és hazai (OEK, SE) adatok alapján.

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Koaguláz-negatív staphylococcusok Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Streptococcus agalactiae Streptococcus pyogenes Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Klebsiella spp. Enterobacter spp. Acinetobacter spp.

SENTRY 2004 23,9 10,2 2,7 3,1 5,8 1,5 1,2 0,3 27,2 7,2 8 5,1 2,5

ESGNI 2004 15,1 10,8 5,9 5,3 4,6

14,5 4,6 3,9 3,6

50

OEK 2004 11,6

SE 2004 12,1

NNSR 2007 19

NNSR 2008 13,8

SE 2009 13,9

54,9

26,9

17

21,9

32,6

2,3 7 0,8 1 0,7 11,3 4,6 3,6 3,7 4

0,1 2,6 0,4 0,4 0 14 7 4,5 4,9 3,4

6

6,7

6 11 12 6 5

7,1 12,6 8,9 8,1 4,4

0,7 5,5 1,3 0,9 0,4 11 4,6 4,6 2,6 1,5

80 70 60 50

összes Gram-pozitív

40

összes Gram-negatív

30

Candida spp.

20 10

20 01 20 02 20 03 20 04 20 05 20 06 20 07 20 08 20 09

0

30 25 20 2001 15

2002 2003 2004 2005 2006

10 5

51

S.

m al to

ph ilia

os a ug in ae r P.

KE S

cs op o

rt

i E. co l

ok te ro co cc us

En

au r

eu s

0

S.

százalékos gyakoriság az összes véráramfertõzésben

1. Ábra. Véráramfertõzésbõl izolált Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, sarjadzó gombák elõfordulási gyakoriságának dinamizmusa 2001-2009 során saját laboratóriumunk adatai alapján.

2007 2008 2009

2. Ábra. Véráramfertõzésekbõl leggyakrabban izolált mikróbák évenkénti változása saját laboratóriumunk adatai alapján (2001-2009). KES: Klebsiella, Enterobacter, Serratia

4. Táblázat. Késõi neonatális szepszisek a Semmelweis Egyetemen 2001-2007.

Gram negatív baktériumok Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter spp. Serratia spp. Citrobacter spp. Proteus spp. Nem-fermentáló baktériumok Acinetobacterium spp. Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia Gram pozitív baktériumok CNS Staphylococcus epidermidis Staphylococcus haemolyticus egyéb CNS Enterococcus faecalis Enterococcus gallinarium Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Staphylococcus haemolyticus "C" Sarjadzó gomba Candida albicans Candida glabrata Candida krusei Candida parapsilosis Összesen

2001 40 4 19 2 7 1 0 0 7 2 4 1 15 11 8 0 3 3 0 1 0 0 8 5 0 0 3 63

2002 33 2 12 0 3 1 1 1 13 0 11 2 19 15 7 2 6 2 0 1 1 0 14 8 1 1 4 66

2003 13 7 0 3 1 1 0 0 1 0 0 1 23 19 16 2 3 2 1 1 0 0 7 4 0 0 3 44

2004 10 1 1 0 1 0 0 0 7 1 5 1 16 14 11 3 0 2 0 0 0 0 3 2 1 0 0 29

2005 14 4 1 2 0 0 0 1 6 0 5 1 21 15 9 6 0 6 0 0 0 0 3 2 0 0 1 38

2006 3 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 8 8 7 1 0 0 0 0 0 0 12 6 0 0 6 23

2007 Összesen 1 113 0 18 0 34 1 8 0 13 0 3 0 1 0 2 0 35 0 4 0 24 0 6 12 116 9 91 7 65 0 17 2 9 1 16 0 2 1 4 0 1 1 1 3 50 1 28 0 2 0 1 2 19 16 279

Multirezisztens kórokozók gyakorisága Az utóbbi évtizedben jelentõsen megnõtt a terápiás problémát okozó rezisztens baktériumok aránya a kórokozó spektrumban, különösen a nozokomiális patogének körében. A nemzetközi és nemzeti összesítõ értekezések, esettanulmányok mellett ezen kórokozók vizsgálatára irányították figyelmünket a saját rutin mikrobiológiai vizsgálataink eredményei is. A 5. táblázatban mutatjuk be, hogy ötéves különbséggel - 2004 és 2009 között - a laboratóriumunkba érkezõ klinikai mintákból kitenyészett mikroorganizmusok milyen aránya tartozott a multirezisztens kórokozók csoportjába, mennyit változott a rezisztencia mértéke. Az eredmények összegzésénél a Nemzeti Nosocomiális Surveillance Rendszer (NNSR)

52

multirezisztens kórokozók által okozott nosocomiális fertõzések alrendszerébe bejelentésre kötelezett multirezisztens kórokozók speciális definícióit vettük alapul (Epinfo 2009. év IX. évf.4. szám). 5. Táblázat Laboratóriumunkban izolált multirezisztens kórokozók százalékos elõfordulási gyakorisága az összes adott izolált baktériumfaj függvényében Kórokozó Staphylococcus aureus Enterococcus spp. Enterobacter spp.

Antibiotikum rezisztencia 2004 SE 2009 SE MRSA methicillin/oxacillin 5,2 19,7 VRE vancomycin 1,7 3,2 MENB III. gen. cefalosporinok, imipenem 22,9 20,7 és/vagy meropenem, vagy ESBL termelõ

Escherichia coli

MECO III. gen. cefalosporinok, imipenem és/vagy meropenem, vagy ESBL termelõ

0,8

7,4

Klebsiella spp.

MKLE III. gen. cefalosporinok, imipenem és/vagy meropenem, vagy ESBL termelõ

4,2

4,3

Acinetobacter baumanii Pseudomonas aeruginosa

MACI imipenem és/vagy meropenem MPAE A felsorolt antipseudomonas hatású szerek közül csak 2-re vagy 2-nél kevesebbre érzékeny (piperacillin/tazobactam, ceftazidim, cefepim, imipenem, meropenem, ciprofloxacin, gentamicin, tobramycin, amikacin,aztreonam) MSTM trimethoprim-sulfamethoxazol

0 7,2*

12,2 11,8*

3,2

8,7

0

0

Stenotrophomonas maltophilia Staphylococcus aureus

VISA

vancomycinre mérsékelten érzékeny

* csak polymyxin B-re érzékeny Pseudomonas aeruginosa

Nozokomiális húgyúti fertõzések epidemiológiája 2006. január és 2008. december között a Semmelweis Egyetem hét klinikájáról gyûjtött vizelet minták pozitív tenyésztési eredményei (n = 4833) kerültek elemzésre. Tanulmányunk szerint az E. coli, Enterococcus spp., Klebsiella spp., P. aeruginosa és Candida spp. volt az öt leggyakoribb nozokomiális húgyúti patogén. A kórokozók százalékos eloszlását a különbözõ osztályokon a 6. táblázatban foglaltuk össze. A leggyakoribb nozokomiális húgyúti kórokozó, az E.coli antibiotikum rezisztencia adatait a beküldõ osztályok függvényében a 3. ábrával szemléltettük.

53

6. Táblázat Húgyúti patogének eloszlása osztályok szerint. KES: Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp.

n=4823 E. coli Koraszülött intenzív osztály (n=190) 37 Gyerek Klinika (n=576) 54 Nõgyógyászat (n=471) 44 Belgyógyászat (n=496) 45 Urológia (n=2643) 39 Ortopédia (n=251) 41 Szívsebészet (n=196) 34

KES E. faecalis Proteus spp. P. aeruginosa Candida spp. Egyéb 27 5 3 7 13 8 10 10 4 9 2 11 12 23 4 3 6 8 16 17 5 4 5 8 12 28 4 5 2 10 5 22 8 7 4 13 16 20 6 7 13 4

rezisztencia mértéke (%)

Nozokomiális húgyúti fertõzésekbõl izolált E. coli antibiotikumérzékenysége (%) az ellátó osztály függvényében

80 60 40 20 0 Gy K Be Ur Sz Nõ oló Ortop ívs lgy ere oras gy gia óg eb óg éd zü kK y és yá löt ia ás lin ze s t za ika z ... at t t

AMX AMC CAZ FEP SUM CIP GE

osztály

3. Ábra Nozokomiális húgyúti fertõzésekbõl izolált Esherichi coli törzsek antibiotikum érzékenysége az ellátó osztály függvényében

54

6.2. Staphylococcus aureus törzsek

Meticillin-rezisztens és meticillin-érzékeny Staphylococcus aureus törzsek összehasonlítása Az MRSA és MSSA törzsek antibiotikum érzékenysége jellegzetesen más és földrajzi különbségeket is mutat. Ennek bizonyítására saját laboratóriumunkban izolált, valamint Ausztriából és Macedóniából származó törzsek mikrobiológiai vizsgálatait végeztük el. A 284 MSSA és 274 MRSA törzs nemzetenkénti eloszlása a 4.6. fejezetben olvasható. Az MRSA törzsek antibiotikum érzékenységét a 7. táblázat foglalja össze. Közel az összes törzs érzékeny volt vancomycinre, ami 1 µg/ml koncentrációban hatékony volt a magyar, osztrák és macedón törzsek többsége ellen. A macedón törzsek 3.7 %-a azonban magasabb vancomycin koncentráció (4 µg/ml) mellett volt gátolt. A CLSI és az EUCAST új interpretációs kritériumai alapján ezen törzsek vancomycinre mérsékelten/nem érzékenyek. Ezzel szemben minden magyar és osztrák MRSA törzs érzékeny volt vancomycinre és heterorezisztenciát sem mutattunk ki. A legtöbb MRSA törzs rezisztens volt gentamicinre, magas MIC értékekkel, mindhárom országban. Ugyanezt tapasztaltuk fluorokinolonok esetében is, vagyis a kinolonok már nem jelentenek terápiás alternatívát az MRSA fertõzésekben. A magyar és osztrák MSSA törzsek fluorokinolonra érzékenynek bizonyultak. (Az MSSA törzsek antibiotikum érzékenységét a 8. táblázat foglalja össze.) A 274 vizsgált MRSA törzsbõl 268 multidrug rezisztens volt, vagyis két vagy több antibiotikum osztályra nem volt érzékeny. A S. aureus törzsekkel elvégzett PFGE vizsgálat eredménye nagymértékben heterogén képet mutatott, tehát a törzsek nem tartoztak egy klónba.

55

7. Táblázat Az osztrák (AU), magyar (HU) és macedón (MA) MRSA törzsek MIC50, MIC90 értékei és MIC tartományai antistaphylococcalis szerek esetében Antibiotikum

MIC (mg/L) MIC50 AT HU Oxacillin 1024 512 Vancomycin 1 1 64 Gentamicin 64 Clindamycin >256 >256 Erythromycin >256 >256 Ciprofloxacin 128 16

MK 1024 1 512 16 256 16

MIC90 AT 1024 1 256 >256 >256 >256

HU 1024 2 512 >256 >256 128

MK 1024 2 1024 256 256 32

Tartomány AT 16->1024 0.5-2 <2-512 0.5->256 <0.5->256 8->256

HU 8->1024 0.5-2 <2->1024 0.5->256 <0.5->256 <0.5->256

MK 4->1024 0.5-4 <2-1024 0.5->256 <0.5->256 0.5-64

% Rezisztens AT HU 100 100 0 0 92.5 74.5 97.5 97.4 97.5 97.4 100 98

MK 100 0 95 66.7 88.9 96.3

% Érzékeny AT HU 0 0 100 100 2.8 23.5 2.5 2.6 2.5 2.6 0 1.9

MK 0 96.3 3.7 29.6 9.8 3.7

8. Táblázat Az osztrák (AU), magyar (HU) és macedón (MA) MSSA törzsek MIC50, MIC90 értékei és MIC tartományai antistaphylococcalis szerek esetében

Antibiotikum

MIC (mg/L) MIC50 AT HU Oxacillin <0.125 0.25 Vancomycin 1 1 Gentamicin 0.5 0.5 Clindamycin <0.5 <0.5 Erythromycin <0.5 <0.5 Ciprofloxacin <0.5 <0.5

MK 0,5 0.5 256 4 2 8

MIC90 AT 0.5 1 2 256 >256 64

HU 1 1 1 256 >256 2

MK 2 1 256 256 256 32

Tartomány % Rezisztens AT HU MK AT HU 0 <0.125-2 <0.125-2 <0.125-2 0 0.5-2 0 0.5-2 0.5-2 0 0.8 0.5->256 0.003->256 1-256 6.1 27.6 <0.5->256 <0.5->256 0.125-256 23.5 30.1 <0.5->256 <0.5->256 0.5-256 24.3 9.8 <0.5->256 <0.5-128 0.5-32 20.9

56

MK 0 0 69.6 55.3 48.9 51.1

% Érzékeny AT HU 100 100 100 100 98.4 93.9 48.0 75.7 66.7 75.7 87.0 74.8

MK 100 100 8.7 29.8 51.1 48.9

A Staphylococcus aureus epidemiológiája A S. aureus, illetve az MRSA epidemiológiáját tekintve szemléletes például szolgál egy macedón felmérés, melyben hároméves retrospektív analízissel elemeztük a S. aureus, fõleg az MRSA fertõzéseket. A Skopjében lévõ egyetemi klinikai központban, pavilonos felépítése miatt, a S. aureus törzsek épületen belüli és épületek közötti terjedése volt megfigyelhetõ. A 3497 S. aureus 28.5 %-át sebváladékból, 21 %-át orrváladékból, 13 %-át alsó légúti mintából, 11.8 %-át hemokultúrából izolálták. MRSA legnagyobb gyakorisággal sebfertõzésekbõl, pneumóniákból és véráramfertõzésekbõl volt izolálható. Összességében a S. aureusok 1/3-a volt MRSA. A 9. táblázatban összefoglalt eredményekbõl kitûnik, hogy az S. aureusok 45.5 %-a a sebészeti épületben, fõleg az általános sebészeti osztályon, az intenzív osztályon és a kóma centrumban kezelt betegekbõl került izolálásra. Különösen magas volt körükben az MRSA aránya. A sebészeti épületben a S. aureusok több mint fele MRSA volt és az említett három osztályról került ki az MRSA-k 95 %-a. Bár az osztályok az épület különbözõ szintjein vannak, de nincsenek hermetikusan elkülönítve és a betegek, állapotuk súlyosságától függõen, átkerülnek egyik osztályról a másikra. Ezzel megvalósul a S. aureus, de különösen az MRSA törzsek intra- és interhospitális terjedése. A belgyógyászati épületben sokkal jobb volt a helyzet. Itt az MRSA törzsek 3 része a nefrológiai osztályhoz volt köthetõ. Három osztály MRSA-mentes volt. Egyéb, egymástól és a sebészeti és belgyógyászati épületektõl független osztályok mintáiból izolálták a S. aureus törzsek 38.3 %-át. 12.6 %-uk volt MRSA, ezek eloszlása osztályonként igen nagy különbségeket mutatott, melynek hátterében itt is a betegségek természete állt. A hematológiai betegekben a törzsek 37.3 %-a MRSA volt. Az MRSA törzsek 46.8 %-a – szokatlanul - a gyerekgyógyászati osztályról került ki. Az 10. táblázat a S. aureusok elõfordulását osztályok szerint, izolátumok számának csökkenõ sorrendjében foglalja össze.

57

9. Táblázat Staphylococcus aureus izolátumok eloszlása egy épületen belüli osztályok szerint

Osztályok Sebészeti épület Intenzív osztály Kóma centrum Általános sebészet Traumatológia Ortopédia Neurológia Urológia Együtt Belgyógyászati épület Nefrológia Endokrinológia Dermatovenerológia Toxikológia Reumatológia Gasztroenterológia Pulmonológia, allergológia Szemészet Fül-orr-gégészet Együtt Egyéb, egymástól független épületek Haematológia Infektológia Gyermekgyógyászat Kardiológia Nõgyógyászat Maxillofacialis sebészet Radiológia, onkológia Együtt Összesen

S. aureus törzsek n % 440 284 607 48 172 11 27 1590 (45.5%)

MRSA % n %

% MRSA az egyes osztályokon

27.7% 17.9% 38.2% 3% 10.8% 0.7% 1.7% 100%

346 213 268 15 26 1 2 871 (54.8%)

39.7% 24.5% 30.8% 1.7% 3% 0.1% 0.2% 100%

78.6% 75% 44.2% 31.2% 15.1% 9.1% 7.4%

272 49.4% 53 9.6% 120 21.8% 18 3.3% 18 3.3% 26 4.7% 12 2.2% 11 2.0% 21 3.8% 551 (15.8%) 100%

42 4 8 1 1 0 0 0 2 58 (10.5%)

72.4% 6.9% 13.8% 1.7% 1.7% 0 0 0 3.4% 100%

15.4% 7.5% 6.7% 5.6% 5.6% 0 0 0 9.5%

56 27 80 4 4 0 0 171 (12.6%) 1100 (31.5%)

32.7% 15.8% 46.8% 2.3% 2.3% 0 0 100%

37.3% 14.3% 11.9% 7.3% 1.4% 0 0

150 189 672 55 281 4 6 1357 (38.8%) 3496 (100%)

11.1% 13.9% 49.5% 4.1% 20.7% 0.3% 0.4% 100%

58

10. Táblázat Staphylococcus aureus izolátumok elõfordulása osztályok szerint, az izolátumok számának csökkenõ sorrendjében Osztályok Gyermekgyógyászat Általános sebészet Intenzív osztály Kóma centrum Nõgyógyászat Nefrológia Infektológia Ortopédia Haematológia Dermatovenerológia Kardiológia Endokrinológia Traumatológia Urológia Gasztroenterológia Fül-orr-gégészet Reumatológia Toxikológia Pulmonológia, allergológia Neurológia Szemészet Maxillofacialis sebészet Radiológia és onkológia Összesen

S. aureus törzsek n % 672 19.2% 607 17.4% 440 12.6% 284 8.1% 281 8.0% 272 7.8% 189 5.4% 172 4.9% 150 4.3% 120 3.4% 55 1.6% 53 1.5% 48 1.4% 27 0.8% 26 0.7% 21 0.6% 18 0.5% 18 0.5% 12 0.3% 11 0.3% 11 0.3% 4 0.1% 6 0.2% 3497 100%

MRSA % % MRSA n % az egyes osztályokon 80 7.3% 11.9% 268 24.4% 44.2% 346 31.5% 78.6% 213 19.4% 75% 4 0.4% 1.4% 42 3.8% 15.4% 27 2.5% 14.3% 26 2.4% 15.1% 56 5.1% 37.3% 8 0.7% 6.7% 4 0.4% 7.3% 4 0.4% 7.5% 15 1.4% 31.2% 2 0.2% 7.4% 0 0 0 2 0.2% 9.5% 1 0.1% 5.6% 1 0.1% 5.6% 0 0 0 1 0.1% 9.1% 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1100 100% 31.5%

6.3. Staphylococcus haemolyticus törzsek 2001 és 2008 között 2967 véráram fertõzést igazoltunk a Semmelweis Egyetem különbözõ klinikáin kezelt betegeknél. A 11. táblázatban összefoglaltak alapján az elsõ vizsgált év után a fertõzések döntõ többségét (49 %-68 %) Gram-pozitív mikroorganizmusok okozták. A S. haemolyticus az összes infekció körülbelül 6 %-át és az összes Gram-pozitív fertõzés 11 %-át okozza. A vizsgált idõperiódusban összesen 184 S. haemolyticus véráram fertõzés igazolódott. A S. epidermidis után a S. haemolyticus volt a második leggyakoribb CNS bakterémia okozó és az összes CNS izolátum 12-26 %-át adta a különbözõ években. Jelentõs különbségeket figyeltünk meg, mikor a S. haemolyticus izolátumok eloszlását a különbözõ klinikai osztályok szerint hasonlítottuk össze (12. táblázat). A két neonatális intenzív osztályon kezelt betegek esetében a hemokultúra izolátumok 18 %-a és 15 %-a volt S. haemolyticus, míg “felnõtt” intenzív osztályok betegeinél csak az izolátumok 4 %-a.

59

11. Táblázat. A véráram fertõzésekhez köthetõ patogének eloszlása a Semmelweis Egyetem klinikáin kezelt betegek esetében 2001. január és 2008. december között. KES = Klebsiella spp., Enterobacter spp., Cirobacter spp. és Serratia spp.

Patogén Teljes szám Összes Gram-pozitív Staphylococcus aureus Staphylococcus haemolyticus Staphylococcus epidermidis Egyéb CNS Streptococcusok Enterococcusok Egyéb Gram-pozitív Összes Gram-negatív Escherichia coli KES csoport Proteus spp. Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Stenotrophomonas maltophilia Egyéb Gram-negatív Candida spp.

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Összesítve % % % % % % % % Szám % 272 369 448 527 449 235 309 348 2967 100 41 49 60 53 63 59 68 59 1679 57 8 11 11 12 12 11 15 15 354 12 4 6 10 5 8 5 5 5 184 6 16 18 22 19 22 22 28 19 613 21 4 5 5 3 4 7 6 8 149 5 2 2 1 4 3 6 6 4 103 3 7 7 10 8 12 8 6 8 255 9 0 0 0 1 1 0 2 1 21 1 53 44 35 42 33 37 28 37 1143 39 11 13 12 14 13 13 10 15 381 13 25 14 11 11 9 11 7 11 359 12 2 1 1 1 1 1 1 1 37 1 9 9 6 9 6 8 5 7 224 8 4 4 2 3 2 3 1 1 76 3 1 2 1 2 1 0 1 0 34 1 1 1 1 1 1 0 2 1 32 1 6 7 5 5 4 4 4 4 145 5

12. Táblázat. A Staphylococcus haemolyticus incidenciája a bakterémiás epizódokat okozó izolátumok között, osztályok szerint, 2001-2008 években. Osztály Belgyógyászat 1 Belgyógyászat 2 Belgyógyászat 3 Belgyógyászat 4 Pulmonológia Sebészet 1 Sebészet 2 Szívsebészet Intenzív osztály 1 Intenzív osztály 2 Neonatális intenzív osztály 1 Neonatális intenzív osztály 2 Egyéb Összesen

Össz bakterémia n 196 405 137 129 143 131 101 713 125 80 352 348 97 2957

60

S. haemolyticus bakterémia n % 4 2,0 8 2,0 1 0,7 3 2,3 1 0,7 7 5,3 6 5,9 28 3,9 5 4,0 3 3,8 64 18,2 51 14,7 3 3,1 184 5.8

A sebészeti osztályokra 5-6 %-os S. haemolyticus véráramfertõzés jellemzõ, míg a belgyógyászati és egyéb osztályokra 0-3 %.

A Staphylococcus haemolyticus izolátumok antibiotikum érzékenysége A S. haemolyticus izolátumok 97 %-a fenotípusos oxacillin rezisztenciát mutatott. Minden ilyen törzsben a mecA gén PCR vizsgálattal kimutatható volt. Az erythromycin, clindamycin, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazol és ciprofloxacin rezisztencia 96 %, 62 %, 87 %, 49 %, és 84 % volt, egyenletesen magas MIC értékekkel a vizsgált periódus alatt. (13. Táblázat) Az erythromycin rezisztens és clindamycin érzékeny törzsek között indukálható MLSB fenotípust nem találtunk. Minden törzs érzékeny volt linezolidra. A doxycyclin rezisztencia aránya meglepõen alacsony volt (15 %). Ahogy a 4. ábra mutatja, a vancomycin MIC értékek minden S. haemolyticus törzsnél 1.0-4.0

g/ml között voltak. A CLSI kritériumai szerint

minden izolátum vancomycin érzékeny volt, de 38 %-uk vancomycin MIC értéke 4 ug/ml. A 6

g/ml vancomycin tartalmú agar lemezen egyetlen törzs sem mutatott növekedést, a

speciális inkubálási körülmények között. Egyetlen 1 g/ml vancomycin MIC értékkel bíró törzs sem mutatott heterorezisztenciát vancomycinre, módosított populáció analízis profillal meghatározva, de a 2

g/ml vancomycin MIC értékû törzsek között 30 % mutatott

heterorezisztenciát vancomycinre és 22 % rezisztenciát. A teicoplanin MIC a törzsek 39 %-ában 1-8 g/ml (érzékeny), 19 %-ában 6 g/ml (mérsékelten érzékeny), 42 %-ában 32-128 g/ml (rezisztens) volt. A teicoplanin rezisztens törzsek egyikében sem volt kimutatható vanA vagy vanB gén.

Antibiotikum rezisztencia mintázatok A fenotípusos antibiotikum rezisztencia profil epidemiológiai markerként való használatára törekedve a rezisztencia fenotípusokat egy számmal és egy betûvel határoztuk meg, a 4.2.3. fejezetben leírtaknak megfelelõen. Összesen 33 különbözõ fenotípust találtunk. Az izolátumok 96 %-a multirezisztenciát mutatott. Köztük, ahogy a 14. táblázat mutatja, hat epidémiás mintázat igazolódott, a vizsgált S. haemolyticus törzsek 78 %-át lefedve. Az egyéb rezisztencia mintázatok elõfordulása 1-2 % között volt.

61

13. Táblázat. Az antistaphylococcalis szerekkel szembeni rezisztencia prevalenciája az invazív Staphylococcus haemolyticus törzsekben Antibiotikum

2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Összesen n=10 n=22 n=44 n=26 n=38 n=12 n=15 n=17 n=184 MIC intervallum MIC50 % % % % % % % % % 97 oxacillin 90 100 96 96 100 92 93 100 4->256 >256 erythromycin 100 95 96 100 100 92 87 94 96 1->256 128 62 clindamycin 70 82 66 65 45 50 47 76 2->256 >256 87 gentamicin 80 91 89 85 89 75 87 94 2->256 128 49 sulph./trimethoprim 50 41 36 50 47 83 67 53 4->256 128 15 doxycycline 70 27 9 15 8 8 20 0 2-32 2 ciprofloxacin 50 73 84 88 97 83 80 88 84 <0,5->256 64 0 linezolid 0 0 0 0 0 0 0 0 0.25-0.5 0.38 0 vancomycin 0 0 0 0 0 0 0 0 1-4 2 teicoplanin 40 27 46 30 64 40 46 41 42 1-128 16

62

MIC90 >256 >256 >256 >256 >256 8 128 0.5 4 64

120

cumulative % of strains

100 80 60 40 20 0 1

2

4

8

16

32

64

128

MIC, mg/L

vancomycin

teicoplanin

4. Ábra A Staphylococcus haemolyticus törzsek kumulatív érzékenység/rezisztencia aránya glikopeptidekre. 14. Táblázat A Staphylococcus haemolyticus törzsek fõbb antibiotikum rezisztencia mintázatai Mintázat típus 4a 4f 5c 5e 6b 7a Együtt

Rezisztencia mintázat OX, E, CL, GE OX, E, GE, CIP OX, E, CL, GE, CIP OX, E, GE, SXT, CIP OX, E, CL, GE, SXT, CIP OX, E, CL, GE, SXT, DO, CIP

Szám 8 24 35 29 37 10

% 4.35 13.04 19.02 15.76 20.01 5.43 78

Rövidítések: OX = oxacillin, E = erythromycin, CL = clindamycin, GE = gentamicin, SXT = trimethoprim-sulfamethoxazol, DO = doxycyclin, CIP= ciprofloxacin Vizsgálatunk igazolta, hogy a törzsek 5 %-a a glikopeptidek és a linezolid kivételével minden antibiotikumra rezisztens volt. 25 %-uk hat, 39 %-uk öt, 22 %-uk négy, 5 %-uk három antibiotikumra volt rezisztens és csak a törzsek 3 %-a volt két különbözõ antibiotikumra rezisztens vagy mindenre érzékeny. Sok azonos antibiotikum rezisztencia mintázatot mutató törzs különbözõ, strukturálisan nem kapcsolódó kórházi osztályokról került 63

izolálásra, ugyanakkor több különbözõ antibiotikum rezisztencia mintázatú törzset találtunk azonos osztályokon.

A törzsek klonális rokonsága A PFGE mintákat 12-19 sáv jellemezte, melyek 40 és 600 kb közti tartományban voltak. A S. haemolyticus törzsek genomiális DNS-ének SmaI enzimes emésztésével 56 jól meghatározható profilt figyeltünk meg. Tenover kritériumai alapján (Tenover et al. 1995) 27 PFGE típust és 29 szubtípust különböztettünk meg. Ez a 29 szubtípus a 27 fõ típus 11 típusával volt összefüggésben. A 27 típus egyezési koefficiense 25-80 % közt változott; mindegyiket egy számmal kódoltuk. Minden szubtípust egy betûvel jelöltünk (egyezés 80%). A 4. kép jól mutatja a PFGE típusok heterogenitását. A 5. ábra a dendrogram eredménye, melyet mind az 56 különbözõ mintázat típus számítógépes PGFE profil analízisével kaptunk. Ez igazolja a törzsek genetikai heterogenitását, SmaI emésztés után. Sok azonos PFGE típust vagy szubtípust mutató törzs különbözõ, struktúrálisan nem kapcsolódó kórházi osztályokról került izolálásra, ugyanakkor több különbözõ PFGE típusú vagy szubtípusú törzset találtunk azonos osztályokon. Az antibiotikum rezisztencia fenotípusok és a PFGE genotípusok közt nem találtunk összefüggést. K

125

128

130

132 136

137

K

143

144 145

146

148 153

K

4. Kép SmaI-emésztett genomiális DNS PFGE mintázatok Staphylococcus haemolyticus törzseknél. K: kilobázis léptékû DNS létra, 125-153 oszlopban különbözõ Staphylococcus haemolyticus törzsek.

64

Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

30

25

20

15

10

5

0

SmaI

136

KSFO01

145

KSFO01

44

1 PIC

143

2 PIC

3

1 PIC

4

AN-INT

103

2 PIC

161

1 PIC

59

2 PIC

160

SZISEB

67

KIFX01

156

KIFX01

43

1 PIC

130

1 PIC

51

AN-INT

14

1 PIC

28

1 PIC

23

1 PIC

120

KBFX01

124

1 PIC

40

2 PIC

41

SEB 1

102

2 PIC

128

2 PIC

157

1 PIC

46

2 PIC

76

1 PIC

125

KKFX01

173

2 PIC

146

2 PIC

153

2 PIC

29

2 PIC

123

2 PIC

144

KEFO01

65

OGYK

53

2 PIC

132

1 PIC

148

2 PIC

162

1 PIC

169

SEB1

170

1 PIC

159

1 PIC

182

2 PIC

47

2 PIC

101

KEFO01

171

KEFO01

20

KEFO01

88

SZISEB

82

KSFO01

34

2 PIC

79

SEB1

85

SEB1

87

2 PIC

106

1 PIC

92

KEFO01

95

TÜDÕ INT

5. Ábra A vizsgált Staphylococcus haemolyticus törzsek dendrogramja. A skála a hasonlóság átlagos százalékát jelöli.

65

6.4. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek

A fertõzés kockázati tényezõi 2001. január és 2005. december között 46 újszülöttbõl izoláltunk ESBL-termelõ Klebsiella törzseket, 55 újszülöttbõl pedig nem ESBL-termelõ Klebsiella törzseket. A klinikai tünetek alapján ESBL-termelõ K. pneumoniae okozta fertõzéseket állapítottunk meg 23 újszülöttnél, 2 esetben pedig kolonizációt. ESBL-termelõ K. oxytoca fertõzést 16 újszülöttnél állapítottunk meg, kolonizációt öt esetben. 37 újszülöttnek volt nem ESBL-termelõ K. pneumoniae és nyolcnak nem ESBL-termelõ K. oxytoca okozta fertõzése, 10 esetben pedig nem ESBL-termelõ Klebsiella törzsekkel való kolonizációt tapasztaltunk. Összesen 84 fertõzésben szenvedõ gyermeket vontunk be a tanulmányba. Az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca fertõzésekre vonatkozó vizsgált kockázati tényezõk az 15. táblázatban, míg a nem ESBL-termelõ Klebsiella fajokra vonatokozók a 16. táblázatban találhatók. A vizsgált tényezõk tekintetében — beleértve a nemet, a gesztációs idõt, az ikerterhességet, a születési súlyt, a centralis vénás katéter jelenlétét, a gépi lélegeztetést, a mesterséges táplálást, a polimikrobás fertõzést, a császármetszést, a transzfúziót — nem találtunk szignifikáns különbséget az ESBL-termelõ és a nem ESBL-termelõ Klebsiella fajoknak megfelelõ csoport között. Még ha a nem ESBL-termelõ Klebsiella fajokkal fertõzött páciensek esetében nagyobb is volt a túlélési arány (mortalitási arány: 2/45, 4.4 %), mint az ESBL-termelõ Klebsiella fajokkal fertõzötteknél (mortalitási arány: 6/39, 15 %), ez a különbség nem volt szignifikáns. Egy haláleset volt nem ESBL-termelõ K. oxytoca okozta fertõzésnek tulajdonítható, míg kettõ ESBL-termelõ K. pneumoniae okozta fertõzés következménye volt. A többi esetben nem volt bizonyítható az összefüggés a halálesetek és a Klebsiella fertõzések között.

Antimikrobiális érzékenység Összesen 101 Klebsiella törzset izoláltunk újszülöttekbõl (egy beteg — egy izolátum) 2001. január és 2005. december között. Az ESBL-aktivitást E-teszttel erõsítettük meg 46 törzsnél. Az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzseket két idõszakban izoláltuk, két éves idõkülönbséggel. Az elsõ idõszakban (2001. januártól 2003. júniusig) 25 ESBLtermelõ K. pneumoniae és 9 ESBL-termelõ K. oxytoca törzset izoláltunk. A második idõszakban (2003. júniustól 2005. decemberig) 12 ESBL-termelõ K. oxytoca törzset izoláltuk különbözõ betegekbõl.

66

15. Táblázat Az ESBL-termelõ Klebsiella oxytoca (ESBL-KO) és Klebsiella pneumoniae (ESBL-KP) törzsek által okozott fertõzések rizikófaktorainak összehasonlítás. Változók

ESBL-KO csoport (n=16)

ESBL-KP csoport (n=23)

Átlag

P érték

Átlag

Nem (férfi:nõ)

7:9

Születési súly (g) <1500

6/16

828 (780-870)

7/23

982 (600-1380)

0.73

Születési súly (g) <1000

5/16

885 (780-1170)

4/23

788 (600-950)

0.81

Születési súly (g)

12:11

1740 (780-3240)

0.73

1841 (600-4300)

Centrális katéter

3/16

6/23

0.73

Gépi lélegeztetés

10/16

14/23

0.71

Parenterális táplálás

14/16

Gesztációs kor (hetek) <36

14/16

Polimikróbás fertõzés

10/16

16/23

0.73

Császármetszés

9/16

14/23

0.71

Transzfúzió

7/16

11/23

0.71

Ikrek

6/16

6/23

0.76

Halálozás

2/16

4/23

0.72

22/23 31.8 (25-38)

20/23

0.83 32.3 (25-42)

0.70

16. Táblázat A nem ESBL-termelõ Klebsiella oxytoca (nem ESBL KO) és Klebsiella pneumoniae (nem ESBL KP) törzsek által okozott fertõzések rizikófaktorainak összehasonlítás Változók

Nem ESBL KO csoport (n=8)

Nem ESBL KP csoport (n=37)

Átlag

P érték

Átlag

Nem (férfi:nõ)

8:0

Születési súly (g) <1500

3/8

1415 (570-1490)

9/37

1050 (470-1490)

0.99

Születési súly (g) <1000

2/8

670 (570-670)

15/37

802 (470-990)

0.99

Születési súly (g)

21:37

1784 (570-3450)

0.99

1709 (470-3840)

Centrális katéter

2/8

6/37

0.99

Gépi lélegeztetés

7/8

20/37

0.99

Parenterális táplálás

8/8

36/37

0.99

Gesztációs kor (hetek) <36

8/8

Polimikróbás fertõzés

4/8

28/37

0.99

Császármetszés

4/8

27/37

0.99

Transzfúzió

3/8

22/37

0.99

Ikrek

0/8

9/37

0.99

Halálozás

1/8

1/37

0.99

31.3 (25-38)

67

29/37

32.7 (25-41)

0.99

Noha két különbözõ idõszakban gyûjtöttük, az izolátumok igen hasonló érzékenységi profillal rendelkeztek. Ezek között említendõ a ceftazidimre vonatkozó MIC-ek emelkedése (> 48 µg/ml) és az alacsonyabb cefotaxim MIC-értékek, melyek a „Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI) alapján a mérsékelten érzékeny vagy érzékeny tartományba esnek. Klavulánsav jelenlétében minden izolátum esetén a cefotaxim és ceftazidim MIC-ek jelentõsen csökkentek, ? 1 µg/ml-re. A többi ß-laktám – cefepim (0.75-8 µg/ml), imipenem (0.25-0.38 µg/ml), meropenem (0.023-0.047 µg/ml) – és a ciprofloxacin (0.38-1 µg/ml) MICértéke ugyanazon törzseknél az érzékeny tartományba esett. Minden törzs rezisztens volt gentamicinre (>256 µg/ml) és minden 2005-ben izolált ESBL-termelõ K. oxytoca törzs amikacinra is (>32 µg/ml). (17. Táblázat)

Analitikai izoelektromos fókuszálás Mindegyik klinikai izolátum (mindkét idõszakból) expresszálta a ß-laktamázt, pI = 8.2-es értékkel, ami az SHV-típusú ß-laktamázra jellemzõ (18. táblázat). Kilenc K. oxytoca törzs pI = 5.4 ß-laktamázt termelt, jelezve egy járulékos TEM-1 szerû ß-laktamázt.

18. Táblázat. ESBL termelõ Klebsiella törzsek jellemzése. Törzsek

Izolálás ideje

Fertõzött Kolonizált Izoelektromos betegek betegek PFGE pont (pI) száma száma

PCR és szekvenálási eredmények

Plazmidok

K. pneumoniae

2001 február - 2002 április

14

2

A

8.2

SHV-5

P1

K. pneumoniae

2002 május - október

7

0

B

8.2

SHV-5

P1

K. oxytoca

2002 augusztus - 2003 január

7

0

C

5.4, 7.6, 8.2

TEM-1, SHV-12

P2

K. oxytoca

2003 január

2

0

D

5.4, 8.2

TEM-1, SHV-12

P3

K. pneumoniae

2004 január

2

0

E

8.2

SHV-5

P4

2005 július - november

7

5

F

7.6, 8.2

SHV-5

P5

K. oxytoca

Pulzáló mezejû gélelektroforézis Az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca molekuláris tipizálása a vizsgált idõszakban hat fõ PFGE mintázatot azonosított, melyeket A-F betûkkel jelölünk (18. táblázat). 2001. január és 2003. június között három különbözõ K. pneumoniae (A, B és E) és két különbözõ K. oxytoca törzset (C és D) azonosítottunk. 2005-ben egy új típusú (F típusú) K. oxytoca törzset izoláltunk (6. ábra).

68

17. Táblázat. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek antibiotikum érzékenysége.

Baktérium törzsek

PFGE Ceftazidim

Ceftazidim/ Cefotaxim/ Cefotaxim Cefepim Imipenem Meropenem Amikacin klavulánsav klavulánsav

K. pneumoniae

A

>256

0.38->4

8-48

0.064-0.125

2-4

0.25

0.023-0.032

>16

K. pneumoniae

B

128->256

0.25-0.38

8-48

0.094 -0.25

1-8

0.25-0.38

0.023-0.047

>16

K. oxytoca

C

24-256

0.125-0.38

8-12

0.047-0.094

1.5-2

0.25-0.38

0.023-0.032

>16

K. oxytoca

D

128>256

0.25-0.38

8-24

0.094 -0.25

2-4

0.25-0.38

0.023-0.047

>15

K. pneumoniae

E

64

0.19

6

0.064

0.75

0.25

0.023

>15

K. oxytoca

F

128->256

0.25-0.38

8-12

0.25-0.38

0.023-0.032

1-1.5

0.047-0.094 0.75-1.5

69

ESBL-termelõ Klebsiella törzsek idõbeli eloszlása a II. PIC-en Izolátumok száma 10

9

K. pneumoniae, A típus

8

K. pneumoniae, B típus K. oxytoca, C típus

7

K. oxytoca, D típus 6

K. pneumoniae, E típus 5

K. oxytoca, F típus 4

3

2

1

0 2001 janmárc

2001 áprjun

2001 júlszept

2001 oktdec

2002 janmárc

2002 áprjun

2002 júlszept

2002 oktdec

2003 janmárc

2003 áprjun

2003 júlszept

2003 oktdec

2004 janmárc

2004 áprjun

2004 júlszept

2004 oktdec

2005 janmárc

2005 áprjun

2005 júlszept

2005 oktdec

2006 janmárc

2006 áprjun

2006 júlszept

2006 oktdec

Idõ

6. Ábra. Az ESBL-termelõ Klebsiella izolátumok genotípusainak eloszlása 70

Plazmid DNS preparálás és restrikciós elemzés A teljes plazmid izolálás alapján az ESBL-termelõ Klebsiella izolátumok között 5 különbözõ mintát (P1-P5) különíthetünk el. A K. pneumoniae törzsek (A és B genotípus) azonos plazmid profillal rendelkeztek (P1), egy megközelítõleg 23 kb méretû plazmidot (P1) hordoztak. Az E genotípusú K. pneumoniae ettõl eltérõ plazmid profilt mutatott (P4), három plazmiddal: egy 94 kb méretûvel, egy 2 és 4 kb méret között ingadozóval és egy 2 kb-nál kisebb méretûvel. A K. oxytoca törzsek három különbözõ mintázatot mutattak: P2, P3 és P5. A K. oxytoca C genotípusnak két plazmidja volt: egy 94 kb-os és egy megközelítõleg 2 kb-os (P2). A D genotípusú K. oxytoca-ra a P3 plazmid típus volt jellemzõ, amely egyetlen 94 kb méretû plazmidot foglal magába, míg az F genotípus esetében két plazmid jellemzõ: az egyik 94 kb-os, a másik 2 és 4 kb között változik (P5). A törzsekbõl izolált teljes plazmidok EcoRI és HindIII enzimekkel történõ restrikciója megerõsítette az 5 különbözõ plazmid mintázatot.

PCR amplifikálás és szekvenálás A ß-laktamáz gének PCR-analízise a blaSHV gén jelenlétét mutatta ki az összes ESBLtermelõ Klebsiella izolátumban. Az amplifikált blaSHV gének szekvencia analízise azonosított egy SHV-5 enzimet a PFGE A és B típusú K. pneumoniae és az F típusú K. oxytoca törzsekben. Az SHV-12 enzimet a PFGE C és D típusú ESBL-termelõ K. oxytoca törzsekben azonosítottuk (18. táblázat). A C és D genotípusú K. oxytoca törzsek TEM-1 enzimet is termeltek. Egyetlen törzsben sem volt jelen a CTX-M gén.

6.5. Metallo- -laktamáz termelõ Klebsiella törzsek 2009-ben egy budapesti centrumban a Klebsiella spp. izolátumok 5 %-a (Enterobacteriaceae izolátumok 1.4 %-a), egy másik budapesti centrumban a Klebsiella spp. izolátumok 4.8 %-a (Enterobacteriaceae izolátumok 2.4 %-a) volt ertapenem rezisztens nem karbapenemáz termelõ. A törzsek további vizsgálata során egy K. pneumoniae és egy K. oxytoca törzs bizonyult „B” csoportba tartozó metallo- ß-laktamáz termelõnek, melyek az elsõ magyarországi izolátumok. Ezen törzsek mikrobiológiai jellemzését végeztük el. A K. pneumoniae KP3686 és K. oxytoca KO5294/9 izolátumok E-teszttel meghatározott MIC értékeit a 19. táblázat foglalja össze. A széles spektrumú cephalosporinokra rezisztensek voltak. A K. pneumoniae törzs a legtöbb nem

-laktám

antibiotikumra, köztük az aminoglikozidokra, a ciprofloxacinra és a trimethoprimsulfamethoxazolra is rezisztens volt. Mindkét törzs ertapenem rezisztens. 71

A KP3686 törzsben detektáltuk a kromoszómálisan kódolt, nem-ESBL típusú blaSHV-11 gént és a plazmidon kódolt blaCTX-M-15, blaTEM-1 géneket, ezen kívül a class-1 integronon elhelyezkedõ blaVIM-4 gént (19. táblázat). A KO5294/9 törzsben csak a class-1 integronon lévõ blaVIM-4 gént találtuk. Mindkét integron két gén kazettát hordozott: az elsõ pozícióban egy aac(6’)-Ib (úgynevezett aacA4) gént és ezt követõen egy blaVIM-4 gén kazettát. Az integronok szekvenálási eredménye kimutatta, hogy ugyanaz a VIM4-tartalmú class-1 integron van mindkét izolátumban, továbbá hogy ez az integron megegyezik a dél-magyarországról származó P. aeruginosa törzsekben és az elsõ MBL-termelõ Aeromonas hydrophila törzsben korábban leírt integronnal. A nukleotid szekvenciák a GenBank adatbázisába feltöltésre kerültek és a KP3686 törzsnél GU181265 számmal, a KO5294/9 törzsnél GU181269 számmal elérhetõk. DNS hibridizációval kimutattuk, hogy a VIM-gén mindkét törzsben kb. 90bp nagyságú plazmidokon van. Bár a konjugációs kísérlet nem sikerült, a ß-laktamáz gént hordozó plazmidokkal sikerült transzformálni az E. coli DH5 törzset. A transzformált baktériumok PCR vizsgálata és a kapott termékek szekvenálása megerõsítette a blaCTX-M-15 ESBL és blaTEM-1 gének jelenlétét a pKP3686/2 plazmidon és a blaVIM-4 génét a pKP3686/1 és pKO5294/9 plazmidokon (19. Táblázat). A fingerprint analízishez a transzformált baktériumokból kivont plazmid DNS-t PstI és EcoRI enzimekkel emésztettük. A pKP3686/1 és pKO5294/9 plazmidok egyezését a restrikciós analízis is megerõsítette. A PFGE és MLST vizsgálatok eredményei bizonyítják, hogy a KP3686 törzs a korábban leírt ST11 klónba tartozik, melyet CTX-M-15-termelõ epidémiás klónként (EC III) országszerte detektáltak és újabban Franciaországban, Hollandiában, Spanyolországban és Koreában is megjelent (http://www.pasteur.fr/mlst). Ismereteink szerint ez az elsõ eset, hogy a nemzetközileg sikeres ST11 K. pneumoniae klón egy MBL-kódoló integront importált.

72

19. Táblázat A K. pneumoniae KP3686, K. oxytoca KO5294/9, E. coli DH 5 Törzsek

KP3686

PCR és szekvenálás eredménye

VIM-4

E. coli DH5

-

E. coli DH5 pKP3686/1, ~90 kb)**

VIM-4

E. coli DH5 pKP3686/2, ~50 kb)**

CTX-M-15, TEM-1

E. coli DH5 pKO5294/9, ~90 kb)**

VIM-4

törzsek jellemzõi

MIC (mg/L)* AMC TZP CAZ CTX FEP ATM ETP IPM MEM CIP AMK TOB GEN SXT TGC CST

TEM-1, SHV-11, CTX-M-15, >256 >256 VIM-4

KO5294/9

és transzformált E. coli DH 5

>256 >256

4

4

32

64

8

16

1.5

0.5

64

64

48

0.19

2

2

12

8

0.5

>256

64

64

4

16

8

0.5

>256 >256

1

2

16

>256 >256 >32 0.75 0.5

16

>256

2

0.5

2

1

0.016 0.032 0.016 0.032 0.008 0.25 0.094 0.19 0.012 0.12 0.064 0.016 0.12 0.5

>256 >256

8

0.25 >32

0.032 0.064 1.5

16

0.19 0.19

4

8

0.064 0.023 0.25 0.5

0.016 0.38 0.094 0.25

1

8

>256 0.006 0.25 0.5

4

8

0.064 0.012 0.25 0.5

0.047 0.125

3

0.25 0.19

* AMC: amoxicillin/klavulánsav, TZP: piperacillin/tazobactam, CAZ: ceftazidime, CTX: cefotaxime, FEP: cefepime, ATM: aztreonam, ETP: ertapenem, IPM: imipenem, MEM: meropenem, CIP: ciprofloxacin, AMK: amikacin, TOB: tobramycin, GEN gentamicin, SXT: trimethoprimsulfamethoxazol, TGC: tigecycline, CST: colistin ** A transzformált baktériumokban lévõ plazmidok rövidítése és mérete

73

6.6. Kinolon rezisztencia vizsgálatok 2002 és 2006 között izolált ESBL termelõ bélbaktériumban (70 E. coli, 101 K. pneumoniae, 5 C. freundii, 61 Enterobacter spp.) vizsgáltuk a qnrA, qnrB, qnrS és aac(6’)-Ibcr gének jelenlétét és az izolátumok kinolon érzékenységét. 61 ESBL-termelõ Enterobacter spp. izolátumból 57 volt rezisztens nalidixsavra (93 %) és 50 (82 %) ciprofloxacinra. 101 ESBL-termelõ Klebsiella spp. izolátumból 79 (78 %) volt rezisztens nalidixsavra, 60 (60 %) pedig ciprofloxacinra. A 70 ESBL-termelõ E. coli izolátumból 65 (93 %) volt nalidixsav-rezisztens és 54 (77 %) ciprofloxacin-rezisztens. Az öt ESBL-termelõ C. freundii izolátumból egy volt rezisztens ciprofloxacinra.

A qnr A, ,B, S és aac(6’)-Ib-cr pozitív ESBL-termelõ törzsek jellemzése

A qnr és aac(6’)-Ib-cr gének prevalenciája A qnr determinánsok prevalenciája viszonylag magas volt a K. pneumoniae (8 %) és alacsony az E. coli izolátumokban (1.6 %) valamint az Enterobacter fajok esetén (0 %). Az ötbõl egy ESBL-termelõ C. freundii izolátum volt qnr-pozitív. A qnrA1, qnrB2 és qnrS1 volt kimutatható és a qnrA1-nek volt a legnagyobb prevalenciája (3 %). Az összes ESBL-termelõ izolátumból hatvanhárom (26.6 %) volt pozitív aac(6’)-Ib-re, amelybõl 19-ben (az összes 8 %-a) - 16 K. pneumoniae és 3 E. coli - volt jelen az aac(6’)-Ib-cr variáns. Egyetlen qnrpozitív törzs sem hordozta az aac(6’)-Ib-cr variánst.

A qnrA-pozitív törzsek jellemzése A qnrA1-pozitív törzsek - hat K. pneumoniae és egy E. coli - rezisztensek voltak nalidixsavra, norfloxacinra, ciprofloxacinra és levofloxacinra, igen magas MIC-értékekkel. A konjugációs próba, mely három qnrA1-pozitív törzs esetében volt sikeres, megerõsítette, hogy a qnrA1 gén jelenléte önmagában csupán alacsony szintû kinolon-rezisztenciát okoz. Az E. coli J53 RifR-hez (nalidixsav, 4 µg/ml; norfloxacin, 0.06 µg/ml; és ciprofloxacin, 0.12 µg/ml) képest a transzkonjugánsok MIC-értékei 8-szor magasabbak voltak nalidixsavra, 132-szer magasabbak norfloxacinra és 66-132-szer magasabbak ciprofloxacinra. Mindazonáltal a transzkonjugánsok így is csak alacsony szintû kinolon-rezisztenciát mutattak, ami arra utal, hogy az eredeti izolátumok magas-szintû kinolon-rezisztenciája számos rezisztenciamechanizmus együttes hatásának tulajdonítható. A qnr-pozitív törzsekbõl és a qnr-pozitív konjugált baktériumokból izolált plazmidok azonos méretûek voltak (>10 kb).

74

A qnrB-pozitív törzsek jellemzése A qnrB gént két izolátumban detektáltuk: egy K. pneumoniae és egy C. freundii esetén. A K. pneumoniae M95 mind a qnrA1, mind a qnrB2 géneket hordozta, de csak a qnrA1 volt konjugációval átvihetõ, ami a két gén eltérõ genetikai hátterére utal. A ciprofloxacin és levofloxacin MIC-értékei a K. pneumoniae M95-ben voltak a legmagasabbak a többi qnrA1-pozitív törzzsel összehasonlítva, ami az eredeti izolátum egyidejû qnrA1- és qnrB2-termelésével magyarázható. Önmagában a qnrA1 átvitele nem eredményezett jelentõs változást a kinolon-érzékenységben a transzkonjugánsok esetében. A kizárólag a qnrB2 gént hordozó C. freundii M141 érzékeny volt a vizsgált fluorokinolonokra, legalább 8-szor kisebb MIC-értékekkel, mint a CLSI által javasolt érzékenységi határértékek.

A qnrS-pozitív törzsek jellemzése A qnrS1 gént csak egy K. pneumoniae törzsben detektáltuk, amely rezisztens volt a legtöbb vizsgált fluorokinolonra. Azonban a norfloxacin (16 µg/ml) és a ciprofloxacin (4 µg/ml) MIC-értékei a CLSI által javasolt határértékek voltak. A levofloxacin MIC-értéke (4 µg/ml) a két CLSI határérték (8 és 2 µg/ml) között volt.

A aac(6’)-Ib-cr -pozitív törzsek jellemzése A 19 aac(6’)-Ib-cr-pozitív izolátumból 6 (32 %) volt érzékeny mind ciprofloxacinra, mind levofloxacinra.

A qnr-pozitív törzsek által termelt ß-laktamáz enzimek jellemzõi A qnr-pozitív törzsek által termelt ß-laktamáz enzimek jellemzõit — izoelektromos pontok, PCR és szekvenálási adatok — meghatároztuk. Tanulmányunk szerint a qnrA1 gén jelenléte kapcsolt volt az SHV-5, SHV-12 és CTX-M-15 enzimekkel. A qnrB2-pozitív C. freundii törzsben található ESBL enzim genotípusát nem tudtuk meghatározni. A qnrS1 gént együtt találtuk az SHV-2 ESBL génnel. Eredményeinket a 20. táblázatban foglaltuk össze.

75

20. Táblázat A qnr-pozitív törzsek által termelt ß-laktamáz enzimek jellemzõi és kinolonrezisztencia MIC értékei Törzsek

qnr gének

E. coli M136 K. pneumoniae 124 K. pneumoniae 125 K. pneumoniae M88 K. pneumoniae M140 K. pneumoniae M143 K. pneumoniae M95 C. freundii M141 K. pneumoniae 96

qnr A1 qnr A1 qnr A1 qnr A1 qnr A1 qnr A1 qnr A1, qnrB2 qnr B2 qnrS1

MIC (ug/ml) PCR, szekvenálás Nalidixsav Ciprofloxacin Levofloxacin >32 >256 64 TEM-1, SHV-12 >32 64 64 TEM-1, SHV-12 >32 64 128 TEM-1, SHV-12 >32 64 8-16 SHV-5 >32 256 128 TEM-1, SHV-12 >32 32 64 CTX-M-15 >32 >256 128 TEM-1, SHV-12 2 <0.5 <0.5 ND >32 4 4 TEM-1, SHV-2

6.7. Stenotrophomonas maltophilia törzsek A S. maltophilia nozokomiális fertõzésekben betöltött szerepének megítéléséhez felmértük izolálási gyakoriságukat 2002 és 2009 között. Jellemzõen alsó légúti mintákból (bronchoalveoláris lavage, köpet, endotracheális tubusváladék), sebfertõzésekbõl, szemészeti fertõzésekbõl, vizeletbõl és vérbõl izoláltuk õket a fertõzést feltételezhetõen okozóként illetve kolonizálóként. Adatokat nem mutatunk, de megemlítjük, hogy ritkán voltak egyedüli patogének, sokkal jellemzõbb volt a polimikróbás fertõzésekbõl való izolálhatóságuk (az esetek 2/3-ban). A laboratóriumunkban izolált S. maltophilia törzsek évenkénti számát és minták szerinti százalékos eloszlását a 21. táblázatban összegeztük. A S. maltophilia antibiotikum érzékenységi vizsgálatához a nemzetközi ajánlások szûkszavúak, illetve szigorúan feltüntetik a „folyamatban” jelzõt a standardizálás leírásakor. Ezért,

hogy

támpontot

kapjunk

a

korrekt

mikrobiológiai

lelet

megszületéséhez,

laboratóriumunkban izolált törzsek antibiotikum érzékenységi vizsgálatát az általában szokásos vizsgáló módszerekkel (korongdiffúzió, mikrodilúció, automata) végeztük el, az eredményeket 24 h-ra és 48 h-ra is leolvasva (22. táblázat). Az érzékeny (S), mérsékelten érzékeny (I) és rezisztens (R) interpretációk az EUCAST ajánlásának, ennek hiányában pedig a CLSI ajánlásának felelnek meg. Stenotrophomonas-ra vonatkozó ajánlás hiányában polymyxin B, colistin, ciprofloxacin és levofloxacin esetében a Pseudomonas fajokra, doxycyclin esetében az Acinetobacter fajokra, tigecyclin esetén az Enterobacteriaceae családra vonatkozó ajánlásokat vettük alapul.

76

A korongdiffúziós módszerrel végzett trimethoprim-sulfamethoxazol érzékenységi vizsgálatok eredményei szignifikánsan nem változtak 24-48 h-ra és jól korreláltak a mikrodilúcióval végzett vizsgálatok eredményeivel. A rezisztencia mértéke közel 10%. Kinolonok esetében, ha irányadónak a mikrodilúciós módszert fogadjuk el, akkor látható, hogy a kinolonok érzékenysége korongdiffúzióval vizsgálva 48 h-ra leolvasva ad közel azonos eredményt a mikrodilúciós módszerhez. Ciprofloxacinra, levofloxacinra és moxifloxacinra az izolátumok 100, 23 illetve 9 %-a volt rezisztens. Tigecyclinre, polymyxin B-re és colistinre stabilan érzékeny volt a törzsek 63, 43 ill. 34 %-a, dilúciós módszerrel vizsgálva azonban szinte 100 %-ban rezisztensnek bizonyultak. Ugyanakkor doxycyclin esetében az érzékeny kategóriába esõ, alacsony MIC értékeket mértünk a törzsek 90 %-nál, míg korongdiffúzióval nem volt értékelhetõ gátlási zóna.

21. Táblázat A vizsgált Stenotrophomonas maltophilia törzsek adatai Év

2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 107

122

105

84

81

47

46

83

Hemokultúra

5.6

4.1

9.5

8.3

3.7

6.4

2.2

2.4

Kanül

4.7

4.9

1

0

2.5

2.1

2.2

1.2

60.7 63.9 37.1 61.9 60.5 61.7

63

54.2

Hasûri minta

0.9

0.8

2.9

0

1.2

0

0

1.2

Egyéb fiziológiásan steril folyadék

0

0.8

1.9

0

1.2

0

0

1.2

Vizelet

6.5

3.3

6.7

9.5

11.1 12.8

2.2

2.4

Seb (mély)

4.7

5.7

11.4

9.5

8.6

8.5

6.5

7.2

Szemváladékok

3.7

0.8

6.7

3.6

7.4

6.4

4.3

9.6

Felsõ légúti minta

0.9

0.8

1

0

0

0

0

0

Anus

0

0

0

0

0

0

13

12

Anyatej

0

0

0

1.2

0

0

0

1.2

Fülváladék

2.8

1.6

5.7

2.4

3.7

2.1

2.2

7.2

Nõi genitális minta

3.7

9.8

10.5

2.4

0

0

0

0

Férfi genitális minta

5.6

3.3

4.8

0

0

0

0

0

Sterilitási próba

0

0

1

1.2

0

0

4.3

0

Összesen

n

Minta

Alsó légúti váladékok

77

22. Táblázat. Stenotrophomonas maltophilia törzsek korongdiffúziós és mikrodilúciós vizsgálati eredményei, 24 és 48 órára interpretálva

Korongdiffúzió Antibiotikum

Sulfamethoxazol/ trimethoprim

Polymyxin B

Colistin

Ciprofloxacin

Levofloxacin

Moxifloxacin

Doxycyclin

Tigecyclin

24 h S I R ? S I R ? S I R ? S I R ? S I R ? S I R ? S I R ? S I R ?

db 58 0 8 66 32 0 38 70 27 0 43 70 19 0 51 70 56 0 14 70 65 0 4 69 0 3 67 70 44 0 26 70

Mikrodilúció

48 h db 30 1 35 66 30 0 40 70 24 0 46 70 7 0 63 70 54 0 16 70 64 0 5 69

% 87,88 0 12,12 100 45,71 0 54,29 100 38,57 0 61,43 100 27,14 0 72,86 100 80 0 20 100 94,2 0 5,797 100 0 4,286 95,71 100 62,86 0 37,14 100

% 45,45 1,515 53,03 100 42,86 0 57,14 100 34,29 0 65,71 100 10 0 90 100 77,14 0 22,86 100 92,75 0 7,246 100

24 h db 61 0 5 66 1 1 67 69 0 0 69 69 0 0 69 69 55 0 15 70 63 0 6 69 63 3 4 70 0 0 70 70

% 92,42 0 7,576 100 1,449 1,449 97,1 100 0 0 100 100 0 0 100 100 78,57 0 21,43 100 91,3 0 8,696 100 90 4,286 5,714 100 0 0 100 100

48 h db 60 0 6 66 1 0 67 68 0 0 69 69 0 0 69 69 54 0 16 70 62 0 7 69

% 90,91 0 9,091 100 1,471 0 98,53 100 0 0 69 69 0 0 100 100 77,14 0 22,86 100 89,86 0 10,14 100

Rövidítések: S: érzékeny, I: mérsékelten érzékeny és R: rezisztens, : vizsgált törzsek száma

78

7. Megbeszélés 7.1. Egyes nozokomiális fertõzések általános epidemiológiája

Véráramfertõzések kórokozó spektruma A laboratóriumunkban tenyésztéssel alátámasztott véráramfertõzések kórokozó spektruma jól összevethetõ a hazai és nemzetközi adatokkal. Az elsõ három leggyakoribb kóroki tényezõ a CNS, a S. aureus és az E. coli. A mikróbák incidenciájának évenkénti tendenciáját tekintve mi is azt tapasztaltuk, hogy a Gram-pozitív mikróbák által okozott fertõzések aránya egyenletesen emelkedik. Ezt egyetemünkön fõleg az Enterococcus spp. számának emelkedése magyarázhatja. Jellegzetes az is, hogy a Klebsiella spp. korábbi dominanciáját az Enterobacteriaceae családba tartozó egyéb baktériumok által okozott véráramfertõzések tarkítják. A CNS magas izolálási gyakorisága hátterében az állhat, hogy nagyszámú

hemokultúrát

vizsgálunk

csökkent

védekezõképességû

(hematológiai,

transzplantált, koraszülött) betegek szepszisében, illetve centrális vénás kanül-asszociált primer véráramfertõzésekben. Adataink alapján a késõi neonatális szepszisek száma örvendetesen csökken (legalábbis a tenyésztéssel igazolhatóak száma). A legfõbb patogének egyértelmûen a CNS családjába tartozó coccusok. Noha a CNS alacsony patogenitású, gyakori kommenzális mikróba az immunkompetens szervezetekben, a koraszülöttek különösen fogékonyak az általa okozott

invazív

fertõzésre.

A

lázas

betegek

hemokultúrájából

kitenyészett

CNS

szignifikanciája nehéz kérdés, mivel nagyon problémás a kissúlyú koraszülöttektõl a hemokultúra vétele, a neonatológusok kb. 80 %-ban egy bakterémiás periódus alatt csak egy darab hemokultúrát vesznek. Így elveszítjük a felnõtteknél alkalmazható eljárást (ha több hemokultúrás palackból tenyészik ki ugyanaz a kórokozó ugyanolyan antibiogrammal, az valószínûsíti patogén szerepét). Sok intézményben manapság már a CNS a neonatális bakterémiák legfõbb oka, a véráram fertõzések >50 %-át okozva (Brodie et al. 2000, Mahieu et al. 2001, Aziz et al. 2005, Brady et al. 2005, van der Zwet et al. 2005, Mireya et al. 2007, Von Dolinger et al. 2007). A legfõbb neonatális fertõzésekben érintett faj a S. epidermidis, amely CNS kolonizációk 50-80 %-áért és a CNS véráramfertõzések 60-93 %-áért felelõs. Egyéb fajok, amelyek betegségokozó szerepét bizonyították a S. haemolyticus, S. hominis, S. warneri, S. saprophyticus, S. cohnii és a S. capitis. A CNS kolonizációk zöme nozokomiális eredetû,

79

fõleg az ápolószemélyzet kezérõl kerülnek át (Patrick et al. 1989, Kim et al. 2000, Silva et al. 2002, Chapman et al. 2003). Magas kockázata van a CNS bakterémiára azoknak az újszülötteknek, akiknek intravaszkuláris, különösen centrális katéterük van, amelyek hosszú idõn át kerülnek alkalmazásra. Másik jelentõs rizikófaktor a CNS szeptikémiára a parenterális táplálás, az intravénás lipid infúziók alkalmazása, amelyek növekedési lehetõséget biztosítanak a baktériumok számára, valamint a széles spektrumú antibiotikumok gyakori használata. A CNS nyák- és biofilm-termelõ képességét hozzák összefüggésbe a koraszülöttekre vonatkozó fokozott virulenciájával. Noha a slime és egyéb virulenciafaktorok fontosak a CNS patogenitása szempontjából, sok tanulmány közül egy esetben sem találtak bizonyítékot hipervirulens CNS klónok létezésére, amelyek az újszülöttekben betegséget okoznak. Másfelõl viszont számos tanulmányban kimutatták, hogy a CNS szepszist bizonyos kitüntetett molekuláris típusok okozták, amelyek jelentõs hasonlóságot mutattak mind a személyzet, mind az újszülöttek esetében, ami a keresztkontaminációt igazolta. A CNS szepszis klinikai szempontból gyakran jellegtelen, semmint fulmináns, bár már halálesetekrõl is beszámoltak. Általában a korai halálozás 2-17.3 %-áért felelõsek (Makhoul et al. 2005, Gastmeier et al. 2007). A CNS-ek döntõ többsége rezisztens oxacillin/meticillinre (Bromiker et al. 2001, Rubin et al. 2002). A késõi kezdetû szepszisre gyanús gyermekeket empirikus antibiotikum terápiában részesítik, amely gyakran magába foglalja a vancomycint. Az újszülöttekben bekövetkezõ nozokomiális CNS szepszis megelõzésére irányuló erõfeszítés eddig nem volt túlságosan sikeres és ezen fertõzések kezelése jelentõs antibiotikum terhelést eredményez a NICU-n, amely nemcsak az antibiotikum-rezisztencia emelkedett kockázatát eredményezi a CNS és a S. aureus esetén, hanem az antibiotikum-rezisztens CNS-klónok kiszelektálódását is. A vancomycinnel kezelt betegek esetén kockázati tényezõként merül fel a vancomycinrezisztens enterococcusok és a vancomycin-csökkent érzékenységû S. aureus megjelenése. Jelenleg nincs egyetértés a neonatológusok között számos nézõpontot illetõen a késõi kezdetû szepszisre gyanús hospitalizált újszülöttek diagnózisával és kezelésével kapcsolatban.

Multirezisztens kórokozók gyakorisága A nozokomiális fertõzésekbõl izolált multirezisztens kórokozók gyakoriságának öt év elteltével (2004 és 2009 között) történõ megváltozása aggasztó képet nyújt. Kiemelendõ, hogy a S. aureus izolátumok meticillinre való rezisztenciája megnégyszerezõdött, elérte a 20 %-os szintet. Az ESBL-termelõ E. coli törzsek gyakorisága is közel tízszeresére nõtt, amit 80

valószínûleg az egész világon elterjedt CTX-M-15 termelõ klónok megjelenése okozott. Egyetemünk klinikáin ápolt betegek fertõzéseiben is megjelentek a szintén világszerte súlyos problémát jelentõ multirezisztens A. baumannii törzsek. A vancomycin-rezisztens E. faecium törzsek izolálási gyakorisága megnõtt, de egyelõre még alacsony mértékû. A nemfermentáló Gram-negatív mikróbák közül a pánrezisztens, csak polymyxin B (colistin) érzékeny P. aeruginosa, valamint a trimethoprim-sulfamethoxazol rezisztens S. maltophilia izolátumok magas és növekvõ aránya nagy terápiás kihívás napjainkban.

Nozokomiális húgyúti fertõzések epidemiológiája A húgyúti fertõzések bakteriális spektrumában számos különbség van, kortól, nemtõl, immunstátusztól és egyéb más prediszponáló tényezõktõl függõen. Az antibiotikum rezisztencia szintek és mintázatok alapján szigorúbb irányelveknek és szabályozásnak kell érvényesülnie az antibiotikum politikában. Minden húgyúti fertõzés egyedi lehet. A mikrobiológus felelõs munkájával kell, hogy segítse a kezdeti antimikrobiális terápia optimalizálását.

Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a nozokomiális fertõzések nagy részére jellemzõ, hogy legjellegzetesebb kórokozói nem azonosak a “klasszikus”, ún. obligát patogénekkel, hanem gyakran fakultatív patogén, vagy opportunista baktériumok. Jól meghatározható azoknak a kórokozóknak a köre, amelyek leggyakrabban, vagy csaknem mindig nozokomiális infekciókban szerepelnek (A. baumannii, P. aeruginosa, Pseudomonas spp., multirezisztens koaguláz-negatív staphylococcusok, S. maltophilia, stb.). Mivel ezek gyakran jelen vannak a kórházi környezetben, a betegek gyakran kolonizálódnak e baktériumokkal. Tény, hogy a mindennapi klinikai gyakorlatban az antibiotikum választáshoz a kezelés megkezdésekor csak kivételesen áll rendelkezésre kimutatott kórokozó és antibiogram. Növelni kell az empirikus terápia hatékonyságát. Az infekciók kezelésével kapcsolatos ajánlások a helyi sajátosságok és rezisztenciaviszonyok alapján módosítandók. Egyértelmû, hogy az antibiotikum politika és az infekció kontroll egymástól elválaszthatatlan. Magával az antibiotikumok alkalmazásának megszorításával nem lehet megakadályozni a rezisztens törzsek által okozott infekciók elterjedését, ehhez a nozokomiális epidémiák kialakulásának, illetve elterjedésének gátat vetõ infekció kontroll szükséges, valamint racionális antibiotikum terápia alkalmazása. Önmagában a megszorítás nem elég, sõt

81

pl. a homogenizálás, azaz csak ugyanazon antibiotikumok alkalmazása éppen a rezisztencia fokozódásához vezethet. A hazai rezisztencia adatok riasztóan rosszak bizonyos baktériumcsoportok esetében, valamint az antibiotikum fogyasztás is meghaladja az európai átlagot. Itt az ideje a jól átgondolt, racionális antibiotikum használat elterjedésének, mely hátterében megfelelõ oktatás, orvosi szemléletváltozás, valamint természetesen jól mûködõ mikrobiológiai laboratórium, jól együttmûködõ klinikus és mikrobiológus szükséges az antibiotikum rezisztencia kontrollálásához. A nozokomiális fertõzések gyakoriságának és megoszlásának ismerete szükségszerûen az elsõ lépés ahhoz, hogy e fertõzések kockázata és a társuló morbiditás és mortalitás csökkenjen. A legjobb kezelés a megelõzés, a következetes és agresszív kézmosás és a tisztítási eljárások minden egyes osztályon. A járványok pontos felderítéséhez szükséges az adott osztályon elõforduló törzsek tipizálására molekuláris technikákkal. Genetikai módszerekkel megismerve az egyes rezisztencia-mechanizmusok hátterét, természetét az így szerzett tapasztalat visszavezethetõ a mindennapi rutin mikrobiológiai, klinikai, infetológiai és higiéniai munkába.

7.2. Staphylococcus aureus törzsek A S. aureusok antibiotikum rezisztenciájában igen jelentõs földrajzi eltérések vannak. Ezt az általunk vizsgált macedón, osztrák és magyar MRSA és MSSA törzsek összehasonlító elemzése is igazolta. (Horváth et al.– közlés alatt 2010) Skopjéban az intenzív osztály, a kóma centrum, az általános sebészeti, a nefrológiai és haematológiai osztáy betegei nagy arányban kolónizálódtak és fertõzõdtek MRSA-val. Ezt az alapbetegségek mellett feltehetõen a törzsek intra- és interhoszpitális terjedése és a kórházi infekció kontroll szigorú intézkedésének hiánya okozta. Mivel az MRSA gyakorisága Macedóniában magas (Cekovska et al. 2005), gyakoribb glikopeptid használatot lehet feltételezni, ami emeli a kockázatát a glikopeptid mérsékelten érzékeny S. aureus (GISA) törzsek kifejlõdésének. Kijelenthetjük, hogy a különbözõ európai országokból származó S. aureus törzsek rezisztencia mintázata eltérõ. A helyi rezisztencia adatok ismerte szükségszerû, mivel az empirikus terápia alapját ez adhatja. A multirezisztens MRSA törzsek megjelenése az egész kontinensen súlyos probléma, egyre nagyobb jelentõséget adva a glikopeptideknek és az újabb anti-MRSA szereknek az MRSA fertõzések kezelésében.

82

Az MRSA és MSSA törzsekre vonatkozó rezisztencia adatok külön-külön történõ megadása kiemelkedõen fontos. A rendkívül nagy különbség az MRSA és MSSA törzsek antibiotikum rezisztenciájában és egyes virulencia faktoraiban arra utal, hogy a S. aureus speciesnek talán különbözõ subspecieseit képzik. A klinikai adatok alapján megállapítható, hogy az MRSA hordozók között gyakoribbak a Staphylococcus fertõzések, mint az MSSA hordozók között (25 % versus 4 %). Az MRSA és az MSSA okozta nozokomiális bakterémiák mortalitási rátáját összehasonlító vizsgálatok eredményeinek értékelésénél figyelembe kell venni a lehetséges korlátokat, mint a kis mintaszám, a különbözõ beteg populációk különbözõ betegségekkel, a kórokozó földrajzilag változó virulenciája, a különbségek az empirikus terápiában és az alkalmazott antibiotikumok hatékonyságában. A német nozokomiális fertõzések surveillance rendszerének adatai nem tudták alátámasztani, hogy az MRSA okozta pneumónia és véráram fertõzés az intenzív osztályokon szignifikánsan magasabb halálozási kockázattal jár. A Staphylococcus fertõzések, így az MRSA véráram fertõzések kialakulásában kardinális pont lehet a kezdeti antibiotikum terápia: a megfelelõ terápia késése összefügg a magasabb mortalitással. A fõ különbség az MRSA és MSSA coccusok között az antibiotikum érzékenységi mintázat, mivel az MRSA törzsek a

-laktám rezisztencia mellett könnyen más antibiotikumokra is

rezisztenssé válhatnak. A multidrug rezisztencia, mint szelektív elõnyt adó indirekt virulencia faktor lehetõsége szintén felmerül. Az MSSA fertõzések sokkal könnyebben kezelhetõk. Bebizonyosodott,

hogy

az

MRSA

véráram

fertõzések

szignifikánsabb

hosszabb

hospitalizációval, lassabb klinikai felépüléssel és magasabb költségekkel járnak, mint az MSSA okozta véráram fertõzések. Bár a klinikai tanulmányok eredményei alapján az MRSA törzsek virulensebbnek tûnnek, az in vitro kísérletek ezt nem igazolják. Az ellentmondás hátterében az MRSA populációk heterorezisztens jellege állhat. Az empirikusan megkezdett terápia hatására a meticillin rezisztens szubpopulációk kiszelektálódnak, dominánssá válnak, és ezáltal determinálják a további klinikai képet. Az MRSA és az MSSA törzsek közötti különbségek alapján – tekintve a sejtproliferációs kinetikát, a celluláris struktúrát, a slime és biofilm képzést, a sejtfelszíni adhezineket, az enzimkészletet, a szuperantigén exotoxinokat és a citotoxinokat (különösen a Panton-Valentin leukocidint és az

-, - és -variáns-haemolysineket) – felmerült a kérdés,

hogy a meticillin rezisztens törzsek virulensebbek-e a meticillin érzékenyeknél. A válasz nehéz, hiszen több szempontot kell figyelembe venni, köztük az ellentmondásos kísérleti eredményeket is (Rozgonyi et al. 2007, Kocsis et al. 2010).

83

Az MRSA és MSSA törzsek adhézióért felelõs génjeinek és citotoxin génjeinek gyakoriságát saját vizsgálati eredményeink is mutatják. Az infekció kialakulásának kezdeti fázisában: az adhézióban és kolonizációban játszanak fontos szerepet a baktérium felszínén elhelyezkedõ adhéziós fehérjék, mint például fibrinogén-, fibrin-, fibronektin-, kollagénkötõ fehérjék. Az extracellularis mátrixhoz kötõdni képes adhéziós molekulákat az MSCRAMM (Microbial Surface Components Recognising Adhesive Matrix Molecules) molekula családba sorolják. A biofilm képzésben az ica locus terméke, a polysaccharid intercellularis adhaesin (PIA) biztosít kapcsolatot a coccusok között. Az invazív fertõzések kialakulásában a S. aureus szöveti penetrációját elõsegítõ exoenzimek (lipáz, kollagenáz, foszfatáz) és citotoxinok (?-, ß-, ?-hemolizinek és leukocidinek) játszanak szerepet. Az adhéziós proteinek manapság már a S. aureus elleni vakcina kutatások célpontja is, ezért a S. aureus fertõzések patogenezisének molekuláris genetikai szinten való pontosabb megismerése a jövõben a prevenció oldaláról is hasznos lehet. A kollagén kötõ fehérjét kódoló cna gén vizsgálataink szerint inkább az MSSA törzseket jellemezi. A protein-A a S. aureus egyik fontos virulencia faktora, amelynek segítségével az IgG nem antigén specifikus Fc-végéhez kapcsolódva a fagocitózis elõl a baktérium maszkírozza magát. A protein-A-t kódoló spa gén jelenléte az MRSA törzseket jellemezte szignifikánsan (p <0.05). A biofilm képzésben fontos szerepet játszó ica locus icaA gén és a fibronektinkötõ protein A-ért felelõs fnbA gén gyakoriságát tekintve az MSSA és MRSA törzsek között szignifikáns különbséget nem tapasztaltunk, hasonlóan magas százalékokban (> 90 %) detektáltuk. A virulencia szempontjából a gének halmozódása is érdekes, hiszen a fertõzés során a különbözõ virulencia faktorok hatásai összeadódnak, ill. a receptorok jelenléte szerint fejezõdhetnek ki. Mind az MRSA, mind az MSSA törzseket az adhéziós gének többféle kombinációs mintázata jellemezte. A spa, icaA és fnbA génekbõl álló, 3 génes mintázat az MRSA törzseknél szignifikánsan gyakoribb volt. (Kocsis és mtsai 2007) Az ?-, ß-, ?-, ?–variáns, ?-hemolizinek és a Panton-Valentine leukocidin kódoló génjeinek prevalenciáját is vizsgáltuk, hazai, osztrák és macedón törzsekben. Az ?-hemolizint kódoló hla gént a vizsgált magyar MSSA törzsek 99 %-a hordozta. A gén mindhárom ország MRSA törzseiben hasonlóan magas arányban megtalálható volt. Bár a ß-hemolizin hlb gén kromoszómálisan kódolt, a gén prevalenciáját a mobil genetikai elemekkel szerzett idegen gének csökkenthetik. A vizsgált törzsekben alacsony hlb gyakoriságot (43 %, 48 %) találtunk. A hlg gyakorisága az MSSA törzsek között hasonló volt (kb. 70 %), az MRSA törzsek közt a magyar és macedón izolátumokban gyakoribb. A hlgv (?–variáns hemolizin) és hld (?hemolizin) géneket az MRSA és MSSA törzsekben is hasonló gyakorisággal detektáltuk. A 84

Panton-Valentine leukocidin pvl gént más vizsgálatokhoz hasonlóan a törzsek kis százalékában találtuk meg (0.4 % MRSA, 3 % MSSA). Jellemzõ három, négy és öt génbõl álló kombinációs mintázatokat figyeltünk meg. (Kocsis et al. 2009)

7.3. Staphylococcus haemolyticus törzsek Eredményeink világosan mutatják a Gram-pozitív coccusok növekvõ jelentõségét a véráramfertõzést okozó baktériumok között az elmúlt években, miként ez más publikációkban is olvasható (Fluit et al. 2001, Björkqvist et al. 2002, Decousser et al. 2003, Nunes et al. 2005, Natoli et al. 2009). Vizsgálatunkban a vérbõl izolált törzsek 6 %-a bizonyult S. haemolyticusnak. Az intenzív osztályokon, különösen a neonatális intenzív centrumokban gyakoribbak az ilyen fertõzések, mint más osztályokon. Eredményeink harmonizálnak a világirodalmi adatokkal, miszerint az összes CNS klinikai izolátum 5-38 %-át S. haemolyticus adja (Jarlov et al. 1998, Natoli et al. 2009, Rodrigez-Aranda et al. 2009). A kivételes specifikusság alátámasztja, hogy bizonyos betegeknél, például a kritikus állapotuk miatt az intenzív osztályon több invazív terápiás intervencióban részesülõknél nagyobb a kockázata a kolonizációnak, majd az ebbõl kiinduló infekciónak. Az általunk gyûjtött S. haemolyticus törzsek döntõ többsége multidrug-rezisztens volt. A multirezisztenciájuk azonban nem bizonyult egységesnek. Több fenotípusos rezisztencia mintázatot találtunk, köztük négy relatíve gyakorit, melyekre az oxacillin, erythromycin, gentamicin és ciprofloxacin szimultán rezisztencia jellemzõ. Klinikailag fontos, hogy a vérbõl izolált

törzsek

97

%-a

hordozta

a

mecA

gént,

nagyon

magasszintû

oxacillin,

következésképpen ß-laktám rezisztenciát eredményezve, ami az irodalomat tekintve szokatlan (Low et al. 1992, Petinaki et al. 2001, John et al. 2002). Vizsgálatunk másik aggasztó eredménye a 42 %-os teicoplanin rezisztencia 16 µg/ml MIC50 és 64 µg/ml MIC90 értékekkel. Eszerint hazánkban a teicoplanin többé nem tekinthetõ elsõ vonalbeli antibiotikumnak a S. haemolyticus fertõzésekben. Eredményeink alátámasztják a nézetet, miszerint a vancomycin az egyetlen elérhetõ antibiotikum – esetleg a linezolid-, mely még aktív mind az empirikusan, mind pedig az antibiogram alapján kezelt súlyos, meticillin-teicoplanin-rezisztens

S.

haemolyticus

okozta

fertõzésekben.

Az

általunk

alkalmazott szûrõ módszerrel egyetlen S. haemolyticus izolátum sem bizonyult vancomycin rezisztensnek a CLSI kritériumai szerint, de 38 %-uk 4 µg/ml vancomycin MIC értékû volt. A probléma súlyosabb, ha eredményeinket az EUCAST (www.eucast.org) glikopeptid rezisztencia meghatározásra vonatkozó irányelvei szerint elemezzük. A S. haemolyticus törzsek 38 %-a vancomycin rezisztens, 80 %-a teicoplanin rezisztens az EUCAST 85

iránymutatása szerint. Mindemellett eredményeinkbõl kiderül, hogy a vancomycin heterorezisztencia, módosított populáció profil analízissel vizsgálva, magas. Az érzékeny törzsek között (MIC 2 g/ml) a szigorúan érzékenyek (PAP AUC < 0.9) elõfordulása csak 48 %. Újabban több beszámoló is hangsúlyozta a vancomycin-rezisztens S. haemolyticus izolátumok emelkedõ gyakoriságát, mely a vancomycin terápiában fokozatos emelkedést mutat, de a jelenség valódi klinikai jelentõsége nem tisztázott (Wilson et al. 1986, Schwalbe et al. 1987, Blans et al. 2001, Menezenes et al. 2008). Eredményeink szerint a doxycyclin és a linezolid hatékony lehet a multidrugrezisztens S. haemolyticus törzsek egy része ellen és a vancomycin mellett szintén használhatók az empirikus terápiában, de ezen eredmények klinikai szignifikanciáját a továbbiakban vizsgálni kell. A hemokultúrából izolált S. haemolyticus törzsek PFGE analízisével heterogén mintázatot nyertünk, meghatározó genotípus nélkül. Ez az eredmény mutatja, hogy sok fenotípusosan különbözõ törzset vizsgáltunk, nem ugyanazon törzs szubkultúráit, ezért megállapításaink magára a S. haemolyticus speciesre is érvényesek. Eredményeink alátámasztják az egyéb közleményeket, miszerint a S. haemolyticus nagy genomiális variabilitást mutat (Burnie et al. 1997, Raimundo et al. 2002). Néhány tanulmány szerint jellemzõen magas genetikai homogenitást mutatnak a S. haemolyticusok, ha azok egy kórház ugyanazon osztályáról nyert „járványos” izolátumok (Björkqvist et al. 2002). Törzseinknél a fenotípusos antibiotikum rezisztencia mintázatok és a PFGE genotípusok között nem volt korreláció. Ezen eredmények és a S. haemolyticus multirezisztenciája miatt az antibiotikum rezisztencia mintázatok nem használhatók epidemiológiai vizsgálatokra. Abszolút egyértelmû, hogy surveillance programok szükségesek a súlyos fertõzéseket okozó mikrobiális patogének spektrumában bekövetkezõ változások azonosítására és az antimikrobiális rezisztencia mintázatok trendjeinek monitorozására, mind a nozokomiális, mind pedig a területen szerzett fertõzések vonatkozásában (Low et al. 1992, Gradelski et al. 2001, Björkqvist et al. 2002). Mivel a S. haemolyticus egy különleges speciesnek tûnik a CNS-ek közt, a CNS izolátumok species szintû meghatározása elengedhetetlen, habár nagyszámú tanulmány átnézésével leszûrhetõ, hogy ezt nem mindenhol teszik meg (Tabe et al. 1998, Tacconelli et al. 2001). A CNS species szintû azonosításának klinikai és epidemiológiai jelentõsége is lehet a klinikusok számára. A helyzet hasonló a gomba fertõzésekben látottakhoz, miszerint ahogy a Candida krusei fluconazol rezisztenciát jelent, a S. haemolyticus oxacillin és nagy valószínûséggel teicoplanin rezisztenciát. Emellett, mivel a multirezisztens S. haemolyticus potenciális patogén és a bõr normál flórájának rezidens tagja, 86

rezisztencia gének donora is lehet más fajok, fõleg a virulensebb S. aureus számára (Tabe et al. 2001, Hanssen et al. 2004, Berglund et al. 2008). Ezért a rezisztencia gének intra- és interspecies terjedését komolyan figyelembe kell venni.

7.4. ESBL-termelõ Klebsiella törzsek Neonatális késõi szepszisben a Gram-negatív pálcák (fõleg Klebsiella fajok) voltak a leggyakoribb kórokozók fejlett országokban 3 évtizeddel ezelõttig (Park et al. 2007), mostanság pedig a fejlõdõ országokban leggyakrabban izolált kórokozók (Shah et al. 1999, Zaidi et al. 2005). A Gram-negatív baktériumok, fõleg az Enterobacteriaceae család tagjai az emésztõtraktus normál lakói. Az újszülöttekben kialakulhat korai fertõzés az anyai Gramnegatív flórából kiindulóan vagy kialakulhat a bélkolonizáció a születés után olyan mikroorganizmusokkal, amelyek késõbb átléphetnek az éretlen vagy sérült bélnyálkahártyán, LOS-t eredményezve, néha nekrotizáló enterocolitis-szel társulva. Az Enterobacteriaceae család Gram-negatív enterális mikroorganizmusai magas letalitású nozokomiális szepszis kialakulásához vezethetnek (Haque et al. 2004, Makhoul et al. 2005), különösen az alacsony születési súlyú és koraszülött gyermekek esetén. A zsúfoltság szintén hozzájárulhat az E. cloaceae fertõzések kitöréséhez. A Citrobacter koseri (korábban Citrobacter diversus) okozta invazív fertõzések sokkal gyakoribbak újszülöttek körében, mint más betegcsoportokban, míg a Citrobacter freundii ritkán okoz betegséget újszülöttekben. A Klebsiella fajok fontos szerepe a perinatális intenzív osztályokon kialakuló fertõzésekben régóta ismert. A kórokozó túlél a környezetben és átmenetileg megtalálható az ápolószemélyzet kezén is, ami elõsegíti az újszülött-újszülött átvitelt. A Klebsiella fajok okozta neonatális fertõzések incidenciája 2.9 és 12.3 között változik 100 felvételre vonatkoztatva, 13-68 % közötti halálozási aránnyal (Zaidi et al. 2005). Az Enterobacter és Klebsiella fajok aggasztó mértékû rezisztenciát mutatnak (Tseng et al. 2002, Bindayna et al. 2006). A kiterjesztett spektrumú cefalosporinok bevezetése óta az ESBL-termelõ Klebsiella törzsek különösen súlyos problémát jelentenek világszerte. Sok ESBL a TEM-1, TEM-2 vagy az SHV-1 származéka. Míg néhány kórház klinikai mikrobiológiai laboratóriumában elérhetõk molekuláris epidemiológiai eszközök, mint a pulzáló mezejû gélelektroforézis (PFGE), a legtöbb laboratórium számára ez nem megoldott. Ezért a Klebsiella-fertõzések dinamikája egyes kórházi egységekben, például a PIC-eken teljesen felderítetlen lehet. 87

Figyelembe véve az ezen patogének által okozott szepszisek agresszív természetét, fõleg a fiatalabb gyermekek esetén, az ezen mikroorganizmusok, fõleg az ESBL-termelõk ellen alkalmazott empirikus terápia megfontolásra szorul, különösen feltételezett LOS esetén VLBW gyermekeknél (Saiman et al. 2002, Pessoa-Silva et al. 2003, Crump et al. 2007). Az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzsek jelenléte a PIC-eken jelentõs klinikai probléma. Leírtuk az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca infekciók molekuláris epidemiológiáját egy PIC-en, két idõszakban. Két különbözõ SHV-típust azonosítottunk: SHV-5 és SHV-12. Az SHV-5 típus a leggyakoribb Magyarországon és Európában (Szabó et al. 1999, Tóth et al. 2005), míg az SHV-12 típust, melyet gyakran izolálnak Spanyolországban, Franciaországban és Olaszországban (De Champs et al. 2004, Hernández et al. 2005, Segatore et al. 2004), eddig csak egyetlen E. cloacae törzsbõl izolálták Magyarországon (Tóth et al. 2005). Egyazon ESBL-variáns eltérõ földrajzi és idõbeli felbukkanása a konvergens evolúciós eseményeknek tulajdonítható. Érdekes módon két ESBL-termelõ K. oxytoca törzset is izoláltunk, amelyek járványt okoztak 2003-ban és 2005-ben. A K. oxytoca, a K. pneumoniae-hoz hasonlóan, gyakori kórokozó a perinatalis intenzív osztályokon. A K. pneumoniae törzsek jóval gyakrabban termelnek ESBL-eket, míg a K. oxytoca esetében ez igen ritka. Az SHV-12 termelõ K. oxytoca viszonylagos újdonság Magyarországon, noha Franciaországban már izolálták (Cambau et al. 2006). Ezidáig csak egyetlen (SHV-5) ESBL-termelõ K. oxytoca okozta perinatalis intenzív osztályon zajlott járványról számoltak be (Venezia et al. 1995). Nem találtunk szignifikáns különbséget a fertõzésre vonatkozó kockázati tényezõk tekintetében az ESBL-termelõ és nem ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzsek között. Az eredményt koherens mások eredményeivel (Kang et al. 2004). Bár a mortalitás magasabb volt az ESBL-termelõ Klebsiella fajokhoz tartozó csoportban, mint a nem ESBL-termelõ csoportban, ezen különbségek sem voltak statisztikailag szignifikánsak. A szignifikancia ebbéli hiánya magyarázható az alacsony mintaszámmal; bár a klinikai adatok is vitatottak (Du et al. 2002, Kang et al. 2004, Kim et al. 2002). Számos korábbi tanulmányban vizsgálták az ESBL-termelõ organizmusok molekuláris epidemiológiáját a PIC-ek vonatkozásában. Ezen tanulmányok többségében csak egyetlen járványt okozó törzset azonosítottak, egy rövidebb idõszak során (hetek-hónapok). Vannak olyan tanulmányok is, amelyekben idõrõl-idõre számos törzs cirkulálásáról számolnak be, bár ez olyan PIC-ekre vonatkozik, amelyek másik, a szülésnek helyet adó kórházból fogadnak újszülötteket (Lebessi et al. 2002). Azt is kimutattuk, hogy egy járványt okozó törzs eltûnhet és helyét újabb járványt okozó törzsek vehetik át hosszabb idõ alatt. A vizsgált PIC-re az 88

összes újszülött a szülészeti osztályról került át, bár más osztályok személyzetével is kapcsolatban voltak. Mindazonáltal nem tudtunk detektálni egyetlen SHV-5 és SHV-12 termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzset sem ugyanazon kórház más osztályain és az adott idõszakban az osztály környezeti vizsgálata is negatív eredményt hozott. A bizonyíték hiánya ellenére, lehetséges, hogy a fertõzésnek van egy közös környezeti forrása (Branger et al. 1998, Cotton et al. 2000, Gaillot et al. 1998). A fertõzés egy lehetséges forrása, melyet javasolni kívánunk, a gyermekek anyja, akiknek normál bélflórájában jelen lehetnek ESBLtermelõ törzsek, melyekkel a gyermekek szülés során kontaminálódhatnak. Ez a magyarázat a választ adhat a multiklonalitás és az ismételt felbukkanás kérdésére is az ESBL-termelõ törzsek esetében. A fentebb említett eredmények alapján javasolnánk az éretlen újszülöttek édesanyjának rutinszerû bélflóra-szûrését. Mivel az ESBL-termelõ organizmusok világszerte egyre több beteget érintenek, a PICen elõforduló ESBL-termelõ baktériumok molekuláris epidemiológiája még összetettebbé kezd válni. Sajnos az ESBL-termelés megjelenik olyan törzsekben, mint a K. oxytoca, ahol korábban ez igen ritka volt. Erre a helyzetre fel kell hívni a figyelmet, hogy ezen törzsek elterjedésének megelõzését célzó intézkedések optimalizálhatók legyenek. Mivel az ESBL-termelõ organizmusok világszerte egyre több beteget érintenek, a PICen elõforduló ESBL-termelõ baktériumok molekuláris epidemiológiája még összetettebbé kezd válni. Sajnos az ESBL-termelés megjelenik olyan törzsekben, mint a K. oxytoca, ahol korábban ez igen ritka volt. Erre a helyzetre fel kell hívni a figyelmet, hogy ezen törzsek elterjedésének megelõzését célzó intézkedések optimalizálhatók legyenek. Számos módon elkülöníthetõk a különbözõ ß-laktamáz típusok egyetlen izolátumban. Az analitikai izoelektromos fókuszálás segítséget nyújthat az adott izolátum által termelt ßlaktamáz enzimek jelenlétének és izoelektromos pontjának (pI) meghatározásában. Azonban sok különféle ß-laktamáznak azonos izoelektromos pontja van, ezért ezzel a módszerrel nem határozható meg a ß-laktamázok típusa. A blaSHV, blaTEM és blaCTX-M stb. gének amplifikálása és szekvenálása a leggyakrabban alkalmazott eljárás. Ez az eljárás könnyen kivitelezhetõ, de így nem azonosíthatók biztosan az azonos típusba tartozó ß-laktamázok: az alacsonyabb kópiaszámban jelenlévõ géneket kisebb valószínûséggel lehet detektálni, mint a nagyobb mennyiségben jelenlévõket. Az azonos típusba tartozó többféle ß-laktamáz detektálásához megfelelõ módszer a bla gének nagymértékû klónozása és szekvenálása. A Szabó D. és munkatársai által kifejlesztett real-time PCR SNP (Single Nucleotid Polymorphism) assay hasznos kiegészítõ módszer azon esetekben, amikor a genomból történõ amplifikálás és a primer PCR termékek szekvenálása arra enged következtetni, hogy több, azonos csoportú (és 89

azonos izoelektromos ponttal rendelkezõ) ß-laktamáz egyidejûleg van jelen egy baktériumban. A módszer igen jól reprodukálható és posztamplifikációs lépések nélkül is kivitelezhetõ. Az assay számos SNP egyidejû azonosítását is lehetõvé teszi. Ez különösen hasznos nagy populációkon végzett követéses vizsgálatoknál, amelyek a ß-laktamáz gének molekuláris epidemiológiájának meghatározására irányulnak (Szabó et al. 2005).

7.5. Metallo- -laktamáz termelõ Klebsiella törzsek Az ESBL-termelõ, multirezisztens Enterobacteriaceae törzsek terjedésével a karbapenemek maradtak lehetõségül az ilyen Gram-negatív baktériumok okozta súlyos fertõzések kezelésére. Napjainkban azonban számos vizsgálat már egyértelmûen bizonyította karbapenem rezisztens törzsek kiszelektálódását a vele történõ kezelés hatására (Yigit et al. 2001, Leavitt et al. 2007, Navon-Venezia et al. 007, Queenan et al. 2007, Souli et al. 2008, Vatopoulos 2008, Doumith et al. 2009). Irodalmi adatok alapján az Enterobacteriaceae törzsek karbapenem rezisztenciája többféle módon alakulhat ki (Queenan et al. 2007, Walther-Rasmussen et al. 2007, Woodford et al. 2007). Cefalosporinázok termelése (klasszikus ESBL-enzimek, plazmidon kódolt AmpC, kromoszomális

AmpC

derepressziója/túltermelése)

együttesen

a

sejtmembrán

permeabilitásának csökkenésével (különbözõ külsõ membrán proteinek elvesztése miatt) vagy ritkábban efflux pumpa mechanizmussal vezethet karbapenem rezisztenciához. Jellemzõen az ilyen típusú törzsek csak ertapenemmel szemben válnak rezisztenssé, míg imipenemmel és meropenemmel szemben a MIC érték az érzékeny tartományban maradhat. Rutin mikrobiológiai vizsgálatok során segítségünkre lehet, hogy az in vitro ESBL fenotípusos szûrõtesztek pozitívak maradnak (pl. klavulánsav gátlás kimutatható), a csökkent permeabilitásra utalhat, ha a törzsek cefoxitinre is rezisztenssé válnak. Karbapenemáz termeléshez az „A” , „B” és „D” molekuláris osztályba tartozó ßlaktamázok vezethetnek. „A”-ba tartozóak lehetnek kromoszomálisan kódoltak (általában): S. marcescensben leírt SME (Serratia marcescens enzime), NMC (not metalloenzyme carbapenemases) Enterobacter spp.-ben, Enterobacter cloaceaeben leírt IMI (imipenemhydrolyzing ß-lactamases), egy esetben K. pneumoniae törzsben leírt SHV-38, és szintén egy esetben Serratia fonticola törzsben leírt SCF-1; lehetnek plazmidon kódoltak (általában): KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), GES (Guiana extended-spectrum) bizonyos típusai. A „B” molekuláris osztályba tartozó ß-laktamázok a metallo- ß-laktamázok (pl. IMP, VIM, GIM). A „C” molekuláris osztályba tartozó ß-laktamázok, pl. egyes OXA-típusok. 90

Ezen enzimekre jellemzõ, hogy elbontják az összes ß-laktám antibiotikumot, beleértve a karbapenemeket is. A „B” és „D” osztályba tartozó (valamint a GES típusúak) kizárólag a monobaktámokat (aztreonam) nem képesek hasítani, így ezek hatékonyak maradnak e törzseknél. Ez utóbbi fontos különbség az ESBL enzimekhez képest, ahol ez éppen fordítva van. Lényeges különbség továbbá, hogy -laktamáz inhibitorokkal, az enzim mûködése nem gátolható, szemben az ESBL enzimekkel. A metallo-ß-laktamázok klasszikus gátlószerei közé tartozó EDTA-val kombinált fenotípusos tesztek a „B” molekuláris osztályba tartozó karbapenemáz enzimek jelenlétét valószínûsítheti. Fontos azonban megjegyezni, hogy sokszor nehezen értékelhetõ, mivel az EDTA nemcsak az MBL mûködését, hanem a baktérium egyéb létfontosságú fehérjéinek mûködését is gátolja. Újabb vizsgálatok ígéretes inhibitorként írják le a dipicolinic savat, mely a baktérium növekedését már nem befolyásolja. Annak ellenére, hogy a karbapenemáz enzimek jól bontják a karbapenemeket, az Enterobacteriaceae törzseknél sokszor nem alakítanak ki rezisztens fenotípust és így a rutin diagnosztikában problémát jelenthet felismerésük. Több vizsgálat is azt mutatta, hogy a karbapenemek közül az ertapenem alkalmazható a legnagyobb a karbapenemáz szûrésére. Gyanú esetén mindenképpen szükség van a módosított Hodge-teszt elvégzésére a CLSI ajánlás szerint. Az EARSS 2007. évi jelentésében felhívta a figyelmet a karbapenem rezisztens

Enterobacteriaceae

törzsek

európai

terjedésének

veszélyére.

Emelkedik

gyakoriságuk, azonban feltehetõen az eltérõ antimikrobás kezelési szokások miatt széles tartományban variál gyakoriságuk: Görögország (45.9 %), Izrael (21.9 %), Törökország (2.2 %), Németország (1.7 %), Olaszország (1.7 %). A metallo-ß-laktamázok közül az „A” csoportú KPC enzimek a legelterjedtebbek, melynek eddig hat változata ismert. Az elsõ KPC termelõ K. pneumoniae törzset 1996-ban izolálták az USA-ban, azóta számos általa okozott sporadikus fertõzést, kiterjedt nozokomiális járványokat okozott. Az utóbbi években több európai országban is megjelentek KPC-termelõ Enterobacteriaceae törzsek (Franciaország, Görögország, Skócia, Anglia, Norvégia, Svédország) (Naas et al. 2005, Leavitt et al. 2007, Walther-Rasmussen et al. 2007, Souli et al. 2008, Chen 2009, Navon-Venezia et al. 2009, Samuelsen et al. 2009). Aggodalomra az adhat okot, hogy a törzsek bár eltérõ KPC géneket hordoztak, ugyanabba a szekvencia típusba tartoztak (ST258), mely egy rendkívül sikeres KPC termelõ K. pneumoniae epidémiás klón terjedését feltételezi (Samuelsen et al. 2009). A Nemzeti ESBL Referencia laboratórium vizsgálatai azt mutatják, hogy Magyarországon az Enterobacteriaceae törzsek karbapenem rezisztenciájáért legnagyobb valószínûséggel a cefalosporináz és kapcsolt mechanizmusok a felelõsek, de elterjedõben 91

vannak a KPC termelõ törzsek is. 2009-ig nem volt igazolható „B” csoportba tartozó metalloß-laktamáz termelõ törzs Magyarországon az Enterobacteriaceae családba tartozó speciesekben. Ismereteink szerint elõször igazoltuk VIM-termelés megjelenését hazai Enterobacteriaceae családba tartozó törzsekben. VIM-4-termelõdést K. oxytoca-ban elõször találtunk. Az elsõ VIM-termelõ Klebsiella speciesek megjelenése hazánkban aggasztó felfedezés. Nagyon fontos, hogy megértsük a VIM-termelõ törzsek epidemiológiájának dinamikáját. A class 1 gén kazetták homogenitása a Klebsiella spp. között és a korábban leírt P. aeruginosa és Aeromonas hydrophila között a VIM-4 rezisztencia kazetta közös eredetére utal. Bár a blaVIM-tartalmú integronok fõleg transzferábilis plazmidokkal terjednek a legtöbb bélbaktériumban, a plazmidok terjedése azonos mintázattal különbözõ specieshez tartozó izolátumok között, mint az általunk megfigyelt esetben, nem gyakori. Eredményeink rávilágítanak a horizontális terjedés szerepére az integron vagy plazmid terjedésében és/vagy ezek ismételt aquirálására különbözõ klinikai törzsekben. Külön aggodalomra adhat okot, hogy a VIM-4 termelõ K. pneumoniae izolátum egy rendkívül sikeres multirezisztens ST11 klónhoz tartozik, mely megelõlegezi sikeres pályafutását. A pontos molekuláris háttér tisztázása mellett óriási a felelõsség a rutin mikrobiológiai viszgálatok esetén. Rendkívül fontos, hogy gyanú – legnagyobb érzékenységgel az ertapenem alkalmazható a karbapenemáz-termelés szûrésére (Anderson et al. 2007, Chen 2009) - esetén fenotípusos szûrõ és megerõsítõ tesztekkel (majd késõbbi molekuláris módszerekkel konfirmálva) a rutin mikrobiológiai laboratóriumban is tudjuk igazolni a törzsek karbapenemáz termelését, mert önmagukban egyes ß-laktámokra és/vagy karbapenemekre vonatkozó MIC értékek az érzékeny interpretációs kategóriába tartozhatnak, holott valójában ezen törzsek kezelésében egyetlen ß-laktám antibiotikum sem jöhet szóba. Az MBL-termelõ törzsek fenotípusos detektálása valóban nagy kihívás a rutin mikrobiológiai laboratórium számára. A karbapenemekkel szembeni rezisztencia sokszor fenotípusosan nem jelenik meg, vagy esetleg, ha alkalmazza a laboratórium az ertapenemet, akkor erre rezisztenciát tapasztalunk, illetve másik gyanújel lehet az egyéb

-laktám

antibiotikumokkal szembeni rezisztencia, vagy ha az izolátum rezisztens más antibakteriális családba tartozó szerekre is. Általánosan karbapenemáz termelésre utal a módosított Hodge-teszt pozitivitása. Az MBL-termelést ezután fenotípusosan a

-laktám antibiotikumot önállóan és különbözõ

gátlószerekkel együtt alkalmazva a mért gátlási zóna különbsége / MIC érték szignifikáns 92

változása alapján erõsíthetjük meg. A gátlószeres kombinációkban alkalmazható szerek: EDTA, 2-merkaptopropionsav (MPA), dipikolinsav. Nem-fermentáló baktériumok (P. aeruginosa, Acinetobacter spp.) esetében az imipenem-imipenem/EDTA a legszenzitívebb módszer (Yong et al. 2002). Bélbaktériumok esetében species-specifikusság is van: Klebsiella spp.-eknél ceftazidim+klavulánsavceftazidim+klavulánsav /EDTA, míg E. cloaceae és C. freundii törzsek esetében cefepim+klavulánsav- cefepim+klavulánsav /EDTA lehet célravezetõ (Yan et al. 2004).

7.6. Kinolon rezisztencia vizsgálatok Vizsgálatunk során mindhárom qnr csoportot és az aac(6’)-Ib-cr-t detektálni tudtuk. A prevalencia alacsony volt: ~3 % a qnrA, 0.8 % a qnrB, 0.4 % a qnrS- és 8 % az aac(6’)-Ib-cr génekre, emellett a legtöbb plazmid-kódolt rezisztencia-allélt a K. pneumoniae tartalmazta. Az összes izolátumban a qnrA prevalenciája volt a legnagyobb. A qnrA determinánsok nemzetközi elterjedtsége ellenére csak a qnrA1-et tudtuk detektálni. A qnrA1 és qnrS1 altípusok prevalenciája az ESBL-termelõ Enterobacteriaceae körében alacsony volt: ~ 3 % qnrA1-re és 0.4 % qnrS1-re, ami nagyon hasonló a nemzetközi tanulmányokban leírt értékekhez. Meglepõ módon két fajban csak qnrB géneket tudtunk detektálni. QnrA1 mellett qnrB2 gént mutattunk ki egy K. pneumoniae törzsben és qnrB2 gént találtunk egy C. freundii izolátumban is. QnrB géneket eddig csak az Egyesült Államokban és Ázsiában észleltek. Más szerzõk is megfigyelték, hogy a QnrB széles határok között változó kinolon MIC-értékekkel rendelkezõ izolátumokban van jelen, beleértve a teljes érzékenységet is. A qnr-pozitív törzsek MIC-értékeinek széles tartománya felhívja a figyelmet arra, hogy a qnr gének detektálása a klinikai izolátumokban fenotípusosan igen nehéz lehet. A qnr-pozitív törzsekbõl és a qnr-pozitív konjugált baktériumokból izolált plazmidok azonos méretûek voltak (>10 kb). A qnr gének pontos lokalizációja egyéb törzsekben még nincs meghatározva, de ha plazmidon helyezkedik el, lehetséges, hogy a plazmid nem konjugatív vagy a konjugáció folyamán a qnr elvész. Más tanulmányokban is kimutatták, hogy nem az összes qnrA pozitív izolátum volt képes átadni a kinolon-rezisztenciát. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy qnr-pozitív törzsek gyakran expresszálnak ESBL enzimeket, mint az SHV-2, SHV-7, SHV-12, CTX-M-9, CTX-M-14, CTX-M-15 és a VEB-1. Magyarországon a qnrA1 gén jelenléte kapcsolt volt SHV-5, SHV-12 és CTX-M-15 enzimekhez. A qnrB2 jelenléte SHV-12-vel volt kapcsolt. A qnrS1 gén az SHV-2 ESBL enzimmel együtt fordult elõ.

93

Noha a qnr csak alacsony szintû kinolon-rezisztenciát okoz és nem tûnik gyakorinak, hozzájárulhat rezisztencia kialakulásához megváltozott kinolon célenzimek, efflux pumpa aktiváció vagy a külsõ membrán porin csatornáinak defektusai révén. A aac(6’)-Ib-cr jelenléte nem eredményezett nagy emelkedést a kinolonok MICértékeiben, bár jelentõsen növeli a kromoszómális mutánsok szelekciójának gyakoriságát. (Paterson et al. 2003, Park et al. 2006, Robicsek et al. 2006a, Robicsek et al. 2006b, Park et al. 2007)

7.7. Stenotrophomonas maltophilia törzsek Bizonytalan taxonómiai státus után sokáig a Stenotrophomonas egyetlen speciese volt. Ubiquiter élõlény, a nedves környezet széles spektrumát kedveli (pl. dializáló folyadék, parenterális tápoldat, dezinficiáló szer, inhalációs eszközök), mely számos nozokomiális fertõzés forrása lehet. Virulencia faktorairól keveset tudunk, de ezek közül a legjelentõsebb az üveg-, teflonfelületekhez és mûanyagokhoz való fokozott tapadási képessége adhezin termelése következtében (O’Brien et al. 1982). Napjainkban a csökkent védekezõképességû betegek számának növekedése, általában az intrinsic rizikófaktorok növekedése, a szélesspektrumú

antibakteriális

kezelés

(fõleg

karbapenemek)

szelekciós

nyomása

következtében egyre gyakrabban izolálható nozokomiális patogénné vált. Klinikai mintából való kitenyésztése esetén mindig felmerül a kérdés, hogy valódi infekciót okozó mikroorganizmusról van-e szó, vagy kolonizálóról. A klinikust segíti a fertõzés egyértelmû jeleinek megléte, a minta szemi/kvantitatív tenyésztése, ha ismételt vizsgálatnál ugyanazon mikróba tenyészik ki, valamint a kiegészítõ adekvát képalkotó és szövettani vizsgálatok (Laing FPY, 1995). Az elmúlt közel tíz év során izolált S. maltophilia törzseink klinikai eredete azt mutatja, hogy leggyakrabban alsó légúti fertõzésekbõl, sebfertõzésekbõl, ritkábban véráramfertõzésekbõl és szemfertõzésekbõl izolálható. Ezek az eredmények összhangban vannak az irodalomban olvashatókkal. Rizikótényezõk megléte esetén fontos nozokomiális patogén szerepét alátámasztja egy korai vizsgálatunk. Perinatális intenzív centrumban 2001. január és 2002. decembere között kezelt betegekbõl izolált 45 S. maltophilia törzs antibiotikumérzékenységét, a törzsek genetikai összefüggését és a fertõzés szempontjából legfontosabb rizikótényezõket határoztuk meg. Az izolátumok 76 %-a légúti fertõzésbõl/kolonizációból származott, amely a vizsgálati periódus idejében az ezen típusú klinikai minták 5 %-át adták. Nem okozott véráramfertõzést. Valamennyi izolátum érzékeny volt trimethoprim-sulfamethoxazolra. Epidemiológiai 94

vizsgálatunk bizonyította a törzsek heterogenitását, AP-PCR-rel (ERIC-2) végzett molekuláris vizsgálat alapján 10 különbözõ klónba voltak sorolhatók. Legfontosabb rizikófaktornak az alacsony születési súly, az éretlenség, a hosszas kórházi tartózkodás, az elõzetes antibiotikum kezelés és a gépi lélegeztetés voltak. (Kristóf et al. 2003; kongresszusi absztrakt) A S. maltophiliát valós infekciót okozó etiológiai ágensként elfogadva nagy kihívás a mikrobiológusnak a korrekt antibiogram elkészítése, a klinikusnak a kezelés. A baktérium számos rezisztencia mechanizmus birtokában gyakorlatilag a teljes kezelésben szóbajövõ antibakteriális szerre rezisztens lehet részben veleszületetten, részben szerzett módon. A legtöbb rutin mikrobiológiai laboratórium a korongdiffúziós módszert alkalmazza az antibiotikum-érzékenységi vizsgálatokhoz, azonban az így kapott eredmények ezen lassan növõ mikróba esetén teljesen helytelen interpretációhoz vezethetnek. Számos korábbi tanulmány számolt be a korongdiffúziós módszer és dilúciós módszerek által kapott eredmények jelentõs különbségérõl, mely eredmények alapján a korongdiffúziós módszer csak néhány antibiotikum érzékenységi vizsgálatára alkalmazható. Néhány antibiotikum - S. maltophilia izolátum relevanciáját kivéve a korongdiffúziós módszer értékelését jellemzõen befolyásolja a táptalaj minõsége, különösen ion-összetétele, az inkubálás hõmérséklete, a leolvasás ideje (24-48 h), az antibiotikumtartalmú korong körüli kisebb/nagyobb benövések megjelenése, az ún. „inner colonies”-ek megítélése (Garrison et al. 1996, Traub et al. 1998, Carroll KC, 1998, Valdezate et al. 2001). Ezek figyelembe nem vétele fals érzékeny (ún. major hiba) interpretáláshoz vezet, különösen a

-laktám, kinolon és aminoglikozid

antibiotikumcsaládok esetében. Jelenleg nincs általános specifikus referencia módszer a S. maltophilia antibiotikum érzékenységi vizsgálatához. A nemzetközi ajánlások szûkszavúak, ill. szigorúan feltüntetik a „folyamatban” jelzõt a standardizálás leírásakor. Az aktuális évi, érvényben levõ CLSI (2009) ajánlások korongdiffúzióval történõ vizsgálatra minocyclin, levofloxacin, trimethoprimsulfamethoxazol,

dilúciós

módszerrel

trimethoprim-sulfamethoxazol,

történõ

vizsgálatra

ticarcillin/klavulánsav,

minocyclin,

chloramphenicol

levofloxacin, antibakteriális

szerekre vannak. Az EUCAST (2010) külön a S. maltophiliát csak a Pseudomonas törzsek vizsgálatára vonatkozó ajánlásoknál egy helyen emeli ki név szerint és csak a dilúcióval történõ trimethoprim-sulfamethoxazol vizsgálatára ad ajánlást (korongdiffúziós vizsgálatra való ajánlás folyamatban van). Azt is meg kell említeni, hogy az EUCAST-adatbázisában egyelõre igen kevés rögzített adat található. Trimethoprim-sulfamethoxazol irányában korongdiffúziós módszerrel történõ eredmény pl. csak 67 darab (2010. 04. 19-i adat). Az

95

egyéb antibakteriális szerek dilúciós módszerrel történõ vizsgálati száma is alacsony, 2002500 között van. Trimethoprim-sulfamethoxazol érzékenység mikrodilúciós vizsgálati eredményeinek összegzése jellemzõ bimodális eloszlást mutat, nagy kérdés az érzékenységi határérték megállapítása (Valdezate et al. 2001). Vizsgálatunkban két 4/76 µg/ml MIC értékû törzs áll, mely érték kritikus az interpretáció szempontjából. Az EUCAST még érzékenynek minõsíti, a CLSI már rezisztensnek. Eredményeink alapján a korongdiffúzióval történõ vizsgálat eredményeinek 24 óra inkubálási idõ utáni leolvasása jól korrelál a mikrodilúciós módszerrel. A kinolonok vizsgálatára a korongdiffúziós módszer 24 h-ra megbízhatatlan, magas a fals érzékeny interpretálás lehetõsége (major hiba). A CLSI megengedi a levofloxacinra való érzékenység korongdiffúzióval történõ vizsgálatát, azonban így kb. 10 %-kal nagyobb az érzékeny kategória a dilúciós vizsgálatokhoz képest 24 h-ra való leolvasás után. 48 h-ra való leolvasás után jól korrelál a két módszerrel kapott eredmény. Az is egyértelmûen bizonyított, hogy a ciprofloxacin nem alkalmas S. maltophilia által okozott infekciók kezelésére. A multirezisztens nem fermentáló mikróbákra napjainkban elõszeretettel alkalmazott polymyxin B és colistin S. maltophiliával szembeni hatékonysága eredményeink alapján nagyon csekély, mely megkérdõjelezi a sokak által kombinációs terápiában való alkalmazásuk indokoltságát. Érzékenységi vizsgálatuk csak dilúciós módszerrel javasolt, de még további vizsgálatok indokoltak. Elõzetes eredményeink alapján sem a doxycyclin, sem a Magyarországra nemrég bevezetett új tetracyclin-származék, a tigecyclin nem mutat jelentõs gátló hatást a S. maltophilia izolátumokra. A tapasztalt nagy mértékû különbséget a két módszer (diffúzió és dilúció) között tovább kívánjuk vizsgálni.

A tigecyclin eredményeink szerint kevésbé

hatékony, mint az EUCAST adatai mutatják. Ennek oka lehet, hogy izolátumaink közül sok olyan beteg fertõzésébõl/kolonizációjából származott, mely esetekben gyakran alkalmazzák más mikróbák ellen ezt a szert. Az automata rendszerek nem biztos alkalmazhatóságának hátterében az áll, hogy ezek a rendszerek a gyorsan szaporodó mikróbák érzékenységi vizsgálatára vannak tervezve, így fals érzékeny eredményeket adnak. Ezt felismerve pl. a VITEK (bioMerieux) automata csak a trimethoprim-sulfamethoxazolra való érzékenység eredményét interpretálja S. maltophilia törzsek esetében. Jelen és korábbi vizsgálataink eredményei is azt igazolták, hogy biztonsággal csak a trimethoprim-sulfamethoxazolra való érzékenységi vizsgálat javasolható korongdiffúzióval, 24 h-s inkubáció után értékelve. A többi antibakteriális családba tartozó szer iránti 96

érzékenység megállapításához vagy 48 h-s leolvasás javasolt illetve egyértelmûen csak dilúciós módszer. A kezelési lehetõségeket tekintve el kell fogadnunk azt a tényt, hogy a lassan szaporodó és gyorsan kialakuló rezisztenciával jellemezhetõ S. maltophilia törzseknél az in vitro érzékenységi vizsgálat nem egyértelmûen ad(hat) segítséget a kezeléshez, nem korrelál mindig a klinikai képpel. A rezisztenciavizsgálatok ecsetelt nehézségei miatt gyakran retrospektív vizsgálatokon alapul a kezelés. A különbözõ vizsgálatok földrajzilag különbözõ helyeken, gyakran összehasonlíthatatlan betegtípusokon történtek, melyek eredményeibõl nehéz egyértelmû konklúziót levonni. A jelenleg használatos antibiotikumok közül a trimethoprim-sulfamethoxazol a leghatékonyabb. Statikus hatása van a mikróbára, maximálisan tolerálható dózisban kell adni, de sajnos a szulfonamid tartalma toxikus lehet. A moxalaktam érzékenysége esetén jó, csak szintén toxikus és Magyarországon nem hozzáférhetõ. A fluorokinolok használatának több gátja lehet. Nozokomiális környezetben, fõleg a jellegzetes prediszponáló tényezõkkel bíró betegek jelentõs része preventíven már szedett/szedi ezeket az antibiotikumokat. A régebbi fluorokinolonok nem mutatnak megnyugtató hatékonyságot. Gyakori, hogy rezisztens mutánsok szelektálódnak a terápia során. A baktericid hatás hiánya, a gyakoribbá váló rezisztencia és a monoterápia gyakori sikertelensége miatt több kísérlet is volt a szinergistaként ható antibiotikumok alkalmazásával kapcsolatban, azonban ezek csak in vitro vizsgálatok voltak (Poulos et al. 1995, Krueger et al. 2001, Senol et al. 2002). Vizsgálták trimethoprim-sulfamethoxazol és colistin, ticarcillinklavulásav,

polymyxin

ceftazidim+ciprofloxacin,

B

kombinációját,

egyéb

aztreonam+amoxi-klavulánsav

kombinációs (Denton,

javaslatok

1998).

In

a vitro

vizsgálatokkal bizonyították a trimethoprim-sulfamethoxazol és polymyxin B szinergizmusát multirezisztens törzsek esetében. Ki lehetett szinergista baktericid hatást mutatni, azonban ki kell hangsúlyozni, hogy csak a polymyxin B MIC értékével együtt adva, kisebb koncentrációban nem (Munoz, 1996). Az antibiotikum kombinációk alkalmazása, ezek klinikai ellenõrzése még folyamatban van. Eredményeink alapján – mely jól korrelál egyéb magyarországi adatokkal- a trimethoprim-sulfamethoxazol rezisztencia közel 10%-ra tehetõ a S. maltophilia törzsek körében. A kinolonok közül csak az újabb generációs szerek, a levofloxacin és moxifloxacin mutat kellõ hatékonyságot. A multirezisztens mikróbák elleni küzdelembe manapság újra bevont colistin (polymyxin B) csak néhány esetben nyújthat segítséget. 97

8. Következtetések 1. A hazai rezisztencia adatok riasztóan rosszak bizonyos baktériumcsoportok esetében. Mivel a mindennapi klinikai gyakorlatban az antibiotikum választáshoz a kezelés megkezdésekor csak kivételesen áll rendelkezésre kimutatott kórokozó és antibiogram, ezért növelni kell az empirikus terápia hatékonyságát. Az infekciók kezelésével kapcsolatos ajánlások a helyi sajátosságok és rezisztenciaviszonyok alapján módosítandók. A mikrobiológus az adott osztályok jellemzõ mikróbáit és azok jellemzõ antibiotikum rezisztencia tulajdonságait látva, az infekciókontroll aktív résztvevõjeként az adott osztály empirikus terápiás stratégiájának meghatározásában tud segíteni. 2. Meghatároztuk az általunk gyûjtött S. aureus törzsek antibiotikum érzékenységét és összevetettük osztrák és macedón törzsek jellemzõivel. Antibiotikum érzékenységi és virulencia faktorokra irányuló vizsgálatokkal jellemeztük az MSSA és MRSA törzsek nagymértékû különbözõségét. Ezen eredmények alapján talán két szubtípusba való sorolásuk lenne indokolt. 3. Elvégeztük az elsõ hazai felmérést S. haemolyticus speciesen és megvizsgáltuk törzseink teicoplanin rezisztenciáját. A S. haemolyticus képessége rezisztenciaszerzésre és patogén potenciálja immunszupprimált betegekben megerõsíti a CNS species szintû azonosításának és a megfelelõ antibiotikumok MIC értékek rutinszerû meghatározásának jelentõségét és az epidemiológia vizsgálatának fontosságát. További vizsgálatok szükségesek a S. haemolyticus szepszis patogenezisében szerepet játszó különbözõ virulencia faktorok jelentõségének értékeléséhez. 4. Leírtuk az ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca infekciók molekuláris epidemiológiáját egy PIC-en, ötéves vizsgálati periódusban. Két különbözõ SHV-típust azonosítottunk: SHV-5 és SHV-12. Kimutattuk, hogy az ESBL-termelõ törzsek által okozott járványok epidemiológiája az évek során megváltozhat: egy járványt okozó törzs eltûnhet és helyét újabb járványt okozó törzsek vehetik át. Ez a dinamizmus, a multiklonalitás, valamint az, hogy közös környezeti forrást nem sikerült bizonyítani, feltételezhetõvé teszi, hogy a fertõzés egy lehetséges forrása a gyermekek édesanyja, akiknek normál bélflórájában jelen lehetnek ESBL-termelõ törzsek, melyekkel a gyermekek szülés során kontaminálódhatnak. A fentebb említett eredmények alapján javasolnánk az éretlen újszülöttek édesanyjának rutinszerû bélflóra-szûrését.

98

5. Jellemeztük Magyarország elsõ VIM-4 metallo- -laktamázt termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzsét. A VIM-4 megjelenésérõl K. oxytoca speciesben elõször számoltunk be. Igazoltuk, hogy a törzs a korábban leírt ST11 klónba tartozik, melyet CTX-M-15-termelõ epidémiás klónként (EC III) országszerte detektáltak. Ismereteink szerint ez az elsõ eset, hogy a nemzetközileg sikeres ST11 K. pneumoniae klón egy MBL-kódoló integront importált. 6.

Felmértük

a

plazmid

mediálta

kinolon

rezisztenciát

ESBL-termelõ

Enterobacteriaceae baktériumoknál Magyarországon. Ezek az eredmények a három qnr gén és az aac(6’)-Ib-cr lassú szétterjedésére utalhatnak az ESBL-termelõ Enterobacteriaceae esetén. Megállapítottuk a qnrB gén európai megjelenését, ami a kiterjedt spektrumú cefalosporinokra és a kinolonokra vonatkozó rezisztencia átadásában részt vevõ plazmidok széleskörû elterjedtségére utal a klinikai izolátumokban. 7. Nemzetközi ajánlások hiánya miatt meghatároztuk a S. maltophilia antibiotikum érzékenységi vizsgálatához a rutin mikrobiológiai laboratóriumban is megfelelõ biztonsággal alkalmazható módszert, néhány Magyarországon szóbajövõ terápiás szerre. Jelen és korábbi vizsgálataink eredményei is azt igazolták, hogy korongdiffúziós módszerrel csak a trimethoprim-sulfamethoxazol érzékenységi vizsgálata javasolható biztonsággal, a rutin 24 órás inkubáció után értékelve. A többi antibakteriális családba tartozó szerre való érzékenység megállapításához 48 órás leolvasás javasolt, illetve egyértelmûen csak a dilúciós módszerrel végzett érzékenység meghatározás.

99

9. Összefoglalás Semmelweis Ignác óta az orvostudomány diagnosztikus és gyógyító eszközrendszere óriási fejlõdésen ment keresztül, mely paradox módon egyben a legfontosabb tényezõje a mai nozokomiális fertõzéseknek. A kórokozó pontos ismerete minden nozokomiális fertõzésnél alapvetõ kérdés. A mikrobiológus felderíti a lehetséges rezisztencia mechanizmusokat és az eredményt ez alapján interpretálja. Az adott osztály jellemzõ mikróbáit és antibiotikum rezisztencia tulajdonságait ismerve segít az adott osztály empirikus terápiás stratégiájának meghatározásában, ezáltal az infekciókontrollnak is aktív résztvevõje. Speciális rezisztencia tulajdonság megjelenésekor az adott mikróba/mikróbák alapos vizsgálatával és a rezisztenciamechanizmus genetikai hátterének felderítésével kialakulásának lehetséges oka és epidemiológiai jelentõsége is meghatározható. A kutatások eredményei visszaépíthetõk a rutin diagnosztikai munkába és az infekció-kontrollba. Ezt a szemléletet követve, ESBL-termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca infekciók molekuláris epidemiológiáját írtuk le egy perinatális intenzív centrumban, ötéves követéses vizsgálat során. Kimutattuk, hogy az ESBL-termelõ törzsek által okozott járványok epidemiológiája az évek során megváltozhat: egy járványt okozó törzs eltûnhet és helyét újabb járványt okozó törzsek vehetik át. Elvégeztük az elsõ hazai felmérést S. haemolyticus speciesen és hangsúlyoztuk a glikopeptid rezisztenciájuk magas arányát és a korrekt mikrobiológiai vizsgálatok jelentõségét. Jellemeztük Magyarország elsõ VIM-4 metallo- laktamázt termelõ K. pneumoniae és K. oxytoca törzsét. A VIM-4 megjelenésérõl K. oxytoca speciesben elõször számoltunk be. Ismereteink szerint ez volt az elsõ eset, hogy a nemzetközileg sikeres ST11 K. pneumoniae klón egy MBL-kódoló integront importált. Felmértük a plazmid-mediált kinolon rezisztenciát ESBL-termelõ Enterobacteriaceae baktériumoknál Magyarországon. Megállapítottuk a qnrB gén európai megjelenését, ami a kiterjedt spektrumú cefalosporinokra és a kinolonokra vonatkozó rezisztencia átadásában részt vevõ plazmidok széleskörû elterjedtségére utal a klinikai izolátumokban. Meghatároztuk az általunk gyûjtött S. aureus törzsek antibiotikum érzékenységét és összevetettük osztrák és macedón törzsek jellemzõivel. Az érzékenységi és virulencia faktorok vizsgálatának eredményei alapján az MSSA és MRSA törzsek két szubtípusba való sorolása lenne indokolt. Nemzetközi ajánlások hiányában meghatároztuk a S. maltophilia törzsek rutin mikrobiológiai laboratóriumban is megfelelõ biztonsággal alkalmazható antibiotikum érzékenységi vizsgálati módszereit, Magyarországon használt szerekre.

100

9. Summary Diagnostic and therapeutic devices have gone through a great development since Ignác Semmelweis but paradoxically represent the most important factor of recent nosocomial infections. Proper characterization of causative agents is crucial in every nosocomial infection. Microbiologists reveal putative resistance mechanisms and interpret results based on these informations. Being aware of microbes typically occurring on a certain ward and its antibiotic resistance properties they help to establish the strategy of empiric treatment and thus actively participates in infection control of the ward. When a special resistance mechanism appears, by providing substantial examination of microbes and revealing the genetic background of the resistance mechanism we are able to determine putative reasons of its development and epidemiological significance. Results of researches can be built in the routine diagnostic work and infection control. Following this approach we described the molecular epidemiology of infections caused by ESBL-producing K. pneumoniae and K. oxytoca in a perinatal intensive care unit in a five-year long surveillance. We showed that the epidemiology of outbreaks caused by ESBL-producing strains may vary during years: a strain causing outbreaks may disappear and new strains may replace it causing outbreaks as well. We performed the first national study on S. haemolyticus and pointed out the high prevalence of glycopeptide resistance as well as the significance of correct microbiological investigations. We characterized the first VIM-4 metallo-ß-lactamase producing K. pneumoniae and K. oxytoca strains in Hungary. We reported the emergence of VIM-4 in a K. oxytoca strain. To our knowledge this is the first case when the internationally successful ST11 K. pneumoniae clone imported an MBL-coding integron. We also determined the plasmid-mediated quinolone-resistance in ESBL-producing Enterobacteriaceae in Hungary. We established the appearance of qnr gene in Europe referring the widespread dissemination of plasmids playing role in the transfer of resistance against extended spectrum cephalosporins and quinolones. We determined the antibiotic resistance of S. aureus strains collected in our laboratory and compared data to that of Austrian and Macedonian strains. Results of investigations concerning susceptibility and virulence factors suggest that reclassification of MSSA and MRSA strains into two distinct subtypes should be considered. In the lack of international recommendations we determined the antibiotic susceptibility testing methods for S. maltophilia strains that can appropriately be performed in routine microbiological laboratories for the drugs available in Hungary.

101

10. Irodalomjegyzék

Andersen BM, Lindemann R, Bergh K, Nesheim BI, Syversen G, Solheim N, Laugerud F: Spread of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a neonatal intensive unit associated with understaffing, overcrowding and mixing of patients. J Hosp Infect. 2002, 50: 18-24.

Anderson KF, Lonsway DR, Rashed JK, Biddle J, Jensen B, McDougal LK, Carey RB, Thompson A, Stocker S, Limbago B, Patel JB: Evaluation of method to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 2007, 45: 2723-2725.

Archibald LK, Manning ML, Bell LM, Banerjee S, Jarvis WR: Patient density, nurse-topatient ratio and nosocomial infection risk in a pediatric cardiac intensive care unit. Pediatr Infect Dis J. 1997, 16: 1045-1048.

Avison MB, Higgins CS, Heldreich CJ, Bennett PM, Walsh TR: Plasmid location and molecular heterogeneity of the L1 and L2 b-lactamase genes of Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 413-419.

Avison MB, Higgins CS, Ford PJ, von Heldreich CJ, Walsh TR, Bennett PM: Differential regulation of L1 and L2 b-lactamase expression in Stenotrophomoans maltophilia. J Antimicrobial Chemotherapy 2002, 49: 387-389.

Aziz K, McMillan DD, Andrews W, Pendray M, Qiu Z, Karuri S, Lee SK; Canadian Neonatal Network: Variations in rates of nosocomial infection among Canadian neonatal intensive care units may be practice-related. BMC Pediatr. 2005, 5: 22.

von Baum H, Lin D, Wendt C: Prevalence of colonisation with third-generation cephalosporin-resistant Enterobacteriacae in ICU patients of Heidelberg University Hospitals. Clin. Microbiol. Infect. 2004, 10: 436-440.

102

Bennett JV, Brachman PhS: Hospital Infections. 3. Edition. Little, Brown and Comp. Boston/Toronto, 1992.

Berger A, Salzer HR, Weninger M, Sageder B, Aspöck C: Septicaemia in an Austrian neonatal intensive care unit: a 7-year analysis. Acta Paediatr. 1998, 87: 1066-1069.

Berglund C, Söderquist B: The origin of a methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates at a neonatal ward in Sweden-possible horizontal transfer of a staphylococcal cassette chromosome

mec

between

methicillin-resistant

Staphylococcus

haemolyticus

and

Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect. 2008, 11:1048-1056.

Biavasco F, Vignaroli C, Varaldo PE: Glycopeptide resistance in coagulase-negative staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2000, 19: 403-417.

Biedenbach DJ, Moet GJ, Jones RN: Occurrence and antimicrobial resistance pattern comparisons among bloodstream infection isolates from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2002). Diagn Microbiol Infect Dis. 2004, 50: 59-69.

Bindayna KM, Jamsheer A, Farid E, Botta GA: Neonatal sepsis 1991-2001: Prevalent bacterial agents and antimicrobial susceptibilities in Bahrain. Med. Princ. Pract. 2006, 15: 131-136.

Bizzarro MJ, Raskind C, Baltimore RS, Gallagher PG: Seventy-five years of neonatal sepsis at Yale: 1928-2003. Pediatrics 2005, 116: 595-602.

Björkqvist M, Söderquist B, Törnqvist E, Sjöberg L, Fredlund H, Kühn I, Colque-Navarro P, Schollin J: Phenotypic and genotypic characterisation of blood isolates of coagulase-negative staphylococci in the newborn. APMIS 2002, 110: 332-339.

Blans M, Troelstra A: Glycopeptide resistance in Staphylococcus haemolyticus during treatment with teicoplanin. Infect Control Hosp Epidemiol. 2001, 22: 263-264.

103

Bonnet R, Sampaio JL, Chanal C, Sirot D, De Champs C, Viallard JL, Labia R, Sirot J: A novel class A extended-spectrum- -lactamase (BES-1) in Serratia marcescens isolated in Brazil. Antimicrob Agents Chemother. 2000, 44: 3061-3068.

Bouza E, San Juan R, Munoz P, Voss A, Kluytmans J: Co-operative Group of the European Study Group on Nosocomial Infections. A European perspective on nosocomial urinary tract infections I. Report on the microbiology workload, etiology and antimicrobial susceptibility (ESGNI-003 study). European Study Group on Nosocomial Infections. Clin Microbiol Infect. 2001, 7: 523-531.

Bouza E, San Juan R, Munoz P, Voss A, Kluytmans J: Co-operative Group of the European Study Group on Nosocomial Infections. A European perspective on nosocomial urinary tract infections II. Report on incidence, clinical characteristics and outcome (ESGNI-004 study). European Study Group on Nosocomial Infection. Clin Microbiol Infect. 2001, 7: 532-542.

Bouza E, San Juan R, Munoz P, Pascau J, Voss A, Desco M: Cooperative Group of the European Study Group on Nosocomial Infections (ESGNI). A European perspective on intravascular catheter-related infections: report on the microbiology workload, aetiology and antimicrobial susceptibility (ESGNI-005 Study). Clin Microbiol Infect. 2004, 10: 838-842. Erratum in: Clin Microbiol Infect. 2005, 11 (Suppl 4): 65-68.

Böröcz K, Kende É, Szilágyi E: A "Johan Béla" Országos Epidemiológiai Központ tájékoztatója a nosocomialis surveillance során alkalmazandó módszerekrõl, I. rész: A nosocomialis fertõzések definíciói. Epinfo (Budapest, OEK) 2002, 9. évf. 3. különszám

Böröcz K, Szilágyi E, Kurcz A, Libisch B, Glatz K, Gacs M. First vancomycin-resistant Enterococcus faecium outbreak reported in Hungary. Euro Surveill. 2005, 10: E050127. 1. Bradford R, Abdul Manan R, Daley AJ, Pearce C, Ramalingam A, D'Mello D, Mueller Y, Uahwatanasakul W, Qu Y, Grando D, Garland S, Deighton M: Coagulase-negative staphylococci in very-low-birth-weight infants: inability of genetic markers to distinguish invasive strains from blood culture contaminants. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2006, 25: 283-290.

104

Brady MT: Health care-associated infections in the neonatal intensive care unit. Am J Infect Control. 2005, 33: 268-275.

Branger C, Lesimple AL, Bruneau B, Berry P, Lambert-Zechovsky N: Long-term investigation of the clonal dissemination of Klebsiella pneumoniae isolates producing extended-spectrum beta-lactamases in a university hospital. J Med Microbiol. 1998, 47: 201– 209.

Brodie SB, Sands KE, Gray JE, Parker RA, Goldmann DA, Davis RB, Richardson DK: Occurence of nosocomial bloodstream infection in six neonatal intensive care units. Pediatr Infect Dis J. 2000, 9: 56-65.

Bromiker R, Arad I, Peleg O, Engelhard D: Neonatal bacteremia: patterns of antibiotic resistance. Infect Control Hosp Epidemiol. 2001, 22: 767-770.

Burnie JP, Naderi-Nasab M, Loudon KW, Matthews RC: An epidemiological study of blood culture isolates of coagulase-negative staphylococci demonstrating hospital-acquired infection. J Clin Microbiol. 1997, 35: 1746-1750.

Cambau E, Lascols C, Sougakoff W, Bebear C, Bonnet R, Cavallo JD, Gutmann L, Ploy MC, Jarlier V, Soussy CJ, Robert J: Occurrence of qnrA-positive clinical isolates in French teaching hospitals during 2002–2005. Clin Microbiol Infect. 2006, 12: 1013–1020.

Carroll KC, Cohen S, Nelson R, Campbell DM, Claridge JD, Garrison MW, Kramp J, Malone C, Hoffmann M, Anderson DE: Comparison of various in vitro susceptibility methods for testing Stenotrophomonas maltophilia. Diagn Microbiol Infect Dis. 1998, 32: 229-235.

CDC definitions of nosocomial infections. APIC Infection Control and Applied Epidemiology: Priciples and Practice St. Louis: Mosby; 1996, A-1-20.

Chapman RL, Faix RG: Persistent bacteremia and outcome in late onset infection among infants in a neonatal intensive care unit. Pediatr Infect Dis J. 2003, 22: 17-21.

105

Chen LF: Klebsiella pneumoniae carbapenemase: extended-spectrum ß-lactamase continues to go global. Medscape Infectious Diseases, 2009.

CLSI:

Performance

standards

for

antimicrobial

susceptibility

testing;

Nineteenth

informational supplement. In CLSI document M100-S19. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standard Institute, 2009.

Cotton MF, Wasserman E, Pieper CH, Theron DC, van Tubbergh D, Campbell G, Fang FC, Barnes J: Invasive disease due to extended spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal unit: the possible role of cockroaches. J Hosp Infect. 2000, 44: 13– 17.

Couto RC, Carvalho EA, Pedrosa TM, Pedroso ER, Neto MC, Biscione FM: A 10-year prospective surveillance of nosocomial infections in neonatal intensive care units. Am J Infect Control. 2007, 35: 183-189.

Crivaro V, Bagattini M, Salza MF, Raimondi F, Rossano F, Triassi M, Zarrilli R: Risk factors for nosocomial infections in a neonatal intensive-care unit. Infect Control Hosp Epidemiol. 2006, 27: 571-575.

Crump JA, Collingnon PJ: Risk factors for extended-spectrum B-lactamase-producing Serratia marcescens and Klebsiella pneumoniae acquisition in a neonatal intensive care unit. J Hosp Infect. 2007, 67: 135-141.

Damjanova I, Tóth A, Pászti J, Hajbel-Vékony G, Jakab M, Berta J, Milch H, Füzi M: Expansion and countrywide dissemination of ST11, ST15 and ST147 ciprofloxacin-resistant CTX-M-15-type beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae epidemic clones in Hungary in 2005 - the new 'MRSAs'? J Antimicrob Chemother. 2008, 62: 978-985.

De Champs C, Chanal C, Sirot D, Baraduc R, Romaszko JP, Bonnet R, Plaidy A, Boyer M, Carroy E, Gbadamassi MC, Laluque S, Oules O, Poupart MC, Villemain M, Sirot J: Frequency and diversity of Class A extended-spectrum betalactamases in hospitals of the Auvergne, France: a 2 year prospective study. J Antimicrob Chemother. 2004, 54: 634–639.

106

Decousser JW, Pina P, Picot F, Delalande C, Pangon B, Courvalin P, Allouch P: Frequency of isolation and antimicrobial susceptibility of bacterial pathogens isolated from patients with bloodstream infections: a French prospective national survey. J Antimicrob Chemother. 2003, 51: 1213-1222.

Denton M, Kerr KG: Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia. Clinical Microbiologicy Reviews. 1998, 11: 57-80.

Diancourt L, Passet V, Verhoef J, Grimont PA, Brisse S: Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol. 2005, 43: 4178-4182.

Doumith M, Ellington MJ, Livermore DM, Woodford N: Molecular mechanisms disrupting porin expresssion in ertapenem-resistant Klebsiella and Enterobacter spp. clinical isolates from the UK. J Antimicrob Chemother. 2009, 63: 659-667.

Du B, Long Y, Liu H, Chen D, Liu D, Xu Y, Xie X: Extended-spectrum beta-lactamaseproducing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae bloodstream infection: risk factors and clinical outcome. Intens Care Med. 2002, 28: 1718–1723.

Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P: Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol. 1995, 33: 24-27.

Edwards JR, Peterson KD, Mu Y, Banerjee S, Allen-Bridson K, Morrell G, Dudeck MA, Pollock DA, Horan TC: National Healthcare Safety Network (NHSN) report: data summary for 2006 through 2008, issued December 2009. Am J Infect Control. 2009, 37: 783-805.

Elting LS, Khiardoni N, Bodey GP, Fainstein V: Nosocomial infection caused by Xanthomonas maltophilia a case controll study of predisposing factors. Infect Control Hosp Epidemiol. 1990, 11: 134-138.

Emmerson AM: J Hosp Inf 1995, 30/Suppl/, 421.

107

Epinfo 2009, IX. évf. 4. szám

Essack SY, Hall LM, Pillay DG, McFadyen ML, Livermore DM: Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended-spectrum beta-lactamases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban, South Africa. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 88-95.

Fluit AC, Schmitz FJ, Verhoef J: European SENTRY Participant Group. Frequency of isolation of pathogens from bloodstream, nosocomial pneumonia, skin and soft tissue, and urinary tract infections occurring in European patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001, 20: 188-191.

Fluit AC, Verhoef J, Schmitz FJ: Frequency of isolation and antimicrobial resistance of Gram-negative and Gram-positive bacteria from patients in intensive care units of 25 European University hospitals participating in the European Arm of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program 1997-1998. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2001, 20: 617-625.

Foca M, Jakob K, Whittier S, Della Latta P, Factor S, Rubenstein D, Saiman L: Endemic Pseudomonas aeruginosa infection in a neonatal intensive care unit. N Engl J Med. 2000, 343: 695-700.

Fredheim EG, Klingenberg C, Rohde H, Frankenberger S, Gaustad P, Flaegstad T, Sollid JE: Biofilm formation by Staphylococcus haemolyticus. J Clin Microbiol. 2009, 47: 1172-1180.

Froggatt JW, Johnston JL, Galetto DW, Archer GL: Antimicrobial resistance in nosocomial isolates of Staphylococcus haemolyticus. Antimicrob Agents Chemother. 1989, 33: 460-466.

Gaillot O, Maruejouls C, Abachin E, Lecuru F, Arlet G, Simonet G, Berche P: Nosocomial outbreak of Klebsiella pneumoniae producing SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase, originating from a contaminated ultrasonography coupling gel. J Clin Microbiol. 1998, 36: 1357–1360.

108

Galanakis E, Krallis N, Levidiotou S, Hotoura E, Andronikou S: Neonatal bacteremia: a population based study. Scand J Infect Dis. 2002, 34: 598-601.

Gales AC, Jones RN, Forward KR, Linares J, Sader HS, Verhoef J: Emerging importance of multidrug-resistant Acinetobacter species and Stenotrophomonas maltophilia as a pathogens in seriously ill patients. Geographic patterns, epidemiological features and trends in SENTRY antimicrobial surveillance program (1997-1999). Clin Infect Dis. 2001, 32 (Suppl. 2): S104113.

Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC: CDC definitions for nosocomial infections. In: Olmsted RN (ed) APIC infection control and applied epidemiology: principles and practice. Mosby, St. Louis, 1996, pp A1–A20.

Garrison MW, Anderson DE, Campbell DM, Carroll KC, Malone CL, Anderson JD, Hollis RJ, Pfaller MA: Stenotrophomonas maltophilia: Emergence of multidrug-resistant strains during therapy and an in vitro pharmacodynamic chamber model. Antimicrob Agents Chemother. 1996, 40: 2859-2864.

Gastmeier P, Hentschel J, De Veer I, Obladen M, Rüden H: Device-associated nosocomial infection surveillance in neonatal intensive care using specified criteria for neonates. J Hosp Infect. 1998, 38: 51-60.

Gastmeier P, Loui A, Stamm-Balderjahn S, Hansen S, Zuschneid I, Sohr D, Behnke M, Obladen M, Vonberg RP, Rüden H: Outbreaks in neonatal intensive care units - They are not like others. Am J Infect Control 2007, 35: 172-176.

Giakkoupi P, Xanthaki A, Kanelopoulou M, Vlahaki A, Miriagou V, Kontou S, Papafraggas E, Malamou-Lada H, Tzouvelekis LS, Legakis NJ, Vatopoulos AC: VIM-1 Metallo-betalactamase-producing Klebsiella pneumoniae strains in Greek hospitals. J Clin Microbiol. 2003, 41: 3893-3896.

Godó ZI, Magyar E, Andirkó I, Rozgonyi F: Compact growth of Staphylococcus haemolyticus in soft agar is not due to hydrophobic interaction between the cocci. Acta Microbiol Hung. 1997, 44: 343-349. 109

Goldmann DA: The bacterial flora of neonates in intensive care-monitoring and manipulation. J Hosp Infect. 1988, 11: 340-351.

Gradelski E, Valera L, Aleksunes L, Bonner D, Fung-Tomc J: Correlation between genotype and phenotypic categorization of staphylococci based on methicillin susceptibility and resistance. J Clin Microbiol. 2001, 39: 2961-2963.

Hanssen AM, Kjelden G, Sollid JUE: Local variants of staphylococcal cassette chromosome mec in sporadic methicillin-resistant Staphylococcus aureus and methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci: Evidence of horizontal gene transfer? Antimicrob Agents Chemother. 2004, 48: 285-296.

Haque KN, Khan MA, Kerry S, Stephenson J, Woods G: Pattern of culture-proven neonatal sepsis in a district general hospital in the United Kingdom. Infect Control Hosp Epidemiol. 2004, 25: 759-764.

Harbarth S, Sudre P, Dharan S, Cadenas M, Pittet D: Outbreak of Enterobacter cloaceae related to understaffing, overcrowding, and poor hygiene practices. Infect Control Hosp Epidemiol. 1999, 20: 598-603.

Hernández JR, Martínez-Martínez L, Cantón R, Coque TM, Pascual A, Spanish Group for Nosocomial Infections (GEIH): Nationwide study of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae producing extended-spectrum beta-lactamases in Spain. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49: 2122–2125.

Horan TC, Gaynes RP: Surveillance of nosocomial infcetions. In: Hospital Epidemiology and Infection

Control,

3rd

edition,

Mayhall

CG,

editor.

Philadelphia:

Lippincott

Williams&Wilkins, 2004: 1659-1702.

Huang YC, Su LH, Wu TL, Lin TY: Genotyping analysis of colonizing candidal isolates from very-low-birthweight infants in a neonatal intensive care unit. J Hosp Infect. 2004, 58: 200203.

110

The International Neonatal Network: The CRIB (clinical risk index and comparing performance of neonatal intensive care units. Lancet 1993, 342: 193-198.

Isaac DW, Pearson TA, Hurwitz CA, Patrick CC: Clinical and microbiologic aspects of Staphylococcus haemolyticus infections. Pediatr Infect Dis J. 1993, 12: 1018-1021.

Jaballah NB, Bouziri A, Mnif K, Hamdi A, Khaldi A, Kchaou W: Epidemiology of hospitalaquired bloodstream infections in a Tunisian pediatric intensive care unit: A 2-year prospective study. Am J Infect Control. 2007, 35: 613-618.

Jarlov JO, Hoiby N: Coagulase-negative staphylococci in a major Danish university hospital: diversity in antibiotic susceptibility between wards. APMIS 1998, 106: 411-416.

Jiang JH, Chiu NC, Huang FY, Kao HA, Hsu CH, Hung HY, Chang JH, Peng CC: Neonatal sepsis in the neonatal intensive care unit: characteristics of early versus late onset. J Microbiol Immunol Infect. 2004, 37: 301-306.

John MA, Pletch C, Husain Z: In vitro activity of quinipristin/dalfopristin, linezolid, telithromycin and comparator antimicrobial agents against 13 species of coagulase-negative staphylococci. J Antimicrobial Chemother. 2002, 50: 933-938.

Jolley AE: The value of surveillance cultures on neonatal intensive care units. J Hosp Infect. 1993, 25: 153-159.

Jones RN, Croco MA, Kugler KC, Pfaller MA, Beach ML: Respiratory tract pathogens isolated from patients hospitalized with suspected pneumonia: frequency of occurrence and antimicrobial susceptibility patterns from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (United States and Canada, 1997). Diagn Microbiol Infect Dis. 2000, 37: 115-125.

Jones RN: Global epidemiology of antimicrobial resistance among community-acquired and nosocomial pathogens: a five-year summary from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1997-2001). Semin Respir Crit Care Med. 2003, 24: 121-134.

111

Jurányi Róbert: Az infekciókontroll és a kórházi fertõzések járványtanának alapjai. Budapest : SE-EFK, 2002. - ISBN 963 7152 37 7.

Kang CI, Kim SH, Kim DM, Park WB, Lee KD, Kim HB, Oh M, Kim EC, Choe KW: Risk factors for and clinical outcomes of bloodstream infections caused by extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae. Infect Control Hosp Epidemiol. 2004, 25: 860–867.

Karchmer AW: Nosocomial bloodstream infections: organisms, risk factors, and implications. Clin Infect Dis. 2000, 31(Suppl4): S139-143.

Karlowitz MG, Buescher ES, Surka AE: Fulminant late-onset sepsis in a neonatal intensive care unit, 1988-1997, and the impact of avoiding empiric vancomycin therapy. Pediatrics 2000, 106: 1387-1390.

Kende Éva: Kórházi fertõzések, kórházi járványok. Pro Hygiene Kft. Budapest, 1992.

Kim SD, McDonald LC, Jarvis WR, McAllister SK, Jerris R, Carson RA, Milller JM: Determining the significance of coagulase-negative staphylococci isolated from blood cultures at a community hospital: a role for species and strain identification. Infect Control Hosp Epidemiol. 2000, 21: 213-217.

Kim YK, Pai H, Lee HJ, Park SE, Choi EH, Kim J, Kim JH, Kim EC: Bloodstream infections by extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in children: epidemiology and clinical outcome. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46: 1481–1491.

Klinkenberg C, Ronnestad A, Anderson AS, Abrahamsen TG, Zorman J, Villaruz A, Flaegstad T, Otto M: Persistent strains of coagulase-negative staphylococci in a neonatal intensive care unit: virulence factors and invasiveness. Clin Microbiol Infect. 2007, 11: 11001111.

112

Koksal F, Yasar H, Samasti M: Antibiotic resistance patterns of coagulase-negative staphyloccus strains isolated from blood cultures of septicemic patients in Turkey. Microbiol Res. 2009, 164: 404-410.

Kollef MH: The prevention of ventilator-associated pneumonia. N Eng J Med. 1999, 340: 627-633.

Krueger TS, Clark EA, Nix DE: In vitro susceptibility of Stenotrophomonas maltophilia to various antmicrobial combinations. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2001, 41: 71-78.

Krzewinski JW, Nguyen CD, Foster JM, Burns JL: Use of random amplified polymorphic DNA PCR to examine epidemiology of Stenotrophomonas maltophilia and Achromobacter (Alcaligenes) xylosoxidans from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 2001, 39: 3597-3602.

Ladhani S, Grandsen W: Septicaemia due to glucose non-fermenting, Gram-negative bacilli other than Pseudomonas aeruginosa in children. Acta Paediatr. 2002, 91: 303-306.

Laing FPY, Ramotar K, Read RR, Alfieri N, Kureishi A, Henderson EA, Louie TJ: Molecular epidemiology of Xanthomonas maltophilia colonization and infection in the hospital environment. J Clin Microbiol. 1995, 33: 513-518.

Lau YL, Hey E: Sensitivity and specificity of daily tracheal aspirate cultures in predicting organisms causing bacteremia in ventilated neonates. Pediatr Infect Dis J. 1991, 10: 290-294.

Lauretti L, Riccio ML, Mazzariol A, Cornaglia G, Amicosante G, Fontana R, Rossolini GM: Cloning and characterization of blaVIM, a new integron-borne metallo-beta-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate. Antimicrob Agents Chemother. 1999, 43: 1584-1590.

Leavitt A, Navon-Venezia S, Chmelnitsky I, Schwaber MJ, Carmelli Y: Emergence of KPC-2 and KPC-3 in carbapenem-resistant strains in an Israeli hospital. Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51: 3026-3029. 113

Lebessi E, Dellagrammaticas H, Tassios PT, Tzouvelekis LS, Ioannidou S, Foustoukou M, Legakis NJ: Extended spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit in the high-prevalence area of Athens, Greece. J Clin Microbiol. 2002, 40: 799–804.

Li X-Z, Zhang L, Poole K: SmeC, an outer membrane multidrug efflux protein of Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46: 333-343.

Libisch B, Muzslay M, Gacs M, Minárovits J, Knausz M, Watine J, Ternák G, Kenéz E, Kustos I, Rókusz L, Széles K, Balogh B, Füzi M: Molecular epidemiology of VIM-4 metallobeta-lactamase-producing Pseudomonas sp. isolates in Hungary. Antimicrob Agents Chemother. 2006, 50: 4220-4223.

Libisch B, Giske CG, Kovács B, Tóth TG, Füzi M: Identification of the first VIM metallobeta-lactamase-producing multiresistant Aeromonas hydrophila strain. J Clin Microbiol. 2008, 46: 1878-80.

Losonczy Gy, Szalka A: A klinikai epidemiológia alapjai, Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2001.

Low DE, Schmidt BK, Kirpalani HM, Moodie R, Kreiswirth B, Matlow A, Ford-Jones EL: An endemic strain of Staphylococcus haemolyticus colonizing and causing bacteraemia in neonatal intensive care unit patients. Pediatrics 1992, 89: 696-700.

Mahieu LM, Buitenweg N, Beutels P, De Dooy JJ: Additional hospital stay and charges due to hospital-aquired infections in a neonatal intensive care unit. J Hosp Infect. 2001, 47: 223229.

Makhoul IR, Sujov P, Smolkin T, Lusky A, Reichman B: Epidemiological, clinical and microbiological characteristics of late-onset sepsis among very low birth weight infants in Israel:a national survey. Pediatrics 2002, 109: 34-39.

114

Makhoul IR, Sujov P, Smolkin T, Lusky A, Reichman B; Israel Neonatal Network: Pathogenspecific early mortality in very low birth weight infants with late-onset sepsis: a national survey. Clin Infect Dis. 2005, 40: 218-224.

Mathai D, Jones RN, Pfaller MA; SENTRY Participant Group North America. Epidemiology and frequency of resistance among pathogens causing urinary tract infections in 1.510 hospitalized patients: a report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (North America). Diagn Microbiol Infect Dis. 2001, 40: 129-136.

Menezenes GA, Harish BN, Sujatha S, Vinothini K, Parija SC: Emergence of vancomycinintermediate Staphylococcus species in southern India. J Med Microbiol. 2008, 57: 911-912.

Mireya UA, Marti PO, Xavier KV, Cristina LO, Miguel MM, Magda CM: Nosocomial infections in paediatric and neonatal intensive care units. J Infect. 2007, 54: 212-20.

Morrison, AJ, Hoffmann, KK, Wenzel RP: Associated mortality and clinical characteristics of nosocomial Pseudomonas maltophilia in a university hospital. J Clin Microbiol. 1986, 24: 5255.

Munoz JL, Garcia MI, Munoz S, Leal S, Fajardo M, Garcia-Rodrigez JA: Activity of trimethoprim/sulfamethoxazole plus polymyxin B against multiresistant Stenotrophomonas maltophilia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996, 15: 879-881.

Munoz P, Bouza E, San Juan R, Voss A, Pascau J, Desco M: Co-Operative Group of the European Study Group on Nosocomial Infections (ESGNI). Clinical-epidemiological characteristics and outcome of patients with catheter-related bloodstream infections in Europe (ESGNI-006 Study) Clin Microbiol Infect. 2004, 10: 843-845. Erratum in: Clin Microbiol Infect. 2005, 11 (Suppl 4): 65-68.

Naas T, Nordmann P, Vedel G, Poyart C: Plasmid-mediated carbapenem-hydrolysing ßlactamase KPC in a Klebsiella pneumoniae isolate from France. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49: 4423-4424.

115

Natoli S, Fontana C, Favaro M, Bergamini A, Testore GP, Minelli S, Bossa MC, Casapulla M, Broglio G, Beltrame A, Cudillo L, Cerretti R, Leonardis F: Characterization of coagulasenegative staphylococcal isolates from blood with reduced susceptibility to glycopeptides and therapeutic options. BMC Infect Dis. 2009, 9: 83.

Navon-Venezia S, Leavitt A, Schwaber MJ, Rasheed JK, Srinivasan A, Patel JB, Carmeli Y, the Israeli KPC Kpn Study Group: First report on a hyperepidemic clone of KPC-3-producing Klebsiella pneumoniae in Israel genetically related to a strain causing outbreaks in the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2009, 53: 818-820.

NNIS Manual. U. S. Department of Health and Human Services, Public Health Service. CDC. Atlanta, Georgia, 1992.

NNIS System Report, data summary from January 1992 through June 2004. Am J Infect Control. 2004, 32: 470-485.

Nunes APF, Teixeria LM, Bastos CCR, Silva MG, Ferreira RBR, Fonseca LS, Santos KRN: Genomic

characterization

of

oxacillin-resistant

Staphylococcus

epidermidis

and

Staphylococcus haemolyticus isolated from Brazilian medical centres. J Hosp Inf. 2005, 59: 19-26.

Nunes APF, Teixeria LM, Iorio NLP, Bastos CCR, Fonseca LS, Souto-Padrón T, Santos KRN:

Heterogeneous

resistance

to

vancomycin

in

Staphylococcus

epidermidis,

Staphylococcus haemolyticus and Staphylococcus warneri clinical strains: characterisation of glycopeptide susceptibility profiles and cell wall thickening. Int J Antimicr Agents. 2006, 27: 307-315.

O'Brien M, Davis GHG: Enzymatic profile of Pseudomonas maltophilia. J Clin Microbiol. 1982, 16: 417-421.

Park CH, Robicsek A, Jacoby GA, Sahm D, Hooper DC: Prevalence in the United States of aac(6')-Ib-cr encoding a ciprofloxacin-modifying enzyme. Antimicrob Agents Chemother. 2006, 50: 3953–3955.

116

Park CH, Seo JH, Lim JY, Woo HO, Youn HS: Changing trend of neonatal infection: Experience at a newly established regional medical center in Korea. Pediatr Int. 2007, 49: 2430.

Park YJ, Yu JK, Lee S, Oh EJ, Woo GJ: Prevalence and diversity of qnr alleles in AmpCproducing Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii and Serratia marcescens: a multicentre study from Korea. J Antimicrob Chemother. 2007, 60: 868–871.

Paterson DL, Rice LB, Bonomo RA: Rapid method of extraction and analysis of extendedspectrum beta-lactamases from clinical strains of Klebsiella pneumoniae. Clin Microbiol Infect. 2001, 7: 709–711.

Paterson DL, Hujer KM, Hujer AM, Yeiser B, Bonomo MD, Rice LB, Bonomo RA: Extended-spectrum beta-lactamases in Klebsiella pneumoniae bloodstream isolates from seven countries: dominance and widespread prevalence of SHV- and CTX-M-type betalactamases. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47: 3554–3560.

Patrick CC, Kaplan SL, Baker CJ, Parisi JT, Mason EO Jr: Persistent bacteremia due to coagulase-negative staphylococci in low birth weight neonates. Pediatrics 1989, 84: 977-985.

Perl TM, Krüger WA, Houston A, Boyken LD, Pfaller MA, Herwaldt LA: Investigation of suspected nosocomial clusters of Staphylococcus haemolyticus infections. Infect Control Hosp Epidemiol. 1999, 20: 128-131.

Pessoa-Silva CL, Moreira BM, Almeida VC, Flannery B, Lins MCA, Sampaio JLM, Teixeira LM, Miranda LEV, Riley LW, Gerberding JL: Extended-spectrum B-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit: risk factors for infection and colonization. J Hosp Infect. 2003, 53: 198-206.

Petinaki E, Kontos F, Miriagou V, Maniati M, Hatzi F, Maniatis AN: Survey of methicillinresistant coagulase-negative staphylococci in the hospitals of central Greece. Int J Antimicrobiol Agents. 2001, 18: 563-566.

117

Poulos CD, Matsumara SO, Willey BM, Low DE, McGeer A: In vitro susceptibility of antimicrobial

combinations

against

Stenotrophomonas

(Xanthomonas)

maltophilia.

Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1995, 39: 2220-222.

Pournaras S, Tsakris A, Maniati M, Tzouvelekis LS, Maniatis AN: Novel variant (bla(VIM4)) of the metallo-beta-lactamase gene bla(VIM-1) in a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother. 2002, 46: 4026-4028.

Queenan AM, Bush K: Carbapenemases: the versatile ß–lactamases. Clin Microbiol Rev. 2007, 20: 440-458.

Raimundo O, Heussler H, Bruhn JB, Suntrarachun S, Kelly N, Deighton MA, Garland SM: Molecular epidemiology of coagulase-negative staphylococcal bacteraemia in a newborn intensive care unit. J Hosp Inf. 2002, 51: 33-42.

Rasheed JK, Jay C, Metchock B, Berkowitz F, Weigel L, Crellin J, Steward C, Hill B, Medeiros AA, Tenover FC: Evolution of extended-spectrum ß-lactam resistance (SHV-8) in a strain of Escherichia coli during multiple episodes of bacteremia. Antimicrob Agents Chemother. 1997, 41: 647-653.

Reese RE, Betts RF: A practical approach to infectious diseases. 5th ed, Tippinscott Williams and Wilkins, Philadelphia, 2003.

Robicsek A, Jacoby GA, Hooper DC: The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance. Lancet Infect Dis. 2006, 6: 629–640.

Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm DF, Jacoby GA, Hooper DC: qnr prevalence in ceftazidimeresistant Enterobacteriaceae isolates from the United States. Antimicrob Agents Chemother. 2006, 50: 2872–2874.

Rodrigez-Aranda A, Daskalaki M, Villar J, Sanz F, Otero JR, Chaves F: Nosocomial spread of linezolid-resistant Staphylococcus haemolyticus infections in an intensive care unit. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009, 63: 398-402.

118

Rolston KVI, Kontoyiannis DP, Yadegarynia D, Raad II: Nonfermentative gram-negative bacilli in cancer patients: increasing frequency of infection and antimicrobial susceptibility of clinical isolates to fluoroquinolones. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 2005, 51: 215-218.

Rosenthal VD, Maki DG, Jamulitrat S, Medeiros EA, Todi SK, Gomez DY, Leblebicioglu H, Abu Khader I, Miranda Novales MG, Berba R, Ramírez Wong FM, Barkat A, Pino OR, Duenas L, Mitrev Z, Bijie H, Gurskis V, Kanj SS, Mapp T, Hidalgo RF, Ben Jaballah N, Raka L, Gikas A, Ahmed A, Thu le TA, Guzmán Siritt ME, INICC Members: International Nosocomial Infection Control Consortium (INICC) report, data summary for 2003-2008, issued June 2009. Am J Infect Control. 2010, 38: 95-104. e2.

Rubin LG, Sanchez PJ, Siegel J, Levine G, Saiman L, Jarvis WR; Pediatric Prevention Network: Evaluation and treatment of neonates with suspected late-onset sepsis: a survey of neonatologists' practices. Pediatrics 2002, 110: e42.

Sabui T, Tudehope D, Tilse M: Clinical significance of quantitative blood cultures in newborn infants. J Pediatr Child Health. 1999, 35: 578-581.

Saiman L: Risk factors for hospital-acquired infections in the neonatal intensive care unit. Seminars in Perinatology 2002, 26: 315-321.

Saiman L: Strategies for prevention of nosocomial sepsis in the neonatal intensive care unit. Curr Opin Pediatr. 2006, 18: 101-106.

Samuelsen O, Naseer U, Tofteland S, Skutlaberg DH, Onken Anette, Hjetland R, Sunddsfjord A, Giske CG: Emergence of clonally related Klebsiella pneumoniae isolates of sequence type 258 producing plasmid-mediated KPC carbapenemase in Norway and Sweded. J Anticrob Chemother. 2009, 63: 654-658.

Sanches SI, Mato R, de Lencraste H, Tomasz A: Patterns of multidrug resistance among methicillin-resistant

hospital

isolates

of

coagulase-positive

and

coagulase-negative

staphylococci collected in the international multicenter study RESIST in 1997 and 1998. Microb Drug Resist. 2000, 6: 199-211. 119

Schrag SJ, Zell ER, Lynfield R, Roome A, Arnold KE, Craig AS, Harrison LH, Reingold A, Stefonek K, Smith G, Gamble M, Schuchat A: A population-based comparison of strategies to prevent early-onst group B streptococcal disease in neonates. N Eng J Med. 2002, 347: 233239.

Schwalbe RS, Stapleton JT, Gilligan PH: Emergence of vancomycin resistance in coagulasenegative staphylococci. N Eng J Med. 1987, 316: 927-931.

Segatore B, Setacci D, Perilli M, Franchino L, Franceschini N, Agnifili A, Rossolini GM, Amicosante G: Antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Enterobacteriaceae producing complex beta-lactamase patterns including extended-spectrum enzymes. Int J Antimicrob Agents. 2004, 23: 480–486.

Senol, E, DesJardin, J, Stark, PC, Barefoot L, Snydman DR: Attributable mortality of Stenotrophomonas maltophilia bacteriaemia. Clin Infect Dis. 2002, 34: 1653-1656.

Shah S, Ehrenkranz RA, Gallagher PG: Increasing incidence of Gram-negative rod bacteremia in a newborn intensive care unit. Pediatr Infect Dis J. 1999, 18: 591-595.

de Silva GDI, Kantzanou M, Justice A, Massey RC, Wilkinson AR, Day NPJ, Peacock SJ: The ica operon and biofilm production in coagulase-negative staphylococci associated with carriage and disease in a neonatal intensive care unit. J Clin Microbiol. 2002, 40: 382-388.

Slagle TA, Bifano EM, Wolf JW, Gross SJ: Routine endotracheal cultures for the prediction of sepsis in ventilated babies. Archives of Disease in Childhood 1989, 64: 34-38.

Souli M, Galani I, Giamarellou H: Emergence of extensively drug-resistant and pandrugresistant Gram-negative bacilli in Europe. Eurosurveillance, 2008, 47.

Souvenir D, Anderson DE, Palpant S, Mroch H, Askin S, Anderson J, Claridge J, Eiland J, Malone C, Garrison MW, Watson P, Campbell DM: Blood cultures positive for coagulasenegative staphylococci: antisepsis, pseudobacteremia, and therapy of patients. J Clin Microbiol. 1998, 36: 1923-1926. 120

Stoll BJ, Gordon T, Korones SB, Shankaran S, Tyson JE, Bauer CR, Fanaroff AA, Lemons JA, Donovan EF, Oh W, Stevenson DK, Ehrenkranz RA, Papile LA, Verter J, Wright LL: Late-onset sepsis in very low birth weight neonates: a report from the National Institute of Child Health and Human Development Neonatal Research Network. J Pediatr. 1996, 129: 6371.

Stoll BJ, Hansen N, Fanaroff AA, Wright LL, Carlo WA, Ehrenkranz RA, Lemons JA, Donovan EF, Stark AR, Tyson JE, Oh W, Bauer CR, Korones SB, Shankaran S, Laptook AR, Stevenson DK, Papile LA, Poole WK: Late-onset sepsis in very low birth weight neonates:the experience of the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics 2002, 110: 285-291.

Stoll BJ, Hansen N, Fanaroff AA, Wright LL, Carlo WA, Ehrenkranz RA, Lemons JA, Donovan EF, Stark AR, Tyson JE, Oh W, Bauer CR, Korones SB, Shankaran S, Laptook AR, Stevenson DK, Papile LA, Poole WK: Changes in pathogens causing early-onset sepsis in very-low-birth-weight infants. N Eng J Med. 2002, 347: 240-247.

Szabo D, Filetoth Z, Szentandrassy J, Nemedi M, Toth E, Jeney C, Kispal G, Rozgonyi F: Molecular epidemiology of a cluster of cases due to Klebsiella pneumoniae producing SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase in the premature intensive care unit of a Hungarian hospital. J Clin Microbiol. 1999, 37: 4167–4169.

Szabo D, Silveira F, Fujitani S, Paterson DL: Mechanisms of resistance of bacteria causing ventilator-associated pneumonia. Clin Chest Med. 2005, 26: 75-79.

Szewczyk EM., Piotrowski A, Rózalska M: Predominant staphylococci in the intensive care unit of a paediatric hospital. J Hosp Infect. 2000, 45: 145-154.

Tabe Y, Nakamura A, Oguri T, Igari J: Molecular characterization of epidemic multiresistant Staphylococcus haemolyticus isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1998, 32: 177-183.

Tabe Y, Nakamura A, Igari J: Glycopeptide susceptibility profiles of nosocomial multiresistant Staphylococcus haemolyticus isolates. J Infect Chemother. 2001, 7: 142-147.

121

Tacconelli E, Tumbarello M, Donati KG, Bettio M, Spanu T, Leone F, Sechi LA, Zanetti S, Fadda G, Cauda R: Glycopeptide resistance among coagulase-negative staphylococci that cause bacteraemia: epidemiological and clinical findings from a case-control study. Clin Inf Dis. 2001, 33: 1628-1635.

Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, Swaminathan B: Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol. 1995, 33: 2233-2239.

Tiemersma EW, Bronzwaer SL, Lyytikainen O, Degener JE, Schrijnemakers P, Bruinsma N, Monen J, Witte W, Grundman H: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus in Europe 1999–2002. Emerg Infect Dis. 2004, 10: 1627–1634.

Tóth A, Gacs M, Márialigeti K, Cech G, Füzi M: Occurrence and regional distribution of SHV-type extended-spectrum betalactamases in Hungary. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2005, 24: 284–287.

Tóth A, Kispál G, Ungvári E, Violka M, Szeberin Z, Pászti J, Molnár K, Gacs M, Füzi M. First report of heterogeneously vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) causing fatal infection in Hungary. J Chemother. 2008, 20: 655-656.

Traub WH, Leonhard B, Bauer D: Antibiotic susceptibility of Stenotrophomonas (Xanthomonas) maltophilia: Comparative (NCCLS) criteria) evaluation of antimicrobial drugs with the agar dilution and the agar disk diffusion (Bauer-Kirby) tests. Chemotherapy, 1998, 44: 164-173.

Tseng YC, Chiu YC, Wang JH, Lin HC, Lin HC, Su BH, Chiu HH: Nosocomial bloodstream infection in a neonatal intensive care unit of a medical center: a three-year review. J Microbiol Immunol Infect. 2002, 35: 168-172.

Tullu MS, Deshmukh CT, Baveja SM: Bacterial nosocomial pneumonia in paediatric intensive care unit. J Postgrad Med. 2000, 46: 18-22.

122

Usukara Y, Igarashi T: Examination of severe, hospital acquired infcetions affecting extremely low birthweight (ELBW) infants. Pediatrics International 2003, 45: 230-232.

Ünal S, Hoskins J, Flokowitsch JE, Wu CY, Preston DA, Skatrud PL: Detection of methicillin-resistant staphylococci by using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol. 1992, 30: 1685-1691.

Valdezate S, Vindel A, Loza E, Baquero F, Canton R: Antimicrobial susceptibilities of unique Stenotrophomonas maltophilia clinical strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001, 45: 1581-1584.

Vatopoulos A: High rates of metallo-ß-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae in Greece – a review of the current evidence. Eurosurveillance 2008, 4.

Venezia RA, Scarano FJ, Preston KE, Steele LM, Root TP, Limberger R, Archinal W, Kacica MA: Molecular epidemiology of an SHV-5 extended-spectrum beta-lactamase in Enterobacteriaceae isolated from infants in a neonatal intensive care unit. Clin Infect Dis. 1995, 21: 915–923.

Victor MA, Arpi M, Bruun B, Jonsson V, Hansen MM: Xanthomonas maltophilia bacteriaemia in immunocompromised hematological patients. Scan J Infect Dis. 1994, 26: 163-170.

Vidyasagar D: A new score to detect neonatal nosocomial infection: 'a rule of 14'. Crit Care Med. 2000, 28: 2166-2167.

Viedma DG, Marin M, Cercenado E, Alonso R, Rodrigues-Cráixems M, Bouza E: Evidence of nosocomial Stenotrophomonas maltophilia cross-infection in a neonatology unit analysed by three molecular typing methods. Infect Control Hosp Epidemiol. 1999, 20: 816-820.

Villarino ME, Stevens LE, Schalbe B: Risk factors for epidemic Xanthomonas maltophilia infection/colonization in intensive care unit patients. Infect Control Hosp Epidemiol. 1992, 13: 201-206.

123

Von Dolinger de Brito D, de Almeida Silva H, Jose Oliveira E, Arantes A, Abdallah VO, Tannus Jorge M, Gontijo Filho PP: Effect of neonatal intensive care unit environment on the incidence of hospital-acquired infection in neonates. J Hosp Infect. 2007, 65: 314-318.

Walsh TR, Bolmström A, Qwärnström A, Ho P, Wootton M, Howe RA, MacGowan AP, Diekema D: Evaluation of current methods for detection of staphylococci with reduced susceptibility to glycopeptides. J Clin Microbiol. 2001, 39: 2439-2444.

Walther-Rasmussen J, Hoiby N: Class A carbapenemases. J Antimicrob Chemother. 2007, 60: 470-482.

Weinstein RA: Laboratory role in the management of hospital acquired infections. Emerg Infect Dis. 2001, 7: 188-192.

Wilson AP, O’Hare MD, Felmingham D, Grüneberg RN: Teicoplanin-resistant coagulasenegative staphylococcus. Lancet 1986, 2(8513): 973.

Wilson MP, Spencer RC: Predominance of Gram-negative bacilli and increasing antimicrobial resistance in nosocomial bloodstream infections at a university hospital in southern Taiwan, 1996-2003. J Hosp Infect. 1999, 42: 1-6.

Woodford N, Dallow JWT, HILL RLR, Palepou MFI, Pike R, Ward ME, Warner M, Livermore DM: Ertapenem resistance among Klebsiella and Enterobacter in the UK to a reference laboratory. Int J Antimicrob Agents. 2007, 29: 456-459.

Wootton M, Howe RA, Hillman R, Walsh TR, Bennett PM, MacGowan AP: A modified population analysis profile (PAP) method to detect hetero-resistance to vancomycin in Staphylococcus aureus in a UK hospital. J Antimicrob Chemother. 2001, 47: 399-403.

Yan JJ, Wu JJ, Tsai SH, Chuang CL: Comparison of the double-disk, combined disk, and Etest methods for detecting metallo- -lactamases in gram-negative bacilli. Diagn Microbiol Infect Dis. 2004, 49: 5-11.

124

Yigit H, Queenan AM, Anderson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW, Steward CD, Alberti S, Bush K, Tenover FC: Novel carbapenem-hydrolysing ß-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 1151-1161.

Yong D, Lee K, Yum JH, Shin HD, Rossolini GM, Chong Y: Imipenem-EDTA disk method for differentiation of metallo- -lactamase-producing clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol. 2002, 40: 3798-3801.

Zaidi AK, Huskins WC, Thaver D, Bhutta ZA, Abbas Z, Goldmann DA: Hospital-aquired neonatal infections in developing countries. Lancet 2005, 365: 1175-88.

Zhang L, Li X-Z, Poole K: SmeDEF multidrug efflux pump contributes to intrinsic multidrug resistance in Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrob Agents Chemother. 2001, 45: 34973503.

Zinn CS, Westh H, Rosdahl VT, Sarisa study Group: An international multicenter study of antimicrobial resistance and typing of hospital Staphylococcus aureus isolates from 21 laboratories in 19 countries or states. Microb Drug Resist. 2004, 10: 160–168.

van der Zwet WC, Kaiser AM, van Elburg RM, Berkhof J, Fetter WP, Parlevliet GA, Vandenbroucke-Grauls CM: Nosocomial infections in a Dutch neonatal intensive care unit:surveillance study with definitions for infection specifically adapted for neonates. J Hosp Infect. 2005, 61: 300-311.

www.oek.hu / NNSR eredményei

125

11. Saját publikációk jegyzéke Az értekezés témájához kapcsolódó elsõ szerzõs, nemzetközi folyóiratban publikált közlemények:

Kristóf K, Tóth Á., Damjanova I., Jánvári L, Konkoly-Thege M., Kocsis B, Concan R, Cornaglia G, Nagy K, Szabó D: Identification of blaVIM-4 gene in the internationally successful Klebsiella pneumoniae ST11 clone and in a Klebsiella oxytoca strain in Hungary. J Antimicrobial Chemoterapy. 2010 : Doi:10.1093/jac/dkq133. IF (2008): 4.328

Kristóf K, Szabó D, Marsh JW, Cser V, Janik L, Rozgonyi F, Nobilis A, Nagy K, Paterson DL: Extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella spp. in a neonatal intensive care unit: risk factors for the infection and the dynamics of the molecular epidemiology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2007 Aug, 26(8): 563-570. IF (2007): 2.309

Kristóf K, Kocsis E, Szabó D, Kardos Sz, Cser V, Nagy K, Hermann P, Rozgonyi F: Significance of methicillin - teicoplanin resistant Staphylococcus haemolyticus in bloodstream infections in Hungarian University Hospitals (revízió alatt)

Az értekezés témájához kapcsolódó elsõ szerzõs, hazai folyóiratban publikált közlemények:

Kristóf K, Kocsis E, Nagy K: Clinical microbiology of early-onset and late-onset neonatal sepsis, particularly among preterm babies. Acta Microbiol Immunol Hung. 2009; 56(1):21-51.

Kristóf K, Nagy K: A túlzott antibiotikum-használat következményei – antibiotikum rezisztencia. Családorvosi Fórum 2005, 10: 22-26.

Kristóf K: Stenotrophomonas maltophilia antibiotikum érzékenységi vizsgálatának nehézségei. Mikrobiológiai körlevél. 2006, 6. évfolyam 1. szám: 27.

Kristóf K: Antibiotikum-rezisztenciamechanizmusok fenotípusos detektálása. Orvosképzés, 2008, 4: 315-318.

126

Az értekezés témájához kapcsolódó társszerzõs, nemzetközi folyóiratban publikált közlemények:

Horváth A, Rozgonyi F, Pesti N, Kocsis E, Malmos G, Kristóf K, Nagy K, Lagler H., Presterl E, Stich K, Gattringer R, Kotolácsi G, Cekovska Z, Graninger W: Quantitative differences in antibiotic resistance levelsbetween methicillin-resistant and methicillinsensitive Staphylococcus aureus strains isolated in Hungary, Austria and Macedonia. 2010, Journal of Chemotherapy (elfogadva) IF (2008): 0.81

Kocsis E, Kristóf K, Hermann P, Rozgonyi F: A comparative review of the pathogenecity and virulence factors of methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus., Reviews in Medical Microbiology 2010, 21 (2) 31-37. IF (2008): 0.75

Kocsis E, Lagler H, Pesti N, Stich K, Kristóf K, Nagy K, Hermann P, Komka K, Cekovska Z, Graninger W, Rozgonyi F: Comparison of Austrian, Hungarian and Macedonian methicillin-resistant and methicillin-sensitive Staphylococcus aureus strains in relation to prevalence of cytotoxin genes. Microb Pathog. 2009, 46(6):328-36. IF (2008): 2.289

Szabó D, Kocsis B, Rókusz L, Szentandrássy J, Katona K, Kristóf K, Nagy K: First detection of plasmid-mediated, quinolone resistance determinants qnrA, qnrB, qnrS and aac(6’)-Ib-cr in extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in Budapest, Hungary. J Antimicrob Chemother. 2008, 62(3):630-632. IF: 4.328

Szabó D, Melan MA, Hujer AM, Bonomo RA, Hujer KM, Bethel CR, Kristóf K, Paterson DL: Molecular analysis of the simultaneous production of two SHV-type extended-spectrum beta-lactamases in a clinical isolate of Enterobacter cloacae by using single-nucleotide polymorphism genotyping. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49(11):4716-20. IF: 4.379

Rozgonyi F, Kocsis E, Kristóf K, Nagy K: Is MRSA more virulent than MSSA? Clin Microbiol Infect. 2007, 13(9):843-5. IF: 2.98

127

Az

értekezés

témájához

kapcsolódó

társszerzõs,

hazai

folyóiratban

publikált

közlemények:

Szász M, Lehotkai N, Kristóf K, Nagy K: Prevalence and antimicrobial resistance of uropathogens in different inpatient wards. Acta Microbiol Immunol Hung 2009, 56: 375-387.

Kocsis E, Lagler H, Pesti N, Stich K, Kristóf K, Nagy K, Graninger W, Rozgonyi F: Tapadási gének gyakoriságának vizsgálata methicillin-rezisztens (MRSA) és methicillinérzékeny (MSSA) Staphylococcus aureus törzsekben. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia 2007, XIV (3-4): 133-138.

Cekovska Z, Panovski N, Petrovska M., Kristóf K, Rozgonyi F: Incidence of Staphylococcus aureus isolated from patients treated at the Clinical Center of Skopje, Macedonia, with special attention to MRSA. Acta Microbiol Immunol Hung. 2005, 52(3-4):373-384.

Az értekezés témájához kapcsolódó idézhetõ kongresszusi absztraktok:

Kristóf K, Kamotsay K, Ghidán Á, Rozgonyi F: The predominance of multiple resistant Staphylococcus epidermidis in bloodstream infections of neonates in neonatal intensive care units. Clin Microbiol Infect. 2002, 8, Suppl. 1: 182.

Kristóf K, Szabó D, Harmath Á, Rozgonyi F: Stenotrophomonas maltophilia in a neonatal intensive care unit. Clin Microbiol Infect. 2003, 9, Suppl. 1: 339.

Az értekezés témájához kapcsolódó könyvfejezet:

Kristóf Katalin, Rozgonyi Ferenc: Intrauterin és perinatalis bacterialis fertõzések. In: Klinikai, járóbeteg-szakorvosi és háziorvosi microbiologiai gyorsdiagnostica I. kötet Bacterialis fertõzések diagnosticája (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, 2006): 188-201.

Egyéb elsõszerzõs közlemények:

Kristóf K, Barcs I, Czienel M, Ghidán Á, Nagy K: Connatal listeriosis--a case report and the possibilities of microbiological diagnosis. Acta Microbiol Immunol Hung. 2008, 55(1):63-72. 128

Kristóf K, Barcs I, Cziniel M, Ghidán Á, Rozgonyi F, Nagy K: Connatalis listeriosis bizonyított esete – a mikrobiológiai diagnosztika lehetõségei. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológia 2007, 27-32.

Kristóf K, Latkoczy K, Rozgonyi F: Microbiological and serological diagnostic methods to detect intrauterine and perinatal infections. Orv Hetil. 2003, 144(44):2147-2157.

Egyéb társszerzõs közlemények:

Bausz M, Fodor E, Resch MD, Kristóf K: Bacterial contamination in the anterior chamber after povidone-iodine application and the effect of the lens implantation device. J Cataract Refract Surg. 2006, 32(10):1691-1695. IF: 2.285

Bán Éva, Kristóf Katalin, Mátyus János, Tenke Péter: A klasszikus húgyúti infekciók mikrobiológiai diagnosztikája az Orvosi Mikrobiológiai Szakmai Kollégium módszertani levele 2005. December. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológia. 2006, 33-38.

Mardh PA, Sziller I, Tolbert V, Novikova N, Kristóf K, Rodrigues AG, Pina-Vaz C, Martinez-de-Oliviera J: Candida glabrata with special reference to European epidemiology. Review and presentation of new data. It J Gynaecol Obstet. 2005, 17(2):73-80.

Egyéb könyvfejezetek:

Kristóf Katalin: Bacterialis vaginosis. In: Klinikai, járóbeteg-szakorvosi és háziorvosi microbiologiai gyorsdiagnostica I. kötet Bacterialis fertõzések diagnosticája (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, 2006): 183-186.

Kristóf

Katalin:

Parazitás

betegségek

mikrobiológiai

diagnosztikája.

In:

Orális

mikrobiológia, immunitástan, diagnosztika és infekciókontroll (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, Kónya József, 2007): 196-197.

Kristóf Katalin: A baktériumok azonosítása. In: Orvosi mikrobiológiai gyakorlatok (Egyetemi jegyzet: Szerkesztõ: Nagy Károly, Semmelweis Kiadó, 2006): 39-47. 129

Kristóf Katalin: Általános mikrobiológia. Vizsgálati anyagok vétele, beküldése és feldolgozása. In: Orvosi mikrobiológiai gyakorlatok (Egyetemi jegyzet: Szerkesztõ: Nagy Károly, Semmelweis Kiadó, 2006): 47-51.

Kristóf Katalin: Részletes mikrobiológia. I.1.1.2., I.1.1.4-5., I.2.5., I.3.1., I.8. In: Orvosi mikrobiológiai gyakorlatok (Egyetemi jegyzet: Szerkesztõ: Nagy Károly, Semmelweis Kiadó, 2006): 39-47.

Cser Viktória, Kristóf Katalin, Rozgonyi Ferenc: Leggyakoribb Gram-negatív kórokozók antibioticum resistentiája, detektálási lehetõségei és interpretálása In: Klinikai, járóbetegszakorvosi és háziorvosi microbiologiai gyorsdiagnostica I. kötet Bacterialis fertõzések diagnosticája (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, 2006): 331-343.

Cser Viktória, Kristóf Katalin, Rozgonyi Ferenc: Leggyakoribb Gram-pozitív kórokozók antibioticum resistentiája, detektálási lehetõségei és interpretálása. In: Klinikai, járóbetegszakorvosi és háziorvosi microbiologiai gyorsdiagnostica I. kötet Bacterialis fertõzések diagnosticája (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, 2006): 343-357.

Rozgonyi Ferenc, Kristóf Katalin, Dobay Orsolya: Laboratóriumi munka. In: Klinikai, járóbeteg-szakorvosi és háziorvosi microbiologiai gyorsdiagnostica I. kötet Bacterialis fertõzések diagnosticája (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, 2006): 357-421.

Beck Zoltán, Kristóf Katalin: A vírusfertõzések laboratóriumi diagnosztikája. In: Orális mikrobiológia, immunitástan, diagnosztika és infekciókontroll (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, Kónya József, 2007): 150-153.

Beck Zoltán, Kristóf Katalin: A gombás megbetegedések laboratóriumi diagnosztikája. In: Orális mikrobiológia, immunitástan, diagnosztika és infekciókontroll (Szerkesztette: Rozgonyi Ferenc, Kónya József, 2007): 187-189.

130

Egyéb idézhetõ absztraktok:

Kristóf K, Keresztes L, Rókusz L: Konzultatív mikrobiológia kölcsönös elõnyei intenzív osztályon. Infektológia és Klinikai Mikrobiológia 1999, 6:1. suppl. S17.

Kristóf K, Mislóczky M, Erdei E, Ferencz A: Az urogenitalis rendszer infekciós megbetegedéseinek vizsgálata fertilitás változás hátterében. Klin. Kísérl. Lab. Med. 2000, 26, 110.

Kristóf K, Rozgonyi F: Frequency and antibiotic resistance of bacteria isolated from patients suffering infectious complications following the implantation of prosthetic devices. Int J Antimicrob Agts, 2002, Vol. 19, Supl.1, S96.

Kristóf K, Kamotsay K, Ghidán Á, Rozgonyi F: Multirezisztens Staphylococcus epidermidisek dominanciája perinatális intenzív centrumok betegeinek hemokultúrás anyagában. Klin. Kísérl. Lab. Med. 2002, 29/1, 56-57.

Kristóf K, Kardos Sz, Cser V, Ghidán Á, Rozgonyi F: The impact of multiple resistant S. haemolyticus in NICU-acquired infection. Folia Chemother. Austr. 2003, 19/3-4, 25.

Kristóf K, Cser V, Szabó D, Rozgonyi F: Occurence of Gram-negative nonfermenters in neonatal intensive care units. Clinical Microbiol Infect. 2004, Volume 10, Suppl. 3, 672.

Kristóf K, Kardos Sz, Cser V, Ghidán Á, Rozgonyi F: Multirezisztens Staphylococcus haemolyticus törzsek szerepe perinatális intenzív centrumokban. Infektol. Klin. Mikrobiol. 2004, 11/S1, S15.

Kristóf K, Szabó Z, Cser V, Kardos S, Ghidán Á, Rozgonyi F: Phenotypical differences in antibiotic resistance between MRSA and MSSA strains isolated from clinical samples of patients treated at the clinics of the Semmelweis University. Clin Microbiol Infect. 2005, 11, Suppl. 2, 305.

131

Kristóf K, Kardos S, Pesti N, Rozgonyi F: Increasing frequency of MRSA carriage in upper respiratory tract of patients. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 2005, 52, Suppl: 85. Kristóf K, Antmann K, Szalay Z, Pesti N, Nagy K, Rozgonyi F: Methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus járvány sikeres megfékezése. Infektol Klin Mikrobiol. 2007, XIV/S1, S5.

Mislóczky M, Kristóf K, Õsz Józsefné, Ferencz A: Automatizált szerológia diagnosztika elõnyei a klinikai mikrobiológiai laboratóriumban. Klin Kísérl Lab Med. 2000, 26: 93.

Mislóczky M., Kristóf K., Õsz Józsefné, Ferencz A.: Vizelet bacteriuria szûrése automatával. Klin. Kísérl. Lab. Med. 2000, 26: 111.

Rozgonyi F, Kristóf K, Budai I: Mikrobiológiai diagnosztikai lehetõségek intrauratin és perinatális infekciók esetén. Infektol Klin Mikrobiol. 2001, VIII. Évf. 1. Suppl., S4.

Maródi Cs, Kristóf K, Harmath Á, Paulin F, Rozgonyi F: A Semmelweis Egyetem szülészeti és nõgyógyászati klinikáinak vizsgálati anyagából kitenyésztett B csoportú Streptococcusok karakterizálása. Nõgyógy. Szülész. Továbbk. Szle. 2002, 4, Suppl. 1: 83.

Pulay I., Pászti J, Tarjányi M, Konkoly-Thege M, Kolos Á-né, Kristóf K, Döngölõ I, Flautner I: Methicillin rezisztens Staphylococcus aureus halmozódás, illetve endemia kezelése linezoliddal, általános tanulságok. Infektol Klin Mikrobiol. 2002, IX. Évf., 1. Suppl: S25.

Szabó D, Kristóf K, Harmath Á, Hazai G, Rozgonyi F: Occurence of extended-spectrum lactamase-producing Klebsiella pneumoniae strains in a neonatal intensive care unit, Budapest Clinical Microbiology and Infection, 2003, Volume 9, Supplement1: 247.

Pulay I, Varga Szabó D, Ungvári E, Kristóf K, Konkoly-Thege M: The possible role of linezolid in the control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus outbreaks. Clinical Microbiol. Infect. 2004, Volume 10, Supplement 3: 197.

132

Szabó Zs, Kristóf K, Cser V, Kardos Sz, Ghidán Á, Rozgonyi F: 2001-2003 között izolált methicillin-érzékeny és methicillin-rezisztens Staphylococcus aureus törzsek antimikrobiális szerek iránti érzékenysége. Infektol. Klin. Mikrobiol. 2004, 11/S1, S17.

Kocsis E, Pesti N, Kristóf K, Nagy K, Lagler H, Stich K, Graninger W, Rozgonyi F: Tapadási gének gyakoriságának viszgálata methicillin rezisztens és érzékeny Staphylococcus aureus törzsekben. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológia 2006, Suppl. I: S10.

Horváth A, Malmos G, Pesti N, Kristóf K, Nagy K, RozgonyiF: Differences in antibiotic resistance of MRSA and MSSA strains isolated from clinical samples of hospitalized patients treated at the clinics of the Semmelweis University. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 2006, 53: 276.

Kocsis E, Pesti N, Kristóf K, Nagy K, Lagler H, Stich K, Graninger W, Rozgonyi F: Frequency of genes responsible for cell cytotoxicity in methicillin-resistant and methicillinsensitive Staphylococcus aureus. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica 2006, 53: 297.

Rozgonyi F, Pesti N, Kristóf K, Lagler H, Kotolácsi G, Prestels E, Graninger W: Quantitative antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus. ECCMID 2006, Április 1-4. Clin. Microbiol. Infect. 2006, 12, Suppl 4: P1284.

Kocsis E, Lagler H, Pesti J, Stich K, Kristóf K, Nagy K, Graninger W, Rozgonyi F: Enterotoxin gének gyakoriságának vizsgálata methicillin-rezisztens és methicillin-érzékeny Staphylococcus aureus törzsekben. Infektol. Klin. Mikrobiol. 2007, XIV/S1, S11.

133

Köszönetnyilvánítás Hálás köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik szakmai és tudományos munkámat mindenkor segítették: Dr. Szabó Dóra Prof. Dr. Rozgonyi Ferenc Dr. Bán Éva, Dr. Konkoly-Thege Marianne, Prof. Dr. Nagy Erzsébet, Dr. Dobay Orsolya, Dr. Rókusz László, Dr. Kocsis Erika, Dr. Kocsis Béla, Dr. Juhász Emese, Dr. Horváth Andrea, Pesti Józsefné, Dr. Krizsán Gergely, Katona Katalin, Kardos Szilvia, Dr. Harmath Ágnes, Dr. Nobilis András, Dr. Ostorházi Eszter, Dr. Ghidán Ágoston, Dr. Cser Viktória Sánta Eszter

134

This document was created with Win2PDF available at http://www.daneprairie.com. The unregistered version of Win2PDF is for evaluation or non-commercial use only.