Aktivitás-függő idegrendszeri plaszticitás fiziológiás és patológiás folyamatokban
PAPP ANDREA MÁRTA
Biológia Doktori Iskola Iskolavezető: Prof. Erdei Anna, tanszékvezető egyetemi tanár Molekuláris Sejt- és Neurobiológia Program Programvezető: Prof. Sass Miklós, tanszékvezető egyetemi tanár
Témavezető Prof. Juhász Gábor, tudományos tanácsadó, az MTA doktora
Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar, Biológiai Intézet Proteomikai Kutatócsoport Budapest, 2007
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS....................................................................................................................................................5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS..........................................................................................................................7 2.1. Plaszticitási folyamatok és a „három kompartmentes modell”...........................................................7 2.1.1. Plaszticitási folyamatok a neuronális kompartmentben....................................................................7 2.1.2. Plaszticitási folyamatok a gliális kompartmentben ............................................................................8 2.1.3. Plaszticitási folyamatok az extracelluláris kompartmentben ............................................................9 2.2. Előzmények a szenzoros ingerléssel összefüggő MMP-szint változások....................................... 10 tanulmányozásához........................................................................................................................................ 10 2.2.1. Mátrix metalloproteinázok (MMP-k)................................................................................................ 10 2.2.1.1. Mátrix metalloproteinázok általános biológiai funkciói és csoportosítása................................................. 10 2.2.1.2. A zselatinázok (MMP-2 és MMP-9) domén struktúrája és szubsztrát preferenciája............................. 10 2.2.1.3. Zselatinázok expresszió- és aktiváció-szabályozása ............................................................................... 13 2.2.1.4. Zselatinázok szerepe a központi idegrendszerben ................................................................................... 15 2.2.2. A retina, mint a központi idegrendszer modellje ............................................................................ 17 2.2.2.1. Zselatinázok szerepe a retinában és a szemben általában....................................................................... 17 2.2.2.2. A fehér-fény indukált fotoreceptor degenerációról..................................................................................... 18 2.2.2.3. A retina funkcionális működésének a monitorozásáról .......................................................................... 20 2.3. Előzmények az epileptiform aktivitással összefüggő extracelluláris aminosav és nukleozid szint változások tanulmányozásához........................................................................................................... 20 2.3.1. Az epilepsziáról általában ................................................................................................................... 20 2.3.2. A Lindán mint neurotoxikus környezeti rizikófaktor..................................................................... 21 2.3.3. Az in vivo mikrodialízisről általában................................................................................................... 22 3. CÉLKITŰZÉSEK......................................................................................................................................... 24 4. MÓDSZEREK .............................................................................................................................................. 25 4.1. Kísérleti állatok, vegyszerek .................................................................................................................. 25 4.2. Fehér fény-expozíciós kísérletek .......................................................................................................... 25 4.2.1. Fehér fény-expozíciós paradigmák.................................................................................................... 25 4.2.1.1. Foto-stressz modell (fehér fény, 3 óra, 5.500 lux) .................................................................................. 25 4.2.1.2. Xilazin hatása a foto-stressz modellben ................................................................................................. 26 4.2.1.3. MMP-inhibitor hatása a foto-stressz modellben ..................................................................................... 27
2
4.2.1.4. Nappali fény (500 lux) adaptáció ......................................................................................................... 27 4.2.2. Elektroretinográfia (ERG) ................................................................................................................. 27 4.2.3. Retina morfológia ................................................................................................................................ 29 4.2.4. TUNEL-festés ..................................................................................................................................... 30 4.2.5. Szem-struktúrák disszekciója ............................................................................................................. 30 4.2.6. Totál-RNS izolálása és RT-PCR kísérletek ...................................................................................... 31 4.2.7. Zselatin zimográfia .............................................................................................................................. 32 4.2.8. MMP-2 és MMP-9 Western blot detektálása .................................................................................. 34 4.2.9. Adatelemzés. Statisztika...................................................................................................................... 34 4.3. Kémiailag-indukált epilepszia kísérletek.............................................................................................. 35 4.3.1. Akut in vivo mikrodialízis .................................................................................................................... 35 4.3.2. Elektroencefalográfia (EEG)............................................................................................................. 36 4.3.3. Aminosavak meghatározása HPLC módszerrel.............................................................................. 37 4.3.4. Nukleozidok meghatározása HPLC módszerrel............................................................................. 37 4.3.5. Kromatogramok kiértékelése............................................................................................................. 38 5. EREDMÉNYEK........................................................................................................................................... 39 5.1. Fehér fény-expozíciós kísérletek .......................................................................................................... 39 5.1.1. Funkcionális visszatérés foto-stresszt követően ............................................................................. 39 5.1.2. Morfológiai adatok foto-stresszt követően...................................................................................... 40 5.1.3. TUNEL eredmények foto-stresszt követően.................................................................................. 42 5.1.4. Zselatinázok mRNS-szintű változásai foto-stresszt követően...................................................... 43 5.1.5. Zselatinázok fehérje-szintű változásai foto-stresszt követően...................................................... 44 5.1.6. Xilazin hatása ....................................................................................................................................... 46 5.1.7. Az MMP-gátlás hatása az ERG b-hullám foto-stressz által kiváltott változásaira ..................... 47 5.1.8. Fény-adaptáció 500 lux „szokásos” nappali fény hatására ............................................................ 49 5.2. Kémiailag-indukált epilepszia kísérletek.............................................................................................. 50 5.2.1. Halothan-altatott patkány EEG-aktivitás változásai ip. Picrotoxin illetve Lindán hatására..... 50 5.2.2. Aminosav koncentrációváltozások a hippocampusban Picrotoxin, illetve Lindán hatására .... 54 5.2.3. Nukleozid koncentrációváltozások a hippocampusban Picrotoxin, illetve Lindán hatására.... 55 6. MEGBESZÉLÉS........................................................................................................................................... 57 6.1. Fehér fény hatása a szemben ................................................................................................................ 57 6.2. Picrotoxin és Lindán hatásai a hippocampusban............................................................................... 61
3
7. IRODALOMJEGYZÉK.............................................................................................................................. 64 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................................................ 79 ÁBRÁK JEGYZÉKE ....................................................................................................................................... 81 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS........................................................................................................................ 82 ÖSSZEFOGLALÁS.......................................................................................................................................... 83 SUMMARY......................................................................................................................................................... 84
4
1. BEVEZETÉS A központi idegrendszer összetett jelenségei felfoghatók hármas tagolású szöveti modellben megvalósuló folyamatokként. Ennek az egyszerűsített „három kompartmentes modellnek” az idegsejtek hálózata alkotja az egyik alegységét, a másodikat a gliasejtek összessége, míg a harmadik komponenst e két sejt populáció között elhelyezkedő extracelluláris tér képviseli. Minden kompartmentben jellemző folyamatok zajlanak, melyek állandó kölcsönhatásban állnak egymással. A neuronok elektromos ingerelhetőségének köszönhetően, valamint aktivitásukkal egyértelműen összefüggésbe hozható transzmitter és modulátor molekulák és receptoraik neurokémiai jellemezhetősége miatt, az egyedi idegsejtek és hálózataik szerepe széleskörűen tanulmányozott és vezető szerepük az idegrendszer működésében általánosan elfogadott. Ezzel szemben a gliasejtekben és az extracelluláris térben zajló folyamatok sokrétűségét és jelentőségét csak újabban ismerték fel, de egyre szélesebb körben kutatják. A kezdeti elképzelés, hogy a gliasejtek a neuronok metabolikus szükségleteinek a kielégítésére szolgálnak, hogy a jelátvitelben már szerepüket betöltött neurotranszmitterek eltávolítását és a neuronális mikrokörnyezet megfelelő ion-összetételének stabilitását biztosítják csupán, mára elavulttá vált. Egyértelműen kialakult az a nézet, hogy kétirányú neuron-glia kommunikáció zajlik az idegrendszerben. A gliális elemek fiziológiai szerepének a tanulmányozása módszertanilag nehéz és drága képalkotó technikákat igényel, ami a kutatások kiterjesztésének egyik korlátozó tényezője. Az extracelluláris tér, mint az idegrendszeri folyamatoknak aktív részese, talán a gliasejteknél is kevesebb figyelmet kapott. Azonban, a 80-as évektől, az in vivo mikrodialízis technika megjelenésével lehetőség nyílt az extracelluláris folyadék (ECF) kis-molekula összetételének tanulmányozására, és elterjedt a szinaptikus aktivitással összefüggésbe hozható neurotranszmitter koncentráció-változások monitorozása. Míg a monoaminok szinaptikus és varikozitás eredete bizonyítást nyert, addig az aminosav-transzmitterek pontos eredete és változásaiknak interpretációja máig vitatott. Ennek ellenére, a mikrodialízis egy széleskörűen alkalmazott módszer, mely a humán epilepszia preoperatív jellemzésétől a gyógyszer-várományos molekulák központi idegrendszeri hatásainak a dokumentálásáig terjed. Az extracelluláris mátrix (ECM) komplex és dinamikus szerkezeti felépítését alig néhány éve kezdjük részleteiben megismerni, így új felismerés az extracelluláris térben található fehérjék és makromolekulák plasztikus folyamatokban való részvétele. Főként az egyedfejlődés illetve tumorgenezis és progresszió folyamataiban ismerték fel a sejt-sejt és sejt-mátrix kapcsolatok 5
jelentőségét, valamint az extracelluláris proteolitikus enzimek aktív szerepét a szöveti átrendeződésekben. Ezek a felismerések a központi idegrendszer kutatásában is alkalmazást nyertek és bebizonyosodott az extracelluláris proteázok szerepe az ontogenezis illetve patológiás szöveti-átrendeződéssel járó folyamatokban. Jelen disszertáció az extracelluláris térben tapasztalható változások bizonyos aspektusait követi nyomon két különböző kísérleti paradigmában. Első kísérleti modellünk - kiindulva az egyik extracelluláris proteáz (mátrix metalloproteináz-9, MMP-9) különböző sejtpusztulással és szöveti átrendeződéssel jellemzett folyamatokban bizonyított idegrendszeri indukciójából és abból a tényből, hogy hosszan tartó erős fehér fény expozíció a fotoreceptor sejtek kiterjedt apoptózisához és a retina mélyreható szerkezeti átrendeződéséhez is vezethet -, azt a kérdést vetette fel, hogy a fehér fénynek lehet-e MMP-9-et indukáló hatása a retinában. A másik kísérleti modell kémiailag indukált rohamszerű aktivitás folyamán jellemzi az extracelluláris folyadékbeli excitatorikus aminosav-, illetve nukleozid-szintek változásait és egy epileptogén vegyület (Lindán) hatásmechanizmusának a GABAA receptoron kifejtett komponensét próbálja körvonalazni egy ismerten GABAA klorid-csatorna blokkoló vegyület (Picrotoxin) hatásaival való összehasonlítás által.
6
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Plaszticitási folyamatok és a „három kompartmentes modell” A központi idegrendszer rendkívüli komplexitása, a tanulmányozhatóság egyszerűsítése szempontjából, különböző felosztásoknak ad teret, melyek egyike a három kompartmentes modell (neuronok, gliasejtek és extracelluláris tér). Élettani körülmények között a neuronális aktivitással összefüggő párhuzamos és koordinált folyamatok zajlanak mindhárom kompartmentben, lehetővé téve az idegrendszer stabilitásának hátterén a funkcionális adaptáció folyamatait. Patológiás behatásokra is mindhárom komponens érintett, mint ahogy a behatásra adott - a homeosztázis megőrzését illetve visszaállítását célzó - válaszban is részt vesznek, esetenként eltérő arányban. Ebben a rövid bevezetőben nem vállalkozom az irodalom teljes áttekintésére csak az újabban felismert eredményeket ismertetem mindhárom kompartmentben, hangsúlyozva a gliális és extracelluláris kompartmentek szerepét, majd bővebb áttekintése következik az alkalmazott kísérleti modellekkel összefüggő irodalmi adatoknak. 2.1.1. Plaszticitási folyamatok a neuronális kompartmentben Bár a neuronok azonosítása és szinaptikus- valamint hálózati-plaszticitásuk tanulmányozása elektrofiziológiai és neurokémiai módszerekkel hosszú múltra tekint vissza, újabban felismert tulajdonság az intrinsic neuronális excitabilitás aktivitás-függő változása (Moyer, Jr. et al. 1996; Thompson et al. 1996; Li et al. 2004), mely végső soron kritikus meghatározója a neuron válaszának egy adott szinaptikus bemenetre. Különböző kísérleti modellekben a tartós excitabilitás módosulásnak (potenciáció illetve depresszió) hátterében megannyi, sejtfüggően különböző mechanizmust azonosítottak, de ennek a sejtszintű plaszticitásnak a funkcionális következményei kevéssé ismertek. Az ismételt vizuális ingerlés hatására kialakuló tartós excitabilitás növekedésről az ebihal látórendszerében feltételezik, hogy a jel/zaj arány javítása révén jobb vizuális inger észlelést eredményez in vivo (Aizenman et al. 2003). Kondicionálási modellekben, a memória nyom kimutatható perzisztenciája mellett az excitabilitás növekedés lecsengő volta (Moyer, Jr. et al. 1996) arra enged következtetni, hogy az excitabilitás változások csupán a szinaptikus tartós potenciáció kialakulásának a valószínűségét növelik, de nem képezik részét magának az engramnak (Zhang & Linden 2003). A neuronok válaszának flexibilitása a környezeti behatásokra csak egy idegrendszeri homeosztázis hátterén jöhet létre. Gerinctelenek azonosított pacemaker sejtjein bizonyították, hogy azok, az individuális ion-csatornák expressziójában és konduktanciájában tapasztalt nagy 7
egyedek-közötti különbségek ellenére, konzervált kisülési mintázatot generálnak (Schultz et al. 2006a). Ezt a molekuláris variabilitást kompenzációs mechanizmusoknak tulajdonítják, melyek az idegrendszer funkcionális stabilitását biztosítják az egyed élete folyamán (Schultz 2006b). 2.1.2. Plaszticitási folyamatok a gliális kompartmentben A gliális kompartment sejtjeinek a neuronhálózat mechanikai és trofikus támogatásán túlmutató, árnyalt és sokrétű szerepére a módszertani lehetőségek bővülésével (pl. Tsien 1980; konfokális mikroszkópia elterjedése) kezd fény derülni. Az elmúlt tíz évben körvonalazódott, hogy az asztrogliák nem csak a neuronális aktivitás nyomán szinaptikusan felszaporodott glutaminsav és K+-ionok eltávolítását végzik, hanem egy „háromkomponensű szinapszis” részeseiként (Araque et al. 1999; Halassa et al. 2007) a preszinaptikusan felszabadult glutaminsav hatására a periszinaptikus asztrogliában intracelluláris Ca2+-oszcillációk keletkeznek, melyek szignalizációs szereppel bírnak. Ilyen asztrogliális Ca2+-szignálokat szenzoros ingerlés hatására már in vivo is kimutattak (Wang et al. 2006). A Ca2+-szignálok funkcionális következménye nem csak a lokális vérellátás folyamatos adaptálása a neuronális-aktivitás metabolikus igényeihez, hanem az asztrogliából történő kémiai transzmitterek és jelátviteli molekulák (glutaminsav, ATP, D-szerin, taurin, tumor necrosis factor-α (TNF-α), atrial natriuretic factor (ANF)) felszabadulása is („gliotranszmisszió”). Tehát, az asztrogliák nem csak a neuronális aktivitás integrálását végzik, hanem a gliotranszmisszió útján visszahatnak a környező neuronok aktivitására és szinaptikus plaszticitására. A Ca-függően felszabadult asztrogliális glutaminsav - extraszinaptikus NMDA receptorokra hatva - bizonyítottan neuronális aktivitás szinkronizációt okoz (Fellin et al. 2004) és feltételezhetően neuron-csoportok kóros, epileptiform szinkronizációjával is kapcsolatban áll. A D-szerin, az NMDA receptorok glicin-kötő helyének endogén ligandjaként, vagy az LTP vagy az LTD kialakulásának irányába tolhatja el az NMDA-receptorok aktivációs szintjét, ezáltal az asztrogliáknak a szinaptikus metaplaszticitásban biztosítva szerepet. Az asztrogliális eredetű ATP a környező asztrogliákra fejt ki - a gap-junctionok-on keresztül terjedő Ca2+-hullámokhoz hasonló parakrin hatást (Guthrie et al. 1999), illetve az ATP extracelluláris hidrolíziséből származó aktivitás-függően felszaporodott adenozin a neuron-hálózatokon belüli szinaptikus kapcsolatok erősségének a szabályozásában vesz részt (Pascual et al
2005; Serrano et al. 2006). Így, a
glutaminsav és ATP révén, a gliotranszmissziónak is ismertek már serkentő valamint gátló transzmitterei.
8
Ez a komplex kétirányú kommunikáció a neuronok és gliasejtek között az extracelluláris kompartmenten keresztül zajlik, mely önmaga is dinamikus résztvevője az idegrendszeri plaszticitási folyamatoknak. 2.1.3. Plaszticitási folyamatok az extracelluláris kompartmentben Az extracelluláris kompartment egy, a sejtek által előállított komplex mikrokörnyezet, melyet az extracelluláris folyadékba beágyazott mátrix makromolekulák hálózata alkot. Az extracelluláris folyadékban ionok, kis molekulák, peptidek és szolúbilis fehérjék sokasága van jelen, és az idegrendszert ért behatásokra ezek az oldott komponensek mennyiségi és minőségi változásokat mutatnak, hiszen a sejtek aktivitásából származnak és aktuális szintjeik a sejtek általi felvételük és leadásuk egyensúlyi folyamatait tükrözik. Ezzel kapcsolatban merült fel a zárt és nyitott szinapszisok elmélete (Zoli & Agnati 1996), mely - a transzmitterek szinaptikus résben lokalizált, avagy extraszinaptikus diffundálási lehetőségét - a periszinapszis funkcionális jellgzeteségei (enzimek, transzporterek jelenléte), a gliasejt anatómiai elrendeződése illetve a felszabaduló transzmitter mennyiségétől teszi függővé. A nyitott szinapszisok tulajdonképpen a szinaptikus résnél nagyobb extracelluláris téren keresztüli diffúzióval mediált interneuronális és neuron-glia közötti térfogat-transzmissziót („volume transmission”) jelölik. Tehát, plasztikus folyamatok (glia duzzadás,
sejtadhéziós molekulák lebontása, stb.) dinamikus változásokat
okoznak az extracelluláris tér térfogatában, geometriájában, tortuozitásában kihatva a sejtek közötti kommunikációra élettani és patológiás folyamatokban (Syková 2005). Az
extracelluláris
tér
kis-molekula
koncentrációiban
bekövetkező
változások
monitorozására a mikrodialízis technika széleskörűen alkalmazott. A dializátumban kimutatható dopamin, szerotonin és acetilkolin aktivitás-függő neuronális felszabadulása elfogadott, viszont az alapszintű extracelluláris aminosavak (glutaminsav, aszparaginsav, glicin és GABA) sejtes eredete, funkcionális vagy metabolikus jellege, illetve élettani relevanciája nem teljesen tisztázott (Del Arco et al. 2003). Epilepsziában főként az extraszinaptikus receptorokon keresztül zajló neuron glia kölcsönhatásban és a receptor-szintű adaptációban tekintik meghatározónak a glutaminsavat és a GABA-t (Sierra-Paredes & Sierra-Marcuño 2007), és feltételezik, hogy a fokozott neuronális aktivitás kapcsán megnövekedett glutaminsav felszabadulás megjelenhet a mikrodialízissel mintavételezett extracelluláris folyadékban. Az extracelluláris mátrix dinamikus, helyben és időben szabályozott lebontása alapvető fontosságú a szöveti átrendeződésben az ontogenezis folyamán, illetve élettani és patológiás
9
körülmények között egyaránt. Az ECM egyes molekulái a sejt-sejt és sejt-mátrix kapcsolatok kialakításában vesznek részt; sejtfelszínhez kötött vagy szolúbilis proteázai a pericelluláris proteolízis révén a sejtek alakváltoztatását és migrációját teszik lehetővé, míg a mátrix makromolekulák által megkötött növekedési faktorok, citokinek, stb. proteolitikus felszabadítása útján a sejtek túlélésében vagy pusztulásában, gyulladásos folyamatok kiváltásában, stb. játszanak egyre jobban körvonalazott szerepet. 2.2. Előzmények a szenzoros ingerléssel összefüggő MMP-szint változások tanulmányozásához 2.2.1. Mátrix metalloproteinázok (MMP-k) 2.2.1.1. Mátrix metalloproteinázok általános biológiai funkciói és csoportosítása A mátrix metalloproteinázok (MMP-k, matrixinek) családjába tartozó Zn2+-függő endopeptidázok általánosan elismert szerepet töltenek be a pericelluláris proteolízisben, a sejtekközti tér makromolekuláinak katabolizmusa által. Az extracelluláris mikrokörnyezet megváltoztatása kihat a sejt-mátrix kapcsolatokra, és ennek következtében a sejtszintű válaszokat is képes modulálni. Az MMP-k újabban felismert szerepei közé tartoznak a sejtek közötti kapcsolatok modulálása; a sejt-maturáció, illetve sejt-migráció elősegítése; biológiailag aktív molekulák aktivitásának szabályozása - inaktív prekurzorok limitált proteolízis útján történő aktivációja, kötött formákból történő felszabadítás vagy inhibitorok aktivitásának módosítása révén (Vu & Werb 2000; McCawley et al. 2001; Brinckerhoff & Matrisian 2002). Az emlősökben több mint 20 mátrix metalloproteináz ismert. Az enzim-család kevésbé jellemzett tagjain kívül, szubsztrát preferenciájuk és domén struktúrájuk alapján a következő csoportok különíthetők el: kollagenázok, sztromelizinek, zselatinázok (IV-típusú kollagenázok) és „membrán-kötött”-MMP-k (membrane-type matrix metalloproteinase, MT-MMP) (Yong et al. 1998; Vu & Werb 2000). 2.2.1.2. A zselatinázok (MMP-2 és MMP-9) domén struktúrája és szubsztrát preferenciája a) Domén struktúra. A zselatinázok csoportjába az MMP-2 (EC 3.4.24.24, zselatináz-A), illetve az MMP-9 (EC 3.4.24.35, zselatináz-B) tartoznak, melyekre a következő moduláris domén struktúra jellemző (van den Steen et al. 2002; Nagase & Woessner 1999) (1. ábra): •
szignál-peptid;
10
•
pro-peptid (ciszteinje (Cys, C) a katalitikus Zn2+-t megkötve biztosítja a pro-forma inaktivitását);
•
katalitikus domén (melybe a zselatinázokra jellemző három darab II-es típusú fibronektinszerű szekvencia van beágyazva) és a
•
C-terminális végen a hemopexin-szerű domén.
A katalitikus domén tartalmazza: •
a Zn2+-kötő „motívumot” („motif”) HEXXHXXGXXH (ahol az X bármely aminosav lehet), melynek hisztidinjei (His, H) kötik a szerkezeti Zn2+-atomot;
•
2-3 Ca2+-iont, melyek a stabilitáshoz és az enzimatikus aktivitáshoz szükségesek; valamint
•
egy konzervált metionint (Met, M), mely egy jellemző „Met-kanyar” („Met-turn”) struktúrát alkot (Bode et al. 1993).
H H
O
H
S
Zn2+
PRCGXPD Y
AHEXGHXXGXXH
Y MMP-9
1 2
3
4
5
6
7
YY MMP-2
1. ábra A zselatinázok domén struktúrája. 1. szignál-peptid; 2. pro-peptid; 3. aktív enzim (rész); 4. II-típusú fibronektin-szerű; 5. Zn2+-kötő; 6. V-típusú kollagén-szerű; 7. hemopexin-szerű; Y Nglikozilációs helyek melyek közül
a legtöbb MMP-ben konzervált (MMP-2 e tekintetben a
kivételek közé tartozik). Az ábra felső részében a zimogén (inaktív, proforma) ciszteinkapcsolóban ("Cys-switch") részt vevő szekvenciák láthatók (Van Wart & Birkedal-Hansen 1990).
11
Az MMP-9-ben, a pro-peptid és aktív-enzim N-terminális részein, N-glikozilációs helyek találhatók, míg a katalitikus- és hemopexin-domének határán, egy V-ös típusú kollagén-szerű – treonin, szerin, és prolin aminosavakban gazdag - régió is jelen van, mely potenciálisan többszörösen O-glikozilált lehet (Nagase & Woessner 1999; Van den Steen et al. 2002). Ezeknek a glikozilációs állapotoknak a funkcionális jelentősége in vivo pontosan nem ismert, de in vitro kísérletekben bizonyított, hogy a glikoziláció befolyásolhatja az enzim-aktivitást, szubsztrát affinitást stb. b) Szubsztrátok. Mint az MMP-k általában, a zselatinázok is, részben átfedő szubsztrát preferenciával, sokfajta extracelluláris mátrix makromolekulát hasítanak (a teljesség igénye nélkül): MMP-2: zselatinok; kollagének I, IV, V, VII, XI; fibronectin; laminin; aggrecan; elastin; tenascin-C; MMP-9: zselatinok; kollagének III, IV, V, XIV; aggrecan, elastin; entactin (Nagase 1996; Sternlicht & Werb 2001). Míg nagyfokú zselatinbontó képességük általánosan alkalmazott a zselatin-szubsztrát zimográfiában kimutatásuk és azonosításuk céljából, addig az in vitro bizonyított és egymással jelentősen átfedő szubsztrát készletük felveti az aktuális in vivo szubsztrátjaik kérdését. A központi idegrendszer esetében ezeknek a „klasszikus” ECM-szubsztrátoknak élettani relevanciája is vitatott, mert bár a vér-agy gát lamina basalis-ának összetétele - főként IV-típusú kollagén, fibronectin és laminin - zselatinázok általi lebontásra alkalmassá teszi, addig a felnőtt agy interneuronális mátrixában a fent említett makromolekulák nagy részének a jelenléte nem jellemző (Dzwonek et al. 2004; Sugita et al. 2001). Mivel az MMP-2-nek, elterjedt agyi alapszintű expressziója miatt, az extracelluláris mátrix fiziológiai turnover-ében tulajdonítanak szerepet, addig az indukálható MMP-9-nek az in vivo szubsztrátjainak felderítésére több figyelem fordult. Az idegrendszerben eddig bizonyítást nyert MMP-9 szubsztrátok: a fehérállomány mielin felépítésében szerepet játszó mielin bázikus fehérje (myelin basic protein, MBP) (Asahi et al. 2001), a vér-agy gát integritásában résztvevő zonae occludens-1 (ZO-1) (Asahi et al. 2001), a neurodegenerációban involvált amiloid (Backstrom et al. 1996) és a posztszinaptikus elhelyezkedésű disztroglikán (Kaczmarek et al. 2002; Michaluk et al. 2007). Felvetődött, hogy az MMP-k szubsztrátum-fajlagosságának hiányát a komplex szabályozás ellensúlyozza, mely azt célozza, hogy egy pontosan meghatározott időben és helyen aktiválódott
12
MMP az aktuálisan jelen levő extracelluláris mátrix molekulákat processzálja vagy katabolizálja („hic et nunc activity” Dzwonek et al. 2004). 2.2.1.3. Zselatinázok expresszió- és aktiváció-szabályozása a) MMP-9. Az MMP-9 expressziója és aktivációja, az MMP-kre általában jellemző nagyon komplex szabályozás alatt áll: •
Géntranszkripció szintjén: Az MMP-9 bazális kifejeződése erősen sejt-függő, konstitutív transzkripcióját kevés esetben írták le, de expressziója jelentősen indukálható főként AP-1 és NF-κB szabályozó szekvenciákon keresztül, IL-1, vírusok, lektinek, citokinek hatására (Van den Steen et al. 2002).
•
Transzláció szintjén: A megszintetizált mRNS stabilitását befolyásolhatja a nitrogénmonoxid (NO) (Akool et al. 2003); az mRNS transzlokációját is leírták az aktív dendritikus tüskék felé, ahol lokális fehérje-szintézis is végbemehet (Szklarczyk et al. 2002).
•
Poszttranszlációs
módosulások
szintjén:
A
megszintetizált
pro-MMP-9
fehérje
endoplazmatikus retikulumba történő transzlokációja után, a szignál-peptid eltávolítása következik be, majd a fehérje maturációja folyamán a pro-enzim prekurzor (~85-kDa) glikozilációja (~92-kDa), valamint esetleges homo-dimerizációja (~190-kDa prekurzor illetve ~220-kDa glikozilált forma) következik be. A glikoziláció és a dimerizáció egymástól független, párhuzamos folyamatként mehet végbe. Vezikuláris szekréció útján csak a glikozilált, inaktív, pro-formák (zimogének) kerülnek ki az extracelluláris térbe (Olson et al. 2000). A neutrofil granulocitára jellemző, egy NGAL-lal (neutrophil gelatinase associated lipocalin, ~25 kDa) komplexált hetero-dimer (~125-130-kDa) képződése (Pugin et al. 1999), mely szöveti mintákból gyakran kimutatható. •
Zimogén aktiváció szintjén: A pro-enzim extracelluláris aktivációja egy többlépcsős, „mindent vagy semmit” folyamat, mely végén, a pro-peptid domén Cys-je és a katalitikus Zn2+ közötti kötés felbomlik, és limitált autoproteolízis útján a pro-peptid domén lehasad és egy intermedier ~85-kDa aktív forma jön létre. A C-terminális domén lehasadásával keletkező ~68-kDa forma szintén enzimatikusan aktív. A pro-MMP-9, részleges vagy teljes, enzimatikus aktivációja in vivo, egy proteolitikus kaszkád utolsó lépéseként jöhet létre MMP-1, -2, -3, -7, -12, valamint tripszin, cathepsin G, szöveti kallikrein vagy plazmin hatására (Okada et al. 1992; Van den Steen 2002) (2. ábra).
13
•
Aktív enzim szintjén: Az extracelluláris térben az aktív MMP-9 a katalitikus doménjéhez nem-kovalensen
kötő
„MMP
szöveti
inhibitor”-okkal
(Tissue
inhibitor
of
metalloproteinases, TIMP) gátolható. A 21-30-kDa TIMP-ek (TIMP 1-4) a fő endogén szabályozói az MMP-k szövetekben kifejtett aktivitásának (Nagase & Woessner 1999), de biológiai funkcióik sokkal komplexebbek (Gardner & Ghorpade 2003). Leírták az LRP-hez (low-density receptor-related protein), mint receptorhoz történő MMP-9 kötődést is, melyet internalizáció és az MMP-9 degradációja követ (Hahn-Dantona et al. 2001).
2. ábra Az MMP-k proteolitikus aktivációs kaszkádja. b) MMP-2. Az MMP-9-től eltérően, az MMP-2 a legtöbb sejtkultúrában bazális szinteken kimutatható és bár gén-szintű indukciója (pl. Transforming Growth Factor- β (TGF-β) hatására)
14
kiváltható, általános expressziós szintje aránylag kevéssé változik növekedési faktorok vagy citokinek hatására (Barrett et al. 1998). Glikozilációja, illetve dimerizációja nem ismert, a zimogén (72-kDa), illetve aktív (62-kDa) formák főként TIMP-2-höz kötődnek. A pro-MMP-2 aktivációja zömében a sejtfelszín-közelében történik MT1-MMP (MMP-14) hatására, de az aktivációt MMP-1 és MMP-7 is kiválthatja. További aktív hasítási termék (42-45 kDa) keletkezik a C-terminális autolíziséből. Az aktív MMP-2 endogén inhibitorai a TIMP-1, -2 és -3, valamint az α2makroglobulin (Barrett et al., 1998). 2.2.1.4. Zselatinázok szerepe a központi idegrendszerben a) Az ontogenezis folyamán. Az egyedfejlődés során az MMP-9 expressziója pontos időbeni szekvenciát követ különböző szövetekben, mely összefüggést mutat a sejtek migrációjával, maturációjával, a mielinizáció folyamatával és a kiterjedt morfológiai átrendeződéssel általában. Így, a 11 napos egér embrió központi idegrendszerében megjelenő, mRNS-szinten kimutatható, MMP9-nek szerepet tulajdonítanak a neurogenezis és angiogenezis folyamataiban (Cañete-Soler et al. 1995). Patkányban a kisagykéreg posztembrionális ontogenezisével, illetve felnőttkori motorikus készségek elsajátításával kapcsolatban mutattak ki sejt-függő, időben és térben lokalizált MMP-2, 3, -9 és TIMP-1, -2, -3 expresszió különbségeket (Vaillant et al. 1999). Megnövekedett MMP-9 és MMP-12 szintek mutathatók ki a corpus callosum (Uhm et al. 1998; Larsen et al. 2006), illetve a látóideg (Oh et al. 1999; Larsen et al. 2006) mielinizációjával egyidejűleg is, mikor az MMP-9-nek az oligodendrogliák nyúlvány-növekedésében (Uhm et al. 1998; Oh et al. 1999) és maturációjában tulajdonítanak szerepet (Larsen et al. 2003; Larsen et al. 2006). Ezzel szemben, az MMP-2 immunhisztokémiai módszerrel széleskörűen kimutatható az embrionális szövetekben (Casasco et al. 1995). Felnőttkorban, a zselatinázok alapszintű expressziója regionális eltéréseket mutat. Az MMP-2 mRNS, fehérje illetve enzimaktivitás szintjén diffúzan kimutatható a szürkeállományban és túlnyomó részben astroglia eredetű (Szklarczyk et al. 2002). A konstitutív idegrendszeri MMP-9 expresszió kevésbé széleskörű, és csak bizonyos neuronális szómákban és dendritekben lokalizálták a hippocampus, agykéreg és kisagy területén (Backstrom et al. 1996; Vaillant et al. 1999; Szklarczyk et al. 2002; Jourquin et al. 2003). b) Patológiás plaszticitási folyamatokban. Mivel a kollagenázt, az első ismert MMP-t, egy nagymértékű morfológiai átrendeződéssel járó folyamatban fedezték fel (ebihal metamorfózis,
15
Gross & Lapière 1962), kezdetben a zselatinázok központi idegrendszerbeli szerepét is olyan modellekben tanulmányozták, melyekben ismerten sejtpusztulással járó kiterjedt szöveti átrendeződés következik be. Így, megnövekedett MMP-9 expressziót és/vagy aktivitást mutattak ki kainsav-indukált epilepszia (Zhang et al. 1998; Szklarczyk et al. 2002; Jourquin et al. 2003), ischemia (Rosenberg et al. 1996; Planas et al. 2001; Rivera et al. 2002; Lee et al. 2004), agyi trauma (Wang et al. 2000; Planas et al. 2002) esetében. Az indukált MMP-9-nek a Gluerg excitotoxicitásban, az ischemia utáni sejtpusztulásban, és a szöveti struktúra masszív elváltozásában tulajdonítottak negatív szerepet. Ezekben a patológiás modellekben az MMP-9 indukcióját nem csak a neuronokban mutatták ki, hanem reaktív mikrogliákban és asztrogliákban is, de az nem derült ki egyértelműen, hogy a később elpusztuló vagy a sikeresen védekező sejtek szintetizálják-e. Ugyanezekben a paradigmákban egy tágabb értelemben vett összefüggés is feltételezhető magával a fokozott neuronális aktivitással, a dendritikus burjánzás („sprouting”) tehát egy diszkrétebb, funkcionálisan adaptív strukturális változás - és az MMP-9 indukció között (Szklarczyk et al. 2002). Tovább finomodott az MMP-k központi idegrendszeri funkcióinak megítélése, amikor ischemia modellekben kétfázisos indukciót tapasztaltak, és a késői MMP-növekedésnek a beavatkozást követő regeneráció elősegítésében tulajdonítottak szerepet. Ezzel összhangban, kémiailag-indukált demielinizációt követően, az MMP-9 indukció - indirekt módon, egy gátló NG2 proteoglikán degradációja révén - a lézió utáni remielinizációt segítette elő (Larsen et al. 2003). c) Fiziológiás plaszticitási folyamatokban. MMP-9 indukciót leírtak olyan idegrendszerspecifikus plaszticitási folyamatokban is, mint az alvás megvonás (Taishi et al. 2001), a térbeli memória kialakulása (Wright et al. 2003; Meighan et al. 2006), a hippocampus-függő asszociatív tanulás (Nagy et al. 2006) vagy az LTP (long-term potentiation) fenntartása (Bozdagi et al. 2007). Ez utóbbiban az MMP-9 proteolitikus aktivitását az NMDA receptor aktivációjához kötik és az MMP-9-nek a fiziológiás szinaptikus átrendeződésben és az integrin-mediált jelátvitelben tulajdonítanak szerepet (Bozdagi et al. 2007). Tehát, a zselatinázok központi idegrendszeri szerepéről folyamatosan árnyaltabb kép alakult ki, mely a kezdeti, masszív szöveti károsodással járó, kóros beavatkozásoktól a fiziológiáshoz közeli ingerekkel kiváltott szinaptikus plaszticitásig terjed. Felvetődik a kérdés, hogy fiziológiás úton történő ingerlés, pl. egy szenzoros rendszeré, képes-e indukálni és/vagy esetleg aktiválni az MMP-
16
9-et a központi idegrendszerben. Egy jól megválasztott modellben a fiziológiás szenzoros ingerrel kiváltott zselatináz aktivitás változásainak nyomonkövetése mellett, a funkcionális és morfológiai változásokat is monitorozhatjuk, és megfigyelhetjük összefüggéseiket az enzimaktivitással. 2.2.2. A retina, mint a központi idegrendszer modellje A gerincesek retinája a diencephalonból fejlődik ki, így sejtes elemei a központi idegrendszer részének tekinthetők. A retina a központi idegrendszer egy általánosan használt modellje, modellként való alkalmazásának a következő előnyei adódnak: •
extracranialis lokalizációja miatt könnyen hozzáférhető;
•
ismert morfológiai felépítése, korlátozott számú sejttípus pontosan leírt hálózatából áll;
•
az agyhoz hasonló funkcionális szerveződésű és
•
fiziológiás ingere a fény, melynek paraméterei kísérleti körülmények között könnyen változathatóak és reprodukálhatóak (Nowak 1998).
2.2.2.1. Zselatinázok szerepe a retinában és a szemben általában a) A retinában. A retinában, az MMP-9 konstitutív jelenlétét eddig csak a ganglion sejtek rétegében mutatták ki (Sivak et al. 2000), míg az MMP-2-t a ganglion sejtek, a látóideg eredésénél elhelyezkedő asztrogliák (Agapova et al. 2001), az érkörnyéki mikrogliák (Yuan & Neufeld 2001), valamint a pigmenthám sejtjei alapszinten egyaránt kiválasztják. A pigment epithel sejtjei preferenciáltan az apicalis felszínükön szekretálják az MMP-2-t, melynek a fény-adaptált retina interfotoreceptor mátrixában - mely egy atípusos extracelluláris mátrix - a mátrix turnover-ben, és esetleg a fotoreceptorok külső szegmensének fagocitózisra kerülő korongjainak leválásában tulajdonítanak szerepet (Padgett et al. 1997; Uehara et al. 1990). Az MMP-9 indukcióját is a ganglion-sejt rétegben mutatták ki, az agyhoz hasonló Gluerg excitotoxicitási modellekben, kainsav (Zhang et al. 2004), NMDA (Manabe et al. 2005), KCl (Mali et al. 2005) intravitrealis adagolását követően; ischemia-reperfúzió (Zhang et al. 2002), illetve a látóideg mechanikus megsértését (Zhang & Chintala 2004) követően. Mindezen modellekben az MMP-9 expresszió növekedésnek a ganglion sejtek pusztulásában tulajdonítottak szerepet. A retinát specifikusan érintő kóros folyamatokban is a megnövekedett MMP-9-nek káros hatásait írták le. Például, diabéteszes proliferatív vitreo-retinopáthia (Abu El-Asrar et al 1998; Salzmann et al. 2000) az MMP-9-et a morfológiai elváltozások kialakulásával (neovaszkularizáció, retinális leválás, exudátum képződés a vér-retina gát károsítása révén) hozták összefüggésbe, míg 17
glaucoma-modellekben a nyomás-növekedéssel korreláló MMP-9 növekedés, a ganglionsejtek apoptózisával és a laminin degradációval függött össze (Guo et al. 2005). A retina-specifikus folyamatok körében a fehér fény-expozíció - a fototranszdukciós kaszkádon túl bekövetkező - hatásai is érdeklődésre tarthatnak számot, főként az eddig nem tanulmányozott, de esetlegesen létrejövő, zselatináz-indukció és/vagy aktiváció szempontjából. b) A szemben. A szem struktúrái közül, nem csak a retinában mutatták ki a zselatinázok jelenlétét, hanem a szaruhártya, csarnokvíz, lencse (Wong et al. 2002) és üvegtestben egyaránt. Ezekben a struktúrákban létrejövő különböző szemészeti megbetegedésekben a megnövekedett (cornealis lézió és hegesedés folyamán; allergének vagy patogének által okozott gyulladásos folyamatokban; vagy éppen lecsökkent MMP-szinteknek (lencse oxidatív stressz után tulajdonítanak kóroki szerepet. Ennek ellenére, az MMP-9 sejtszintű eredetét ezen megbetegedések zömében nem sikerült egyértelműen kimutatni (Sivak & Fini 2002). A nézet, hogy az MMP-9 regeneratív folyamatokban is betölthet szerepet, a szem megbetegedései kapcsán is felmerült: bizonyított az MMP-9 közreműködése a cornealis sebgyógyulásban (Fini et al. 1992), de esetleges pozitív szerepe a retinális folyamatokban nem ismert. 2.2.2.2. A fehér-fény indukált fotoreceptor degenerációról Az élethosszig tartó természetes fény expozíciónak szerepet tulajdonítanak a krónikus szembetegségek kialakulásában (Roh et al. 1994; Young 1994). A napfény látható spektruma (400750 nm), ismételt expozíció esetében küszöb alatti retinális károsodást okozhat, melynek kumulatív hatását összefüggésbe hozták az időskorban kialakuló fotoreceptor degenerációval és irreverzibilis látáskárosodással (Young 1988; Taylor et al. 1992). A humán retinális disztrófiák és degenerációk, illetve az állatmodellekben a fény-indukált retina degenerációk hátterében közös mechanizmus, a fotoreceptor sejtek apoptózisa áll (Wenzel et al. 2005). Mivel a krónikus fény expozíció nehezen tanulmányozható állatkísérleti modellekben, a retinális degenerációig elvezető biokémiai és szövettani változások részleteit akut (fehér- vagy monokróm-) fény-expozíciós paradigmák alkalmazásával próbálták tisztázni. A retina fotoreceptor rétegében kialakuló károsodás, az alkalmazott akut fény-inger következő 3 paraméterétől függ elsősorban: a sugárzás intenzitása, az expozíció időtartama és a fény spektrális eloszlása (különböző hullámhosszúságú fény iránt különböző érzékenység tapasztalható) (van Norren 1991). Mivel a fluoreszcens fehér-fény emissziós spektruma a természetes nappali fényhez hasonló, ezért a túlzott napfény hatásainak tanulmányozására széles
18
körben alkalmazzák. A fotoreceptor sejtek kontrollált és reprodukálható körülmények között indukált apoptózisát célzó kísérletek, a mesterséges fényforrástól függően, különböző intenzitású (3.000 – 15.000 lux) és óráktól napokig terjedő időtartamú megvilágítási paradigmákat alkalmaznak (Wenzel et al. 2005; Gao 1996; Hafezi et al. 1997a,b; Lansel 1999; Wenzel et al. 2000). A károsodás mértékét befolyásoló külső tényezők közül nagy jelentősége van az előzetesen tapasztalt megvilágításnak, mind a korai posztnatális periódusban (Penn et al. 1987), mind az akut fény-expozíciót közvetlenül megelőző időszakban (prekondicionálás) (Li et al. 2003; Liu et al. 1998). A mérsékelt intenzitású (300-800 lux) fény hatására adaptációs folyamatok sokasága zajlik a retinában:
fokozott
posztnatális
fotoreceptor
„culling”,
rodopszin
és
antioxidánsok
mennyiségének, intracelluláris enzimek aktivitásának, membrán lipid-összetételének, neurotrofikus faktorok szintézisének és eloszlásának változásai (Stone et al. 1999, Penn et al. 1987; Penn & Anderson 1987; Liu et al. 1998; Walsh et al. 2001). Mindezek eredőjeként a közepesen erős korai megvilágításnak kitett retina fénymikroszkópos szerkezete ugyan nem tér el jelentősen a sötétben nevelt állatokétól (maximum 5-20 lux) (Stone et al. 1999), mégis részleges védelmet élvez egy későbbi akut fény-expozíció esetében, melyet a mérsékeltebb fotoreceptor apoptózis mutat. A fényinger hatásait befolyásolják továbbá napszaki tényezők, melyek feltételezhetően endogén retinális faktorok expressziós profiljának különbözőségeire vezethetők vissza (Organisciak et al. 2000), illetve tartós endogén sajátosságok, mint például a genetikai háttérrel összefüggő faj- és törzs-specificitás, szem-pigmentáció, az életkor, nem, hormonális állapot, stressz, étrend (LaVail et al. 1987) Mindezek ismeretében, foto-stresszként definiálhatunk minden olyan, az egyed által megszokott fény-expozíciótól eltérő, erős intenzitású és/vagy hosszan tartó megvilágítást, mely a szem különböző struktúráiban - de leginkább a retinában - az élettani folyamatoktól eltérő fotokémiai folyamatokat indít el, melyek funkcionális és/vagy morfológiai változásokat okozhatnak. A foto-stressz modellek lehetőséget nyújtanak nemcsak a fény-hatás és fotoreceptor apoptózis molekuláris részleteinek a tanulmányozására, hanem különböző vegyületek, például szisztémás antioxidánsok (Organisciak et al. 2000) vagy intravitreálisan injektált citokinek, növekedési faktorok, neurotrofinok (LaVail et al. 1992) neuroprotektív hatásainak a feltárására is. Mindezekből kitűnik, hogy a retinában a fehér fényinger paramétereinek változtatásával mechanikus szöveti károsodás nélkül indukálható és tanulmányozható a molekuláris szintű változások széles spektruma, az élettani adaptációtól a kiterjedt és szinkronizált fotoreceptor
19
apoptózisig (Noell et al. 1966; Malik et al. 1986; Young 1994). Tehát, a különböző intenzitású fehér-fénnyel történő vizuális ingerlés alkalmas a zselatinázok indukciójának a tanulmányozására a retinában. 2.2.2.3. A retina funkcionális működésének a monitorozásáról A retina funkcionális működését állatkísérleti modellekben az elektroretinogram (ERG) regisztrálásával követhetjük nyomon. Az ERG a retina egészének - egy ismert és reprodukálható felvillanó fényre adott - elektromos válasza, melyet egy nem-invazív módszer segítségével a cornealis felületről vezetünk el. Az a-hullám fotoreceptor eredete általánosan elfogadott, a bhullám, mint belső retinális válasz eredete részben vitatott, mert nem teljesen tisztázott, hogy milyen mértékben vesznek részt generálásában a poszt-fotoreceptoriális interneuronok, illetve a Müller glia, míg a ganglion sejtekről elfogadott, hogy kevéssé járulnak hozzá az ERG generálásához. Ismert, hogy a b-hullám amplitúdójának csökkenése ischemia alatt arányos a beavatkozás súlyosságával, illetve hogy a reperfúzió folyamán tapasztalt b-hullám visszatérés mértéke az ischemia időtartamával függ össze (Block & Schwartz 1998). Konstans fény által indukált retina degenerációs modellekben (24-48 óra expozíció, 1.000-3.000 lux, 7 napos túlélés) a b-hullám amplitúdója korrelál a retinális károsodás mértékével (Sugawara et al. 2000). Egy közelmúltban laboratóriumunkban kifejlesztett módszert alkalmazva, mellyel szabadon-mozgó patkányokból krónikusan regisztrálható az ERG (Galambos et al. 2000; Szabó-Salfay et al. 2001), lehetőség nyílt arra, hogy a retinában a zselatináz-indukciót párhuzamosan tanulmányozzuk a rövid- és hosszútávon bekövetkező funkcionális változásokkal. 2.3. Előzmények az epileptiform aktivitással összefüggő extracelluláris aminosav és nukleozid szint változások tanulmányozásához 2.3.1. Az epilepsziáról általában Emberben az epilepszia minden olyan idült, spontán visszatérő görcsrohamokkal jellemezhető megbetegedés, melyet jellegzetes elektroencefalográfiás eltérések (tüskék vagy éles hullámokat tartalmazó paroxizmális elváltozások), a mentalis status eltérései és/vagy neurológiai góctünetek kísérnek. Minden egyes roham hátterében, elektrofiziológiai szempontból, a neuronok egy csoportjának kóros szinkron kisülése áll. Epilepsziás rohamokat veleszületett rendellenességek, perinatalis károsodások, metabolikus zavarok, traumák, tumorok, vascularis, degeneratív vagy
20
fertőző betegségek is okozhatnak (szimptomás epilepszia), de az esetek egy jelentős részében nem derül fény specifikus okra (idiopátiás vagy konstitucionális epilepszia) (Mumenthaler 1989). Mivel az epilepszia az életminőséget jelentősen befolyásoló gyakori megbetegedés, mely kórokilag és klinikai jellemzői alapján egy rendkívül heterogén szindróma, a rohamszerű aktivitás tanulmányozására kísérleti állatmodellek sokaságát fejlesztették ki az idők folyamán (genetikailag epilepsziára hajlamos fajok vagy törzsek, elektromos ingerléssel vagy kémiailag-indukált rohamok) (Fisher 1989). Azonban, minden egyes modell, nem az epilepsziás megbetegedés, hanem annak bizonyos típusának a tanulmányozására alkalmas, de ezek a modellek lehetővé teszik új gyógyszeres kezelések kifejlesztését és a patomechanizmus pontosabb megértését (Smolders & Michotte 2007). A központi idegrendszer normális működésének alapfeltétele a neuronális hálózatokban zajló serkentő és gátló folyamatok kiegyensúlyozottsága. Valószínű, hogy az epilepsziás rohamok hátterében ennek az egyensúlynak a felborulása áll, a serkentő folyamatok javára (Mody et al. 1992; Bradford 1995). A kémiailag-indukált „epilepsziás” állatkísérleti modellek körében a rohamok kiváltásának két általánosan alkalmazott módja a glutaminsav-függő (Gluerg) serkentés fokozása vagy a GABAerg gátlás gátlása (pl. a kompetitív GABAA antagonista bicuculline, vagy a GABAA klorid csatornablokkoló Picrotoxin hatására), de gyakorlatilag minden transzmitter rendszer és minden szöveti kompartment érintett. Ma már az is tudott, hogy nem csak a GABAerg rendszer ellensúlyozza a Gluerg fokozott aktivitást epilepsziás roham idején, hanem a tónikus adenozin gátlásnak is szerepe van (Chin 1989). Nukleozidok
excitatorikus
folyamatok
hatására
is
felszabadulásuk különbözik a „klasszikus” transzmitterekétől.
felszabadulnak,
azonban
a
A nem-specifikus nukleozid
transzporterek (Baldwin et al. 1999) szállítási iránya tartós depolarozációban megfordul („reversal potential”) és a citoszolban levő nukleozidok (adenozin, uridin, guanozin) illetve az adenozin intracelluláris metabolitjai (inozin, hipoxantin, xantin) kiürülnek a sejtekből. Bár a nukleozidok általában inhibitoros modulátorként hatnak, ismert, hogy az adenozin receptor-függően citoprotektíven is (de Mendonca & Ribeiro 1993) és citotoxikusan is lehet (Abbrachio et al. 1995). 2.3.2. A Lindán mint neurotoxikus környezeti rizikófaktor A 70-es évek elején figyeltek fel a klórozott szénhidrogén származékok, köztük a rovarirtóként használt Lindán (γ-hexaklórciklohexán) jelenlétére a környezetben. Annak ellenére, hogy humán gyógyászatban mai napig elterjedten használt 1%-os krémként vagy oldatként a scabies (rüh),
21
illetve pediculosis (tetvesség) kezelésére, már a 80-as években felmerült a központi idegrendszeri toxicitásának kérdése (Kramer et al. 1980). A kezelési tévedés vagy véletlen lenyelés esetén előforduló Lindán mérgezésektől eltekintve (Davies et al. 1983) a környezeti (akut vagy krónikus) expozíció toxikus túlsúlya bizonyított (Kramer et al. 1980) ezért több országban használatát rovarirtószerként betiltották. Ennek ellenére, környezeti kockázati tényező napjainkban is, hiszen stabil, zsíroldékony tulajdonságai potenciális feldúsulását eredményezhetik az élelem-láncban. A megengedett határérték alatti koncentrációkat mutattak ki például tisztított ivóvízben (India, Thacker et al. 2007), a tengervízben, üledékben és kagylókban (Törökország, Ozkoc et al. 2007) és általánosan elterjedten állati illetve emberi eredetű szövetekben (Spanyolország, korosztályfüggően a Lindán plazmaszintek korrelációt mutatnak az alanyok állati-eredetű étrendjével, Rivas et al. 2007). A Lindán lenyelve, belélegezve vagy akár épp bőrön át felszívódva is okozhat mérgezést. Központi idegrendszeri izgatóként, emberben a mérgezés tünetei a fokozott idegingerlékenység, izomrángások (myoclonus), görcsrohamok és kóma. Rágcsálókban a tünetek következő egymásutánisága jellemző: testhőmérséklet csökkenés, görcsök (izomrángásoktól a generalizált clonus-ig terjedően), és krónikus adagolás esetén étvágycsökkenés. A Lindán főként a limbikus rendszer struktúráiban okoz jelölt-glükózzal kimutatható aktivitás fokozódást (Camón et al. 1988). Két ismert nem-kompetitív GABA antagonista (Pentylenetetrazol (Metrazol) és Picrotoxin) szignifikánsan csökkentették a Lindán görcskeltő küszöbét (Sunol et al. 1989) és mindhárom vegyület hasonló mintázatú központi idegrendszeri cfos expressziót indukált (Vendrell et al. 1992), ezért a Lindán hatásmechanizmusaként megalapozottnak tűnik a GABAerg antagonizmus feltételezése. 2.3.3. Az in vivo mikrodialízisről általában A mikrodialízis a szövetek extracelluláris terének összetételének tanulmányozására nyújt in vivo lehetőséget, kihasználva az extracelluláris térben oldott fázisban levő molekulák diffúzióval történő mozgását a koncentráció-grádiensük irányában egy féligáteresztő membránon keresztül a mintavevőben folyamatosan áramoltatott perfuzátum felé. Ugyanezen az elven alapszik a reverz mikrodialízis, mikor a perfuzátum tartalmazza azt az anyagot, melyet a vér-agy gát megkerülésével szeretnénk egy adott agyterület extracelluláris terébe juttatni és a farmakon hatására az endogén vegyületek koncentrációjában bekövetkező változásokat monitorozni (Urenjak & Obrenovitch
22
2007). Ennek a farmakon-adagolási módnak előnye, hogy a szövetközti térben jelentős nyomásilletve térfogat-változást nem okoz. Mivel a vegyületek mozgása a szövet és a perfuzátum között nem-egyensúlyi körülmények között történik, tehát nem alkalmazhatók a híg vizes oldatban érvényes törvényszerűségek, a diffúziós folyamat a visszanyeréssel („recovery”) jellemezhető, mely az adott vegyület a dializátummintában illetve a mintavevőt körülvevő mikrokörnyezetben levő koncentrációinak hányadosa (Elmquist & Sawchuk 1997; Ungerstedt 1991). Az endogén vegyületek mérése esetén, a mintavevőbe bediffundáló vegyület extracelluláris koncentrációjához viszonyított relatív mennyiségének pontos meghatározása nem szükséges, mert az alapállapothoz képest a dializátumban bekövetkező relatív koncentráció-változások mérése is informatív. Az akut kísérletek esetében, mikor a mintavételezés röviddel a mikrodialízis mintavevő műtéti beültetése után történik, nem kell számolni a reaktív gliózis és általa okozott extracelluláris térbeli diffúzió változásaival, viszont a szöveti trauma és az alkalmazott altatók befolyásolhatják az extracelluláris tér összetételét, az endogén anyagok lokális koncentrációját (Planas et al. 2002).
23
3. CÉLKITŰZÉSEK Kiindulva abból, hogy a központi idegrendszerben a mátrix metalloproteinázok, de főként a zselatináz MMP-9, indukcióját erős ingerekre bekövetkező sejtpusztulással kísért szöveti átrendeződésekben bizonyították, valamint hogy hosszan tartó erős fehér fény hatására kiterjedt fotoreceptor degeneráció következhet be a retinában, első kísérleti modellünkben a következő kérdésekre kerestünk választ: 1. A fehér fény - mint természetes szenzoros inger - képes-e zselatináz indukciót kiváltani a retinában? 2. Ha igen, a zselatináz indukció mértéke függ-e az inger intenzitásától? 3. Kimutatható-e összefüggés a zselatináz indukció és irreverzibilis funkcióvesztés vagy kiterjedt sejtpusztulás között? 4. A zselatinázok gátlásával befolyásolható-e az erős fehér fény expozíciót követő funkcionális működés? 5. A fehér fénnyel összefüggésben kimutatható-e zselatináz szint változás a retinán kívül, a szem más struktúráiban? A második kísérleti modellünkben, egy környezeti felhalmozódási potenciállal rendelkező klórozott szénhidrogén származék (Lindán, γ-hexaklórciklohexán) központi idegrendszeri hatásaival kapcsolatban a következő kísérleti célokat tűztük ki: 1. Referenciaként, egy ismerten GABAA klorid csatorna blokkoló vegyület (Picrotoxin) által kiváltott epileptiform aktivitás folyamán in vivo - az excitatorikus aminosavak (glutaminsav, aszparaginsav),
valamint
nukleozidok
és
metabolitjaik
extracelluláris
szintjében
bekövetkező - változások jellemzése. 2. A Lindán ismerten görcskeltő hatásait karakterizálni a Picrotoxin indukált rohamok elektrofiziológiai és neurokémiai jellemzéséhez hasonló módon, annak érdekében, hogy az így leírt változások összehasonlításából választ találjunk arra a kérdésre, hogy a Lindán központi idegrendszeri hatásai magyarázhatóak-e kizárólagosan a GABAA receptor gátlásával.
24
4. MÓDSZEREK 4.1. Kísérleti állatok, vegyszerek A fehér fény hatását célzó kísérleteket 350-400 g hím Sprague-Dawley patkányokon (Charles River Laboratories, Budapest, Magyarország) végeztük, míg a kémiailag-indukált epilepszia kísérletekhez 200-400 g hím Wistar patkányokat (Toxicoop, Budapest, Magyarország) használtunk. Az állatok szabadon hozzáfértek szabványos patkánytáphoz és vízhez. A foto-stressz kísérletekben használt patkányok 12 órás 500 lux fehér fény - 12 órás sötét ciklusban nevelkedtek. Kísérleteink során az Európai Közösségek Tanácsa 86/609/EEC direktívában, illetve az 1998. évi XXVIII törvényben (az állatok védelméről és kíméletéről), a 243/1998 kormányrendeletben (az állatkísérletek végzéséről) és az egyetemi állatvédelmi előírásokban foglaltak szerint jártunk el. Mindent elkövettünk az állatok szenvedésének és a kísérletekben felhasznált számuk csökkentésének érdekében. A használt standard laboratóriumi vegyszerek, az esetenként jelzett kivételektől eltekintve, a Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) termékei voltak. 4.2. Fehér fény-expozíciós kísérletek 4.2.1. Fehér fény-expozíciós paradigmák 4.2.1.1. Foto-stressz modell (fehér fény, 3 óra, 5.500 lux) Egész éjszakai sötétadaptációt követően (kevesebb, mint 0,17 lux), a patkányokat intramuscularis (im.) Ketamin (80 mg/kg, Novartis, Budapest, Magyarország) - Xilazin (8 mg/kg, 2% Primazin, Alfasan, Woerden, Hollandia) eleggyel altattuk. Sztereotaxikus (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) készülékbe helyezésük után, 1-1 csepp 2,5%-os Fenilefrin hidrokloriddal (SCHEIN Pharmaceutical Inc., Florham, NJ, USA) kétoldali pupillatágulatot indukáltunk. A szaruhártyák kiszáradásának megelőzésére, szükség szerint ismételt steril 0,9%-os NaCl oldatot csepegtettünk a szemfelületre. Mindkét szemet 5.500 lux fehér fénynek tettük ki 3 órán keresztül, melyet a szaruhártyák felületétől 1 mm-re helyezett 1-1 fénykibocsátó dióda (LED, XWA-L50 ACA-B4, 5 mm külső átmérő, 6.000 mcd, Lite-On, Taipei, Taiwan) biztosított. A LED-ek által kibocsátott fény spektruma 400 nm és 650 nm közötti tartományba esett, két emissziós-maximummal 440 illetve 525 nm-nél, tehát a kísérletek folyamán kizárható az ultraibolya (UV) expozíció (3. ábra).
25
A.U.
440 nm
525 nm
200
300
400
500
600
700
800
(nm )
3. ábra A foto-stressz kísérletekben használt fénykibocsátó diódák mért emissziós spektruma. A diódák felületi hőmérséklete nem haladta meg a 38˚C-ot a kísérletek folyamán, így az addicionális kalorikus hatás a szem struktúráira is kizártnak tekinthető. A kísérleti fényhatásnak kitett állatok az egyéni túlélés időtartamára sötétben voltak. A szemek egészben lettek kipreparálva (enucleatio) mély altatásban a 3 órás foto-stressz végén (0 óra) illetve 3, 6, 12 óra elteltével, valamint 1, 2, 3, 7 és 10 nappal az 5.500 lux fehér fény expozíciót követően. 4.2.1.2. Xilazin hatása a foto-stressz modellben A Xilazin esetleges hatásának kimutatása érdekében kontroll vizsgálatokat végeztünk. Egész éjszakai sötét-adaptációt követően a Ketamin-Xilazin eleggyel altatott, foto-stressznek kitett csoport patkányait a következő kontroll állatokkal vetettük össze: (i) további 9 órát sötétadaptált állatok, melyek altatásban nem részesültek; (ii) Ketamin-Xilazin altatást követően további 9 óráig sötétadaptált csoport; valamint (iii) éjszakai sötétadaptáció után foto-stressznek kitett állatok, melyek kizárólag Ketamin altatást kaptak. Mindhárom kontroll kísérletet két-két állaton végeztük el. Szem-mintákat 6 órával a foto-stressz végét követően, illetve a fény-hatásnak ki nem tett csoportokban 9 órával a kísérlet kezdete után gyűjtöttünk, és zselatin zimográfiára készítettünk elő. 26
4.2.1.3. MMP-inhibitor hatása a foto-stressz modellben A zselatinázok gátlására a széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001-et alkalmaztuk (1 mg/ml, Ilomastat, Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA), mely ismerten gátolja, csökkenő affinitással, a következő metalloproteinázokat: MMP-8, -9, -1, -2, -3 (Galardy et al. 1994). Három altatott patkányban, 30 perccel a foto-stressz kezdete előtt, unilaterálisan 75 µl GM6001 retrobulbaris injektálása történt. Mivel a gyártó a GM6001-et 1 mg/ml dimetil szulfoxid (DMSO) oldatként forgalmazta, az ellenoldali szemben, kontrollként 75 µl DMSO-t injektáltunk retrobulbarisan a GM6001-gyel egyidejűleg. Az oldatokat lassú injektálással jutattuk a retrobulbaris térbe. 4.2.1.4. Nappali fény (500 lux) adaptáció A fény-adaptációs kísérletekben zselatin zimográfiával 3 kísérleti csoportból származó retinamintákat hasonlítottunk össze (n=4/csoport). Ezek a következők voltak: (i) 12 óra fény (500 lux) – 12 óra sötét váltakozásának kitett csoport (nevelkedés ideje alatt alkalmazott, szokásos állatházi fény viszonyok); (ii) 11 napig sötét-adaptált csoport; illetve (iii) 10 nap sötét-adaptációt követően, egy 12 órás 500 lux fehér fény expozíciónak kitett csoport. A fény-adaptációnak kitett állatokban, a szem enucleatio-ja egy 12 órás sötétben eltöltött periódus végén történt. 4.2.2. Elektroretinográfia (ERG) A szabadon-mozgó patkányokban alkalmazható ERG-regisztráláshoz szükséges elektródok és LED-ek beültetését 1 % Halothan-levegő altatásban végeztük. Unilaterálisan (csak foto-stressz hatásnak kitett csoport) vagy bilaterálisan (GM6001-gyel előkezelt csoport) egy szaruhártyaelektródot, valamint egy retrobulbaris piros-fényt kibocsátó stimuláló-LED-et építettünk be. A szaruhártya-elektród egy legyezőszerűen szétbontott többeres nem-pirogén, teflon borítású rozsdamentes acél drótból állt (Medwire 7SST1, Sigmund Cohn Corp., Mount Vernon, NY, USA), melyet a cornea felületére fektettünk a felső szemhéj alá. A retrobulbaris stimuláló piros-fényű LED-et (5 mm külső átmérő, áttetsző testű, 3.000 lux/mm2, Bright LED Electronics, Hong Kong) a koponyacsonthoz erősítettük fogászati cementtel úgy, hogy a fénynyaláb a szem posterior pólusa felé volt orientálva. Ez a LED-orientáció teszi lehetővé, hogy állandó intenzitású fényvillanásokkal
27
ingereljük a retinát úgy, hogy a fotoreceptor sejteket elérő fotonok száma független legyen a fej, illetve a szemhéjak helyzetétől, valamint a pupilla átmérőjétől. A referencia elektród egy 4 x 8 mm, egyik oldalán szigetelt, rozsdamentes acél lapocska, melyet a baloldali rágóizom fölé ültettünk be a bőr alá. Az elektródok és a stimuláló-LED elektromos csatlakozásai a koponyatetőhöz fogászati cementtel rögzített nyomtatott áramkör típusú minicsatlakozó darabon keresztül valósultak meg, melyhez az ERG-regisztrálások idejére az EEG-készüléket és az ingerlőt is átmenetileg csatlakoztattuk. A cementezésekhez olyan magas impedanciájú, nem-porózus dentakrilát cementet használtunk (IVOCLAR CE0047 No. 3, Svájc), amely csillapítja a LED magas bemeneti áramát és csökkenti az ingerlési műterméket. Hét napos felépülést követően, 5 patkány foto-stressz hatásnak lett kitéve, míg 3 patkány retrobulbaris kezelést kapott 30 perccel a foto-stressz kezdete előtt, mely egyoldali GM6001 illetve ellenoldali kontroll (DMSO) injektálásából állt. Az ERG kiváltására 1 ms villanásokat alkalmaztunk, melyeket egy digitálisan vezérelt ingerlő szabályozott (Biostim, Supertech, Pécs, Magyarország). Az ingerek közötti intervallum 10 s volt, mely a retina funkcionális visszatérését lehetővé tette. A kiváltott válaszokat egy Grass B8 EEG-készülékkel regisztráltuk (Grass Technologies, West Warwick, RI, USA) az 1 Hz - 10 kHz sávban, 10.000-szeres erősítéssel. Az adatokat digitálisan tároltuk egy CED 1401 digitális adatrögzítő rendszerrel (Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge, UK), 500 Hz mintavételezési frekvenciát és 1.000 ms regisztrálási időt alkalmazva. Signal 1.906 software (Cambridge Electronic Design) segítségével a foto-stressz időtartama alatt altatott állatokból, illetve ezt követően szabadonmozgó, sötét-adaptált állatokból regisztrált ERG-ket átlagoltuk (70 regisztrátum/átlag) és 40 pontos FFT (Fast Fourier Transform) „simítást” alkalmaztunk. A GM6001-előkezelt patkányokból, a foto-stresszt követő 20 perces sötét-adaptáció végeztével az ERG-regisztrálása folyamatosan történt mindkét szemből 330 percen keresztül, és a regisztrátumok 10 percenként kerültek átlagolásra. Az ERG b-hullám mérése csúcstól-csúcsig történt (4. ábra).
28
b-hullám b-hullám amplitúdó
100 µV 50 ms
a-hullám c-hullám
4. ábra Elektroretinogram részlet, mely példázza a b-hullám amplitúdójának mérését.
4.2.3. Retina morfológia Az irodalomból ismert volt, hogy a fehér fény hatására a fotoreceptorok szinkronizált apoptózisa következhet be, mely a retina külső magvas rétegének (outer nuclear layer (ONL)) kiterjedt degenerációjához vezethet és ez a nagymértékű morfológiai elváltozás fénymikroszkóppal, kvalitatív módon könnyen ellenőrizhető a retinából készült metszeteken. Ezért, kísérleteinkben a szemeket - Ketamin-Xilazin altatásban történt enucleatio-jukat követően -, Tissue-Tek OCT-be (Sakura Finetek Co., Tokió, Japán) ágyaztuk be, majd folyékony nitrogénben lefagyasztva -70˚C-on tároltuk. A sagittalis 10 µm vastagságú kriosztát metszeteket hematoxilin-eozinnal festettük. A 10 napig sötét-adaptált kontroll retinákat foto-stressz hatásnak kitett, majd 10 napig sötétben túlélt állatok retinájával hasonlítottuk össze (n=4/csoport). A metszetek kvalitatív értékeléséhez Olympus BX51 mikroszkópot (Olympus, Budapest, Magyarország) használtunk, és a képeket Analysis Pro 3.2 software segítségével tároltuk (Soft Imaging System GmbH, Münster, Németország). Patkányonként mindkét retinából két sagittalis metszet külső magvas rétegét értékeltük a látóideg eredésének síkjában. A sejtmagok számát egy 150 µm x 80 µm területen számláltuk, a retinák egymásnak megfelelő részein, 60-szoros nagyításban.
29
4.2.4. TUNEL-festés (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated tetramethylrhodamine (TMR)-dUTP nick endlabeling, Terminális dezoxinukleotidil transzferáz-mediált tetrametilrodamin-dUTP „nick” végjelölés) A TUNEL-módszer az apoptózis gyors kimutatásának módja, mely felismeri a DNS láncban keletkezett biokémiailag jellegzetes töréseket. Az apoptózis folyamatában a genomiális DNS fragmentációja az endogén DNázok hatására jön létre, melyek az internukleoszómális régiókban hasítva, kettős-láncú, 180-200 bázis-pár (bp) vagy annak oligomer-jei méretű, DNS fragmenseket eredményez. Kísérleteinkben az in situ DNS fragmentáció kimutatását TUNEL-festéssel retina metszeteken alkalmaztuk, a következő 2 kísérleti csoportot hasonlítva össze (n=4/csoport): (i) foto-stressznek kitett állatok, 20 órás sötétben töltött túlélést követően, (ii) kontroll csoport, mely altatás után 23 órát töltött sötétben. A szemeket, enucleatio-jukat követően, éjszakán át fixáltuk 3,7% formaldehidet tartalmazó, pH 7,6-os foszfát pufferben 4°C-on, majd paraffinba ágyaztuk. Húsz µm-es sagittalis metszeteket készítettünk. A sötét-adaptált kontroll retina metszetekből, 20 U/ml DNáz I-kezelést alkalmaztunk pozitív-TUNEL festés-kontrollként. A TUNEL festéshez „TMR Red In Situ Cell Death Detection Kit”-et (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország) használtunk a gyártó által megadott protokoll szerint. A totál DNS-t Sytox Green-nel (Invitrogen Ltd., Paisley, UK) festettük meg minden metszetben. A metszetekről Olympus IX81 konfokális mikroszkóppal készítettünk képeket, a párhuzamos mintáknál azonos beállítási paramétereket alkalmazva. A képek mentése Fluoview 500 software (Olympus) segítségével történt, mellyel 10 darab 1 µm-es optikai metszet/ábra összegzésére is sor került. 4.2.5. Szem-struktúrák disszekciója A foto-stresszt követően, az egyéni túlélési periódus idejére, a patkányokat sötétben tartottuk. A szemek enucleatio-jára Ketamin-Xilazin altatásban került sor, majd a szemgolyót jégen disszektáltuk. Szaruhártya (cornea), üvegtest (vitreus), ideghártya (retina) és ínhártya (sclera) mintákat kaptunk. A „sclera” minták - az ínhártyán kívül - a retinális pigmenthámot és az érhártyát (chorioidea) is tartalmazták.
30
Zselatin zimográfiára a mintákat azonnal homogenizáltuk 20 µl/mg nedves szövet arányban 10 mM CaCl2, 0,25% (v/v) Triton X-100 oldatban, míg totál-RNS izoláció céljára, a mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk és további felhasználásig -70˚C-on tároltuk. 4.2.6. Totál-RNS izolálása és RT-PCR kísérletek A fényhatásra esetleg létrejövő megnövekedett MMP-2 illetve MMP-9 génkifejeződést az mRNSről készített cDNS segítségével követtük nyomon. Az indukció kimutatására a szöveti mintákban jelenlevő totál-RNS izolálása után, az mRNS-ekről reverz transzkripció (RT) útján cDNS-t készítettünk, melynek a zselatinázokra jellemző szekvenciáit specifikus primerekkel hibridizáltuk és polimeráz láncreakcióval (PCR) felszaporítottuk. A totál-RNS izolálásához Tri Reagenst (Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, USA) használtunk, a gyártó protokolljának megfelelően (1995). A minták tisztaságát (A260/A280 érték 1.6 és 1.9 között) és a totál-RNS koncentrációt spektrofotométerrel (Lambda3, Perkin-Elmer Inc., Waltham, MA, USA) határoztuk meg 260 nm-en való elnyelésük (A260) alapján. Az izolált totál-RNS-t -70˚C-on tároltuk felhasználásig. A reverz transzkripcióhoz 3 µg totál-RNS templátot használtunk random hexamer primerekkel a RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas Inc., Hanover, MD, USA) protokolljának megfelelően. Az így előállított cDNS-ből 3 µl-t amplifikáltunk polimeráz láncreakcióval, 40 ciklust és optimalizált hőmérsékleteket alkalmazva (52˚C MMP-2-nek; 54˚C MMP-9-nek és β-aktinnak). A forward- (F) illetve reverz-primerek (R) a következők voltak (szintetizálás: Genodia, Budapest, Magyarország): MMP-2:
5’-CTA TTC TGT CAG CAC TTT GG-3’ (F) 5’-CAG ACT TTG GTT CTC CAA CTT-3’ (R)
MMP-9:
5’-AAA TGT GGG TGT ACA CAG GC-3’ (F) 5’-TTC ACC CGG TTG TGG AAA CT-3’ (R)
A mintában levő totál-RNS mennyiség („loading”) kontrolljaként az MMP-2-vel és MMP-9-vel párhuzamosan β-aktint is amplifikáltunk a PCR reakcióban, a következő primer-párt használva: 5’-TCC TTC CTG GGT ATG GAA TC-3’ (F) 5’-ACT CAT CGT ACT CCT GCT TG-3’ (R) Az amplifikált termékek mérete 300, 309 illetve 309 bp volt. Öt µl (MMP-2, MMP-9) és 3 µl (βaktin) amplifikációs terméket futtatunk meg Tris borát-EDTA pufferben 2% agaróz gélen, melyhez 0,01% (v/v) etídium bromidot adtunk. A gélekről UV-megvilágításban digitális képeket a GelDoc1000 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) dokumentációs software-rel 31
készítettük és a csíkokat UviSoft Gel Analysis v.10.02 software-rel (Uvitec Ltd., Cambridge, UK) denzitometráltuk. Első lépésben az MMP-9 mRNS-indukció időbeli profilját állapítottuk meg a különböző szem-struktúrákban. Az adatokat a maximális MMP-9 indukció periódusában átlagoltuk: retina (0-24 óra), üvegtest (24-72 óra), sclera (12-72 óra) és cornea (6-72 óra). Az MMP2 mRNS értékeket ugyanezen időintervallumokban átlagoltuk. 4.2.7. Zselatin zimográfia A zselatin zimográfia során a protein-elegyből elektroforetikusan elválasztott zselatinbontó enzimek a poliakrilamid gélbe kopolimerizált zselatint elbontják, így jelenlétük átlátszó csíkokként mutatható ki Coomassie-festéssel a kékkel megfestett háttéren. Jellemzően, nem csak az in vivo aktív enzimek (monomer, homo- illetve heterodimer formái), hanem a zimogének és az előzőleg TIMP-pel komplexált formák is kifejtenek zselatint-emésztő aktivitást (Woessner 1995). A különböző formák molekulatömegük alapján különböztethetőek meg. Kísérleteinkhez a szem különböző struktúráiból készítettünk szöveti homogenizátumot Weeks és mtsai. (1976) illetve Szklarczyk és mtsai. (2002) módszerét követve. A szöveti mintákat tehát 10 mM CaCl2, 0,25% (v/v) Triton X-100 oldatban homogenizáltuk, 20 µl/mg nedves szövet arányban, majd 20 perces centrifugálást (6.000g, 4˚C) követően a felülúszót és a csapadékot elválasztottuk és külön-külön kezeltük tovább. A homogenizálást követően a felülúszó az intracelluláris és sejtmembránhoz kötött MMP-ket, míg a csapadék az extracelluláris mátrix makromolekulákat és a hozzájuk kötött MMP-ket tartalmazza (Weeks et al. 1976; Szklarczyk et al. 2002). A felülúszóból - Triton X-100 szolúbilis frakció – a fehérjéket hideg etanollal csaptuk ki (60% végkoncentráció, 5 perc jégen). Újabb centrifugálást követően (15.000g, 5 perc, 4˚C) a felülúszót leöntöttük és a csapadékot nem-redukáló SDS pufferben vettük fel (125 mM Tris-HCl, pH 6,5; 2% (m/v) nátrium dodecil-szulfát (SDS), 20% (v/v) glicerin; 0,01% (m/v) brómfenol kék), 5,3 µl/mg kezdeti nedves sejttömeg arányban és 15 percig 37˚C-on inkubáltuk, ismételt keverés mellett (vortex). A kezdeti centrifugálást követően kialakult csapadékot - a Triton X-100 inszolúbilis frakciót - mely az extracelluláris mátrixhoz kötött MMP-ket tartalmazta, 50 mM Tris-HCl pH 7,4 és 0,1 M CaCl2 tartalmú pufferben felszuszpendáltuk 20 µl/mg kezdeti nedves sejttömeg arányban és 15 percig 60˚C-on inkubáltuk, mivel a hőkezelés során a kollagén rostok konformációt váltanak és a hozzájuk nem-kovalensen kötött molekulák disszociálnak (Weeks et al. 1976). A 20 percnyi
32
4˚C-on történő 10.000g centrifugálást követően kapott felülúszót kvantitatív módon eltávolítottuk és a Triton X-100 szolúbilis frakciónál ismertetett lépéseket követőn végül 2,7 µl/mg kezdeti nedves sejttömeg arányban vettük fel nem-redukáló SDS pufferbe. A minták fehérje tartalmát „Bicinchoninic Acid Protein Assay Kit”-tel határoztuk meg. Egyenlő fehérje-tartalmú mintákat (struktúránként különböző, 5-60 µg/15 µl/zseb) illetve előfestett molekuláris tömeg standard-eket (MBI Fermentas Inc., Hanover, MD, USA) párhuzamosan választottunk el SDS-poliakrilamid gél-elektroforézis módszerrel. A 7,5% poliakrilamid gélekben 0,1% fluoreszcens izotiocianáttal (FITC)-jelölt zselatint kopolimerizáltunk. A FITC-jelölt zselatin alkalmazásával a proteolitikus aktivitás ismételt monitorozása ultraibolya fényben lehetővé teszi a zimogram optimális ideig tartó előhívását, valamint nagyobb érzékenységgel mutatható ki a zselatint emésztő aktivitás az általánosabban használt Coomassiefestett gélekhez viszonyítva. A Coomassie-festéssel ellentétben, a fluoreszcens-zimogramokban a zselatin bontását ultraibolya fényben sötét csíkokként lehet detektálni világos, fluoreszcens háttér ellenében (Hattori et al. 2002). Az elektroforetikus elválasztást követően, a géleket kétszer 15 percig mostuk 100 ml 2,5% (m/v) Triton X-100-tartalmú oldatban, a maradék SDS eltávolítása céljából. Ezt követően, a géleket 16-48 órán át inkubáltuk 37˚C-on 100 ml aktivitás-pufferben: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM CaCl2; 1 µM ZnCl2; 1% (v/v) Triton X-100; 0,02% (m/v) NaN3. A gélben renaturált MMP-k aktivitását GelDoc1000 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) dokumentációs rendszerrel detektáltuk ultraibolya fényben. A denzitometrálás UVISoft (UVItec Ltd., Cambridge, UK) illetve GelDoc software-ekkel történt. A zselatint-bontó csíkok mátrix metalloproteináz jellegét bizonyítandó, a kiterjedt MMPaktivitást mutató egyik mintából újabb gélt futtattunk úgy, hogy párhuzamos zsebekben ugyanazt a mintát választottuk ismételten el. Az így kapott gélt zsebenként oszlopokra vágtuk és minden géloszlopot más-más proteáz-gátlóval kiegészített aktivitás-pufferben inkubáltunk 48 órán át 37˚C-on. Eredményeink alapján a zselatin emésztést nem befolyásolták a következő inhibitorok: 2 mM fenilmetánszulfonil fluorid (PMSF) (általános szerin-proteáz inhibitor); 2,5 µg/ml aprotinin (általános szerin-proteáz és észteráz inhibitor); 1 mM leupeptin (cisztein-proteáz és tripszin-szerű proteáz inhibitor); vagy 1 µg/ml pepstatin (általános aszpartil-proteáz inhibitor). A 0,5 mM 1,10-Fenantrolin illetve a 10 mM EDTA adalékkal történő inkubálás a zselatintemésztő aktivitás gátlását okozta, bizonyítva a detektált enzimek Ca2+- illetve Zn2+-függését és így, metalloproteináz voltát.
33
4.2.8. MMP-2 és MMP-9 Western blot detektálása A Western blot analízishez, a mintákat 10% (v/v) β-merkaptoetanol tartalmú SDS-pufferben vettük fel. Az elválasztott fehérjéket elektroforetikusan nitrocellulóz-membránra blottoltuk (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). A membránokat 1 órán keresztül szobahőmérsékleten (23˚C) blokkoltuk 5% (m/v) nem-zsíros tejpor tartalmú Trissel pufferolt, Tweent tartalmazó sóoldatban (Tris Buffered Saline-Tween, TBST: 20 mM Tris-HCl pH 7,6; 132,5 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween-20). Ezt követően egész éjszakán át (16 órás) inkubáltuk 4˚C-on, MMP-2 vagy MMP-9 ellen termelt tisztított nyúl antitestekkel (TP-220, TP-221 Torrey Pines Biolabs Inc., Houston, TX, USA) 1:2.000 hígításban, TBST-ben. Ezután torma peroxidázzal konjugált poliklonális kecske anti-nyúl antitesttel (Dako Cytomation, Kopenhága, Glostrup, Dánia) 1:2000 hígításban blokkoló oldatban inkubáltuk 1 órát 23˚C-on (szobahőmérsékleten). Az MMP-k kimutatására kemilumineszcens szubsztrátot (Supersignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL, USA) és Röntgen-filmeket alkalmaztunk. Minden inkubálási lépés között a membránokat bőven mostuk TBST-vel. 4.2.9. Adatelemzés. Statisztika. Az elektrofiziológia és denzitometria adatok kiértékeléséhez és a grafikai ábrázolásokhoz Origin 7.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) software-t használtunk. A különböző csoportokban bekövetkezett változások összehasonlítására a független Student-féle t-próbát alkalmaztuk. A hisztológiai eredmények statisztikai analíziséhez a Statistica v.5 (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA) software nem-parametrikus Mann-Whitney U-próbáját használtuk p<0,05 szignifikancia szinten. Az ERG b-hullám amplitúdójának a visszatérési sebességét („recovery rate”) analízise a kontroll- illetve GM6001-előkezelt csoportokban a b-hullám amplitúdó : visszatérési idő függvény első és második deriváltjára alapult, a következő módon. Először, a visszatérés időfüggésére egy másodfokú
polinomiálist
illesztettünk
(visszatérési
görbék)
a
visszatérési
sebesség
meghatározásának az érdekében. Ezt követően, magát a visszatérés sebességét jellemeztük a visszatérési görbék első deriváltjával, mely egy lineáris függvénye a visszatérési időnek, és ezért, két paramétere (a meredekség és az ordináta tengely metszete) alkalmazható az MMP-inhibitor
34
hatásainak mérésére és a kontrollhoz való viszonyítására. A polinomiális illesztést és a meredekség analízist Matlab (The MathWorks Inc., Natick, MA, USA) környezetben Dr. Szilágyi Nóra végezte. 4.3. Kémiailag-indukált epilepszia kísérletek 4.3.1. Akut in vivo mikrodialízis Az akut mikrodialízis kísérletekhez 350-400 g hím Wistar patkányokat (Toxicoop, Budapest, Magyarország) használtunk. Az állatokat standard körülmények között tartottuk, 12 órás sötétvilágos ciklusban. A kísérleteket Halothan (Léciva, Prága, Cseh Köztársaság) altatásban végeztük. Az indukció fázisában 3%, majd az altatás fenntartásának idejére 0,8-1,2% Halothan-levegő elegyet alkalmaztunk 1.400 ml/perc áramlási sebességgel. Az altatott patkányokat sztereotaxikus készülékbe (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) rögzítettük, a koponya bőrét mediosagittalisan bemetszettük, a koponyacsontot megtisztítottuk és bilaterálisan a mikrodialízis mintavevők pozíciójának megfelelően a koponyacsontba egy-egy 2 mm átmérőjű lyukat fúrtunk. A dura mater bemetszését követően a mintavevőket a hippocampus-ba implantáltuk a következő koordináták szerint: anterior (A): -5,2 mm; lateralis (L): 5 mm; ventralis (V): 8 mm-re (Paxinos & Watson 1997). A szöveti károsodás minimalizálása érdekében, a mintavevők végső ventralis pozíciójának elérése lassan, legkevesebb 15 perc alatt történt. A kísérletek során mértük és azonos értéken (38±0,2˚C) tartottuk a rektális hőmérsékletet. A mikrodialízis mintavevő sajátkészítésű volt. A féligáteresztő membrán 5.000 Dalton molekulatömegig áteresztő 0,2 mm átmérőjű Travenol (Travenol-Baxter Healthcare, Deerfield, ILL, USA) rost, melynek szöveti végét epoxi-ragasztóval lezártuk, és a rost aktív - a hippocampusszal közvetlenül érintkező - felszínének hosszát 3 mm-re állítottuk be, a ventralis hippocampus méretéhez igazodva. A membránhoz csatlakozó bemenő, illetve kimenő kapillárisok (fused silica capillaries, TSP075150, Composite Metal Service Ltd., USA) szabad végeiket 27-gauge rozsdamentes acél tűkkel (Medicor Elektronika Zrt., Budapest, Magyarország) védtük. Az üvegkapillárisokat két-komponensű epoxi-ragasztóval egy 24-gauge rozsdamentes acél csőbe ragasztottuk be. A
mintavevőben
nem-pirogén,
aminosavmentes,
mesterséges
liquort
(artificial
cerebrospinal fluid, (ACSF), Heim Pál Kórház, Gyógyszertár, Budapest) áramoltattunk 1,5 µl/perc állandó áramlási sebességgel. Az ACSF összetétele: 144 mM NaCl; 3 mM KCl; 1 mM MgCl2 és 2 mM CaCl2 volt, pH-ját közvetlenül felhasználás előtt NaOH-al 7,4-re állítottuk.
35
A mintavételezést a beültetéstől számított 120. perctől kezdtük. Ez idő alatt az extracelluláris aminosavak és nukleozidok koncentrációja beállt az egyensúlyi alapszintre. A mikrodialízis kísérletekben fontos, hogy a mintavevők közötti különbséget elimináljuk. Ezért a mintavételezés kezdetén kontrollmintákat gyűjtünk, ezután történik az anyagbeadás. A kontrollmintákból átlagot számolunk, s az anyagbeadás után kapott értékeket a kontrollminták százalékában adjuk meg. Kísérleteinkben, az aminosavak és nukleozidok alapkoncentrációit két 75 µl-es kontrollmintából határoztuk meg. Ezt követően, intraperitonealisan (ip.) 0,5 ml végtérfogatban, 100%-os dimetil szulfoxidban (DMSO, Merck Co., Darmstadt, Németország) frissen feloldott 5 mg/kg (n=3) Picrotoxin-t illetve 10, 20 vagy 60 mg/kg (n=4, 5, illetve 3) Lindán-t injektáltunk. A kísérleti kontroll-csoportot 0,5 ml 100% DMSO-val (n=3) injektáltuk intraperitonealisan. E vegyületeknek az extracelluláris tér aminosav-, illetve nukleozid-koncentrációira kifejtett hatását, a beadást követően gyűjtött három, egyenként 75 µl-es mintából határoztuk meg (50 perces mintavétel). Az aminosav- illetve nukleozid-szintek HPLC-módszerrel történt meghatározásáig a mintákat -20˚C-on tároltuk. A kísérletek végén, az állatokat túlaltattuk, és a mintavevő helyének ellenőrzése céljából az agyat eltávolítottuk, majd 10%-os paraformaldehid oldatban 24 órán keresztül fixáltuk. Mikrotommal metszett 60 µm vastag koronális metszeteken Nissl-festést alkalmazva ellenőriztük a mintavevők ventralis hippocampális helyzetét. Az adatok értékelésében csak azokat a kísérleteket vettük figyelembe melyekben a mintavevő helyes anatómiai helyzetű volt. 4.3.2. Elektroencefalográfia (EEG) Rozsdamentes acél csavar-elektródokat (1 x 5 mm) ültettünk a koponyacsontba a bal frontális (A: 3 mm; L: 3 mm) és a bal occipitális (A: -8 mm; L: 1 mm) agykéregnek megfelelően. A referencia csavar-elektród a kisagy fölé lett beültetve (A: -10 mm; L: 2 mm). Az elektroencefalogram (EEG) regisztrálása Grass 8B modellű EEG készülékkel történt (Grass Technologies, West Warwick, RI, USA) 5.000-szeres erősítést alkalmazva a 0,3–1.000 Hz sávszélességben. Az erősítéshez 4 csatornás előerősítőt használtunk (Supertech, Pécs, Magyarország). Az adatfeldolgozáshoz Cambridge Electronic Design Ltd. (Cambridge, U.K.) gyártmányú CED 1401 AD konvertert és Signal 1.82 software-t használtunk. A mintavételezési frekvencia 500 Hz, a digitális regisztrátumok hossza 30 másodperc volt. A kapott adat-file-okat ASCII formátumba konvertáltuk, mely kompatibilis az EEG görbék wavelet-spektrum analíziséhez és ábrázolásához használt MATLAB (The MathWorks Inc., Natick, MA, USA) és ORIGIN 5.0 (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)
36
software-ekkel. Az EEG regisztrátumok wavelet-analízise, a hagyományos Fourier módszertől eltérően a szignál frekvencia-komponenseinek időbeli változását is képes szemléltetni, ezért alkalmas és egyre kedveltebb módja az epileptikus aktivitás ábrázolásának (Nyikos et al. 2003; Adeli et al. 2003). Mivel a wavelet erő-spektrum („power-spectrum”) funkciónak két független változója van (idő és frekvencia) az EEG komponensek fluktuációi „színkódolt körvonal térképezés”-sel („contour-plot”) ábrázolhatók (Torrence & Compo 1998; Senhadji & Wendling 2002). 4.3.3. Aminosavak meghatározása HPLC módszerrel A mikrodialízissel nyert mintákból az aminosavak (valamint a nukleozidok) koncentrációit automatizált HPLC (Agilent HP-1100 Series, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA) készülékkel, gradiens rendszerben határoztuk meg. Az „Agilent Application Library-ban leírtaknak megfelelően (Henderson et al. 2000) a dializátumban jelen levő aminosavak elválasztására oszlopelőtti orto-ftalaldehid (OPA) származékképzést alkalmaztunk merkaptoetanol jelenlétében (pH 10,4; szobahőn, reakció-idő 2 perc). A derivatizálás és az injektálás automata injektorral történt. Az injektálási térfogat 5 µl volt. Az elválasztás 25˚C-ra termosztált Agilent ODS-Hypersyl reverzfázisú oszlopon történt (C18; 5 µm; 200 x 2,1 mm; 20 mm előtét oszloppal). Az alkalmazott eluensek összetétele a következő volt: „A”-eluens: 0,5% (v/v) tetrahidrofuránt és 0,02% (v/v) tetraetilammónium hidroxidot tartalmazó 0,1 M foszfát puffer, pH 6,0 illetve „B”-eluens: 70% (v/v) acetonitril 0,1 M foszfát pufferben, pH 6,0-ra állítva NaOH-dal. A gradiens profil a következő volt: 0 percnél - 8% B; 9 percnél - 24%; 20 percnél - 35%; 22-28 percnél -100%, 29 percnél - 0%; 0,4 ml/perc áramlási sebesség mellett. Az oszlop ekvilibrálási ideje (két elválasztás között) 8 perc volt. Külső standardként 10 mM aminosav törzsoldatokat használtunk, melyek elegyét minden 10. kísérleti minta után injektáltuk. Fluoreszcens detektálással (excitációs hullámhossz: 340 nm; emissziós hullámhossz: 440 nm) az aminosavak kimutathatósági-határa 1-5 pmol/5 µl minta volt. 4.3.4. Nukleozidok meghatározása HPLC módszerrel A nukleozidok meghatározása mikrodialízis mintákból a korábban leírt módszer szerint történt (Dobolyi et al. 1998; 1999), melynek érzékenysége és szelektivitása alkalmas az inozin, hipoxantin, xantin, uridin, guanozin, timidin és adenozin kimutatására a dializátumból. Az elválasztáshoz az Agilent HP-1100 Series kromatográfiás rendszert használtunk, ODS Hypersyl reverz-fázisú
37
oszloppal (C18; 5 µm szférikus ODS; 200 x 2,1 mm; 20 mm előtét-oszloppal) és a következő eluensekkel: „A”-eluens: 0,02 M formiát puffer, pH 4,45; „B”-eluens: 40% (v/v) acetonitril 0,02 M formiát pufferben, pH 4,45. A gradiens profil a következő volt: 0-10 percnél - 0% B; 20 percnél 15% B; 24 percnél - 47% B és 28 percnél - 0%B. Az áramlási sebesség 0,3 ml/perc volt. Az oszlopot 10°C-ra termosztáltuk a jobb elválasztás érdekében. Az UV-detektálás 254 nm-en történt (referencia: 360 nm). 4.3.5. Kromatogramok kiértékelése Mindkét esetben (aminosavak- és nukleozidok-meghatározása) a kromatogramok kiértékelését ChemStation (Agilent) software-rel végeztük. Mivel az in vitro kalibrációs görbékből csak becsülni tudjuk az extracelluláris koncentrációkat, ezért méréseinkben a dializátum-koncentrációkat adjuk meg. A mintavevők közti egyedi különbségekből adódó szórás elkerülése érdekében minden mintasorozat esetében az adatokat a saját kontroll minták %-ában adjuk meg. A vegyületek hatásainak kimutatásához az ip. anyagbeadást követően (0 perc) az egyes állatokból három 50 perces mintát gyűjtöttünk (0-50 perc; 50-100 perc; 100-150 perc) és időintervallumonként átlagoltuk a különböző patkányokból mért aminosav- illetve nukelozidkoncentrációk százalékos értékeit (átlag ± SEM). A Lindán különböző dózisai illetve a Picrotoxin 5 mg/kg aminosav- valamint nukleozid-koncentrációkra gyakorolt hatásainak kimutatására, és a hatás időfüggésének a leírására GLM ANOVA-t használtunk. Az átlagok különbségeinek szignifikancia szintjeit a Newman-Keuls „multiple comparison procedure”-val határoztuk meg, melyhez NCSS Statisztikai software-t használtuk (NCSS Statistical Software, Kaysville, Utah, USA).
38
5. EREDMÉNYEK 5.1. Fehér fény-expozíciós kísérletek 5.1.1. Funkcionális visszatérés foto-stresszt követően Az erős (5.500 lux), fehér fényhatás 3 órás időtartama alatt az elektroretinogram (ERG) átmeneti nagymértékű csökkenése volt tapasztalható. A b-hullám amplitúdója a sötét-adaptált kontroll retinogram 0,16 ± 0,1 %-ára csökkent. A foto-stressz végeztével - amikor az állatokat sötétbe helyeztük - az ERG és egyben a b-hullám növekedése volt tapasztalható. A b-hullám amplitúdója 3 órával a fény-expozíció megszűnése után a kontroll érték 32,8 ± 7,9%-ra, míg 24 óra elteltével 89,1 ± 13,4%-ra növekedett. A foto-stresszt követő első nap után, a b-hullám amplitúdó a kontrollértékek 83-89%-a között stabilizálódott 10 napon keresztül, amely értékek nem voltak szignifikánsan különbözőek a foto-stressz expozíciót megelőző sötét-adaptált kontroll értékektől (5A és 5B. ábra).
50msec
50µV
kontroll 0 óra 3 óra 6 óra 12 óra 24 óra 48 óra 72 óra 168 óra 240 óra
5A. ábra: A foto-stressz (5.500 lux, 3 óra fehér fény) reverzibilis funkcionális zavarokat okoz a retinában. Reprezentatív electroretinogram válaszok a sötét-adaptált (kontroll) állapotban illetve különböző időpontokban a foto-stresszt követően (0 óra: ERG a foto-stressz végén, melyet a nyíl jelez; skála: 50 ms és 50 µV; az ERG-k ábrázolásánál 40 pontos FFT „simítást” alkalmaztunk).
39
120
b-hullám amplitúdó
100 80
*
60 **
40 20 0
*** 0
3
6
12
24
48
72
168
240
Idő (óra)
5B. ábra: A foto-stressz (5.500 lux, 3 óra fehér fény) reverzibilis funkcionális zavarokat okoz a retinában. B: Az ERG b-hullám amplitúdók átlagainak (±SEM) oszlopdiagramja, a kontroll értékek %-ban kifejezve, a foto-stresszt követő különböző időpontokban (*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001). 5.1.2. Morfológiai adatok foto-stresszt követően A foto-stressz expozíciót követő tizedik, sötétben eltöltött napon a retinális funkció elektroretinogram alapján tapasztalt visszatérésével párhuzamosan, a retina morfológiájában sem voltak kimutathatók jelentős elváltozások hematoxilin-eozin festésben a sötét-adaptált kontrollhoz viszonyítva (6. ábra). A non-parametrikus Mann-Whitney próbát alkalmazva, a foto-stressz expozíciót követően 10 napig sötétben tartott patkányokban a sejtmagok száma (N: 352; SD: 31.8; n: 4) nem tért el szignifikánsan (p<0,05 szinten) a 10 napig sötét-adaptált kontroll retinákban számláltaktól (N: 311; SD: 36.3; n: 4).
40
6. ábra A foto-stressz (5.500 lux, 3 óra fehér fény) nem okoz kiterjedt szerkezeti átrendeződést a retinában. Hematoxilin-eozin festett retina metszetek: kontroll: 10 napig sötétben tartott állat; +10 nap: foto-stressznek kitett, majd 10 napig sötétben túlélt állat. (RPE: retinal pigment epithelium; ONL: outer nuclear layer; INL: inner nuclear layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer; skála 50 µm; a 150 x 180 µm-es négyzet a fotoreceptor sejtmagok számlálására használt területet ábrázolja).
41
5.1.3. TUNEL eredmények foto-stresszt követően A foto-stresszt követő kiterjedt retinális elváltozások, illetve a jelentős sejtpusztulás hiányát támasztotta továbbá alá az in situ DNS fragmentáció kimutatására szolgáló TUNEL-festés (7. ábra). A külső magvas rétegben, 20 órával az erős fehér fény expozíciót követően a TUNELpozitív sejtek száma a sötét-adaptált kontrollokhoz hasonlóan elenyésző volt. A TUNEL-festés pozitív kontrolljaként használt DNáz-kezelt (20 U/ml) sötét-adaptált retinákból származó párhuzamos metszeteken kiterjedt jelölés volt kimutatható. A retina sejtmagjainak általános festésére Sytox Green-t alkalmaztunk.
7. ábra A DNS fragmentáció in situ analízise TUNEL festéssel. a, c, e: Sytox-Green festés; b, d, f: TMR-jelölt TUNEL-festés; a,b: DNáz-I kezelt (20 U/ml) sötét adaptált retinából készült metszet, mint pozitív festett technikai kontroll; c,d: sötét-adaptált kontroll retina; e,f: foto-stressznek kitett retina 20 órás sötétben eltöltött túlélési időszak után (skála: 40 µm, ONL: outer nuclear layer; INL: inner nuclear layer; GCL: ganglion cell layer).
42
5.1.4. Zselatinázok mRNS-szintű változásai foto-stresszt követően Az MMP-9 illetve MMP-2 mRNS szintek változásait vizsgálva, az MMP-9 eltérő időbeni lefutást mutatott a különböző szem struktúrákban, míg az MMP-2 mRNS szintek stabilabbaknak mutatkoztak az MMP-9-nek megfelelő maximális indukció idő-intervallumaiban (8. ábra). Az MMP-2 mRNS szintek csak a sclera mintákban mutattak szignifikáns növekedést a kontrollhoz képest. A retinában szignifikáns MMP-9 mRNS indukció jött létre a foto-stresszt követő első 24 órában. A sclera-ban és cornea-ban is 72 óráig terjedően kimutatható volt egy megnövekedett MMP-9 mRNS szint. Az MMP-9 mRNS növekedés kezdetben csak a retinában volt kimutatható, majd megjelent a cornea-, és végül az üvegtest- és sclera mintákban is. Az mRNS indukció időbeni eltolódása a retinában zajló folyamatoknak a központi, oki szerepét veti fel. Vitreus
800 600 400
*
200 0
MMP2
O.D. (kontroll %)
O.D. (kontroll %)
Retina
800 600 400 200
MMP9
MMP2
MMP9
Cornea
O.D. (kontroll %)
Sclera
0
800
*
600 400 200 0
MMP2 MMP9 8. ábra Foto-stresszt követően (5.500 lux, 3 óra fehér fény) bekövetkező változások az MMP-2 illetve MMP-9 mRNS szintekben a szem különböző struktúráiban: A: retina; B: üvegtest; C: sclera és D: cornea. Y-értékek az RT-PCR amplifikációs termékek optikai denzitásának (O.D.) átlagait (±SD) ábrázolja a kontroll %-ban kifejezve, mindegyik szemstruktúrában az MMP-9 mRNS maximális indukciójának megfelelő időintervallumokban. 43
5.1.5. Zselatinázok fehérje-szintű változásai foto-stresszt követően Sötét-adaptált kontroll retina mintákból készült zimogramon az MMP-2 (65-72 kDa) kimutatható volt, míg a pro-MMP-9 (92-100 kDa) a kimutathatósági szint alatt maradt (9. ábra). A pro-MMP-9nek megfelelő zselatint-emésztő csík a foto-stresszt követően 3 órával vált kimutathatóvá, 6 óránál érte el a csúcsértékét, és 72 óránál visszatért a kezdeti, kimutathatóság alatti értékekre. Az üvegtest, illetve sclera mintákban, a pro-MMP-9 indukció 3 óránál vált detektálhatóvá, maximumát 6-12 óránál érte el, és az alapszintű értékekre a foto-stresszt követően 48, illetve 168 óra elteltével tért vissza. A cornea mintákban a pro-MMP-9 szintek a sclera-nál tapasztalt mintázatnak megfelelően változtak. A szem egy adott struktúrájából származó, szolúbilis illetve inszolúbilis frakciókban csak minimális eltéréseket tapasztaltunk az MMP-9 indukció időbeni lefutásának tekintetében zselatin zimográfiás módszerrel. Az MMP-2 nagyobb részben a Triton X-szolúbilis frakcióban volt kimutatható, és foto-stressz hatására az MMP-2-nek megfeleltethető zselatinemésztés minden tanulmányozott szem struktúrában növekedett, de főként a sclera-ban. Western blottal a 92-100 kDa zselatint emésztő csík MMP-9 eredetét sikerült alátámasztani, bár egy további kb. 65 kDa-os pozitív jelölés is kimutatható volt, míg az anti-MMP2 antitest a 72 kDa csíkot ismerte fel.
44
9. ábra Foto-stressz után (5.500 lux, 3 óra fehér fény) bekövetkező - FITC-jelölt zselatin zimográfiával kimutatható - változások az MMP-2 illetve MMP-9 fehérje szintekben a szem különböző struktúráiban: A: retina; B: üvegtest; C: sclera és D: cornea. (K: sötét-adaptált kontroll minták a szem megfelelő struktúrájából; 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 168 és 240 óra, a foto-stressz végétől eltelt idő).
45
5.1.6. Xilazin hatása Mivel a patkányok Ketamin-Xilazin altatásban voltak a foto-stressznek kitéve, zselatin-zimográfiás módszerrel meghatároztuk, hogy az α2-adrenerg agonista Xilazinnak van-e hatása a foto-stressz-szel összefüggésben kimutatott MMP-szint változásokra. Kísérleti eredményeink azt mutatták, hogy a Ketamin-Xilazin altatás már önmagában megnövelte a pro-MMP-9 szinteket (92-100 kDa) 9 órával az altatást követően a sötét-adaptált, de nem altatott állatokhoz viszonyítva minden tanulmányozott szem struktúrában (10. ábra). Az erős fényhatás végétől számított 6. órában hasonlóan megnövekedett pro-MMP-9 szintek voltak láthatóak a retina, sclera és üvegtest mintákban a Ketamin-Xilazin, illetve a kizárólag Ketaminnal altatott patkányokban egyaránt. Ugyanakkor, a cornea-ban a pro-MMP-9 szintje a foto-stressznek kitett csoportban - melynél az altató elegyben Xilazint is alkalmaztunk -, magasabbnak bizonyult, mint a Xilazin nélkül altatott csoportban. Ez a Xilazin MMP-9 indukáló hatására utal a cornea-ban. Az MMP-2 szintek (65-72 kDa) csak a sclera mintákban mutattak szignifikáns változást a foto-stressz végeztét követő 6. órában.
10. ábra Zselatin zimográfia a szem különböző struktúrái (retina, sclera, cornea) Triton X-100 szolúbilis frakcióiból. A kísérleti csoportok a következők voltak: 1: Ketamin-Xilazin altatásban foto-stressz expozíció majd 6 óra túlélés sötétben; 2: Ketamin altatásban foto-stressz expozíció majd 6 óra túlélés sötétben; 3: Ketamin-Xilazin altatás és 9 óra túlélés sötétben; 4: a kísérlet 9 órás időtartama alatt sötétben tartott állatok.
46
5.1.7. Az MMP-gátlás hatása az ERG b-hullám foto-stressz által kiváltott változásaira Zselatin zimográfiás eljárással ellenőriztük, hogy a retrobulbaris térbe injektált széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001 diffúzió útján eljuthat-e a retinába, s így ott kifejtheti-e hatását (11. ábra). Mind a Triton-X-szolúbilis, mind az inszolúbilis retinális mintákban csökkenés volt kimutatható a pro-MMP-9 és kisebb mértékben az MMP-2 szintekben, 12 órával a foto-stressz után, az oldószerrel injektált kontroll mintákhoz viszonyítva, alátámasztva azt, hogy a GM6001 a sclerán átdiffundál és kifejti MMP-inhibitor hatását a retinában. TX-szolúbilis Mw K I
TX-inszolúbilis K I
170 130 100 72 55 44
11. ábra A retrobulbarisan injektált széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001 hatása a fotostressznek (5.500 lux, 3 óra fehér fény) kitett retina mintákban. A DMSO illetve GM6001+DMSO 30 perces előkezelést követően foto-stressznek kitett majd 12 órát sötétben túlélt állatok retina mintáinak Triton X-szolúbilis, illetve inszolúbilis frakcióiból készült zselatin-zimográfia az inhibitorral kezelt mintákban (I) az MMP-9 és MMP-2 részleges aktivitás-csökkenését mutatja ki a kontroll mintákhoz (K) viszonyítva. A DMSO kezelt szemekben a b-hullám amplitúdóját gyors visszatérés jellemezte a kontroll értékektől szignifikánsan nem eltérő szintekre (210 perccel a fényhatás végétől számítva 115%), 47
melyet egy plateu-fázis követett (12. ábra). Ezzel szemben a DMSO-ban oldott GM6001 kezelés hatására a b-hullám amplitúdóját kis meredekségű, lineáris visszatérés jellemezte, mely a kísérlet végére (5,3 óránál) sem érte el a kontroll értékek 60%-át (57,3±8,3%). Ez az érték megfeleltethető a kezeletlen szemekben 6 órával a foto-stresszt követően mért b-hullám amplitúdó értékeknek (55,3±15,1%). Ez arra enged következtetni, hogy míg a DMSO alkalmazása önmagában - az irodalomban leírt módon -, a mi kísérleteinkben is jelentősen facilitálta az elektromos válaszok (ERG) visszatérését a kezeletlen állatokhoz viszonyítva, addig a DMSO és széles spektrumú MMPinhibitor GM6001 együttes hatásaként, a visszatérés mértéke a kezeletlen állatokéhoz hasonló. Tehát, a GM6001 ellensúlyozva a DMSO facilitáló hatását, tulajdonképpen gátlólag hatott az ERG spontán visszatérésére foto-stresszt követően. Ha a b-hullám amplitúdók 10 perces átlagainak visszatérési folyamatát az idő függvényében ábrázoljuk, a mérési pontokra illeszthető polinomiális függvény deriváltja egy egyenes lesz, melynek ordináta-tengely metszete a kezdeti sebességet, míg meredeksége a visszatérés gyorsulását jellemzi. A 12. ábra B grafikonjából látható, hogy a két paradigma esetében (DMSO-kontroll és DMSO+GM6001 kezelés) az ERG b-hullám amplitúdók visszatérési folyamata egymással ellentétes tendenciát mutat. Mivel a kezelt csoportban alacsony az ordináta tengely metszet és sekély a meredekség levonható az a következtetés, hogy az MMP-gátlás már a hatás kezdetétől lelassítja a funkcionális visszatérési folyamat dinamikáját a retinában.
48
B
A DMSO
DMSO
0,8 0,7
100
0,6 80 0,5
d% dT
b-hullám amplitúdó visszatérés (%)
120
0,9
60
0,4 0,3
40
0,2
DMSO+GM6001
20
DMSO+GM6001 0,1
0
0,0 0
60
120
180
240
300
0
60
perc (T)
120
180
240
300
perc (T)
12. ábra A retrobulbarisan injektált széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001 hatása a fotostressznek (5.500 lux, 3 óra fehér fény) kitett retina funkcionális visszatérésére. A: A kísérletek 5,3 órás ideje alatt a DMSO-val, illetve MMP-inhibitorral (GM6001+DMSO) injektált patkányok szeméből mért ERG b-hullám amplitúdók 10 perces átlagai időfüggően visszatérő értékeire illesztett polinomiálisok összehasonlítása. B: A visszatérési sebességek (az A:-ban ábrázolt görbék deriváltjai) összehasonlítása DMSOkontroll (Y-metszés: 0,873; meredekség: -0,0014), illetve MMP-inhibitorral (Y-metszés: 0,136; meredekség: 0,0001) előkezelt, foto-stressznek kitett szemekből elvezetett ERG-ben. 5.1.8. Fény-adaptáció 500 lux „szokásos” nappali fény hatására Kísérleteinkben
a
nem
foto-stressznek
minősülő,
az
állatok
számára
„megszokott”
fényviszonyokhoz való visszatérést is tanulmányoztuk, miután kellően hosszú időt töltöttek sötétben ahhoz, hogy retinájuk sokrétűen alkalmazkodjon az új fényviszonyokhoz. Hosszantartó (tíz napos) sötét-adaptációt követően a 12 órás 500 lux-értékű szobafény expozíció pro-MMP-9 indukciót kizárólag a retinában (és csak a Triton X-inszolúbilis frakcióban) eredményezett, míg a többi struktúrában (sclera, cornea, üvegtest) MMP-9 indukció nem volt kimutatható zimográfiás eljárással (13. ábra). Az MMP-2 szintek sem mutattak változást egyetlen mintában sem.
49
13. ábra Szokásos állatházi nappali fény (500 lux) MMP-9-indukciót okoz az éber, szabadonmozgó patkány retinájában. Zselatin-zimográfia a szem különböző struktúráiból (retina, vitreus, sclera és cornea) készült Triton X-szolúbilis és inszolúbilis frakciókból. 1: szokásos állatházi fényviszonyok között tartott patkány (12 óra 500 lux fehér fény - 12 óra sötét); 2: 11 napig sötétben tartott patkány; 3: sötétben eltöltött 10 nap után egy állatházi fényciklusnak kitett patkány. A mintákat a 12 órás sötétben eltöltött periódus végén gyűjtöttük. 5.2. Kémiailag-indukált epilepszia kísérletek 5.2.1. Halothan-altatott patkány EEG-aktivitás változásai ip. Picrotoxin illetve Lindán hatására A Halothan-altatott patkányok EEG-jét - az intraperitonealis anyagbeadást megelőzően - lassúhullámok dominálták a delta-frekvencia tartományban (1,0-1,5 Hz), melyben a DMSO-injektálása önmagában (ip. 0,5 ml) nem okozott változást. A Lindán injektálása (20 mg/kg 0,5 ml DMSO-
50
ban) éles negatív hullámokat váltott ki, melyet ritmikus 4-5 Hz aktivitás kísért. A Lindán hatás dózis-függőnek mutatkozott, amennyiben a 4-5 Hz aktivitású 10-30 s periódusok 10-30 perccel a 10 mg/kg Lindán-beadása után jelentek meg, míg a 20 mg/kg Lindán-injektált állatok EEG-jében az 5-120 perces időintervallumban voltak jelen. A 60 mg/kg Lindán-nal kezelt állatok esetében a periodikus 4-5 Hz-es ritmikus mintázat fenntartottá, folyamatossá vált. Mind a Picrotoxin mind a Lindán rövid, rohamszerű kisüléssorozatokat is kiváltott. Meglepő módon, csak a 20 mg/kg Lindán váltott ki epileptiform mintázatot, míg a 60 mg/kg dózisnál az EEG-regisztrátumban nem volt rohamszerű („ictalis”) aktivitás megfigyelhető. Az epileptiform kisülések időtartama 2 s körül maradt, és mintázatában egy nagy amplitúdójú negatív tüskehullámot kisebb amplitúdójú pozitív hullámok követtek. Az epileptiform aktivitás 10-20 perccel a Lindán-beadást követően kezdődött, 5-10 perces rohamközti szakaszokkal („interictalis”) az első 50-70 percben. Ezt követően az inter-ictalis periódus 10-30 percre nyúlt, de a rohamszerű aktivitás a kísérlet 150 perces időtartama végéig sem szűnt meg (14., 15. ábra). A Picrotoxin által kiváltott EEG aktivitás-mintázat hasonlított a 20 mg/kg Lindán által kiváltottra, amennyiben 4-5 Hz-es ritmikus aktivitást és 2-5 s időtartamú epileptiform kisüléseket váltott ki. A Lindántól eltérően a Picrotoxin 4-5 Hz-es mintázatát 10 Hz-es oszcillációk kísérték, illetve az éles negatív hullámok nem voltak kimutathatók. A Picrotoxin hatás idő-lefutásában is mutatkoztak eltérések a Lindánhoz viszonyítva, amennyiben a 4-5 Hz-es EEG mintázat 30-40 perccel az injektálást követően jelent meg, és az epileptiform aktivitás a kísérlet időtartamának utolsó 100 percében volt csak kimutatható. Összehasonlításképpen 1 mg/kg ip. Picrotoxin myoclonus-os görcsöket okozott 15-40 perccel a beadást követően éber, szabadon mozgó patkányokban (Dai & Wooley 1991). Az általunk alkalmazott Halothan-altatásban történt Picrotoxin adagolást követően tapasztalt késés az EEG epileptiform aktivitásának az inicializálásában, valószínűleg az altató hatásának tudható be. Az EEG regisztrátumok spektrális wavelet-analízise folyamatos, illetve szakaszos 4-5 Hzes ritmikus oszcillációkat mutatott ki 60 mg/kg Lindán, illetve 5 mg/kg Picrotoxin beadását követően.
51
A Lindán
Picrotoxin
B
C 200 µV 1 sec
14. ábra Halothan-altatott patkány elektroencefalogram 2 s-es szakaszai. A: kontroll állapot, 10 perccel a toxinok injektálását megelőzően; B: 4-5 Hz-es aktivitás szakaszok 10 perccel a Lindán (20 mg/kg), illetve Picrotoxin (5 mg/kg) beadását követően; C: epileptiform rohamok 10 perccel a Lindán (20 mg/kg), illetve 40 perccel a Picrotoxin (5 mg/kg) injektálását követően jelentkeztek. A nyilak a negatív éles-hullámokat („sharp wave”) jelzik.
52
Frekvencia (Hz) Frekvencia (Hz) Frekvencia (Hz)
15. ábra Jellemző 10 s-es elektroencefalogram szakaszok és a megfelelő wavelet-analízis energiaspektrumai. A: Halothan-altatott patkány EEG-je a toxin beadását megelőzően; B: 60 perccel a Lindán (60 mg/kg) beadását követően regisztrált EEG; C: 10 perccel a Picrotoxin (5 mg/kg) beadását követően regisztrált EEG. A színkód az energia szinteket ábrázolja az alacsony (sötétkék) értékektől a közepes (világoskék, zöld és sárga) értékeken át a magas (piros) intenzitás értékekig.
53
5.2.2. Aminosav koncentrációváltozások a hippocampusban Picrotoxin, illetve Lindán hatására A drogok beadását megelőző két órában a kontroll dializátum mintákban a glutaminsav (Glu), aszparaginsav (Asp), glutamin (Gln), glicin (Gly) és taurin (Tau) szintek stabilak voltak. A kromatogramok alapján a következő aminosav koncentrációkat mértük a dializátumban (átlag ± SEM): Glu: 0,3 ± 0,07 µM; Asp: 0,2 ± 0,05 µM; Gln: 26,6 ± 6,6 µM; Gly: 1,5 ± 0,25 µM; Tau: 2,7 ± 0,5 µM. Az intraperitonealisan injektált Lindán különböző dózisainak (10 mg/kg, n=4; 20 mg/kg, n=5 illetve 60 mg/kg, n=3), illetve a Picrotoxin 5 mg/kg (n=3) dózisának hatásait 150 percen keresztül követtük (16. ábra). Minden adatot a DMSO-val injektált (n=3) kontroll állatokhoz viszonyítottunk. A 0,5 ml 100% DMSO intraperitonealis injektálásának önmagában nem volt semmilyen hatása az Asp, Glu, Gln, Gly és Tau koncentrációk értékeire. A Picrotoxin csökkentette az Asp és Glu extracelluláris szintjét (GLM ANOVA Asp: F4,21 = 3,71; p = 0,019, Glu: F4,21 = 3,94; p = 0,015) a kontrollhoz képest. A Lindán esetében csak 100-150 perccel a 60 mg/kg-os dózis injektálását követően volt kimutatható csökkenés az Asp és a Glu extracelluláris szintjében (Student-féle t-próba p<0,05). A Lindán 20 mg/kg-os dózisa nem csökkentette sem az Asp sem a Glu extracelluláris szintjét és hatása szignifikánsan különbözött a Picrotoxin-étól (GLM ANOVA). A többi aminosav esetében (Gln, Gly és Tau), sem dózis-függő sem időbeni szignifikáns különbség nem volt kimutatható egyetlen kezelési paradigmát követően sem.
54
Kontroll százaléka Kontroll százaléka Kontroll százaléka
150 100 50 0 150 100 50 0 150 100 50 0
0-50 perc
Asp
Glu 50-100 perc
DMSO Lindán 10 mg/kg Lindán 20 mg/kg Lindán 60 mg/kg
Asp
Glu
Picrotoxin 5 mg/kg
100-150 perc
Asp
Glu
16. ábra A picrotoxin (5 mg/kg) illetve Lindán különböző dózisainak (10; 20; 60 mg/kg) ip. injektálását követően kimutatható változások az extracelluláris Asp és Glu szintekben Halothanaltatott patkányok hippocampusában az injektálástól számított: A: 0-50 perc; B: 50-100 perc; C: 100-150 perc idő-intervallumokban gyűjtött mintákból. Az oszlopdiagramok az átlag (±SEM) értékeket ábrázolják a kontroll %-os arányában. Kontrollként a vegyületek ip. injektálását megelőző 2 órában gyűjtött 2 minta koncentrációinak átlagát használtuk. A különböző oszlopokat összekötő nyilak a szignifikánsan különböző csoportokat mutatják (GLM ANOVA). 5.2.3. Nukleozid koncentrációváltozások a hippocampusban Picrotoxin, illetve Lindán hatására A kontroll mikrodialízis mintákban a nukleozid illetve nukleozid-metabolitok koncentrációi a következők voltak (átlag ± SEM): hipoxantin: 0,5 ± 0,1 µM; xantin: 1,8 ± 0,5 µM; uridin: 0,3 ± 0,03 µM; inozin: 0,2 ± 0,03 µM; guanozin: 0,06 ± 0,01 µM; timidin: 0,1 ± 0,02 µM; adenozin: 0,3 ± 0,04 µM. Mivel a kísérleti-kontrollként használt ip. DMSO-kezelést követően a hipoxantin-, xantin-, uridin- és adenozin-szintek enyhe csökkenést mutattak, a Picrotoxin- illetve Lindán-kezelt állatok dializátumainak koncentráció-értékeit a DMSO-injektált állatokéhoz viszonyítottuk.
55
A Picrotoxin szignifikáns növekedést okozott az uridin, xantin, hipoxantin, inozin koncentrációjában 50-100 perccel az injektálást követően (17. ábra). Tíz mg/kg Lindán a hipoxantin és az inozin szintjét növelte szignifikánsan ugyanebben az időtartományban. A Lindán nagyobb dózisai (20 és 60 mg/kg) nem növelték egyik nukleozid koncentrációját sem ebben az időtartományban. A Picrotoxin hatása szignifikánsan eltért a Lindán összes dózisának hatásától xantin esetében, míg inozin esetében csak a 60 mg/kg-os Lindán dózistól különbözött. A 0-50 perc és 50-100 perc méréstartományokban sem a Picrotoxin, sem a Lindán különböző koncentrációi (10, 20 illetve 60 mg/kg) nem változtatta meg a nukleozidok illetve metabolitjaik
Kontroll százalék
Kontroll százalék
extracelluláris koncentrációit a hippocampusban.
0-50 perc
150 100 50 0
hipoxantin xantin
inozin
150
DMSO Lindán 10 mg/kg
100 Lindán 20 mg/kg
50 0 hipoxantin xantin
Kontroll százalék
uridin
50-100 perc
150
uridin
inozin
100-150 perc
Lindán 60 mg/kg Picrotoxin 5 mg/kg
100 50 0
hipoxantin xantin
uridin
inozin
17. ábra A picrotoxin (5 mg/kg) illetve Lindán különböző dózisainak (10; 20; 60 mg/kg) ip. injektálását követően kimutatható változások az extracelluláris hipoxantin, xantin, uridin és inozin szintekben Halothan-altatott patkányok hippocampusában az injektálástól számított: A: 0-50 perc; B: 50-100 perc; C: 100-150 perc idő-intervallumokban gyűjtött mintákból. Az oszlopdiagramok az átlag (±SEM) értékeket ábrázolják a kontroll %-os arányában. Kontrollként a vegyületek ip. injektálását megelőző 2 órában gyűjtött 2 minta koncentrációinak átlagát használtuk. A különböző oszlopokat összekötő nyilak a szignifikánsan különböző csoportokat mutatják (GLM ANOVA).
56
6. MEGBESZÉLÉS 6.1. Fehér fény hatása a szemben Adataink elsőként mutattak ki MMP-9 indukciót természetes ingerek hatására egy szenzoros rendszerben, valamint további adatokkal támasztják alá azt a nézetet, hogy az MMP-9 indukció nem csak a sejtpusztulással kísért folyamatokban vesz részt. A retina a központi idegrendszer gyakran használt modellje annak ellenére, hogy alapvető funkcionális, morfológiai, stb. különbségek is kimutathatók a retina és az agy között. Míg az agyban a neuronális depolarizáció, akciós potenciál generálás és a glutaminsav felszabadulás jellemzik a serkentő ingerületátvitelt, addig a retinában egyedül a ganglion sejtek válaszolnak a fény hatására depolarizációval és akciós potenciál kialakulásával. A retina funkcionálisan specifikusan specializált neuronjai, a fotoreceptor sejtek ezzel szemben sötétben folyamatosan szabadítanak fel glutaminsavat, míg a fény-inger hatására hiperpolarizációjuk mellett a glutaminsav felszabadulás csökkenése következik be. A mi kísérleteinkben tehát, a retinában tapasztalt fény-indukált MMP-9 nem köthető egyértelműen a depolarizációhoz, illetve a megnövekedett glutaminsav szintekhez, mint ahogy azt a korábbi excitotoxicitásra alapuló kísérleti paradigmákban tapasztaltak alapján vélték (Zhang et al. 1998; Szkalrczyk et al. 2002; GursoyOzdemir et al. 2004; Mali et al. 2005; Manabe et al. 2005). Az altatás folyamán használt glutaminsav receptor antagonista Ketamin és az α2-adrenerg agonista Xilazin hozzájárulhatott ahhoz, hogy az általunk használt foto-stressz modellben kiterjedt retinális degeneráció nem volt kimutatható, míg hasonló fény-hatás alkalmazásával (3.000 lux, 2 óra) éber patkányokban kiterjedt fotoreceptor pusztulást írtak le (Hafezi et al. 1997 a,b). Egy előző tanulmányban kimutatták, hogy a Xilazin szisztémás alkalmazása után a fotoreceptor sejtekben átmenti basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) indukció következett be, míg az agyi neuronokban hasonló növekedés nem volt tapasztalható. Ez a fotoreceptorokra egyedülállóan jellemző expressziós mintázat hozzájárulhatott a fotoreceptor sejtek túléléséhez az erős fehér fény hatásának kitett albino patkányokban (Wen et al. 1996). Mindezen különbségek mellett, a retina egy érzékeny modell, melyben az MMP-9 indukció fiziológiás, illetve patológiás körülmények között jól tanulmányozható, de a retinális jellegzetességekre kiemelten figyelni kell mikor az eredményeket a központi idegrendszer egészére általánosítjuk. Erős fehér fénynek kitett retinában megnövekedett MMP-9 transzkripciót és fehérje szintézist tapasztaltunk. A zimogramokon kimutatható emelkedett MMP-9 szintek a szolubilis és 57
inszolubilis frakciókban egyaránt, a zselatinázok megnövekedett expressziójára utalnak a citoszolban, és az extracelluláris térben egyaránt. Ez a foto-stressz után bekövetkezett megnövekedett fehérje-szintézisre, de egyúttal megnövekedett szekrécióra is utal. A zselatin zimográfia módszerével az MMP-9 proenzim és aktív formák szintjeiben tapasztalt változások egyidejűleg kimutathatók (Woessner 1995). A zimogramokon látható késleltetett megnövekedés a pro-MMP-9-nek megfeleltethető zselatinemésztésben (92-100 kDa) valószínűleg az enzim de novo szintézisét tükrözi, mely a fény-hatást követően egy pro-MMP-9 készlet felhalmozódásához vezet. Nem kizárható, hogy egy kb. 82 kDa aktív MMP-9 forma is kialakul átmenetileg, illetve jelen van lokálisan, majd gyorsan tovább alakul, megnehezítve ezáltal a zimogramokon történő kimutatását (Heo et al. 1999). Továbbá, annak a lehetősége sem kizárt, hogy a kb. 65 kDa zselatint emésztő csík, mely a legtöbb, fény-hatást követő mintában megnövekedett szinteket mutatott és melyet az anti-MMP-9 antitest is megjelölt, esetleg az MMP9-nek egy aktív hasítási terméke lehet (Okada et al. 1992), mely átfed az inkább konstitutív MMP-2 zselatint emésztő csíkkal (72-66 kDa). A szem azon struktúráiban, melyek metabolikusan a retinával összekapcsoltak (retinális pigment epithel, mely a sclera mintákban van jelen, illetve az üvegtest minták esetében) a proMMP-9 szintekben tapasztalt egyidejűleg létrejövő, de a retinánál elnyújtottabb növekedés molekuláris szintű mechanizmusainak feltárása további megfigyeléseket tesznek szükségessé. A szem
különböző
struktúráiban
tapasztalt
egymásutániság
az
MMP-9
mRNS
szintek
megnövekedésében az MMP-indukció egy indirekt mechanizmusára utalhat, melynek a fényérzékeny retinából kiinduló diffuzibilis faktorok állhatnak a hátterében, hasonlóan a tumorterjedési modellekben előzőleg egyes MMP-kre már leírt parakrin indukciós folyamatokhoz (Tang et al. 2004). A cornea esetében, az MMP-9 expresszió növekedés részben a Xilazin szisztémás adagolásának a következményének bizonyult, mint ahogy a kontroll-kísérleteinkből kitűnik. A Xilazin-hatására megnövekedett MMP-9 szint a korábban mások által leírt szisztémásan adagolt Xilazin cornealis toxicitásának (Tita et al. 2001) a hátterében állhat. Felvethető annak a lehetősége is, hogy a fény fokozatos abszorpciója a szem átlátszó médiumaiban történő áthaladása során elér egy olyan küszöbértéket, mely lokálisan sejtszintű stressz-hatásokat vált ki, és ez pro-MMP-9 indukciót inicializál mindezen struktúrákban a helyileg jelenlevő rezidens, vagy gyulladásos sejtekből. Ennél a hipotézisnél figyelembe kell venni, hogy a fény-spektrumából a szem különböző médiumai differenciáltan, különböző hullámhosszúságú
58
sugárzást nyelnek el. Így, az UV-sugárzás felnőttekben nem hatol a corneán és lencsén túl, míg túlzott expozíció a látható tartományban (400-700 nm) főként a retinát, a pigment epithel sejtjeit és a choroideát károsítják (Glickman 2002). Mivel az általunk használt LED-ek által kibocsátott fehér fény spektruma nem tartalmazott sugárzást az UV tartományban, nehezen alátámasztható a fényexpozíció közvetlen oki szerepe az MMP-9 indukcióban a retina és pigment epithel minták kivételével a többi tanulmányozott szem struktúrában. Ezért feltételezhetjük, hogy az MMP-9 indukció a retinában kezdődik, és innen terjed ki a szem távolabbi szöveteibe diffuzibilis faktorok révén. A hideg, fluoreszcens, fehér fény által indukált retinális degeneráció egy gyakran alkalmazott modellje az apoptotikus sejthalálnak (Hafezi et al. 1997 a,b; Wenzel et al. 2000; Gordon et al. 2002). Bár ezen tanulmányokban tág tartományban változó fény-expozíciós paradigmákat alkalmaztak, abban mindannyian egyetértenek, hogy kiterjedt TUNEL-pozitív sejtjelölést tapasztaltak a külső magvas rétegben kb. 20 órával és/vagy 40 órával a foto-stresszt követően, illetve abban hogy szignifikáns fotoreceptor elhalás mutatható ki 3-10 napos túlélést követően. A fotoreceptor sejtek sorsa egy komplex kölcsönhatás végeredménye, melyben egyaránt szerepet játszanak az előzetes fény-expozíció mértéke, az akut fény-hatás időzítése, különböző drogok, illetve a fajra jellemző tulajdonságok mellett az aktuális károsító fény-hatás paraméterei is (intenzitás, hullámhossz, időtartam) (Noell et al. 1966; Penn et al. 1987). Más tanulmányok kimutatták a szöveti átrendeződés és/vagy neuronális sejthalál kapcsolatát az MMP-9 indukcióval különböző Gluerg-excitotoxicitási modellekben a központi idegrendszerben (Gu et al. 2002; Rivera et al. 2002; Szklarczyk et al. 2002; Jourquin et al. 2003; Lee et al. 2004), majd később a retina ganglion sejt rétegében is (Zhang & Chintala, 2004; Mali et al. 2005; Manabe et al. 2005). A mi kísérleti paradigmánkban a fény-paraméterei, az alkalmazott altató-elegy, és a patkányok előzetes fény-expozíciójának kölcsönhatásából egy olyan foto-stressz modell jött létre, melyben sem kiterjedt TUNEL-pozitív jelölés a fotoreceptor sejtek rétegében nem mutatható ki 20 órával a foto-stresszt követően, sem szignifikáns csökkenés nem volt tapasztalható a fotoreceptor sejtmagok számában 10 nappal a fény-hatást követően. Természetesen dendritikus arborizáció, vagy szinaptikus disztribúció szintű változások nem zárhatók ki. A felnevelés ideje alatt is alkalmazott és a patkányok által „természetesnek” megtapasztalt 500 lux intenzitású fehér fény reexpozíció egy 10 napos sötét-adaptációt követően, egy még gyengébb stressz-hatásként fogható fel, melyet nem kísér nagymértékű szöveti átrendeződés vagy sejtelhalás. Ennek ellenére, mindkét paradigmában bekövetkezett az MMP-9 indukció. Foto-stresszt követően ez az indukció
59
kiterjedtebb és erőteljesebb volt, míg a fény-adaptációnak megfeleltethető 500 lux hatására a retinára szorítkozott indukció volt látható. Általánosan elfogadott nézet, hogy az ERG b-hullám főként a retinális sejtekben létrejövő helyreállító ("restorative") ion-áramokat tükröz, melynek bizonyosan van egy Müller-glia eredetű komponense (Newman & Odette 1984). Bár ez felveti annak lehetőségét, hogy ebben a fotostressz modellben a b-hullám amplitúdójának a csökkenése és a retinában tapasztalt megnövekedett MMP-9 szintek közös sejtszintű háttérre vezethetők vissza (Müller glia szerepe feltételezhető az MMP-9 indukció hátterében is, az MMP-9 sejtszintű eredetének a pontos meghatározása a jelen tanulmány keretein túlmutató további immunhisztokémiai vizsgálatokat tesz szükségessé. Fiziológiás feltételek között, az ERG b-hullám rendkívül stabil (Szabó-Salfay et al. 2001) és a b-hullám amplitúdójának csökkenései korrelációt mutatnak a retinális károsodás mértékével (Sugawara et al. 2000). Laboratóriumunkban kidolgoztuk az első megbízható implantációs módszert az ERG krónikus regisztrálására szabadon mozgó patkányokban (Galambos et al. 2000), továbbá azt is kimutattuk, hogy a regisztrált válaszok az előzetesen publikált ERG-leírásoknak megfeleltethetőek (Newman & Odette 1984), illetve hogy a regisztrátumok stabilak több héttel a beültetést követően is. Tehát ez a módszer bizonyítottan kellően megbízható az MMP-inhibitorok funkcionális hatásainak kimutatására a retinában. A GM6001 alkalmazása DMSO oldatban csökkentette a b-hullám amplitúdójának a visszatérési sebességét a DMSO-val injektált kontroll szemhez viszonyítva. Mivel a GM6001 egy széles-spektrumú MMP-inhibitor, amely az MMP-9-en kívül nagy affinitással gátolja továbbá az MMP-8, -1, -2 és -3 enzimeket is, ezen MMP-k hatását a b-hullám visszatérésére nem zárhatjuk ki. A GM6001 injektálása azért a retrobulbáris térbe történt, hogy a szem mechanikus sérülését elkerüljük, mert ismert, hogy mechanikus traumák kiválthatnak MMP-9 indukciót (Wang et al. 2000; Planas et al. 2002). A retrobulbáris injektálás ismert és alkalmazott gyógyszeradagolási módozat a humán gyakorlatban, mely a sclera áteresztő-képességét használja ki a retinába eljuttatni kívánt drogok nagy koncentrációban történő bejuttatása céljából (Raghava et al. 2004). A GM6001 gátló hatásából kiindulva, amelyet a látás funkcionális visszatérésére fotostresszt követően fejt ki, az MMP-k - különösen az indukálható MMP-9 fontos komponenseinek tűnnek a visszatérési folyamatnak, mivel kontrollálják a visszatérési sebességet. Ez, az MMP-9 indukció helyreállító szerepére utal. Az MMP-9 specifikus szerepének a további tisztázásához szelektív MMP-9-gátló anyagok alkalmazásával, illetve a leírt módszer MMP-9 knock-out egerekre
60
történő adaptálásával juthatnánk közelebb. Az MMP-9 indukció szerepét a visszatérési folyamatokban a lokálisan elérhető szubsztrátjai határozzák meg (Larsen et al. 2003), ám a retinában az MMP-9 specifikus szubsztrátjairól in vivo szintén nagyon kevés adat áll rendelkezésre. A DMSO önmagában javította az ERG visszatérését a DMSO-nélküli foto-stresszt követő regisztrátumokhoz viszonyítva, mely összecseng azon korábbi tanulmányokkal, melyben a DMSO serkentő, a kiváltott válaszokat növelő hatásait bizonyították az idegrendszerben (Sawada & Sato 1975; Stolc & Vlckova 1982; McCallum 1983). A hosszan-tartó sötét-adaptáció, melyet az előzőleg megszokott fény-hatásnak megfelelő expozíció követett, pro-MMP-9 indukciót váltottak ki, mely kizárólag a retina Triton-X inszolúbilis (extracelluláris) frakciójában volt kimutatható. A szokásos, fény-hatásnak kitett patkány esetében a fény-adaptáció a fotoreceptor sejtek egy kis-intenzitású, nem-destruktív, mindennapos tapasztalataként fogható fel, mely önmagában nem vált ki sejtszintű károsodást. Mivel egy szinaptikus MMP-9 állomány létét feltételezték, mely a szinaptikus ingerület átvitelt hatékonyan tudja befolyásolni (Kaczmarek et al. 2002; Nagy et al. 2006), az MMP-9 korlátozott növekedése az enzim fiziológiás szerepére utalhat, olyan állapot-függő excitabilitást befolyásoló folyamatokban mint a fény-adaptáció. Kísérleteinkben elsőként mutattuk ki az MMP-9 indukcióját in vivo különböző intenzitású szenzoros
ingerek
hatására.
A
szignifikáns
szövet-szerkezeti
átrendeződések
és
a
visszafordíthatatlan funkcionális elváltozások hiánya az MMP-9 fiziológiás körülmények között betöltött szerepére utalnak. Az MMP-9 gátlására bekövetkező késleltetett funkcionális visszatérés pedig arra enged következtetni, hogy az MMP-9 az erős fehér fény-expozíciót követő retinális visszatérési folyamatokban is szerepet játszik. 6.2. Picrotoxin és Lindán hatásai a hippocampusban Picrotoxin epileptiform aktivitást okozott a Halothan altatott állatokban és közben csökkentette az excitatórikus aminosav transzmitterek (az Asp és a Glu), extracelluláris koncentrációját. Korábbi kísérletek kimutatták a GABAA és GABAB receptorok molekuláris szintű preszinaptikus diszinhibíciós interakcióit (Korgsgaard-Larsen et al. 1994; Kardos et al. 1994; Schousboe 1999), melyben a GABAA receptor által mediált gátlás csökkenése a GABAB receptor által közvetített válaszok növekedését válthatja ki (Newberry & Nicoll 1985; Crunelli et al. 1988; Connors et al. 1988; Crunelli & Leresche 1991; von Krosigk et al. 1993). Ezért felvetődik annak a lehetősége, hogy a Picrotoxin által kiváltott GABAA receptor blokád a preszinaptikus GABAB receptorok
61
funkciójának fokozódásával jár, melynek következményeként csökkennek az extracelluláris Glu illetve Asp szintek. A Picrotoxin ennél specifikusabb hatása is feltételezhető, ha antagonistaként hatna egy excitatorikus GABAA receptoron. Ennek a feltételezésnek az alátámasztására szolgálhat, hogy glia sejteken már kimutattak GABA-indukált depolarizációt (Bormann & Kettenmann 1988; MacVicar et al. 1989; Fraser et al 1995). Ebből következhet, hogy a Picrotoxin hatására létre jövő excitatorikus GABAA hatás meggyengülése glia-sejtek hiperpolarizációjához vezet, melynek következményeként a Glu és Asp fokozott gliális felvétele („uptake”) következik be. A Lindán, 20 mg/kg dózisban, epileptiform kisüléseket („spikes”) indukált a Halothanaltatott patkányok hippocampusában annak ellenére, hogy az extracelluláris Glu, illetve Asp szintekben szignifikáns változások nem voltak kimutathatók, ezzel alátámasztva azt, hogy az epileptikus kisülések és az extracelluláris Glu és Asp szintek változásai egymástól függetlenül is bekövetkezhetnek. Ezzel ellentétben, az 5 mg/kg Picrotoxin által kiváltott epileptiform rohamokhoz („bursts”) az extracelluláris Glu és Asp szintek csökkenése társult. Korábbi kísérleti eredmények szabadon mozgó, éber patkányokban szoros kapcsolatot mutattak ki az intrahippocampalisan mikrodialízis útján adagolt Picrotoxin által kiváltott rohamszerű aktivitás („seizures”) és a lecsökkent extracelluláris Glu és Asp szintek között (Sierra-Paredes et al. 1998). Tehát, a Lindán illetve Picrotoxin beadását követően mért extracelluláris serkentő aminosavak koncentrációváltozásainak különbsége valamint a tapasztalt eltérések a regisztrált elektromos oszcillatorikus mintázatok között, azt sugallják, hogy a viselkedés szintű hasonlatosságok ellenére, a Lindán illetve Picrotoxin által aktivált központi idegrendszeri folyamatok nem teljesen egyezőek. A DMSO (Nakahiro et al. 1992; Joy et al. 1987), illetve a Halothan együtt adagolása a kis dózisú Lindánnal szinergisztikus hatást válthatott ki, mely magyarázatául szolgálhat a kis dózisoknál tapasztalt epileptiform tüskék jelenlétének, melyeket nagy dózisú Lindán adagolását követően nem tudtunk kimutatni. Azonban, az EEG-ben regisztrált további változások korreláltak a dózisfüggően fokozódó Lindán mérgezés mértékével, felvetve annak a lehetőségét, hogy az epileptikus tüskék eltűnését a folyamatos 4-5 Hz-es EEG-aktivitás megjelenése okozta, mely elnyomta a tüskék regisztrálhatóságát. Kísérleteinkben a legkövetkezetesebb, illetve legnagyobb mértékű purin szint-növekedés a 10 mg/kg Lindán illetve 5 mg/kg Picrotoxin hatására volt kimutatható, az adenozin metabolitok (Zimmermann 1996) – inozin és hipoxantin - tekintetében. Az extracelluláris uridin szintek - a központi idegrendszerben feltehetően betöltött neuromodulatorikus hatásának megfelelően, a Picrotoxin hatására megnövekedtek. Jelen adatok alátámasztják és kibővítik azon előző
62
eredményeket, melyek megnövekedett inozin és hipoxantin szinteket mutattak ki bicucullin, kainsav, illetve pentilentetrazol által indukált epileptikus aktivitással kapcsolatban (Berman et al. 2000). Összehasonlításképpen, az extracelluláris adenozin-szintekben Lindán és Picrotoxin hatására növekedés nem volt kimutatható, mely az adenozin gyors metabolizációjára utal az adenozin-deamináz hatására (Berman et al. 2000). A kapott eredmények arra engednek következtetni, hogy a Lindán illetve Picrotoxin mérgezés hatására a purin- és pirimidinmetabolizmus változása következik be. Érdekes módon a megnövekedett hippocampalis purinmetabolizmus leginkább a legkisebb Lindán dózis esetében volt kimutatható. Ez összefügghet a Lindánnal kapcsolatban tapasztalható akut tolerancia kialakulására a viselkedési hatások tekintetében (Lorens et al. 1991). További kísérletek szükségesek a Lindán-mérgezés folyamán létrejövő purin- és pirimidin-metabolizmus megváltozott állapotának a viselkedés-szintű elváltozásokkal történő összefüggések tisztázására.
63
7. IRODALOMJEGYZÉK 1. Abbracchio, M.P., Cerutti, S., Barbieri, D., Franceschi, C., Malorni, W., Biondo, L., Burnstock, G., Cattabeni, F. (1995). A novel action for adenosine: apoptosis of astroglial cells in rat brain primary cultures. Biochem. Biophys. Res. Commun. 213: 908-915. 2. Abu El-Asrar, A.M., Dralands, L., Veckeneer, M., Geboes, K., Missotten, L., Van Aelst, I., Opdenakker, G. (1998). Gelatinase B in proliferative vitreoretinal disorders. Am. J. Ophthalmol. 125: 844-851. 3. Adeli, H., Zhou, Z., Dadmehr, N. (2003). Analysis of EEG records in an epileptic patient using wavelet transform. J Neurosci. Methods. 123(1): 69-87. 4. Agapova, O.A., Ricard, c.S., Salvador-Silva, M., Hernandez, M.R. (2001). Expression of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in human optic nerve head astrocytes. Glia 33(3): 205-216. 5. Aizenman, C.D., Akerman, C. J., Jensen, K.R., Cline, H.T. (2003). Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitabilitly improves stimulus detection in vivo. Neuron 39: 831-842. 6. Akool, E.S., Kleinert, H., Hamada, F.M.A., Abdelwahab, M.H., Fröstermann, U., Pfeilschifter, J., Eberhardt, W. (2003). Nitric oxide increases the decay of matrix metalloproteinase 9 mRNA by inhibiting the expression of mRNA stabilizing factor HuR. Mol. Cell Biol. 23: 4901-4916. 7. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R.P., Haydon, P.G. (1999). Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends. Neurosci. 22(5): 208-215. 8. Asahi, M., Wang., X., Mori, T., Sumii, T., Jung, J.C., Moskowitz, M.A., Fini, M.E., Lo, E.H. (2001). Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on the proteolysis of blood-brain barrier and white matter components after cerebral ischemia. J. Neurosci. 21(19): 7724-7732. 9. Backstrom, J.R., Lim, G.P., Cullen, M.J., Tokes, Z.A. (1996). Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) is synthesized in neurons of the human hippocampus and is capable of degrading amyloid-beta peptide (1-40). J. Neurosci. 16(24): 7910-7919. 10. Baldwin, S.A., Mackey, J.R., Cass, C.E., Young, J.D. (1999). Nucleoside transporters: molecular biology and implications for therapeutci development. Mol. Med. Today 5: 216-224. 11. Barrett, A.J., Rawlings, N.D., Woessner, J.F. (1998). Handbook of proteolytic enzymes, Academic Press, London, pages 1199-1210. 12. Benveniste, H. & Huttemeier, P.C. (1990). Microdialysis: theory application. Progr. Neurobiol. 35: 195-215. 64
13. Berman, R. F., Fredholm, B. B., Aden, U., O’Connor, W. T. (2000). Evidence for increased dorsal hippocampal adenosine release and metabolism during pharmacologically induced seizures in rats. Brain Res. 872: 44–53. 14. Block, F. & Schwarz, M. (1998). The b-wave of the electroretinogram as an index of retinal ischemia. Gen. Pharmacol. 30(3): 281-287. 15. Bode, W., Gomis-Rüth, F.X. Stöckler, W. (1993). Astacins, serralysins, snake venom and matrix metalloproteinases exhibit identical zinc-binding environments (HEXXHXXGXXH and Met-turn) and topologies and should be grouped into a common family, the “metzincins”. FEBS Lett. 331(1-2): 134-140. 16. Bormann, J. & Kettenmann, H. (1988). Patch-clamp study of g-aminobutyric acid receptor Cl2 channels in cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9336–9340. 17. Bozdagi, O. Nagy, V., Kwei, K.T., Huntley, G.W. (2007). In vivo roles for matrix metalloproteinase-9 in mature hippocampal synaptic physiology and plasticity. J. Neurophysiol. 98: 334-344. 18. Bradford, H. F. (1995). Glutamate, GABA and epilepsy. Prog. Neurobiol. 47: 477-511. 19. Brinckerhoff, C.E. & Matrisian, L.M. (2002). Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became prince. Nature 3: 207-214. 20. Camón, L., Solà, C., Martinez, E., Sanfeliu, C., Rodríguez-Farré, E. (1988). Cerebral glucose uptake in lindane-treated rats. Toxicology 49(2-3): 381-387. 21. Cañete-Soler, R.C., Gui, Y.H., Linask, K.K., Muschel, R.J. (1995). MMP-9 (Gelatinase B) mRNA is expressed during mouse neurogenesis and may be associated with vascularization. Brain Res. 88(1): 37-52. 22. Casasco, A., Casasco, M., Reguzzoni, M., Calligaro, A., Tateo, S., Stetler-Stevenson, W.G., Liotta,
L.A.
(1995).
Occurrence
and
distribution
of
matrix
metalloproteinase-2-
immunoreactivity in human embryonic tissues. Eur. J. Histochem. 39(1): 31-8. 23. Chin, J.H. (1989). Adenosine receptors in brain: neuromodulation and role in epilepsy. Ann. Neurol. 26: 695-698. 24. Chintala, S.K., Zhang, X., Austin, J.S., Fini, M.E. (2002). Deficiency in matrix metalloproteinase gelatinase B (MMP-9) protects against retinal ganglion cell death after optic nerve ligation. J. Biol. Chem. 277: 47461-47468.
65
25. Connors, B. W., Malenka, R. C., Silva, L. R. (1988). Two inhibitory postsynaptic potentials, and GABAa and GABAb receptor-mediated responses in neocortex of rat and cat. J. Physiol. 406: 443–468. 26. Crunelli, V., Haby, M., Jassik-Gerschenfeld, D., Leresche, N., Pirchio, M. (1988). Cl- and Kdependent inhibitory postsynaptic potentials evoked by interneurones of the rat lateral geniculate nucleus. J. Physiol. 399: 153–176. 27. Crunelli, V. & Leresche, N. (1991). A role for GABAb receptors in excitation and inhibition of thalamocortical cells. TINS 14: 16–21. 28. Cuzner, M.L. & Opdenakker, G. (1999). Plasminogen activators and matrix metalloproteases, mediators of extracellular proteolysis in inflammatory demyelination of the central nervous system. J. Neuromimmunol. 94: 1-14. 29. Dai, K. S. & Woolley, D. E. (1991). Ro 5-4864, like picrotoxin, enhances EPSP-spike coupling in the freely behaving rat. Brain Res. Bull. 27: 13–17. 30. Davies, J.E., Dedhia, H.V., Morgade, C., Barquet, A., Maibach, H.I. (1983). Arch. Dermatol. 119(2): 142-144. 31. de Mendonca, A., Ribeiro, J.A. (1993). Adenosine inhibits the NMDA receptor-mediated excitatory postsynaptic potential int he hippocampus. Brain Res. 606: 351-356. 32. Del Arco A., Segovia, G., Fuxe, K., Mora, F. (2003). Changes in dialysate concentrations of glutamtae and GABA in the brain: an index of volume transmission mediated actions? J. Neurochem. 85(1): 23-33. 33. Dobolyi, A., Reichardt, A., Szikra, T., Szilágy, N., Kékesi, A.K., Karancsi, T., Slégel, P., Palkovits, M., Juhász, G. (1998). Analysis of purine and pyrimidine bases, nucleosides and deoxynucleosides
in
brain
microsamples
(microdialysates
and
micropunches)
and
cerebrospinal fluid. Neurochem. Int. 32: 247-256. 34. Dobolyi, A., Szikra, T., Kékesi, A.K., Kovács, Z., Juhász, G. (1999). Uridine is realeased by depolarization and inhibits unit activity in the rat hippocampus. Neuroreport 10: 3049-3053. 35. Dzwonek, J., Rylski, M., Kaczmarek, L. (2004). Matrix metalloproteinases and their endogenous inhibitors in neuronal physiology of the adult brain. FEBS Lett. 567: 129-135. 36. Elmquist, W.F. & Sawchuk, R.J. (1997). Application of microdialysis in pharmacokinetic studies. Pharm. Res. 14(3): 267-88.
66
37. Fellin, T., Pascual, O., Gobbo, S., Pozzan, T., Haydon, P.G., Carmignoto, G. (2004). Neuronal synchrony mediated by astrocytic glutamate through activation of extrasynaptic NMDA receptors. Neuron 43(5): 729-743. 38. Fini, M.E., Girard, M.T., Matsubara, M. (1992). Collagenolytic/gelatinolytic enzymes in corneal wound healing. Acta Ophthalmol. Suppl. 202: 26-33. 39. Fisher, R.S. (1989). Animal models of epilepsies. Brain Res. Rev. 14: 245-278. 40. Fraser, D. D., Duffy, S., Angelides, K. J., Perez-Velazquez, J. L., Kettenmann, H., MacVicar, B. A. (1995). GABAA/Benzodiazepine receptors in acutely isolated hippocampal astrocytes.J. Neurosci. 15: 2720–2732. 41. Galambos, R., Szabó-Salfay, O., Barabás, P., Pálhalmi, J., Szilágyi, N., Juhász, G. (2000). Temporal distribution of ganglion cell voleys in the normal rat optic nerve. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13454-13459. 42. Galardy R.E., Cassabonne, M.E., Giese, C., Gilbert, J.H., Lapierri, F., Lopez, H., Schaefer, M.E., Stack, R., Sullivan M., Summers, B. et al. (1994). Low molecular weight inhibitors in corneal ulceration. Ann. NY Acad. Sci. 732: 315-323. 43. Gao, H., Hollyfield, J.G. (1996). Basic fibroblast growth factor: increased gene expression in inherited and light-induced photoreceptor degeneration. Exp. Eye Res. 62(2): 181-9. 44. Gardner, J., Ghorpade, A. (2003).Tissue inhibitor of metallioproteinase (TIMP)-1: the ZIMPed balance of marix metalloproteinases in the central nervous system. J. Neurosci. Res. 74(6): 801806. 45. Glickamn, R.D. (2002). Phototoxicity to the retina: mechanisms of damage. Int. J. Toxicol. 21: 473-490. 46. Gordon, W.C., Casey, D.M., Lukiw, W.J., Bazan, N.G. (2002). DNA damage and repair in light-induced photoreceptor degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43(11): 3511-21. 47. Gross, J. & Lapière, C.M. (1962). Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1014-1022. 48. Gu, Z., Kaul, M., Yan, B., Kridel, S.J., Cui, J., Strongin, A., Smith, J.W., Liddington, R.C., Lipton, S.A. (2002). S-nitrosylation of matrix metalloproteinases: signaling pathway to neuronal cell death. Science 297: 1186-1190. 49. Guo, L., Moss, S.E., Alexander, R.A., Ali, R.R., Fitzke, F.W., Cordeiro, M.F. (2005). Retinal ganglion cell apoptosis in glaucoma is related to intraocular pressure and IOP-induced effects on extracellular matrix. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46(1): 175-182.
67
50. Gursoy-Ozdemir, Y., Qiu, J., Matsuoka, N., Bolay, H., Bermpohl, D., Jin, H., Wang, X., Rosenberg, G.A., Lo, E.H. and Moskowitz, M.A. (2004). Cortical spreading depression activates and upregulates MMP-9. J. Clin. Invest. 113: 1447-1455. 51. Gutrie, P.B., Knappenberger, J., Segal, M., Bennett, M.V., Charles, A.C., Kater, S.B. (1999). ATP released from astrocytes mediates glial calcium waves. J. Neurosci. 19(2): 520-528. 52. Hafezi, F., Marti, A., Munz, K., Remé, C.E. (1997a). Light-induced apoptosis: differential timing in the retina and pigment epithelium. Exp. Eye Res. 64: 963-970. 53. Hafezi, F., Steinbach, J.P., Marti, A., Munz, K., Wang, Z.-Q., Wagner, E.F., Aguzzi, A., Remé, C.E. (1997b). The absence of c-fos prevents light-induced apoptotic cell death of photoreceptors in retinal degeneration in vivo. Nat. Med. 3: 346-349. 54. Hahn-Dantona, E., Ruiz, J.F., Bornstein, P., Strickland, D.K. (2001). Te low density lipoprotein receptor-related protein modulates levels of matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) by mediating ints cellular catabolism. J. Biol. Chem. 276(18): 15498-15503. 55. Halassa, M.M., Fellin, T., Haydon, P.G. (2007). The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease. Trends Mol. Med. 13(2): 54-63. 56. Hattori, S., Fujisaki, H., Kiriyama, T., Yokoyama, T., Irie, S. (2002). Real-time zymography and reverse zymography: a method for detection of matrix metalloproteinases and their inhibitors using FITC-labeled collagen and casein as substrates. Anal. Biochem. 301: 27-34. 57. Henderson, J.W., Ricker, R.D., Bidlingmeyer, B.A., Woodward, C. (2000). Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies, www.agilent.com/chem/supplies. 58. Heo, J.H., Lucero, J., Abumiya, T., Koziol, J.A., Copeland, B.R., Zoppo, G.J. (1999). Matrix metalloproteinases increase very early during experimental focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19: 624-633. 59. Hooper, N.M. (szerk.) (1996). Zinc metalloproteases in health and disease. Taylor & Francis Ltd., London, Bristol. 7. fejezet: Nagase, H.: Matrix metalloproteinases, 153-204. 60. Jourquin, J., Tremblay, E., Décanis, N., Charton, G., Hanessian, S., Chollet, A.-M., Le Dieguardher, T., Khrestchatisky, M., Rivera, S. (2003). Neuronal activity-dependent increase of net matrix metalloproteinase activity is associated with MMP-9 neurotoxicity after kainate. Eur. J. Neurosci. 18: 1507-1517.
68
61. Joy, R. M. & Albertson, T. E. (1987). Factors responsible for increased excitability of dentate gyrus granule cells during exposure to lindane. Neurotoxicology 8: 517–524. 62. Kaczmarek, L. Lapinska-Dzwonek, J., Szymmczak, S. (2002). Matrix metalloproteinases int he adult brain physiology: a link between c-Fos, AP-1 and remodeling of neuronal connections? EMBO J. 21(24): 6643-6648. 63. Kardos, J., Elster, L., Damgaard, I., Krogsgaard-Larsen, P., Schousboe, A. (1994). Role of GABAB receptors in intracellular Ca21 homeostasis and possible interaction between GABAA and GABAB receptors in regulation of transmitter release in cerebellar granule neurons. J. Neurosci. Res. 39: 646–655. 64. Kramer, M.S., Hutchinson, T.A., Rudnick, S.A., Leventhal, J.M., Feinstein, A.R. (1980). Operational criteria for adverse drug reactions in evaluating suspected toxicity of a popular scabicide. Clin. Pharmacol. Ther. 27(2): 149-155. 65. Krogsgaard-Larsen, P., Frolund, B., Jorgensen, F., Schousboe, A. (1994). GABAA receptor agonists, partial agonists, and antagonists. Design and therapeutic prospects. J. Med. Chem. 37: 2489–2505. 66. Lansel, N., Hafezi, F., Marti, A., Hegi, M., Remé, C., Niemeyer, G. (1998-1999). The mouse ERG before and after light damage is independent of p53. Doc. Ophthalmol. 96(4): 311-20. 67. Larsen, P.H., Wells, J.E., Stallcup, W.B., Opdenakker, G., Yong, V.W. (2003). Matrix metalloproteinase-9 facilitates remyelination in part by processing the inhibitory NG2 proteoglycan. J. Neurosci., 23, 11127-35. 68. Larsen, P.H., DaSilva, A.G., Conant, K., Yong, V.W. (2006). Myelin formation during development of the CNS is delayed in matrix metalloproteinase-9 and -12 null mice. J. Neurosci. 26(8): 2207-2214. 69. LaVail, M.M, Gorrin, G.M., Repaci, M.A., Yasumura, D. (1987). Light-induced retinal degeneration in albino mice and rats: strain and species differences. In: LaVail, M.M., Hollyfield, J.G., Anderson, R.E. (eds.) Degenerative retinal disorders: clinical and laboratory investigations, Alan R. Liss, Inc., New York, pages: 439-454. 70. LaVail, M.M., Unoki, K., Yasumura, D., Matthes, M.T., Yancopoulos, G.D., Steinberg, R.H. (1992). Multiple growth factors, cytokines, and neurotrophins rescue photoreceptors from the damaging effects of constant light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11249-11253. 71. Lee, S.-R., Tsuji, K., Lee, S.-R., Lo, E. H. (2004). Role of matrix metalloproteinases in delayed neuronal damage after transient global cerebral ischemia. Neurobiol. Dis. 24: 671-678.
69
72. Li, F., Cao, W., Anderson, R.E. (2003). Alleviation of constant light-induced photoreceptor degeneration by adaptation of adult albino rat to bright cyclic light. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44(11): 4968-4975. 73. Li, C.Y., Lu, J.T., Wu, C.P., Duan, S.M., Poo, M.M. (2004). Bidirectional modification of presynaptic neuronal excitability accompanying spike timing-dependent synaptic plasticity. Neuron 41: 257-268. 74. Liu, C., Peng, M., Laties, A.M., Wen, R. (1998). Preconditioning with bright light evokes a protective response against light damage in the rat retina. J. Neurosci. 18(4): 1337-1344. 75. Llorens, J. Sunol, C., Tusell, J. M., Rodriguez-Farré, E. (1991). Evidence for acute tolerance to the behavioral effects of lindane: concomitant changes in regional monoamine status. NeuroToxicology 12: 697–706. 76. MacVicar, B. A., Tse, F. W., Crichton, S. A., Kettenmann, H. (1989). GABA-activated Cl2 channels in astrocytes of hippocampal slices. J. Neurosci. 9: 3577–3583. 77. Mali, R.S., Cheng, M., Chintala, S.K. (2005). Intravitreous injection of membrane depolarization agent causes retinal degeneration via matrix metalloproteinase-9. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46: 2125-2132. 78. Malik, S., Cohen, D., Meyer, E., Perlman, I. (1986). Light damage in the developing retina of the albino rat: an electroretinographic study. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27: 164-167. 79. Manabe, S., Gu, Z., Lipton, S. A. (2005). Activation of matrix metalloproteainse-9 via neuronal nitric oxide synthase contributes to NMDA-induced retinal ganglion cell death. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46(12): 4747-4753. 80. McCallum, J.E. (1983). Improvement in somatosensory evoked response amplitude and neurologic function following DMSO in a cat model of chronic spinal cord compression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 411: 357-360. 81. McCawley, L.J. & Matrisian, L.M. (2001). Matrix metalloproteinases: they’re not just for matrix anymore! Curr. Opin. Cell Biol. 13: 534-540. 82. Meighan, S.E., Meighan, P.C., Choudhury, P., Davis, C.J., Olson, M.L., Zornes, P.A., Wright, J.W., Harding, J.W. (2006). Effects of extracellular matrix-degrading proteases matrix metalloproteinase 3 and 9 on spatial learning and synaptic plasticity. J. Neurochem. 96: 12271241.
70
83. Michaluk, P., Kolodziej, L., Mioduszewska, B. Wilczynski, G.M., Dzwonek, J., Jaworski, J., Gorecki, D.C., Ottersen, O.P., Kaczmarek, L. (2007). Beta-dystrogylcan as target for MMP-9, in response to enhanced neuronal activity. J. Biol. Chem. 282(22): 16036-16041. 84. Mody, I., Otis, T.S., Staley, K.J., Kohr, G.(1992). The balance between excxitation and inhibition in dentate granule cells and its role in epilepsy. Epilepsy Res. 9: 331-339 (Suppl.) 85. Moyer, J.R. Jr., Thompson, L.T., Disterhoft, J.F. (1996). Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning specific manner. J. Neurosci. 16: 5536-5546. 86. Mumenthaler, M. (1989). Neurológia. Medicina, Budapest. Epilepsiák fejezet, 249-271 oldalak. 87. Nagase,
H.
(1996).
Matrix
metalloproteinses.
In:
Hooper,
N.M.
(szerk.)
Zinc
metalloproteinases in health and disease. Taylor & Francis Ltd., London, 7. fejezet, 153-204 oldal. 88. Nagase, H. & Woessner, J.F.Jr. (1999). Matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 274(31): 21491-21494. 89. Nagy, V., Bozdagi, O., Matynia, A., Balcerzyk, M., Okulski, P., Dzwonek, J., Costa, R.M., Silva, A.J., Kaczmarek, L., Huntley, G.W. (2006). Matrix metalloproteinase-9 is required for hippocampal late-phase long-term potentiation and memory. J. Neurosci. 26: 1923–1934. 90. Nakahiro, M., Arakawa, O., Narahashi, T., Ukai, S., Kato, Y., Nishinuma, K., Nishinuma, T. (1992). Dimethyl sulfoxyde (DMSO) blocks GABA-induced current in rat dorsal root ganglion neurons. Neurosci. Lett. 138: 5–8. 91. Newberry, N. R. & Nicoll, R. A. (1985). Comparison of the action of baclofen with gammaaminobutyric acid on rat hippocampal pyramidal cells in vitro. J. Physiol. 360: 161–185. 92. Newman, E.A. & Odette, L.L. (1984). Model of electroretinogram b-wave generation: a test of the K+ hypothesis. J. Neurophysiol. 51: 164-182. 93. Noell, W.K., Walker, V.S., Kang, B.S., Berman, S. (1966). Retinal damage by light in rats. Invest. Ophthalmol. 5: 450-473. 94. Nowak, J.Z. (1988). The isolated retina as a model of the CNS pharmacology. Trends Pharmacol Sci. 9: 80-82. 95. Nyikos, L., Lasztóczi, B., Antal, K., Kovács, R., Kardos, J. (2003). Desynchronisation of spontaneously recurrent experimental seizures proceeds with a single rhythm. Neuroscience. 121(3): 705-17.
71
96. Oh, L.Y., Larsen, P.H., Krekoski, C.A., Edwards, D.R., Donovan, F., Wer, Z., Yong, V.W. (1999). Matrix metalloproteinase-9/gelatinase B is required for process outgrowth by oligodendrocytes. J. Neurosci. 19: 8464-8475. 97. Okada, Y., Gonoji, Y., Naka, K., Tomitall, K., Nakanishi, I., Iwatall, K., Yamashita, K., Hayakawa, T. (1992). Matrix metalloproteinase-9 (92-kDa Gelatinase/Type IV collagenase) from HT-1080 human fibrosarcoma cells. J. Biol. Chem. 267(30): 21712-21719. 98. Olson, M.W., Bernardo, M.M., Pietila, M., Gervasi, D.C., Toth, M., Kotra, L.P., Massova, I., Mobashery, S., Fridman, R. (2000). Characterization of the monomeric and dimeric forms of latent and active matrix metalloproteinase-9. J. Biol. Chem 275(4): 2661-2668. 99. Organisciak, D.T., Darrow, R.M., Barsalou, L., Kutty, R.K., Wiggert, B. (2000). Circadiandependent retinal light damage in rats. Invest. Ophthtalmol. Vis. Sci. 41(12): 3694-3701. 100. Ozkoc, H.B., Bakab, G., Ariman, S. (2007). Distribution and bioaccumulation of organochlorine pesticides along the Black Sea coast. Environ. Geochem. Health. 29(1): 5968. 101. Padgett, L.C., Lui, G.M., Werb, Z., LaVail, M.M. (1997). Matrix metalloproteinase-2 and tissue
inhibitor of metalloproteinase-1
in the
retinal
pigment epithelium and
interphotoreceptor matrix: vectorial secretion and regulation. Exp. Eye res. 64: 927-938. 102. Pascual, O., Casper, K.B., Kubera, C., Zhang, J., Revilla-Sanchez, R., Sul, J.Y., Takano, H., Moss, S.J., McCarthy, K., Haydon, P.G. (2005). Astrocytic purinergic signalling coordinates synaptic network. Science 310(5745): 113-116. 103. Paxinos, G.& Watson, C. (1997). The rat brain stereotaxic coordinates. Academic Press, Orlando. 104. Penn, J.S., Naash, M.I., Anderson, R.E. (1987). Effect of light history on retinal antioxidant and light damage susceptibility in the rat. Exp. Eye Res., 44(6): 779-788. 105. Penn, J.S. & Anderson, R.E. (1987). Effect of light history on rod-outer segment membrane composition in the rat. Exp. Eye Res. 44(6): 767-778. 106. Planas, A.M., Sole, S., Justicia, C. (2001). Expression and activation of matrix metalloproteinase-2 and -9 in rat brain after transient focal cerebral ischemia. Neurobiol. Dis. 8, 834-846. 107. Planas, A.M., Justicia, C., Sole, S., Friguls, B., Cervera, A., Adell, A.., Chamorro, A. (2002). Certain forms of matrix metalloproteinase-9 accumulate in the extracellular space after
72
microdialysis probe implantation and middle cerebral artery occlusion/reperfusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 22, 918-925. 108. Pugin, J., Widmer, M.C., Kossodo, S., Liang, C.M., Preas II, H.L., Suffredini, A.F. (1999). Human neutrophils secrete gelatinase B in vivo in response to endotoxin and proinflammatory mediators. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20: 458-464. 109. Raghava, S., Hammond, M., Kompella, U.B. (2004). Periocular routes for retinal drug delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 1: 99-114. 110. Rivas, A., Cerillo, I., Granada, A., Mariscal-Arcas, M., Olea-Serrano, F. (2007). Pesticide exposure of two age groups of women and its relationship with their diet. Sci. Total. Environ. 382(1): 14-21. 111. Rivera, S., Ogier, C., Jourquin, J., Timsit, S., Szklarczyk, A. W., Miller, K., Gearing, A. J. H., Kaczmarek, L., Khrestchatisky, M. (2002). Gelatinase B and TIMP-1 are regulated in a celland time-dependent manner in association with neuronal death and glial reactivity after global forebrain ischemia. Eur. J. Neurosci. 15: 19-32. 112. Roh, S. & Weiter, J.J. (1994). Light damage to the eye. J. Florida M.A. 81(4): 248-251. 113. Rosenberg, G.A., Navratil, M., Barone, F., Feuerstein, G. (1996). Proteolytic cascade enzymes increase in focal cerebral ischemia in rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16: 360-366. 114. Salzmann, J., Limb, G.A, Khaw, P.T., Gregor, Z.J., Webster, L., Chignell, A.H., Charteris, D.G. (2000). Matrix metalloproteinases and their natural inhibitors in fibrovascular membranes of proliferative diabetic retinopathy. Br. J. Ophthalmol. 84: 1091-1096. 115. Sawada, M. & Sato, M. (1975). The effect of dimethyl sulfoxide on the neuronal excitability and cholinergic transmission in Aplysia ganglion cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 243: 337-357. 116. Schousboe, A. (1999). Pharmacologic and therapeutic aspects of developmentally regulated expression of GABAA and GABAB receptors: cerebellar granule cells as a model system. Neurochem. Int. 34: 373–377. 117. Schultz, D.J., Goaillard, J.M., Marder, E. (2006a). Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9: 356-362. 118. Schultz, J.D. (2006b). Plasticity and stability in neuronal output via changes in intrinsic excitability: it’s what’s inside that counts. J. Exp. Biol. 209: 4821-4827. 119. Senhadji, L. & Wendling, F. (2002). Epileptic transient detection: wavelets and timefrequency approaches. Neurophysiol. Clin. 32(3): 175-192.
73
120. Serrano, A., Haddjeri, N., Lacaille, J.C., Robitailler, R. (2006). GABAergic network activation of glial cells underlies ippocampal heterosynaptic depression. J. Neurosci. 26: 5370-5382. 121. Sierra-Paredes, G., Galán-Valiente, J., Vazquez-Illanes, D., Aguilar-Veiga, E., Soto-Otero, R., Mendez-Alvarez, E., Sierra-Marcuno, G. (1998). Extracellular amino acids in the rat hippocampus during picrotoxin threshold seizures in chronic microdialysis experiments. Neurosci. Lett. 248: 53–56. 122. Sierra-Paredes, G. & Sierra-Marcuño, G. (2007). Extrasynaptic GABA and glutamate receptors in epilepsy. CNS Neurol Disord. Drug Targets. 6(4): 288-300. 123. Sivak, J.M., Mohan, R., Rinehart, W.B., Xu, P.X., Maas, R.L., Fini, M.E. (2000). Pax-6 expression and activity are induced in the reepithelializing cornea and control activity of the transcriptional promoter for matrix metalloproteinase gelatinase b. Dev. Biol. 222(1): 41-54. 124. Sivak, J.M. & Fini, M.E. (2002). MMPs in the eye: emerging roles for matrix metalloproteinases in ocular physiology. Progr. Ret. Eye Res. 21: 1-14. 125. Smolders, I. & Michotte, Y. (2007). The use of microdialysis for the study of neurological disorders. pp. 435-453. In: Handbook of microdialysis. Vol. 16. (szerk. Westerinck, B.H.C. & Cremers, T.I.F.H., Elsevier, Academic Press, Amszterdam, 2007. 126. Sternlicht, M.D. & Werb, Z. (2001). How matrix metalloproteinases regulate cell behavior. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 463-516. 127. Stolc, S. & Vlckova, E. (1982). Facilitatory effect of some drugs on transmission in the frog sympathetic ganglion. J. Auton. Nerv. Syst. 6: 335-345. 128. Stone, J., Maslim, J., Valter-Kocsi, K. Mervin, K., Bowers, F., Chu, Y., Barnett, N., Provis, J., Lewis, G., Fisher, S.K., Bisti, S., Gargini, C., Cervetto, L., Merin, S., Pe’er, J. (1999). Mechanisms of photoreceptor death and survival in mammalian retina. Progr. Ret. Eye Res. 18: 689-735. 129. Sugawara, T., Sieving, P.A., Bush, R.A. (2000). Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Exp. Eye Res. 70: 693-705 130. Sugita , S., Saito, F., Tang, J., Satz, J., Campbell, K., Sudhof, T.C. (2001). A stoichiometric complex of neurexin and dystrglycan in brain. J. Cell. Biol. 154(2): 435-445. 131. Suñol, C., Tussel, J.M., Gelpí, E., Rodríguez-Farré, E. (1989). GABAergic modulation of lindane (gamma-hexachlorcyclohexane)-induced seizures. Toxicol. Appl. Pharmacol. 100(1): 1-8.
74
132. Syková, E. (2005). Glia and volume transmission during physioogical and pathological states. J. Neural. Transm. 112(1): 137-147. 133. Szabó-Salfay, O., Pálhalmi, J., Szatmári, E., Barabás, P., Szilágyi, N., Juhász G. (2001). The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Res. Bull. 56: 714. 134. Szklarczyk, A., Lapinska, J., Rylski, M., McKay, R.D.G., Kaczmarek, L. (2002). Matrix metalloproteinase-9 undergoes expression and activation during dendritic remodeling in adult hippocampus. J. Neurosci. 22(3): 920-930. 135. Taishi, P., Sanchez, C., Wang, Y., Fang, J., Harding, J.W., Krueger, J.M. (2001). Conditions that affect sleep alter the expression of molecules associated with synaptic plasticity. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281: R839-R845. 136. Tang, Y., Kesavan, P., Nakada, M.T., Yan, L. (2004). Tumor-stroma interaction: positive feedback regulation of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) expression and matrix metalloproteinase-dependent generation of soluble EMMPRIN. Mol. Cancer Res. 2: 73-80. 137. Taylor, H.R., West, S, Muñoz, B., Rosenthal, F.S., Bressler, S.B., Bressler, N.M. (1992). Long-term effects of visible light on eye. Arch. Ophthalmol. 110: 99-104. 138. Thacker, N., Bassin, J., Deshpande, V., Devotta, S. (2007). Trends of organochloride pesticides in drinking water supplies. Environ. Monit. Assess. (in press) 139. Thompson, L.T., Moyer, J.R.Jr., Disterhoft, J.F. (1996). Transient changes in excitability of rabbit CA3 neurons with a time course appropriate to support memory consolidation. J. Neurophysiol. 76: 1836-1849. 140. Tita, B., Leone, M.G., Casini, M,L. et al (2001). Corneal toxicity of xylazine and clonidine, in combination with ketamine, in the rat. Ophthalmic Res. 33: 345-352. 141. Torrence, C.H. & Compo, G.P. (1990). Practical guide to waavelet analysis. Bull. A.m. Meteorol. Soc. 79: 61-78. 142. Tsien, R.Y. (1980). New calcium indicators and buffers with high selectivity against magnesium and protons: design, synthesis, and properties of prototype structures. Biochemistry 19: 2396-2404. 143. Uehara, F., Matthes, M.T., Yaasumara, D., LaVail, M.M. (1990). Light-evoked changes in the interphotoreceptor matrix. Science 248: 1633-1636.
75
144. Uhm, J.H., Dooley, N.P., Oh, L.Y., Yong, V.W. (1998). Oligodendrocytes utilize a matrix metalloproteinase, MMP-9, to extend processes along astrocyte extracellular matrix. Glia 22: 53-63. 145. Ungerstedt, U. (1991). Microdialysis - principles and applications for studies in animals and man. J. Intern. Med. 230(4): 365-73. 146. Urenjak, J. & Obrenovitch, T.P. (2007). Microdialysis as a platform for multidisciplinary strategies. 201-215. In: Handbook of microdialysis. Vol. 16. (szerk. Westerinck, B.H.C. & Cremers, T.I.F.H., Elsevier, Academic Press, Amszterdam, 2007. 147. Vaillant, C., Didier-Bazès, M., Hutter, A., Belin, M.-F., Thomasset, N. (1999). Spatiotemporal expression patterns of metalloproteinases and their inhibitors in the postnatal developing rat cerebellum. J. Neurosci. 19(12): 4994–5004. 148. Van den Steen, P.E., Dubois, B., Nelissen, I., Rudd, P.M., Dwek, R.A., Opdenakker, G. (2002). Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 37(6): 375-536. 149. van Norren, D. (1991). Photochemical damage to the eye. News Physiol. Sci. 6: 232-234. 150. Van Wart, H.E. & Birkedal-Hansen, H. (1990). The cysteine switch: a principle of regulation of
metalloproteinase
activity
with
potential
applicability
to
the
entire
matrix
metalloproteinase gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5578-5582. 151. Vendrell, M., Tusell, J.M., Serratosa, J. (1992). c-fos expression aas a model for studying the action of hexachlorocyclohexane isomers in the CNS. J. Neurochem. 58(3): 862-869. 152. von Krosigk, M., Bal, Th., McCormick, D. A. (1993). Cellular mechanisms of a synchronised oscillation in the thalamus. Science 261: 361–364. 153. Vu, T.H. & Werb, Z. (2000). Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal physiology. Genes Dev. 14: 2123-2133. 154. Walsh, N., Valter, K., Stone, J. (2001). Cellular and subcellular patterns of expression of bFGF and CNTF in the normal and light stressed adult rat retina. Exp. Eye Res. 72(5): 495501. 155. Wang, X., Jung, J., Asahi, M., Chwang, W., Russo, L., Moskowitz, M.A., Dixon, C.E., Fini, M.E., Lo, E.H. (2000). Effects of matrix metalloproteinase-9 gene knock-out on morphological and motor outcomes after traumatic brain injury. J. Neurosci. 20: 7037-7042.
76
156. Wang, X., Lou, N., Xu, Q., Tian, G.F., Peng, W.G., Han, X., Kang, J., Takano, T., Nedergaard, M. (2006). Astrocytic Ca2+ signaling evoked by sensory stimulation in vivo. Nat. Neurosci. 9(6): 816-823. 157. Weeks, J.G., Halme, J., Woessner, J.F.Jr. (1976). Extraction of collageanse from the involuting rat uterus. Biochim. Biophys. Acta 445: 205-214. 158. Wen, R., Cheng, T., Li, Y., Cao, W., Steinberg, R. H. (1996). α2-Adrenergic agonists induce basic fibroblast growth factor expression in photoreceptors in vivo and ameliorate light damage. J. Neurosci. 16: 5986-5992. 159. Wenzel, A., Grimm, C., Marti, A., Kueng-Hitz, N., Hafezi, F., Niemeyer, G., Remé, C.E. (2000). c-fos controls the “private pathway” of light-induced apoptosis of retinal photoreceptors. J. Neurosci. 20: 81-88. 160. Wenzel, A., Grimm, C., Samardzija, M., reme, C.E. (2005). Molecular mechanisms of lightinduced photoreceptor apoptosis and neuroprotection for retinal degeneration. Progr. Retin. Eye Res. 24(2): 275-306. 161. Woessner, J.F.Jr. (1995). Quantification of matrix metalloproteinases in tissue samples. Meth. Enzymol. 248: 510-528. 162. Wong, T.T.L., Sethi, C., Daniels, J.T., Limb, G.A., Murphy, G., Khaw, P.T. (2002). Matrix metalloproteinases in disease and repair processes in the anterior segment. Surv. Ophthalmol. 47: 239-256. 163. Wright, J.W., Masino, A.J., Reichert, J.R., Turner, G.D., Meighan, S.E., Meighan, P.C., Harding, J.W. (2003). Ethanol-induced impairment of spatial memory and brain matrix metalloproteinases. Brain. Res. 963, 252-261. 164. Yong, V.W., Krekoski, C.A., Forsyth, P.A., Bell, R., Edwards, D.R. (1998). Matrix metalloproteinases and diseases of the CNS. Trends Neurosci. 21(2): 75-80. 165. Young, R.W. (1988). Solar radiation and age-related macular degeneration. Surv. Ophthalmol. 32: 252-269. 166. Young, R.W. (1994). The family of sunlight-related eye diseases. Optometry Vis. Sci. 71: 125144. 167. Yuan, L. & Neufeld, A.H. (2001). Activated microglia in the human glaucomatous optic nerve head. J. Neurosci. Res. 64(5): 523-532.
77
168. Zhang, J.W., Deb. S., Gottshall, P.E. (1998). Regional and differential expression of gelatinases in rat brain after systemic kainic acid or bicuculline administration. Eur. J. Neurosci. 10: 3358-3368. 169. Zhang, X., Sakamoto, T., Hata, Y., Kubota, T., Hisatomi, T., Murata, T., Ishibashi, T., Inomata, H. (2002). Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in experimental retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Exp. Eye Res. 74: 577-584. 170. Zhang, W. & Linden, D.J. (2003). The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat. Rev. Neurosci. 4: 885-900. 171. Zhang, X & Chintala, S. K. (2004). Influence of interleukin-1 beta induction and mitogenactivated protein kinase phosphorylation on optic nerve ligation-induced matrix metalloproteinase-9 activation in the retina. Exp Eye Res. 78: 849-860. 172. Zhang, X., Cheng, M. and Chintala, S.K. (2004). Kainic-acid mediated upregulation of matrix metalloproteinase-9 promotes retinal degeneration. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45: 23742383. 173. Zimmermann, H. (1996). Extracellular purine metabolism. Drug Development Res. 39: 337– 352. 174. Zoli, M. & Agnati, L.F. (1996). Wiring and volume transmission in the central nervous system: the concept of closed and open synapses. Prog . Neurobiol. 49(4): 363-380.
78
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACSF
artificial cerebrospinal fluid (mesterséges cerebrospinális folyadék; mesterségesliquor)
ANF
atrial natriuretic factor
ANOVA
analysis of variance (varianciaanalízis)
Asp
aszparaginsav
ASCII
American Standard Code for Information Interchange
ATP
adenozin trifoszfát
BDNF
Brain-derived Neurotrophic Factor
bFGF
basic Fibroblast Growth Factor
bp
base pair (bázis-pár)
Cys
cisztein
DMSO
dimethylsulphoxide (dimetil szulfoxid)
ECF
extracelluláris folyadék
ECM
extracelluláris mátrix
EDTA
ethylenediamintetraacetic acid (etilendiamin tetraecetsav)
FFT
Fast Fourier Transform (gyors Fourier transzformáció)
FITC
fluorescent isothiocyanate (fluoreszcens izotiocianát)
GABA
γ-amino vajsav
GCL
ganglion cell layer
GLM
general linear model
Gln
glutamin
Glu
glutaminsav
Gly
glicin
His
hisztidin
HPLC
high performance liquid chromatography (nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia)
HRP
horseradish peroxidase (torma-peroxidáz)
INL
inner nuclear layer (belső magvas réteg)
ip.
intraperitonealis
IPL
inner plexiform layer
LED
light-emitting diode (fénykibocsátó dióda) 79
LTD
long-term depression
LTP
long-term potentiation
MBP
myelin basic protein
Met
metionin
MMP
matrix metalloproteináz
MT-MMP
membrane-type matrix metalloproteinase (membrán-kötött metalloproteináz)
NGAL
neutrophil gelatinase associated lipocalin
NMDA
N-methyl-D-aspartate (N-metil-D-aszparaginsav)
ODS
octadecylsilan (oktadecilszilán)
ONL
outer nuclear layer (külső magvas réteg)
OPA
orto-phthalaldehyde (orto-ftalaldehid)
PMSF
phenylmethanesulfonyl fluoride
RT-PCR
reverse-transcription - polimearse chain reaction (reverz transzkripció - polimeráz láncreakció)
SDS
sodium dodecyl sulphate (nátrium dodecilszulfát)
SEM
standard error of the mean (az átlag standard hibája)
Tau
taurin
TBST
Tris buffered saline - Tween (Trissel pufferolt, Tween tartalmú sóoldat)
TGF-β
Transforming growth factor- β
TIMP
Tissue inhibitor of metalloproteinases
TMR
tetramethylrhodamine (tetrametilrodamin)
TNF-α
Tumor necrosis factor- α
TUNEL
Terminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUTP nick end-labeling (terminális dezoxinukleotidil transzferáz-mediált tetrametilrodamin dUTP „nick” végjelölés)
UV
ultraviolet (ultraibolya)
80
ÁBRÁK JEGYZÉKE 1. ábra
A zselatinázok domén struktúrája.
2. ábra
Az MMP-k proteolitikus aktivációs kaszkádja.
3. ábra
A foto-stressz kísérletekben használt fénykibocsátó diódák mért emissziós spektruma.
4. ábra
Elektroretinogram részlet, mely példázza a b-hullám amplitúdójának mérését.
5. ábra
A foto-stressz reverzibilis funkcionális zavarokat okoz a retinában.
6. ábra
A foto-stressz nem okoz kiterjedt szerkezeti átrendeződést a retinában.
7. ábra
A DNS fragmentáció in situ analízise TUNEL festéssel.
8. ábra
Foto-stresszt követő változások az MMP-2 illetve MMP-9 mRNS szintekben a szem különböző struktúráiban.
9. ábra
Foto-stresszt követő változások az MMP-2 illetve MMP-9 fehérje szintekben a szem különböző struktúráiban.
10. ábra
Xilazin hatása. Zselatin zimográfia a szem különböző struktúráiból.
11. ábra
A retrobulbarisan injektált széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001 hatása a foto-stressznek kitett retina mintákban.
12. ábra
A retrobulbarisan injektált széles spektrumú MMP-inhibitor GM6001 hatása a foto-stressznek kitett retina funkcionális visszatérésére.
13. ábra
Szokásos állatházi nappali fény (500 lux) MMP-9-indukciót okoz az éber, szabadon-mozgó patkány retinájában.
14. ábra
Halothan-altatott patkány elektroencefalogram 2 s-es szakaszai kontroll, illetve Picrotoxin és Lindán injektálását követően.
15. ábra
Jellemző 10 s-es elektroencefalogram szakaszok és a megfelelő wavelet-analízis energia-spektrumai.
16. ábra
A Picrotoxin és Lindán különböző dózisainak injektálását követően kimutatható változások az extracelluláris Asp és Glu szintekben Halothan-altatott patkányok hippocampusában.
17. ábra
A picrotoxin és Lindán különböző dózisainak injektálását követően kimutatható változások az extracelluláris hipoxantin, xantin, uridin és inozin szintekben Halothan-altatott patkányok hippocampusában.
81
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Doktori munkám elvégzéséhez nyújtott segítségükért köszönettel tartozom: Dr. Juhász Gábornak Dr. Kardos Juliannának Dr. Kékesi Adrienna Katalinnak Dr. Lőrincz Magornak Nyilas Ritának Dr. Nyitrai Gabriellának Szepesi Zsuzsannának Dr. Szilágyi Nórának Dr. Szilágyi Lászlónak valamint az ELTE Biológiai Intézet, Proteomikai Kutatócsoportban Kémiai Kutatóközpont Biomolekuláris Kémiai Intézet, Neurokémiai Osztályon ELTE Biológiai Intézet, Biokémia Tanszéken ELTE Biológia Intézet, Élettan és Neurobiológia Tanszéken dolgozó valamennyi munkatársnak. Az értekezés alapjául szolgáló kísérletek az OTKA MEDICHEM DNT RET anyagi támogatásával készültek.
82
ÖSSZEFOGLALÁS Az extracelluláris (e.c.) tér, az idegrendszer három kompartmentes modelljében a neuronok és gliasejtek közötti kommunikációt biztosító komplex mikrokörnyezet, mely az e.c. folyadékba ágyazott mátrix makromolekulák hálózatából áll. I) Az e.c. mátrix szabályozott lebontásában az e.c. proteázok, köztük a zselatinázok (MMP-2 és MMP-9) szerepe bizonyított. Ismert a mátrix metalloproteináz-9 (MMP-9) indukciója sejtpusztulással és szöveti átrendeződéssel járó folyamatokban de az is, hogy funkcionális plaszticitásban is részt vesz. Másrészről, hosszan tartó erős fehér fény fotoreceptor apoptózist okozhat, de ez a hatás sok más paramétertől függően el is maradhat. Kísérleteinkben a fehér fény MMP-t indukáló hatásának a kérdését vetettük fel a retinában. Kísérletesen bizonyítottuk, hogy 1) foto-stressz hatására (5.500 lux, 3 óra) a retinában szignifikáns MMP-9 indukció mutatható ki mRNS és fehérje szinten egyaránt; 2) a fehér fény paramétereitől függően, az indukált retinális MMP-9 expresszió eltérő mértékű, 500 lux szokásos állatházi fényinger retinában lokalizált e.c. MMP-9 változást, míg a foto-stressz szövetileg kiterjedtebb intra- és extracelluláris indukciót okoz; 3) az MMP-9 indukció a retinában nem társult irreverzibilis funkcióvesztéssel, sem drasztikus fotoreceptor apoptózist vagy kiterjedt retina degenerációt nem okozott; 4) a retrobulbaris térbe injektált széles spektrumú MMP-inhibitor (GM6001) DMSO oldatban diffúzióval eléri a retinát és ott, a DMSO facilitáló funkcionális hatásait ellensúlyozva gátlólag hatott a spontán visszatérési folyamatokra foto-stresszt követően; 5) foto-stressz után, kiterjedt pro-MMP-9 indukció tapasztalható, különböző időbeli lefutással, a szem más struktúráiban is (vitreus, sclera és cornea). II) Az e.c. folyadék szolubilis komponensei szintén neuronális aktivitás-függő komplex változásokat mutatnak amelyek hozzájárulnak a hiperexcitatórikus állpotok szabályozásához. Ezirányú kísérleteink kémiailag indukált epileptiform aktivitás folyamán (Picrotoxin illetve Lindán különböző dózisainak hatására) az excitatorikus aminosavak (glutaminsav (Glu) és aszparaginsav (Asp)), illetve nukelozidok és metabolitjaik extracelluláris koncentrációváltozásait mutattásk ki az EEG változásokkal párhuzamosan. 1) a GABAA gátló Picrotoxin, 4-5 Hz-es ritmikus aktivitást és epileptiform kisüléseket okozott Halothan-altatott patkányban úgy, hogy csökkent a Glu és Asp, míg a nukleozidok illetve metabolitjaik (uridin, inozin, hipoxantin, xantin) e.c. koncentrációi csak átmenetileg mutattak szignifikáns növekedést. 2) A Lindán dózisfüggően stabilabb 4-5 Hz-es EEG aktivitást váltott ki; 20mg/kg-nál éles negatív hullámok is társultak. Az e.c. Glu és Asp koncentrációiban csak 60 mg/kg dózisnál volt szignifikáns csökkenés kimutatható a 100-150 perces mintában és kizárólag 10 mg/kg Lindán növelte szignifikánsan az adenozin metabolitok (inozin és hipoxantin) e.c. koncentrációit. Hasonlatosságaik ellenére, a Lindán és Picrotoxin által aktivált központi idegrendszeri folyamatok nem teljesen egyezőek.
83
SUMMARY In the three compartment model of the CNS, between neurons and glial cells the extracellular (e.c.) space is interposed as a complex microenvironment of a network of e.c. matrix molecules surrounded by the e.c. fluid. I) Former data has shown, that e.c. proteases, like gelatinases (MMP-2 and MMP-9), contribute to the regulated degradation of the e.c. matrix. Induction of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) was mainly demonstrated in pathological processes resulting cell death and tissue remodeling, but can also occur independently of tissue damage. It is also known, that exposure to bright white light could induce photoreceptor apoptosis and retinal degeneration. In our 1st experimental paradigm, we investigated whether white-light exposure can induce MMP-9 expression in the retina. We found that: 1) following photo-stress (5,500 lux, 3 h) significant induction of MMP-9 occurs in the retina at mRNA and protein levels; 2) the level of retinal MMP-9 induction depends on light parameters. Room-light exposure (500 lux, 12 h) following long-lasting dark adaptation, led also to elevated MMP-9 levels localized to the e.c. space of the retina, while photo-stress induced a more widespread induction in the eye, both in the cytosolic and e.c. fractions; 3) MMP-9 induction in the retina occurred without irrveresible loss of retinal function; despite elevated MMP-9 levels neither widespread fotoreceptor apoptosis nor extensive retinal degeneration occured; 4) injection of broad-spectrum MMP-inhibitor (GM6001) diluted in DMSO into the retrobulbar space diffused to the retina and counteracted the facilitatory effects of DMSO upon electroretinogram bwave recovery, thus having a net inhibitory effect on the spontaneous functional recovery following photostress; 5) widespread MMP-9 induction occured with different time-courses in neighbouring eye structures (vitreous, sclera and cornea) after photo-stress. II) The soluble components of the e.c. fluid show similar neuronal-activity dependent complex changes.
Our 2nd set of experiments describes the effects of
chemically induced epileptiform activity (using Picrotoxin and different doses of Lindane) on e.c. concentrations of excitatory amino acid transmitters (glutamate (Glu) and aspartate(Asp)), and those of nucleosides and their metabolites. 1) the GABAA inhibitor Picrotoxin induced rhythmic acitivity of 4-5 Hz and epileptic bursts in Halothane-anaesthetized rats, while the e.c. concentrations of Glu and Asp decreased, and some of nucleosides (uridine, inosine, hypoxanthine, xanthine) increasead significantly; 2) In a dose-dependent manner Lindane induced increasingly stable rhythmic pattern of 4-5 Hz; only the 20 mg/kg dose was followed by sharp negative waves. The concentrations of Glu and Asp were significantly decreases only after 60 mg/kg in samples collected 100-150 min. after injection, while only 10 mg/kg Lindane induced significant increase in adenosine-metabolite levels: inosine and hypoxanthine. Despite their similarities, the discrete cellular mechanisms involved in Lindane and Picrotoxin epileptogenesis are not identical. Thus, epileptic activity can occur despite unenhanced Glu levels, while the increased nucleosides could have role in reducing neuronal excitability.
84
