N-trophy4 ˇ sen´ı chemie Reˇ T´ ym JuTeJa Gymn´azium, Brno, V´ıdeˇ nsk´a 47 Tereza Kadlecov´a;
[email protected] Julie Pˇrikrylov´a;
[email protected] Jan Hor´aˇcek;
[email protected] 14. u ´nora 2014
1
´ Uvod
[1] Katal´aza je enzym vyskytuj´ıc´ı se napˇr´ıklad v nˇekter´ ych bˇeˇznˇe dostupn´ ych potravin´ach ˇci krvi, kter´ y mj. katalyzuje reakci pˇremˇeny peroxidu vod´ıku na kysl´ık a vodu (1). H2 O2 → H2 O + O2
2
(1)
D˚ ukaz kysl´ıku
Z reakce 1 vystupuje kysl´ık O2 jako jej´ı plynn´ y produkt. V praxi lze pˇri nadbytku substr´atu pozorovat uvolˇ nuj´ıc´ı se bublinky z l´atky obsahuj´ıc´ı enzym, kter´e stoupaj´ı smˇerem ke hladinˇe, kde se uvoln´ı. D˚ ukaz kysl´ıku provedeme za pomoc´ı vˇedomosti o jeho u ´ˇcinc´ıch. Kysl´ık je nezbytnou sloˇzkou rychl´e oxidace - hoˇren´ı, kde vystupuje jako oxidaˇcn´ı ˇcinidlo a reaguje s p´alenou l´atkou za vzniku plamene (tedy velk´eho mnoˇzstv´ı tepla a svˇetla). Principem experimentu je tedy pozorov´an´ı hoˇren´ı, resp. intenzity produkovan´eho svˇetla. Pokud se plamen pozorovatelnˇe zvˇetˇs´ı oproti hoˇren´ı v bˇeˇzn´e atmosf´eˇre, je kolem plamene vyˇsˇs´ı koncentrace kysl´ıku, coˇz by dok´azalo, ˇze reakce opravdu prob´ıh´a tak, jak jsme ji teoretiky popsali. Do Erlenmeyerovy baˇ nky jsme vloˇzili cca 50ml 40% peroxidu vod´ıku a 5 g brambory. Okamˇzitˇe jsme pozorovali bublinky stoupaj´ıc´ı ke hladinˇe. Na vzduchu jsme si zap´alili ˇspejli, po nˇekolika vteˇrin´ach jsme ji sfoukli a jeˇstˇe doutnaj´ıc´ı jsme ji vloˇzili nad hladinu do ˇ baˇ nky. Spejle zaˇcala opˇet hoˇret. To je jasn´ ym d˚ ukazem pˇr´ıtomnosti kysl´ıku jako produktu reakce 1.
3
Stanoven´ı l´ atky s nejvyˇ sˇ s´ı koncentrac´ı katal´ azy
Pˇri stanovov´an´ı koncentrace (resp. jejich pomˇer˚ u v r˚ uzn´ ych l´atk´ach) jsme vych´azeli z toho, ˇze l´atka obsahuj´ıc´ı enzym slouˇz´ı jako katalyz´ator. Pokud tedy nech´ame reakci prob´ıhat napˇr. 1 minutu a pak zmˇeˇr´ıme objem vyprodukovan´ ych plyn˚ u bˇehem t´eto minuty, dok´aˇzeme 1
ˇ sen´ı chemie Reˇ
JuTeJa
t´ım stanovit relativn´ı koncentrace katal´azy v jednotliv´ ych l´atk´ach. Mˇeˇr´ıme tedy vlastnˇe rychlost reakce: ˇc´ım vˇetˇs´ı rychlost, t´ım vˇetˇs´ı koncentrace katalyz´atoru (katal´azy) ve vstupn´ı l´atce. Jako potenci´aln´ı l´atky s vysokou koncentraci katal´azy jsme zvolili bramboru, kiwi a kvasnice. Prvn´ım n´apadem pro velmi hrub´e stanoven´ı koncentrac´ı byl jednoduch´ y bal´onek pˇripevnˇen´ y na Erlenmeyerovu baˇ nku. Do bal´onku jsme nalili vˇzdy stejn´ y objem 40% H2 O2 , do baˇ nky konstantn´ı mnoˇzstv´ı l´atky, u kter´e chceme zjistit koncentraci, bal´onek jsme pˇripevnili na baˇ nku tak, aby se do n´ı peroxid jeˇstˇe nevylil a po d˚ ukladn´em pˇripevnˇen´ı jsme obˇe l´atky sm´ıchali. Tuto reakci jsme provedlii se vˇsemi tˇremi l´atkami. Kvasinky z n´ı vyˇsly nejl´epe - bal´onek se sice nafoukl opravdu hodnˇe, ale zato za mnohem kratˇs´ı ˇcas, neˇz 1 minuta. Proto jsme museli pˇristoupit ke kvantitativnˇejˇs´ımu ˇreˇsen´ı probl´emu.
Obr´azek 1: Experiment s bal´onkem Rozhodli jsme se j´ımat objem plyn˚ u reakce do odmˇern´eho v´alce ponoˇren´eho ve vaniˇcce obsahuj´ıc´ı kohoutkovou vodu. Celou aparaturu pˇrehlednˇe zn´azorˇ nuje obr´azek 2. Do frakˇcn´ı baˇ nky jsme vloˇzili 1 g analyzovan´e l´atky a do dˇel´ıc´ı n´alevky jsme si pˇripravili 20 ml 5 % H2 O2 . Probl´em t´eto aparatury tkv´ı v tom, ˇze po vyteˇcen´ı veˇsker´eho peroxidu do baˇ nky m´a soustava snahu nas´at vzuch do v´alce z okoln´ı atmosf´ery pˇres otevˇren´ y ventil dˇel´ıc´ı n´alevky a t´ım vyrovnat rozd´ıl hladin ve v´alci a ve vaniˇcce. Tomu je zapotˇreb´ı zabr´anit. My jsme to dˇelali tak, ˇze jsme uz´avˇer zavˇreli ihned po vylit´ı veˇsker´eho peroxidu a zaˇcali mˇeˇrit od rysky, na kter´e v tomto momentˇe byla hladina vody. Resp. jsme vˇzdy na stopk´ach poˇc´ıtali ˇcas potˇrebn´ y k produkci napˇr. 50 ml plynu. V´alec mˇel kapacitu 250 ml s prvn´ı ryskou na 50 ml. Teorie ˇr´ık´a, ˇze rychlost reakce je z´avisl´a tak´e na pH. Potˇrebovali jsme sjednotit pH vˇsech l´atek, u kter´ ych urˇcujeme koncentraci enzymu, protoˇze napˇr. kiwi m´a pomˇernˇe odliˇsn´e pH od brambory. K tomu jsme pouˇzili fosf´atov´ y pufr. Nam´ıchali jsme si ho z K2 HP O4 a KH2 P O4 podle Hendersonovy-Hasselbalchovy rovnice [2]. pH = pK + log10
cK2 HP O4 cKH2 P O4
!
(2)
Stanovili jsme si poˇzadovan´ y objem pufru, vypoˇcetli pomˇer mnoˇzstv´ı dvou sloˇzek pufru a podle mol´arn´ı hmotnosti stanovili jejich gram´aˇz. Pak uˇz jsme jen vyrobili pufr. Do experimentu vstupovalo vˇzdy 20 ml pufru s pH 7, 20 ml 5 % H2 O2 a 1 g analyzovan´e l´atky.
2
ˇ sen´ı chemie Reˇ
JuTeJa
Obr´azek 2: Aparatura na j´ım´an´ı plyn˚ u Po chv´ıli se uk´azalo, ˇze jedin´a l´atka s v´ ysledky pozorovateln´ ymi v rozumn´em ˇcase jsou kvasnice. Kiwi a brambora obsahovaly tak m´alo enzymu, ˇze jsme sice vidˇeli bublinky kysl´ıku, ale objem produkt˚ u byl pod mˇeˇritelnost odmˇern´ ym v´alcem v rozumn´em ˇcase. L´atkou s nejvyˇsˇs´ı koncentrac´ı katal´azy jsou tedy kvasnice. Pro u ´plnost pˇrikl´ad´ame namˇeˇren´a data v tabulce 1.
4
Parametry reakce
[3] Teorie enzymatick´e kinetiky ˇr´ık´a, ˇze vliv na rychlost reakce m´a jej´ı teplota a pH.
4.1
Teplota
Se zvyˇsuj´ıc´ı teplotou roste rychlost reakce podle pˇrirozen´eho pravidla, kter´e ˇr´ık´a, ˇze objekty s vˇetˇs´ı teplotou maj´ı vˇetˇs´ı energii, rychleji se pohybuj´ı a sn´aze reaguj´ı. To dokazuj´ı napˇr´ıklad n´ami namˇeˇren´a data 2. Teorie ˇr´ık´a, ˇze s klesaj´ıc´ı teplotou by mˇela rychlost reakce klesat, to jsme ale neovˇeˇrovali, protoˇze jsme nemˇeli vhodn´e laboratorn´ı vybaven´ı na n´ızk´e teploty. Experiment´alnˇe jsme zjistili, ˇze po pˇrekroˇcen´ı teploty zhruba 70 ◦ C reakce v˚ ubec neprob´ıh´a. To je proto, ˇze zhruba kolem t´eto teploty doch´az´ı k denaturaci b´ılkovin. To je vpodstatˇe zmˇena jejich konformace, kter´a m´a za n´asledek nefunkˇcnost katal´azy jako katalyz´atoru pˇremˇeny H2 O2 na H2 O a O2 . Troufli bychom si tedy ˇr´ıci, ˇze teplota kolem 65 ◦ C je teplotou, pˇri kter´e reakce prob´ıh´a nejrychleji (nejlepˇs´ı reakˇcn´ı podm´ınky).
3
ˇ sen´ı chemie Reˇ
JuTeJa
Měření 1 Koncentrace H2O2 Typ látky obsahující enzym Hmotnost látky obsahující enzym Objem pufru Objem H2O2
5% kvasinky 1.00 20 20
0 29 54 66
75.00 100.00 150.00 200.00
°C
MKH2PO4 pK Koncentrace K2HPO4 Koncentrace KH2PO4 pH pufru
1.44 0.54 400 228.23
g g ml g/mol
136.09 6.8 0.016 0.010 7.00
g/mol mol/dm3 mol/dm3
Rychlost reakce [ml/s]
22.5 7.00
Objem plynu [ml]
Čas od předchozího měření [s]
Teplota reakce pH pufru
g ml ml
Příprava pufru pH = 7 Hmotnost K2HPO4 v pufru Hmotnost KH2PO4 v pufru Objem pufru MK2HPO4*3H2O
#HODNOTA! 0.86 0.93 0.76
Tabulka 1: Kvasinky pˇri pH = 7
4.2
pH
Kaˇzd´ y enzym m´a pH, pˇri kter´em reaguje optim´alnˇe. My jsme si vyrobili stejn´ y pufr, ale s jin´ ym pomˇerem sloˇzek tak, abychom vytvoˇrili m´ırnˇe z´asadit´e a m´ırnˇe kysel´e prostˇred´ı (konkr´etnˇe pH 6 a 8). V tˇechto pufrech jsme prov´adˇeli stejnou reakci. Data 3 a 4 dokazuj´ı, ˇze rychlost reakce v obou smˇerech kles´a. Enzym jako takov´ y se skl´ad´a z aminokyselin, z nichˇz nˇekter´e obsahuj´ı bazick´e a jin´e zase kysel´e skupiny. Jejich stupeˇ n disociace z´avis´ı na pH. Stupeˇ n disociace pak ovlivn´ı konformaci enzymu, kter´a m˚ uˇze a nemus´ı b´ yt v´ yhodna pro naˇsi reakci. Ide´aln´ı pH pro naˇsi reakci je tedy zhruba 7.
Podˇ ekov´ an´ı • Gymn´aziu V´ıdeˇ nsk´a za pˇr´ıstup k laboratoˇr´ım. • RNDr. Olze Langerov´e, naˇs´ı chemik´aˇrce, za asistenci v laboratoˇr´ıch. • Tom´aˇsi Fialovi za konzultace.
Reference [1] www.studiumchemie.cz Datab´aze chemick´ych pokus˚ u: Katalasa v bramboˇre http://www.studiumchemie.cz/pokus.php?id=74 Prvn´ı v´ ysledek googlu pro kl´ıˇcov´a slova ”brambora peroxid vod´ıku”. Takto jsme zjistili, ˇze jde o katal´azu. 4
ˇ sen´ı chemie Reˇ
JuTeJa
Měření 6 Koncentrace H2O2 Typ látky obsahující enzym Hmotnost látky obsahující enzym Objem pufru Objem H2O2
5% kvasinky 1.00 20 20
Teplota reakce pH pufru
62 7.00
g ml ml
Příprava pufru pH = 7 Hmotnost K2HPO4 v pufru Hmotnost KH2PO4 v pufru Objem pufru MK2HPO4*3H2O
°C
MKH2PO4 pK Koncentrace K2HPO4 Koncentrace KH2PO4 pH pufru
0.0 6.5 5.5 6.0 6.0
50.00 100.00 150.00 200.00 250.00
g g ml g/mol
136.09 6.8 0.016 0.010 7.00
g/mol mol/dm3 mol/dm3
Rychlost reakce [ml/s]
Objem plynu [ml]
Čas od předchozího měření [s]
po zahřátí jsme počkali 2 minuty
1.44 0.54 400 228.23
#HODNOTA! 7.69 9.09 8.33 8.33
Tabulka 2: Kvasinky pˇri 62 ◦ C [2] Wikipedia Henderson–Hasselbalch equation http://en.wikipedia.org/wiki/Henderson%E2%80%93Hasselbalch equation [3] Wikipedia Enzyme: Kinetics http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme#Kinetics
5
ˇ sen´ı chemie Reˇ
JuTeJa
Měření 8 Koncentrace H2O2 Typ látky obsahující enzym Hmotnost látky obsahující enzym Objem pufru Objem H2O2
5% kvasinky 1.00 20 20
Teplota reakce pH pufru
26 8.00
g ml ml
Příprava pufru pH = 8 Hmotnost K2HPO4 v pufru Hmotnost KH2PO4 v pufru Objem pufru MK2HPO4*3H2O
°C
MKH2PO4 pK Koncentrace K2HPO4 Koncentrace KH2PO4 pH pufru
0.0 170.0 325.0
50.00 75.00 100.00
g g ml g/mol
136.09 6.8 0.040 0.002 8.00
g/mol mol/dm3 mol/dm3
Rychlost reakce [ml/s]
Objem plynu [ml]
Čas od předchozího měření [s]
po zahřátí jsme počkali 2 minuty
3.617 0.136 400 228.23
#HODNOTA! 0.15 0.08
Tabulka 3: Kvasinky pˇri pH = 8
Měření 9 Koncentrace H2O2 Typ látky obsahující enzym Hmotnost látky obsahující enzym Objem pufru Objem H2O2
5% kvasinky 1.00 20 20
Teplota reakce pH pufru
26 5.98
g ml ml
Příprava pufru pH = 6 Hmotnost K2HPO4 v pufru Hmotnost KH2PO4 v pufru Objem pufru MK2HPO4*3H2O
°C
MKH2PO4 pK Koncentrace K2HPO4 Koncentrace KH2PO4 pH pufru
0.0 63.0 52.0 48.0 55.0 62.0 84.0
50.00 75.00 100.00 125.00 150.00 175.00 200.00
Rychlost reakce [ml/s]
Objem plynu [ml]
Čas od předchozího měření [s]
po zahřátí jsme počkali 2 minuty
#HODNOTA! 0.40 0.48 0.52 0.45 0.40 0.30
Tabulka 4: Kvasinky pˇri pH = 6
6
0.46 1.81 400 228.23
g g ml g/mol
136.09 6.8 0.005 0.033 5.98
g/mol mol/dm3 mol/dm3
