N-trophy5 ˇ sen´ı biologie Reˇ T´ ym Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo Gymn´azium, Brno, V´ıdeˇ nsk´a 47 Eva Falt´ ynkov´a;
[email protected] Tereza Kadlecov´a;
[email protected] Jan Hor´aˇcek;
[email protected] 8. u ´nora 2015
1 1.1
ˇ ast I. - v´ C´ ystup ze sekven´ atoru ´ Uvod
Pˇri otevˇren´ı zad´an´ı biologie n´as po shl´ednut´ı v´ ystupu ze sekven´atoru zalili endorfiny a adrenalin z´aroveˇ n. Vykoukla na n´as ˇca´st v´ ystupu ze sekven´atoru a my museli rozluˇstit, jak´ y konkr´etn´ı protein k´oduje. Skuteˇcnost, ˇze vyˇreˇsen´ım se n´am teprve otevˇre dalˇs´ı objemn´e zad´an´ı, n´as t´ahla kupˇredu a hnala naˇse mozkov´e buˇ nky do akce.
1.2
ˇ sen´ı Reˇ
N´aˇs prvn´ı krok byl zcela jasn´ y. Museli jsme dan´ y v´ ystup ze sekven´atoru vyj´adˇrit jako sekvenci nukleotid˚ u, ˇcili v podobˇe p´ısmen A, C, G, a T jdouc´ıch za sebou. K tomu jsme vyuˇzili legendu, kter´e pˇriˇrazovala ke kaˇzd´e barvˇe ze sekven´atoru pr´avˇe jedno z p´ısmen. Jakoˇzto lidˇst´ı tvorov´e n´achyln´ı k chybˇe jsme v´ ysledek nˇekolikr´at pˇrekontrolovali a dospˇeli k n´asleduj´ıc´ı sekvenci: cgttctatagatacgcgatgacggtataccatccgcaaagt. Kaˇzd´e p´ısmeno znaˇc´ı dus´ıkatou b´az´ı (a - adenin, c - cytosin, g - guanin, t - thymin). Pˇr´ıtomnost´ı tyminu bylo zˇrejm´e, ˇze m´ame tu ˇcest s DNA sekvenc´ı, nikoliv s RNA, nebot’ tam bychom hledali uracil. DNA, nositelka genetick´e informace, je polymer v podobˇe ˇretˇezce nukleotid˚ u. Kaˇzd´ y z nich se skl´ad´a z deoxyrib´ozy (cukr), fosf´atov´e skupiny a na ni nav´azan´e dus´ıkat´e b´aze. Pr´avˇe dus´ıkat´e b´aze zajiˇst’uj´ı spojen´ı s druh´ ym vl´aknem DNA pomoc´ı vod´ıkov´ ych m˚ ustk˚ u a vytv´aˇr´ı tak dvouˇsroubovici, kde vl´akna DNA jsou navz´ajem antiparaleln´ı - jedno jde tedy od 5’ konce ke 3’ konci a druh´e od 3’ konce k 5’ konci. Jak si ale tuto sekvenci spr´avnˇe vyloˇzit? Jelikoˇz byla zad´ana pouze ˇca´st v´ ystupu ze sekven´atoru, netuˇsili jsme, jestli ˇc´ıst zleva ˇci zprava, natoˇz kde zaˇc´ın´a nebo konˇc´ı. Kdyˇz uv´aˇz´ıme, ˇze triplet, kter´ ym je k´odov´ana aminokyselina, nemus´ı b´ yt na zaˇc´atku hned tripletem, ale m˚ uˇze se jednat pouze o jednu nebo dvˇe b´aze za sebou, vych´az´ı n´am z toho 3 moˇznosti posunu. D´ale mus´ıme br´at v potaz ˇcten´ı vl´akna zleva doprava a obr´acenˇe, t´ım se naˇse moˇznosti zvyˇsuj´ı na ˇsest.
1
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Abychom se neupsali k smrti, vyuˇzili jsme chytr´ y translator http://web.expasy.org/ translate/. Dle naˇseho oˇcek´av´an´ı jsme dostali vyhodnocen´ı v podobˇe 3 ˇctec´ıch r´amc˚ u (dalˇs´ı tˇri r´amce znaˇc´ı komplement´arn´ı vl´akno k tomu p˚ uvodn´ımu), viz obr´azek 1.
Obr´azek 1: Moˇzn´e ˇctec´ı r´amce ˇ ı r´amce n´am urˇcuj´ı, odkud bychom zaˇcali triplety ˇc´ıst. V naˇsem pˇr´ıpadˇe hled´ame Ctec´ tzv. otevˇren´ y ˇctec´ı r´amec, kter´ y je ohraniˇcen specifick´ ymi kodony - iniciaˇcn´ı a terminaˇcn´ı. Pˇr´ıtomnost iniciaˇcn´ıho kodonu (methionin), kter´ ym zaˇc´ın´a v ribozomu proteosynt´eza, zajist´ı spr´avn´e pˇreˇcten´ı triplet˚ u. Vybereme tedy jeden z otevˇren´ ych ˇctec´ıch r´amc˚ u (oznaˇceny ˇcervenˇe) — je jedno kter´ y, vl´akna jsou navz´ajem antiparaleln´ı na z´akladˇe komplementarity b´az´ı, tud´ıˇz mus´ı k´odovat stejn´ y protein. P´ısmena pˇredstavuj´ı jednotliv´e aminokyseliny, kter´ ymi je protein k´odov´an. ˇ ycarsk´ D´ale do datab´aze http://web.expasy.org/blast/ (datab´aze provozov´ana Sv´ ym institutem bioinformatiky) zad´ame n´aˇs ˇctec´ı r´amec v RAW form´atu - MTVYHPQS forma z´apisu proteinu (jeho aminokyselin) jen pomoc´ı velk´ ych p´ısmen. No a m´ame hotovo! Datab´aze u ´spˇeˇsnˇe vyhodnotila stoprocentn´ı shodu, a to s enzymem pullulan´aza. U varianty ˇcten´ı zprava doleva jsme se shody se z´aznamy v datab´azi nedoˇckali. Pozn.: Spr´avn´eho ˇreˇsen´ı se m˚ uˇzeme dovt´ıpit i snadnˇejˇs´ı cestou. Do nˇekter´ ych typ˚ u datab´aze nen´ı tˇreba zad´avat jiˇz otevˇren´e ˇctec´ı r´amce, n´ ybrˇz cel´ y DNA k´od a datab´aze sama vyhodnot´ı, jak triplety ˇc´ıst (napˇr. http://www.uniprot.org/blast/). Pozn.: K datu 6.2.2015 jsme zjistili, ˇze dan´a datab´aze z odkazu http://web.expasy.org/ blast/ jiˇz pracuje na principu vloˇzen´ı DNA sekvence z nukleotid˚ u a rovnou vyhodnot´ı v´ ysledek podobnˇe jako http://www.uniprot.org/blast/. Nutno tedy podotknout, ˇze k naˇsemu v´ ysledku jsme dospˇeli jiˇz 31.1.2015 a tehdy jeˇstˇe datab´aze vyhled´avala postupem popsan´ ym v´ yˇse. Bˇehem t´ ydne byla pˇredˇel´av´ana a nebylo moˇzn´e v n´ı vyhled´avat. Nyn´ı uˇz novˇe funguje pˇr´ımo se zad´an´ım nukleotidov´e sekvence.
1.3
Z´ avˇ er
I kdyˇz byl tento u ´kol v podstatˇe jen ”pˇred´ ukolem”ˇci kl´ıˇcem k n´asleduj´ıc´ımu testov´an´ı vzork˚ u, jeho ˇreˇsen´ı jsme si uˇzili a nˇeco i pˇriuˇcili - vyhled´av´an´ı v proteinov´ ych datab´az´ıch. Zaj´ımav´e bylo i zjiˇstˇen´ı, co vˇse se o proteinech v datab´az´ıch m˚ uˇzeme dozvˇedˇet.
2
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
ˇ ast II. - testov´ C´ an´ı vzork˚ u na amyl´ azu
2 2.1 2.1.1
Odpovˇ edi na zadan´ e ot´ azky Kˇ cemu amyl´ aza slouˇ z´ı? Co je substr´ atem tohoto enzymu?
Jedn´a se o enzym, kter´ y katalyzuje hydrolytick´e ˇstˇepen´ı α glykosidov´ ych vazeb. Jeho substr´aty tedy mohou b´ yt ˇskrob, glykogen a pˇr´ıbuzn´e polysacharidy a oligosacharidy. V naˇsem pˇr´ıpadˇe j´ım bude ˇskrob. 2.1.2
Jak´ y je princip reakce d˚ ukazu amyl´ azy za pouˇ zit´ı povolen´ ych pom˚ ucek?
Jak uˇz z pˇredchoz´ı ot´azky vypl´ yv´a, amyl´aza (ve vzorc´ıch) bude katalyzovat ˇstˇepen´ı ˇskrobu a postupnˇe jej rozkl´adat na kratˇs´ı ˇretˇezce tvoˇren´e D-gluk´ozov´ymi jednotkami aˇz dostaneme koneˇcn´ y produkt - disacharid maltosa. Pokud tedy sm´ıch´ame ˇskrob s naˇsimi vzorky, reakce probˇehne pouze za pˇr´ıtomnosti amyl´azy. ˇ Jej´ı pˇr´ıtomnost (resp. pˇr´ıtomnost ˇskrobu) ovˇeˇr´ıme roztokem j´odu. Skrob se skl´ad´a ze dvou sloˇzek - amylopektinu a α-amyl´ozy, jej´ıˇz strukturou je dvouˇsroubovice. J´od m´a tu vlastnost, ˇze se dok´aˇze do t´eto dvouˇsroubovice zaˇclenit a ve v´ ysledku tak barevnˇe indikovat pˇr´ıtomnost ˇskrobu. O funkci ˇzelatiny v zad´an´ı jsme dlouho pˇrem´ yˇsleli, nakonec jsme doˇsli ke dvˇema moˇznostem jej´ıho vyuˇzit´ı. ˇ 1. Zelatinu lze vyuˇz´ıt jako neteˇcn´e prostˇred´ı, kter´e oddˇel´ı jednotliv´e vzorky (napˇr. v petriho misce). ˇ 2. Zelatinu lze vyuˇz´ıt pro tzv. imobilizaci protein˚ u. V takov´em pˇr´ıpadˇe by ˇzelatina fungovala jako nosiˇc, jej´ıˇz p´orovit´ y materi´al dovol´ı substr´at˚ um volnˇe proch´azet, ale enzym z˚ ustane zachycen. V koneˇcn´em d˚ usledku dojde ke zv´ yˇsen´ı aktivity, selektivity a stability enzymu. Obˇe metody jsme vyzkouˇseli a doˇsli jsme k z´avˇeru, ˇze v´ ysledky vych´azej´ı totoˇznˇe – efekt imobilizace byl nerozpoznateln´ y. Pro ostr´e experimenty jsme se tak rozhodli substr´aty do ˇzelatiny nezal´evat, tzn. nevyuˇz´ıt ˇzelatinu pro imobilizaci enzym˚ u a to pˇredevˇs´ım z toho d˚ uvodu, ˇze n´am pˇriˇsla moˇznost 1) sn´aze dokumentovateln´a. 2.1.3
Jak´ y postup jste zvolili?
1. Pˇ r´ıprava prostˇ red´ı pro testov´ an´ı (a) Pro vytvoˇren´ı neteˇcn´eho prostˇred´ı z ˇzelatiny jsme koupili ˇcirou ˇzelatinu v pr´aˇsku na aspiky. (b) Dle receptu jsme ˇzelatinu ”uvaˇrili”a nalili do petriho misek. (c) Na jeˇstˇe neztuhlou ˇzelatinu jsme poloˇzili plato od tablet l´ıcem dol˚ u a nechali ztuhnout v lednici. (d) Po ztuhnut´ı jsme opatrnˇe plato odejmuli a vytvoˇrily se n´am tak ”chl´ıveˇcky”, ve kter´ ych jsme vzorky pozdˇeji testovali.
3
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Obr´azek 2: Pˇripraven´a Petriho miska ˇ 2. Skrobov´ y maz (a) Ve 100 ml destilovan´e deionizovan´e vody jsme rozpustili 0.5 g kuchyˇ nsk´eho ˇskrobu (solamyl). (b) Roztok jsme zahˇra´li nad plamenem, kv˚ uli zvˇetˇsen´ı plochy ˇskrobu a tud´ıˇz zv´ yˇsen´ı jeho reaktivnosti. Z´ıskali jsme tak ˇskrobov´ y maz. (c) Po jeho zchlazen´ı jsme jej otestovali jednou kapkou jodisolu a tmavˇe modr´ ym zbarven´ım tak ovˇeˇrili pˇr´ıtomnost ˇskrobu. 3. Pˇ r´ıprava vzork˚ u (a) Pro zpracov´an´ı pevn´ ych vzork˚ u jsme vyuˇzili tˇrec´ı misku. (b) Z kaˇzd´eho vzorku jsme odmˇeˇrili 10 ml do zkumavky a pˇridali 2 ml ˇskrobov´eho mazu. Z´amˇernˇe jsme sm´ıchali velk´e mnoˇzstv´ı vzorku s pomˇernˇe mal´ ym mnoˇzstv´ım ˇskrobu, aby pˇr´ıpadn´a amyl´aza zvl´adla vˇsechen ˇskrob bezpeˇcnˇe rozˇstˇepit. (c) Dle potˇreby jsme ke vzork˚ um pˇrik´apli destilovanou vodu, abychom z´ıskali d´avkovateln´ y roztok. (d) Ve zkumavk´ach jsme vˇse ˇra´dnˇe prom´ıchali.
4
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Obr´azek 3: Vzorky pˇripraven´e k testov´an´ı 4. Ohˇ rev vzork˚ u (a) Protoˇze amyl´aza je nejv´ıce aktivn´ı pˇri 70 ◦ C, ale pˇri 80 ◦ C uˇz se inaktivuje, napustili jsme do Dewarovy n´adoby co nejteplejˇs´ı kohoutkovou vodu (50 − 60 ◦ C). Kv˚ uli inaktivaci jsme nechtˇeli riskovat ohˇrev nad plamenem. (b) Pot´e jsme do n´adoby, kter´a zajist´ı tepelnou izolaci, vloˇzili na 15 minut vzorky ve zkumavk´ach. (c) Bˇehem ohˇrevu, jsme zkumavky jeˇstˇe protˇrepali.
Obr´azek 4: Vzorky v Dewarovˇe n´adobˇe 5. Testov´ an´ı (a) Do kaˇzd´e petriho misky jsme um´ıstili vlastn´ı nulovac´ı vzorky pro srovn´an´ı barev: • destilovan´a voda + jedna kapka jodisolu 5
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
• ˇskrobov´ y maz + jedna kapka jodisolu (b) Tekut´e vzorky jsme napipetovali, hustˇejˇs´ı nalili pˇr´ımo ze zkumavky do ”chl´ıveˇck˚ u”na petriho misk´ach. (c) Kaˇzd´ y ze vzork˚ u jsme otestovali jednou kapkou jodisolu a vyhodnotili, zda amyl´azu obsahuje ˇci nikoliv. (d) Fotografie jsme poˇrizovali pˇred a hned po pˇrid´an´ı jodisolu. 2.1.4
Jak jste urˇ cili, zda vzorek amyl´ azu obsahuje?
Pokud vzorek amyl´azu obsahoval, dok´azal n´ami pˇridan´ y ˇskrobov´ y maz rozˇstˇepit. Po pˇrid´an´ı j´odu tedy neindikoval modr´e zbarven´ı. Pokud vzorek amyl´azu neobsahoval, nemˇelo n´ami pˇridan´ y ˇskrobov´ y maz co rozˇstˇepit a ˇskrob tak tedy z˚ ustal nezmˇenˇen. V tomto pˇr´ıpadˇe se j´od mohl zaˇclenit do ˇsroubovice jedn´e ze sloˇzek ˇskrobu (viz ot´azka druh´a) a indikovat tak jeho pˇr´ıtomnost tmavˇe modr´ ym zbarven´ım.
2.2
V´ ysledky mˇ eˇ ren´ı
Pro srovn´an´ı nejprve uv´ad´ıme na obr´azc´ıch 5b a 5c barvy nulovac´ıch vzork˚ u.
(a) destilovan´ a voda
(b) j´od+destilovan´a voda
(c) j´od+ˇskrob
Obr´azek 5: Nulovac´ı vzorky pro srovn´an´ı barev
6
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Fotografie
Testovan´ y vzorek
Amyl´ aza
ano
ban´anov´a slupka
→ viz pozn´amky
such´a kukuˇrice
→
?
ne
dˇetsk´ y piˇskot
→ ne
keˇcup
→ ne
suˇsen´ y ban´an
→ ne
rajˇce
→ ne
chleba
→ ano
sliny
→ ano
vnitˇrn´ı strana slupky brambory
→ ano
ml´eko
→ Tabulka 1: V´ ysledky mˇeˇren´ı
7
ˇ sen´ı biologie Reˇ
2.3 2.3.1
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Pozn´ amky Ban´ anov´ a slupka
• K testov´an´ı byl pouˇzit bˇeˇzn´ y ban´an ze supermarketu. 2.3.2
Such´ a kukuˇ rice
→ (a)
(b) cel´a zrna
→ (c)
(d) drcen´a zrna
Obr´azek 6: Zaj´ımav´e v´ ysledky reakce kukuˇrice • K testov´an´ı kukuˇrice jsme pouˇzili suchou kukuˇrici ze zverimexu, urˇcenou pro spotˇrebu zv´ıˇrat. • Zkouˇseli jsme testovat jak cel´a zrna, tak zrna podrcen´a. U cel´ ych zrn byla nepˇr´ıtomnost amyl´azy jasnˇe znateln´a (viz fotografie 6b). Naopak u podrcen´e kukuˇrice je viditeln´ y v´ ysledek opaˇcn´ y (viz fotografie 6d). Mysl´ıme si tedy, ˇze such´a kukuˇrice amyl´azu obsahuje pouze uvnitˇr, amyl´aza vˇsak nen´ı schopn´a prostoupit pˇres vnˇejˇs´ı membr´anu kukuˇrice a rozˇstˇepit tak ˇskrob. 2.3.3
Dˇ etsk´ y piˇ skot
• K experimentu jsme pouˇzili klasick´e dˇetsk´e piˇskoty. 2.3.4
Keˇ cup
• Jako vzorek jsme pouˇzili keˇcup vlastn´ı v´ yroby (od Honzov´ ych prarodiˇc˚ u). • M´enˇe prokazateln´ y vzorek, zbarven´ı nen´ı pˇr´ıliˇs znateln´e. 2.3.5
Suˇ sen´ y ban´ an
• K ovˇeˇren´ı amyl´azy jsme zakoupili pytl´ık suˇsen´ ych ban´an˚ u v Albertu. 2.3.6
Rajˇ ce
• Pouˇzili jsme bˇeˇzn´a rajˇcata z Albertu, ze kter´ ych jsme vyrobili roztok. Do roztoku jsme vkl´adali pˇredevˇs´ım duˇzinu (nikoliv slupku). 8
ˇ sen´ı biologie Reˇ
2.3.7
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Chleba
• Jako vzorek jsme pouˇzili bˇeˇzn´ y chleba z Kauflandu. • Chleba byl pˇred experimentem mraˇzen´ y. • Jedn´a se o jeden z nejpr˚ ukaznˇejˇs´ıch vzork˚ u ze s´erie. 2.3.8
Sliny
• Jeden z nejprokazatelnˇejˇs´ıch vzork˚ u, nen´ı potˇreba dalˇs´ı koment´aˇr. 2.3.9
Vnitˇ rn´ı strana slupky brambory
• Jako vzorek jsme pouˇzili bˇeˇznou bramboru ze supermarketu. • Slupky brambory jsme se snaˇzili kr´ajet co nejtenˇc´ı, abychom dostali opravdu jen slupku. • Ve vzorku se mohl objevit ˇskrob z ”vnitˇrku”brambory, tud´ıˇz ˇskrob mohl, oproti ostatn´ım vzork˚ um, v tomto vzorku pˇreb´ yvat. Proto se m˚ uˇze zd´at, ˇze je vzorek m´ırnˇe namodral´ y. 2.3.10
Ml´ eko
• K pokusu jsme pouˇzili ˇcerstv´e ml´eko z ml´ekomatu, abychom pˇredeˇsli pˇr´ıpadn´e ztr´atˇe funkˇcnosti amyl´azy pˇri tepeln´em procesu pasterizace (inaktivace amyl´azy pˇri 80 ◦ C). • Jednoznaˇcnˇe prokazateln´ y vzorek.
3
Z´ avˇ er
Testov´an´ı amyl´azy pro n´as bylo v´ıce neˇz zaj´ımav´e. Pˇri ˇreˇsen´ı jsme se nˇeco nauˇcili i pobavili a nakonec se i radostnˇe zasm´ali a pl´acli si nad naˇs´ım hotov´ ym d´ılem. Tˇreba kdyˇz jsme zal´evali petriho misky ˇzelatinou a pot´e netrpˇelivˇe vyˇck´avali u ledniˇcky, vypadali jsme jako starostliv´ı rodiˇce, koukaj´ıc´ı na sv´e dˇet’a´tko v inkub´atoru. To jste n´as mˇeli vidˇet! Cel´a biologick´a ˇc´ast vyˇzadovala spoustu n´apadit´ ych myˇslenek, ale od toho je to pˇrece experiment. Vymysl´ıˇs, zkus´ıˇs, ovˇeˇr´ıˇs. Koneckonc˚ u i n´as samotn´e pˇrekvapily nˇekter´e v´ ysledky, napˇr. slupka od ban´anu ˇci brambory.
4
Podˇ ekov´ an´ı • Blance Loupancov´e za konzultace. • Profesork´am Olze Langerov´e a Alenˇe Novosadov´e za zpˇr´ıstupnˇen´ı ˇskoln´ı chemick´e laboratoˇre a pozdˇeji za vyp˚ ujˇcen´ı laboratorn´ıch pom˚ ucek.
9
ˇ sen´ı biologie Reˇ
Maxwellovo stˇr´ıbrn´e kladivo
Na z´avˇer pˇrid´av´ame spoleˇcnou fotografii.
10
