Analytická toxikologie

Toxikologie PřF UK, ZS 2015/2016

5. Analytická toxikologie, testování

Analytická toxikologie ■

analytická toxikologie – stanovení xenobiotik/metabolitů ▪ odhad možné expozice potenciálním xenobiotikem, vyskytujícím se v prostředí (vzduch, voda, potrava) ▪ stanovení koncentrací xenobiotik / metabolitů ▪ identifikace metabolitů a makromolekulárních aduktů

■

uplatnění ▪ toxikokinetika ▪ klinická / soudní toxikologie ▪ pracovní lékařství ▪ monitorování životního prostředí

■

analyt ▪ látka vstupující do organismu (xenobiotikum) ▪ metabolit po biotransformaci (indikátor expozice → biomonitorování) ▪ látky akumulované v tkáních, vázané na proteiny plasmy


biologické vzorky ▪ tělní tekutiny (moč, sérum) ▪ tkáně, orgány

■

metody analytické toxikologie ▪ separační (nutné pro odstranění matrice, zakoncentrování analytu) ▫ extrakce ▫ chromatografie: HPLC, GC, TLC ▪ spektrometrické: MS, AAS ▪ elektrochemické ▪ immunometody

© Karel Nesměrák, 2015

1



Analytická toxikologie vzorek tkáně (homogenizovaný)

pH < 4 destilace vodní parou

pH > 9 extrakce organickým rozpouštědlem

destilační zbytek

destilát

stanovení kovů AAS

stanovení těkavých složek spektrometrické metody

vodná fáze

organická fáze

úprava pH < 4 reextrakce org. rozp.

úprava pH < 4 reextrakce vodou

vodná fáze

organická fáze

vodná fáze

organická fáze

neanalysuje se

stanovení kyselých látek TLC, GC, HPLC, GC-MS

úprava pH > 9 reextrakce org. rozp.

stanovení neutrálních látek TLC, GC, HPLC, GC-MS

vodná fáze

organická fáze

neanalysuje se

stanovení neutrálních látek TLC, GC, HPLC, GC-MS


volba vzorku ▪ časové okno mezi poslední dávkou a dobou odběru vzorku HODINY krev, sliny, pot

DNY moč, stolice

TÝDNY A MĚSÍCE vlasy, nehty

■

volba metody


2




obvyklá množství vzorků materiál

TLC

GC-MS, LS-MS

immunometody

0,5–5,0 ml

10–100 l

50 ml

0,5–5,0 ml

10–100 l

50 g

1–5 g

krev/sérum/plasma moč měkké tkáně sliny

0,5–1,0 ml

vlasy

■

30–50 mg

limity kvantifikace metoda

LOQ

GC ethanol v krvi

1 g/kg

TLC léčiv v moči

0,1–1,0 mg/ml

GC-MS

10–100 ng/ml

GC-MS-MS, RIA

pg/ml – ng/ml


biologické indikátory expozice (BEL, biologický expoziční limit) xenobiotikum

indikátor

anilin

p-aminofenol

50 mg/g kreatininu

methemoglobin

1,5%

krev

kadmium

5 μg l–1

moč

nitrobenzen

p-nitrofenol

5 mg/g kreatininu

moč

trichlorethylen

CCl3COOH

100 mg/g kreatininu

moč

olovo

olovo

0,4 mg l–1

krev

δ-aminolevulová kys.

5 mg/g kreatininu

moč

koproporfyrin

0,2 mg/g kreatininu

moč

kadmium

BEL

vzorek moč


3



Hodnocení toxicity xenobiotik ■

toxické vlastnosti látek hodnoceny ▪ na zvířatech (in vivo)

experimentální toxikologie

▪ na tkáňových a jiných kulturách (in vitro) ▪ sběrem dat – pracovní lékařství a klinická toxikologie (ex post) ▪ odhadem (per analogiam) ▪ výpočtem ze struktury (in silico) ■

z etických důvodů se přímé testování na člověku neprovádí

■

stanovení toxických vlastností látek → stanovení příslušných limitů ▪ problém obrovské množství xenobiotik – desítky milionů sloučenin

■

prvním krokem studium chemických / toxikologických informačních zdrojů (SciFinder, databáze)

Hodnocení toxicity xenobiotik Testy na zvířatech (in vivo) ■

existence mezidruhových rozdílů → nesnadná interpretace dat ▪ rozdílný metabolismus ▪ rozdílné prostředí: kontrolované × reálné ▪ počty jednotlivců: 100–1000 vyšlechtěných zvířat × miliardy lidí ▪ počty buněk v orgánech: myš 12× citlivější potkan 6× citlivější pes 2× citlivější ▪ genetická homogenita: vyšlechtěná zvířata × lidské rasy


4




klíčový ▪ správný výběr pokusného zvířete ▫ laboratorní myš (Mus musculus) ▫ laboratorní potkan (Rattus norvegicus) ▫ králík domácí (Oryctolagus cuniculus) ▫ křeček zlatý-syrský (Mesocricetus auratus) ▫ pes domácí (Canis familiaris), plemeno Beagle ▪ vhodné uspořádání testu (cesta podání, dávkování) ▪ správný postup získávání a interpretace dat

■

testuje / testovalo se ▪ akutní toxicita  stanovení LD50, LC50, dermální dráždivost ▪ subakutní toxicita ▪ chronická toxicita  kancerogenita, mutagenita, genotoxicita


pro experimenty platí přísná pravidla (zákony a nařízení) ▪ způsob ustájení (čistota, krmivo, světlo, teplo, vlhko, světlo–tma) ▪ zdravotní kontrola zvířat (stres) ▪ dodržování předepsaného postupu, protokoly ▪ dodržování správné laboratorní praxe, kontroly a řízení kvality pokusů

■

test obvykle ▪ alespoň dva druhy zvířat (hlodavec × nehlodavec) ▪ parita pohlaví ▪ vhodné stáří ▪ nejméně jedna kontrolní skupina


5



Hodnocení toxicity xenobiotik Alternativní metody testování toxicity ■

vyvíjeny z etických i ekonomických důvodů

■

3R = Reduction, Replacement, Refinement


testy na nižších jednoduchých organismech ▪ bakterie (Phosphobacter – Microtox) ▪ prvoci (bičíkovci Tetrahymena pyriformis) ▪ rybky (paví očka) ▪ červi (nítěnka Tubifex tubifex)

■

testy „ve zkumavce“ (in vitro) ▪ tkáňové kultury: izolované orgány, kuřecí zárodky ▪ buněčné kultury: bílé krvinky, hepatocyty


6




screeningové testy genotoxicity ▪ využití zpětných mutací u vybraných kmenů auxotrofních bakterií ▪ Amesův test

Hodnocení toxicity xenobiotik Predikční toxikologie ■

odhad účinku xenobiotika prostou úvahou ▪ kyseliny, zásady → dráždí až leptají ▪ PAH → pokud se neprokáže opak automaticky kancerogen ▪ aromatické aminy, nitrosloučeniny → pokud se neprokáže opak automaticky kancerogenní, budou působit methemoglobinémii ▪ organické sloučeniny fosforu → obvykle inhibitory acetylcholinesterázy

■

modelové výpočty účinků xenobiotik ▪ odhad toxicity z fyzikálně-chemických vlastností xenobiotika, zejména pKa, log P, reaktivita ▪ QSAR – Quantitative Structure-Activity Relationships ▪ komerčně dostupné programy

■

vždy jde jen o přiblížení, rozhodnout musí experiment


7

Analytická toxikologie

Recommend Documents