Datum: ………….
Jméno a kroužek: …………………………………
Návod a protokol k praktickému cvičení z toxikologie Úloha 1 CR-screening tečkovacími reakcemi Princip:
Reagencie: 1) Marquisovo činidlo (ke 4 ml formaldehydu se přidá 96 ml koncentrované kyseliny sírové p.a.) (žíravina) 2) p-dimethylaminobenzaldehyd v HCl, p-DMAB (1 g p-dimethylaminobenzaldehydu v 5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové p.a. a přidá se 95 ml 96 % ethanolu) (žíravina) 3) síran ceričitý Ce(SO4)2 , (1 g ve 100 ml kyseliny sírová c=1 mol/l) 4) konc. kyselina dusičná ředěná 1:1 (žíravina) 5) chlorid železitý (5 g chloridu železitého se rozpustí v 95 ml destilované vody) 6) ethanolový roztok plegomazinu 2,0 g/l nikotinu 2,0 g/l kyseliny salicylové 2,0 g/l prokainu 2,0 g/l thioridazinu 2,0 g/l kodeinu 2,0 g/l oxazepamu 2,0 g/l nitrazepamu 2,0 g/l Pracovní postup a) Desku Silufolu rozdělíme tužkou na 9 pruhů a 6 sloupců, které očíslujeme. Do středu každého políčka vyznačíme kroužek o průměru asi 0,5 cm. Do vyznačených kroužků na desce naneseme v 2. pruhu do 1. – 6. sloupce 5µl pipetou roztok plegomazinu, ve 3. pruhu roztok nikotinu, ve 4. pruhu roztok kys. salicylové, v 5. pruhu roztok prokainu, v 6.pruhu thioridazinu, v 7. pruhu kodeinu, v 8. pruhu oxazepamu a v 9. pruhu nitrazepamu (viz schéma). Poté, co jsou skvrny zcela suché, přikapáváme na skvrny pomocí automatické pipety v uvedeném pořadí 5 – 10 µl činidel: k tečkám v 1. sloupci se přidá kyselina sírová k tečkám ve 2. sloupci se přidá Marquisovo činidlo k tečkám ve 3. sloupci se přidá p-dimethylaminobenzaldehyd v HCl (p-DMAB) k tečkám ve 4. sloupci se přidá síran ceričitý k tečkám v 5 . sloupci se přidá kyselina dusičná k tečkám v 6 . sloupci se přidá chlorid železitý Do prvního pruhu nanášíme pouze příslušné činidlo.
1
1. sloupec
2. sloupec
3. sloupec
4. sloupec
5. sloupec
6. sloupec
O
O
O
O
O
O
1.pruh 2.pruh
O
O
O
O
O
O
plegomazin
plegomazin
plegomazin
plegomazin
plegomazin
plegomazin
3.pruh 4.pruh
O
O
O
O
O
O
nikotin
nikotin
nikotin
nikotin
nikotin
nikotin
O
O
kys. salicylová
5.pruh 6.pruh
9.pruh
O
O
O
O
kys. salicylová
kys. salicylová
kys. salicylová
kys. salicylová
O
O
O
O
O
O
prokain
prokain
prokain
prokain
prokain
prokain
O
O
O
O
O
O
thioridazin
thioridazin
thioridazin
thioridazin
thioridazin
thioridazin
7.pruh 8.pruh
kys. salicylová
O
O
O
O
O
O
kodein
kodein
kodein
kodein
kodein
kodein
O
O
O
O
O
O
oxazepam
oxazepam
oxazepam
oxazepam
oxazepam
oxazepam
O
O
O
O
O
O
nitrazepam
nitrazepam
nitrazepam
nitrazepam
nitrazepam
nitrazepam
↑ H2SO4
↑ Marquisovo činidlo
↑
↑ síran ceričitý
↑
↑ chlorid železitý
p-DMAB
HNO3
b) Vznik barevných skvrn se pozoruje v dopadajícím světle, zabarvení na tečce se porovnává se zabarvením samotného činidla nakápnutého v prvním pruhu (některá činidla jsou sama o sobě barevná). Další hodnocení provádíme pod UV lampou při 254 nm. Hodnocení: Barevné reakce zaznamenejte do tabulky a porovnejte s očekávanými zbarveními uvedenými v tabulce, která bude k dispozici. H2SO4
Marquis
p-DMAB
Ce(SO4)2
HNO3
FeCl3
UV fluorescence
Plegomazin Nikotin Kys. salicylová Prokain Thioridazin Kodein Oxazepam Nitrazepam
Za pomoci obr. 3 zařaďte testovaná léčiva do třídy barevných reakcí. Hodnocení:
2
Úloha 2 Tenkovrstevná chromatografie vybraných látek TLC chromatografii látek budeme demonstrovat na některých léčivech ze skupiny psychofarmak (např. deriváty fenothiazinů, benzodiazepinů aj.), které se používají při léčbě některých závažných psychiatrických onemocnění. Plegomazin a thioridazin patří mezi neuroleptika, tj. léky, které ovlivňují řady přenašečů v CNS a používají se k léčbě psychotickch stavů a neklidů. Prokain je zástupcem anestetik. Do podobné skupiny patří i další látky, odvozené od alkaloidů koky. Kodein je antitusikum a analgetikum, příbuzné opiovým alkaloidům. Oxazepam a nitrazepam patří mezi sedativa benzodiazepinového typu. Zolpidem je hypnotikum druhé generace. Princip:
Reagencie: 1) ethanolové extrakty thioridazinu 2,0 g/l kodeinu 2,0 g/l zolpidemu 2,0 g/l prokainu 2,0 g/l oxazepamu 2,0 g/l nitrazepamu 2,0 g/l 2) ethylacetát 3) amoniak koncentrovaný 250 g/kg 4) ethanol 5) benzen 6) Marquisovo činidlo (ke 4 ml formaldehydu se přidá 96 ml koncentrované kyseliny sírové) (žíravina) 7) ethanolový roztok extraktu neznámého vzorku 8) p-dimethylaminobenzaldehyd v HCl, p-DMAB (1 g p-dimethylaminobenzaldehydu v 5 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové p.a. a přidá se 95 ml 96 % ethanolu) (žíravina) Pracovní postup: a) Do 2 chromatografických komor připravíme následující směsi o složení: A: 36 ml ethylacetátu, 2 ml ethanolu a 2 ml amoniaku. B: 37 ml benzenu a 3 ml ethylacetátu. Chromatografické komory přiklopíme a směsi promícháme, necháme asi 15 minut sytit. b) Na 2 desky SILUFOLU si označíme 7 bodů pro nanášku vzorků. Měly by být vzdálené asi 1,5 cm od dolního okraje desky. Do prvních tří bodů nanášíme automatickou pipetou 5 – 10 µl standardních roztoků (thioridazin, kodein a zolpidem), do čtvrtého bodu ethanolový roztok extraktu neznámého vzorku, do zbývajících bodů standardní roztoky prokainu, oxazepamu a nitrazepamu. Starty osušíme fénem. c) Jednu desku vložíme do chromatografické komory s připravenou mobilní fází A, přiklopíme a necháme vyvíjet, druhou desku vložíme do chromatografické komory s připravenou mobilní fází B, přiklopíme a necháme vyvíjet.
3
d) Když mobilní fáze dospějí v obou komorách asi 1,5 cm od horního okraje, desky vyjmeme z komor a označíme čela chromatogramů. Prohlédneme je pod UV lampou. Pokud uvidíme fluoreskující skvrny, označíme je. K barevné detekci skvrn se ještě lehce zavlhlé desky rovnoměrně postříkají Marquisovým činidlem. Při postřiku dbejte zvýšené opatrnosti, neboť obsahuje koncentrovanou kyselinu sírovou. Po osušení fénem se chromatogramy vyhodnotí. Obě desky se ještě na závěr postříkají p-dimethylaminobenzaldehydovým činidlem a osuší. Vyhodnotí se ještě další vzniklé barevné skvrny Hodnocení: Zakreslete schéma chromatogramu a po změření vzdáleností start-čelo rozpouštědla a startstřed skvrny pro jednotlivé skvrny vypočtěte hodnoty Rf. Zhodnoťte nález v neznámém vzorku.
Úloha 3 Průkaz ethanolu reakcí s dichromanem draselným Princip:
Reagencie: 1) dichroman draselný 0,3 g/l 2) koncentrovaná kyselina sírová (Pozor žíravina!) 3) ethanol Pracovní postup: Asi k 0,5 ml roztoku K2Cr2O7 přidáme stejný objem ethanolu a pak opatrně přikápneme 5 – 6 kapek kyseliny sírové (ochrana očí štítem). Roztok po 1 – 2 minutách zezelená. Reakční směs po vyhodnocení reakce vylévejte do nádob určených pro sběr nebezpečného odpadu. Hodnocení: Popište změnu zbarvení a výsledek vysvětlete.
4
Úloha 4 Stanovení koncentrace ethanolu v krvi plynovou chromatografií – vyhodnocení záznamu analýzy. Princip:
. Pracovní postup: V grafickém záznamu, který obdržíte od asistenta, změřte výšky vrcholů ethanolu a vnitřního standardu (isopropanolu) jak v neznámém vzorku, tak ve standardním roztoku.
Ukázka záznamu:
hste
výška vrcholu ethanolu ve standardním roztoku
hstvs
výška vrcholu vnitřního standardu ve standardním roztoku
hvze
výška vrcholu ethanolu v neznámém vzorku
hvzvs
výška vrcholu vnitřního standardu v neznámém vzorku
cvz
koncentrace ethanolu v neznámém vzorku
ce
koncentrace ethanolu ve standardním roztoku v g/kg
5
Hodnocení: Koncentraci ethanolu v neznámém vzorku vypočtěte podle vzorce, do kterého se dosazuje vzájemný poměr výšek vrcholů vnitřního standardu a ethanolu v analyzovaném vzorku i ve standardu.
hvze c vz ( g kg) k
=
koeficient
hvzvs
×
hstvs hste
× c st
k pro plnou krev, moč k = 1,0 pro hemolytické sérum k = 1,1 pro sérum k = 1,2
Vyhodnocení:
6
Úloha 5 Demonstrace dechového testeru alkoholu ALCOSCENT DA-8000 Poznámka k bodu 1.,baterie jsou již vloženy, nasadí se pouze náustek.
Výsledek testu:
7
