Molekulární diagnostika babesií Diplomová práce
Radek Píše
Vedoucí diplomové práce: RNDr. Ivo Rudolf, Ph.D.
Brno 2011
Bibliografický záznam
Autor:
Bc. Radek Píše Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie
Název práce:
Molekulární diagnostika babesií
Studijní program:
Biologie
Studijní obor:
Obecná biologie
Vedoucí práce:
RNDr. Ivo Rudolf, Ph.D.
Rok obhajoby:
2011
Klíčová slova:
Babesia, babesióza, Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis concinna, PCR, reverse line blot, RLB, izolace DNA, emergentní, zoonóza
Bibliographic entry
Author:
Bc. Radek Píše Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Detachment of Microbiology
Title of thesis:
Molecular diagnostics of babesias
Degree programme:
Biology
Field of study:
General biology
Supervisor:
RNDr. Ivo Rudolf, Ph.D.
Year of defence:
2011
Keywords:
Babesia, babesiosis, Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis concinna, PCR, reverse line blot, RLB, DNA isolation, emerging, zoonosis
Poděkování Chtěl bych především velmi poděkovat vedoucímu své diplomové práce, RNDr. Ivo Rudolfovi. Ph.D., za čas, ochotu, pomoc, odborné rady a připomínky, nezištné vedení a za trpělivost, které mi věnoval při vypracovávání této práce. Dále chci poděkovat prof. RNDr. Zdeňku Hubálkovi, DrSc. a celému kolektivu Oddělení medicínské zoologie Ústavu biologie obratlovců Akademie věd ČR za moţnost zpracovávat svoji diplomovou práci na tomto pracovišti, děkuji za vlídné přijetí, příjemné a inspirující pracovní prostředí a pomoc nejen při sběru klíšťat. Můj dík patří v neposlední řadě Ing. Lence Betášové za odbornou spolupráci při práci v laboratoři a za laskavý a přátelský přístup.
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem tuto diplomovou práci napsal samostatně a výhradně s pouţitím citovaných pramenů
Brno, 16. května 2011
………………..………………….. Radek Píše
Abstrakt Tato diplomová práce je zaměřena na molekulární diagnostiku vybraných druhů babesií v klíšťatech Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus a Haemaphysalis concinna. Klíšťata byla sbírána vlajkováním vegetace v letech 2008, 2010 a 2011 ve třech lokalitách na Břeclavsku, které náleţí ke dvěma rozdílným ekosystémům. Celkově 1288 odchycených klíšťat bylo roztříděno do 156 izolačních směsí podle druhu, vývojového stadia, pohlaví a lokality. DNA izolovaná z těchto směsí byla dále identifikována metodou reverse line blot (RLB). Tato práce přináší nové výsledky o výskytu prvoků Babesia microti, Babesia divergens, Babesia sp. EU1, Babesia canis canis a Babesia canis vogeli v uvedených druzích klíšťat čeledi Ixodidae, včetně hodnot minimálních prevalencí.
Abstract This thesis is focused on molecular diagnostics of selected species of babesias in hard ticks Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus and Haemaphysalis concinna. Ticks were collected by flagging of vegetation during years 2008, 2010 and 2011 in three areas, which are located near Břeclav city and belong to different ecosystems. A total of 1288 hard ticks were obtained and those individuals were separated into 156 pools according to species, stage, sex and the locality, where ticks were collected. DNA isolated from ticks, which were separated into the pools, was then identified by reverse line blot (RLB). This work records some new data about occurrence of protozoans Babesia microti, Babesia divergens, Babesia sp. EU1, Babesia canis canis and Babesia canis vogeli in mentioned species of ticks of the family Ixodidae, including the numbers of minimal prevalence.
Obsah 1 Úvod ........................................................................................................................................ 3 1.1 Charakteristika babesií ..................................................................................................... 3 1.1.1 Taxonomické zařazení babesií .................................................................................. 4 1.1.2 Morfologie a anatomie buňky ................................................................................... 7 1.1.3 Ţivotní cyklus ............................................................................................................ 8 1.2 Ekologie babesií ............................................................................................................. 12 1.2.1 Klíště jako přirozený vektor .................................................................................... 12 1.2.2 Vybrané druhy klíšťat .............................................................................................. 14 1.2.3 Alternativní cesty přenosu babesií........................................................................... 16 1.2.4 Přírodní ohniskovost nákaz, endemické oblasti, vybraní hostitelé.......................... 17 1.3 Onemocnění způsobená babesiemi, moţnosti terapie a prevence .................................. 19 1.3.1 Lidská babesióza ..................................................................................................... 19 1.3.2 Babesióza zvířat (piroplasmóza) ............................................................................. 20 1.3.3 Přehled humánně a veterinárně významných druhů babesií (tab. č. 1.3.3.1) .......... 23 1.4 Diagnostika a kultivace babesií ...................................................................................... 24 1.4.1 Mikroskopické pozorování v krevním roztěru ........................................................ 24 1.4.2 Imunologické diagnostické metody ......................................................................... 25 1.4.3 Molekulárně-biologické metody ............................................................................. 26 1.4.4 Kultivace babesií ..................................................................................................... 30 2 Cíl práce................................................................................................................................. 31 3 Materiál a metody .................................................................................................................. 32 3.1 Materiál........................................................................................................................... 32 3.1.1 Organizmy ............................................................................................................... 32 3.1.2 Laboratorní pomůcky .............................................................................................. 33 3.1.3 Ochranné prostředky ............................................................................................... 34 3.1.4 Laboratorní přístroje a technika............................................................................... 34 3.1.5 Roztoky a chemikálie .............................................................................................. 35 3.1.6 Komerční soupravy ................................................................................................. 36 3.2 Metody ............................................................................................................................ 36 3.2.1 Sběr klíšťat .............................................................................................................. 36 3.2.2 Izolace DNA ............................................................................................................ 41 3.2.2.1 Homogenizace klíšťat ....................................................................................... 42 1
3.2.2.2 Izolace DNA ..................................................................................................... 42 3.2.3 Polymerázová řetězová reakce (PCR) ..................................................................... 43 3.2.4 Příprava membrány pro RLB .................................................................................. 44 3.2.5 Reverse line blot (RLB)........................................................................................... 46 3.2.6 Vizualizace a vyhodnocení výsledků RLB.............................................................. 48 3.2.7 Recyklace membrány pro opětovné pouţití ............................................................ 48 4 Výsledky ................................................................................................................................ 50 4.1 Sběr klíšťat ..................................................................................................................... 50 4.2 Izolace DNA ................................................................................................................... 51 4.3 Vyhodnocení RLB .......................................................................................................... 55 4.4 Minimální prevalence ..................................................................................................... 63 5 Diskuze .................................................................................................................................. 66 6 Závěr ...................................................................................................................................... 71 7 Seznam literatury ................................................................................................................... 73
2
1 Úvod 1.1 Charakteristika babesií Babesie, česky klíštěnky (Hubálek a Rudolf 2007), patří mezi jednobuněčné eukaryotní mikroorganizmy přenášené klíšťaty. Jsou dále charakterizovány jako intracelulární parazité s obligátním střídáním hostitelů ve svém ţivotním cyklu, kdy do tohoto cyklu vstupuje jednak obratlovec jako mezihostitel, v jehoţ erytrocytech probíhá fáze nepohlavního rozmnoţování parazita, a jednak členovec, v němţ dochází k pohlavnímu rozmnoţování babesií v buňkách střeva. Tento členovec, kterým bývá výhradně klíště, se označuje jako definitivní hostitel. Patogenita babesií spočívá v poškozování erytrocytů. (Homer a kol. 2000a, Vial a Gorenflot 2006, Uilenberg 2006). Babesie jsou celosvětově rozšířeny (vyskytují se v takových biotopech, ve kterých mohou přeţít jejich vektory) a předpokládá se téţ, ţe rod Babesia patří mezi jedny z nejrozšířenějších krevních parazitů volně ţijících savců (Skotarczak a Cichocka 2001). Zoonózy způsobené babesiemi, tzv. babesiózy, si z hlediska humánní medicíny získávají v posledních letech stále více pozornosti; celosvětově je hlášen trend narůstajícího výskytu tohoto onemocnění a babesióza se tedy povaţuje za tzv. emergentní (nově se objevující) onemocnění (Homer a kol. 2000a, Tsuji a kol. 2001, Kim a kol 2007, Hildebrandt a kol 2007, Häselbarth a kol. 2007, Kjemtrup a Conrad 2000, Ríos a kol. 2003). V souvislosti s cestovním ruchem jsou známy i případy importované infekce, většinou ze Spojených států (Nohýnková a kol. 2003, Haapasalo a kol. 2004). Babesie jsou rovněţ významným veterinárním patogenem. Onemocnění zvířat bývá označováno jako tzv. piroplasmóza (Hubálek a Rudolf 2007). Mohou napadat nejen zvířata ţijící ve volné přírodě, ale i domácí a hospodářsky významná zvířata a často tak způsobují významné ekonomické ztráty v chovech, především v tropických a subtropických oblastech světa (Vial a Gorenflot 2006; Brown a kol. 2006). Za objevitele babesií se povaţuje Viktor Babes. Tento rumunský bakteriolog v roce 1888 popsal intraerytrocytární patogen, který způsoboval febrilní hemoglobinurii hovězího dobytka. Babes se tehdy domníval, ţe původcem onemocnění je některý ze zástupců domény Bacteria (Vial a Gorenflot 2006) a nazval jej Haematococcus bovis (Allsopp a Allsopp 2006). O pět let později, v roce 1893, Starovici tento mikroorganismus přejmenoval podle jména svého objevitele na Babesii bovis a určil, ţe se jedná o protozoární agens (Allsopp a Allsopp 2006). 3
1.1.1 Taxonomické zařazení babesií Dle Hausmanna a Hülsmanna (2003) je rod Babesia zařazen mezi následující taxony:
Nadříše: Eukaryota (Chatton, 1925) Říše: Mastigota (Hülsmann a Hausmann, 1994) Podříše: Dimastigota (Hülsmann a Hausmann, 1944) Nadkmen: Metakaryota (Cavalier-Smith, 1991) Kmen: Alveolata (Cavalier-Smith, 1992) Podkmen: Apicomplexa (Levine, 1970) Třída: Haematozoea (Rivier, 1982) Řád: Piroplasmida (Wenyon, 1926) Čeleď: Babesiidae (Poche, 1913) Rod: Babesia (Ikeda, 1914)
V současnosti je známo více neţ sto druhů babesií (Homer a kol. 2000a, Schuster 2002, Hunfeld a kol. 2008). Většina z nich byla taxonomicky zařazena na základě morfologických a fenotypových charakteristik. V souvislosti s rozvojem pouţívání molekulárně-biologických technik v taxonomii se však začíná odhalovat poměrně značná diverzita v celém rodu Babesia (Allsopp a Allsopp 2006). Velice podobné babesiím jsou tzv. theilerie, které jsou rovněţ protozoárními intracelulárními parazity přenášenými klíšťaty. Patří mezi ně např. Theileria parva (patogen veterinárního významu, původce onemocnění East Coast fever) či Theileria annulata (opět patogen
veterinárního
významu,
původce
tzv.
tropické
theileriózy).
Na
základě
morfologických pozorování byly v minulosti některé babesie i theilerie zařazeny do stejných 4
taxonomických skupin. Dnes jiţ nepouţívaný rod Piroplasma například obsahoval zástupce Piroplasma bigeminum (nyní Babesia bigemina) a Piroplasma parvum (nyní Theileria parva). Teprve pomocí elektronového mikroskopu mohly být odhaleny detailnější rozdílnosti mezi buňkami, došlo téţ k objasnění ţivotního cyklu a na základě těchto poznatků byli někteří zástupci tehdejších piroplasmat zařazeni do čeledi Babesiidae, jiní do čeledi Theileriidae. Přesto však zůstává skupina mikroorganizmů s nejistým taxonomickým postavením. Mezi tyto mikroorganismy patří například Theileria equi, Cytauxzoon felis, Babesia microti nebo Babesia gibsoni (Allsopp a Allsopp 2006). Ke spolehlivému odlišení obou mikroorganizmů se v současnosti vyuţívá molekulárně biologických metod, kdy je nejčastěji amplifikován a sekvenován gen pro malou ribozomální podjednotku 18 S RNA, a to buď jeho část, nebo kompletní sekvence (Criado-Fornelio a kol. 2003). Na základě sekvenace tohoto genu Allsopp a Allsopp (2006) navrhují rozdělení klíšťaty přenášených zástupců podkmene Apicomplexa do pěti skupin (viz obr. č. 1.1.1.1), které byly vytvořeny algoritmem PHYML (Phylogeny Maximum Likehood). Skupina Babesia sensu stricto by tak měla obsahovat zástupce Babesia bigemina, Babesia bovis, Babesia canis a Babesia gibsoni tzv. asijského typu. Druhá skupina, označená jako Theileria, je tvořena zástupci Theileria parva, T. annulata, T. mutans, T. taurotragi a T. buffeli. Třetí skupina, tzv. skupina A je poměrně různorodou skupinou a sdruţuje zástupce Theileria equi, T. bicornis, Cytauxzoon felis, Babesia bicornis a Theileria youngi. Skupina B je tvořena převáţně piroplasmaty severoamerického typu (Piroplasmida gen. sp. CA1, Piroplasmida gen. sp. CA4, Piroplasmida gen. sp. MD1, Piroplasmida gen. sp. BH1, Babesia WA1, Babesia WA2), nalezneme zde ovšem i Babesii gibsoni typu California, coţ zřejmě naznačuje nejednotnost druhu Babesia gibsoni. Skupina C je poslední navrhovanou skupinou a jsou v ní obsaţena piroplasmata kočkovitých šelem (B. felis, B. rodhaini, B. leo, Babesia sp. caracal A) a Babesia microti (Allsopp a Allsopp 2006).
5
Obr. č. 1.1.1.1: Fylogenetické vztahy mezi rody Babesia a Theileria. Kladogram vytvořen na základě sekvenace 18S RNA genu pomocí algoritmu PHYML. Pro modelování fylogenetického stromu byly použity organizmy Sarcocystis muris, Toxoplasma gondii a Prorocentrum micans. Měřítko udává změnu 10 nukleotidů ve 100 nukleotididových pozicích. (Upraveno dle Allsopp a Allsopp 2006.) 6
Hunfeld a kol. (2008) navrhují velice podobné fylogenetické uspořádání mezi babesiemi a babesiím podobnými piroplasmaty. Významný humánní i veterinární patogen Babesia divergens by tak měla být zařazena do skupiny tzv. pravých babesií (Babesia sensu stricto, Hunfeld a kol. 2008).
1.1.2 Morfologie a anatomie buňky Během nepohlavního rozmnoţování v erytrocytech mají merozoiti či trofozoiti babesií hruškovitý tvar. Odtud plyne označení piroplasmida (latinsky pirum = hruška, Allsopp a Allsopp 2006). Jejich velikost je asi 1,5µm-5µm. Proto se babesie neformálně rozdělují na tzv. „malé“ babesie s velikostí trofozoitů do 2,5µm (Babesia gibsoni, B. microti, B. rodhaini) a na „velké“ babesie s velikostí trofozoitů do 5,0µm (Babesia bovis, B. canis, B. caballi) (Homer a kol. 2000a, Hunfeld a kol. 2008). Schematické znázornění buňky výtrusovců (Apicomplexa) je znázorněno na obr. č. 1.1.2.1. Povrch buňky je tvořen pelikulou. Pod ní je vnitřní membránový komplex. V přední části buňky se nalézá útvar zvaný apikální komplex; tvoří jej konoid se staţitelným polárním prstencem, dále roptrie, u nichţ se často vyskytují další specializované organelymikronemata (Hausmann a Hülsmann 2003). Apikální komplex sekretuje proteiny důleţité při invazi erytrocytu (Yokoyama a kol. 2006). Pozoruhodnou organelou výtrusovců je apikoplast. Je to nefotosyntetizující plastidu podobný útvar, který snad kdysi vznikl endosymbiózou výtrusovce a fotosyntetizujcího mikroorganizmu, pravděpodobně řasy. Obsahuje čtyři biologické membrány (Lang-Unnasch a kol. 1998). Význam apikoplastu spočívá v biosyntéze mastných kyselin (Hausmann a Hülsmann 2003).
7
Obr. č. 1.1.2.1: Schéma buňky výtrusovců. (Upraveno dle Gürtler a kol. 2009.)
1.1.3 Životní cyklus Babesie jsou obligátní intracelulární parazité. Pro jejich dokonalý vývoj je typické střídání hostitelů, kdy do jejich ţivotního cyklu vstupuje jednak obratlovec, v jehoţ erytrocytech probíhá nepohlavní rozmnoţování parazita, a jednak členovec (klíště), v němţ babesie prodělávají pohlavní rozmnoţování a klíšťata jsou tedy označována jako definitivní hostitelé (Vial a Gorenflot 2006, Homer a kol. 2000a, Kjemtrup a Conrad 2000). Ve vývojovém cyklu babesií rozlišujeme tři stadia: gamogonii, která probíhá ve střevě klíštěte a dochází ke splývání gamet a formování zygoty, sporogonii, coţ je nepohlavní rozmnoţování prvoka v buňkách slinných ţláz klíštěte; ve třetím stupni vývoje, který se nazývá merogonie, dochází k nepohlavnímu rozmnoţování v erytrocytech obratlovců (Vial a Gorenflot 2006). Schéma ţivotního cyklu je znázorněno v obr. č. 1.1.3.1. Klíště je babesiemi nakaţeno během sání na infikovaném obratlovci (A). Ve střevě klíštěte pak dochází k uvolňování parazitů z erytrocytů. U některých se ještě uvnitř erytrocytu začnou formovat hrotovité útvary, tzv. Strahlenkörperova tělíska (B). Buňky s tímto tělískem dále fúzují s buňkami bez něj a vytváří zygotu (C) (Rudzinska a kol. 1983, Mehlhorn a Schein 1984). Tato zygota se stává pohyblivou (někdy téţ nazývána motilní kinetou), opouští střevo 8
a hemolymfou se můţe dostávat (v závislosti na druhu babesie) do různých orgánů klíštěte (např. ovarií dospělé samice, nefrocytů, slinných ţláz), kde můţe téţ proběhnout primární nepohlavní dělení (Kjemtrup a Conrad 2000). Bylo prokázáno, ţe transovariální přenos existuje u skupiny tzv. „velkých“ babesií, která je označována také jako Babesia sensu stricto (Homer a kol. 2000a, Allsopp a Allsopp 2006, Hunfeld a kol. 2008). V buňkách slinných ţláz lze potom vývoj rozlišit do tří stupňů. Parazit nejprve vstoupí do těchto buněk a expanduje, přičemţ vytváří mnohojaderný a relativně nerozlišený útvar zvaný sporoblast (D). Druhý stupeň vývoje nastává pouze tehdy, jestliţe klíště saje na obratlovci. Uvnitř sporoblastu se začnou vyvíjet specializované organely budoucích sporozoitů (mikronemy, roptrie a dvoumembránové komplexy pod cytoplazmatickou membránou, E). Konečná fáze vývoje je charakteristická rozpadem sporoblastu a z něj se uvolňují zralí sporozoiti hruškovitého tvaru (F). Z jediného sporoblastu se obvykle uvolní 5 000-10 000 sporozoitů. Tito jsou spolu se slinami klíštěte inokulováni do krve obratlovce (G). Invadují do erytrocytů procesem invaginace (H). Sporozoiti tak v erytrocytu vytvářejí vakuolu, ta je postupně rozrušována a sporozoit (merozoit) se přeměňuje na tzv. trofozoit, který se nakonec rozdělí binárním dělením (I) ( Homer a kol. 2000a).
9
Obr. č. 1.1.3.1: Schéma ţivotního cyklu Babesia spp. (Upraveno dle Homer a kol. 2000a.) Yokoyama a kol. (2006) popisují detailněji průnik babesií do erytrocytu (obr. č. 1.1.3.2), přesto však tento proces dosud není kompletně zdokumentován (Yokoyama a kol. 2006): 1)
Připojení merozoitu k hostitelské buňce. Glykoproteiny rodiny VMSA (angl. variable merozoite surface antigens, je jich známo nejméně pět typů) jsou lokalizovány na povrchu merozoitu a jsou nezbytné pro přichycení merozoitu k erytrocytu. Tyto glykoproteiny vytváří vazbu také s heparinem, kterým jsou pak inhibovány. Na povrchu merozoitu se proto předpokládá existence heparin vázajících molekul, které kompetitivně váţí heparin.
2)
Reorientace merozoitu apikálním komplexem k membráně erytrocytu.
3)
Pevné připojení merozoitu k plasmatické membráně erytrocytu
4)
Počátek invaze merozoitu do hostitelské buňky. Zde hrají významnou úlohu proteiny sekretované apikálním komplexem. Patří mezi ně RAP-1
protein
sekretovaný roptriemi (angl. rhoptry associated protein 1) a AMA-1 (angl. apical membrane antigen 1) a TRAP (angl. thrombospondin-related anonymous 10
protein) proteiny produkované mikronematy. Tyto proteiny reagují s dosud neznámými receptory erytrocytu, které obsahují kyselinu sialovou. 5)
Merozoit je v erytrocytu lokalizován v parazitoforní vakuole. Sekretovány jsou proteiny SPB (angl. spherical body protein), které se údajně podílejí na lyzi parazitoforní vakuoly.
Receptory hostitelské buňky, které babesie vyuţívají v průběhu penetrace, nejsou doposud popsány. Předpokládá se, ţe se jedná o molekuly obsahující kyselinu sialovou (N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid) (Yokoyama a kol. 2006).
Obr. č. 1.1.3.2: Schéma pronikání babesií do erytrocytu. (Upraveno dle Yokoyama a kol. 2006.) Ward a Jack (1981) se domnívají, ţe některé sloţky komplementu (zejména protein C3b) usnadňují pronikání parazita do červené krvinky. Při experimentu s krysími erytrocyty a merozoity B. rodhaini objevili, ţe receptor pro C3b se nachází jak v erytrocytu, tak i v babesii. Je-li v séru přítomen protein C3b, babesie se přes něj mohou k povrchu erytrocytu lépe přichytit a pronikání do hostitelské buňky je tak usnadněno (Ward a Jack 1981). Jestliţe dojde k rozpadu erytrocytu, uvolnění merozoiti napadnou jiný. Dochází k rapidnímu rozmnoţování parazita a jeho počet narůstá geometrickou řadou (Homer a kol. 2000a). Z některých trofozoitů se stávají gametocyty. Tyto formy parazita jiţ nepodléhají merogonii, zůstávají uvnitř erytrocytu a zvětšují svoji velikost (Rudzinska a kol. 1983). Ţivotní cyklus babesií končí, saje-li klíště na infikovaném obratlovci a jsou-li klíštětem
11
zkonzumovány erytrocyty obsahující gametocyty. Ty se pak ve střevě ještě uvnitř erytrocytu mění v gamety, dochází k formování zygoty a celý cyklus se opakuje (Homer a kol. 2000a). Je pozoruhodné, ţe některé druhy babesií, jako například Babesia equi nebo Babesia microti, snad mohou před tím, neţ napadnou erytrocyty, invadovat do lymfocytů, kde prodělají primární nepohlavní rozmnoţování (Kjemtrup a Conrad 2000).
1.2 Ekologie babesií 1.2.1 Klíště jako přirozený vektor Přirozeným vektorem babesií jsou téměř výhradně klíšťata čeledi Ixodidae. Byl popsán pouze jeden případ, kdy vektorem prvoka Babesia (Nuttallia) meri byl klíšťák (zástupce čeledi Argasidae) Ornithodoros erraticus (Gunders 1977). Dodnes známe přibliţně 650 druhů klíšťat (Ixodidae); ta představují značnou kapacitu v přenosu patogenů jako například Borrelia burgdorferi, Anaplasma phagocytophilum, Babesia spp., Ehrlichia spp., virus klíšťové encefalitidy aj. (Swanson a kol. 2006). Z taxonomického hlediska je čeleď klíšťatovitých (Ixodidae) zařazena do podřádu klíšťat (Ixodides), řádu roztočů (Acarina), třídy klepítkatců (Chelicerata) a kmene členovců (Arthropoda) (Hubálek a Rudolf 2007). Klíšťata jsou hematofágní členovci, mohou dorůstat do velikosti aţ 2 cm a jsou gonochoristé. Na těle klíšťat lze rozlišit dvě části: část přední, hlavovou (gnathosoma) a část zadní (idiosoma). V přední části se nachází hypostom, coţ je specializovaný lancetovitý orgán uzpůsobený k porušení koţní bariéry hostitele a k déletrvajícímu sání krve. Tělo klíšťat je kryto kutikulou. Dospělá klíšťata a nymfy mají čtyři páry končetin, larvy pouze tři páry (Mehlhorn 2001). Hřbetní strana je kryta chitinózním štítkem (scutum). U samců štítek dosahuje aţ k zadnímu okraji těla a překrývá tak celou zadní část klíštěte (conscutum), zatímco u samic je zadní část kryta pouze částečně a zbytek tvoří zřasený integument (alloscutum), který se při sání klíštěte můţe několikanásobně zvětšit. Po stranách štítku mohou být u některých rodů klíšťat oči (Dermacentor, Hyalomma), u jiných rodů chybějí (Ixodes, Haemaphysalis) (Hubálek a Rudolf 2007). Trávicí soustava začíná ústní dutinou vyloţenou chitinovým prstencem. Na jejím dně do ní ústí vývody slinných ţláz. Následuje hltan, jícen a střevo, které je uzpůsobeno tak, aby mohlo pojmout co nejvíce potravy (Rosický a Weiser 1952). Potrava je do těla klíštěte importována tzv. faryngeální pumpou (Mehlhorn 2001). Střední střevo (mesenteron) je
12
zakončeno dvěma malpigickými ţlázami, které na povrch vyúsťují v řitní otvor (Rosický a Weiser 1952). Dýchací soustavu vytváří vzdušnice, které vedou do plicních vaků. Vzdušnice na povrch těla ústí otvory zvanými stigmata (Rosický a Weiser 1952). Oběhová soustava je tvořena hemolymfou, jejíţ oběh je zajištěn vakovitým srdcem (Rosický a Weiser 1952). Mozkové ganglion se nachází v idiosomatu (Hubálek a Rudolf 2007). Důleţitým smyslovým orgánem klíšťat je Hallerův orgán. Nachází se na hřbetní straně chodidla prvního páru nohou. Slouţí především k vyhledávání kořisti, ale téţ pro registraci feromonů (u samců). Je tvořený značným mnoţstvím receptorových buněk. Klíště pomocí tohoto orgánu dokáţe vnímat nejen změny koncentrace oxidu uhličitého, ale i stopy těkavých látek, které se nacházejí ve zvířecím pachu a působí jako atraktanty. Tyto látky byly odhaleny pomocí plynové chromatografie a můţe mezi ně patřit například amoniak, těkavé mastné kyseliny, 2-nitrofenoly, 4-metyl-2-nitrofenoly. Některé látky ještě nebyly identifikovány a zdá se, ţe jednotlivé druhy klíšťat preferují pro ně typické atraktanty (Steullet a Guerin 1994). Klíšťata ve svém ţivotním cyklu procházejí několika vývojovými stadii. Celý ţivotní cyklus můţe trvat aţ šest let (Mehlhorn 2001). U Ixodes ricinus však zpravidla trvá tři roky (Hubálek a Rudolf 2007). Z oplozeného vajíčka se vyvine nejprve šestinohá larva. Po nasátí se mění v osminohou nymfu. Pro další vývoj nymfy je nutné opětovné sání na vhodném hostiteli. Mehlhorn (2001) uvádí, ţe samčí pohlavní orgány jsou plně vyvinuty uţ na konci nymfálního svlékání (Mehlhorn 2001). Po nymfálním svlékání je tedy klíště jiţ plně vyvinuto a připraveno k reprodukci; nasátá samice klade oplozená vajíčka v počtu 500-10 000 (Hubálek a Rudolf 2007). Dle střídání hostitelů v ţivotním cyklu rozlišujeme tento vývojový cyklus klíšťat na jendohostitelský, pro nějţ je typické, ţe klíšťata ţijí od larvy po imágo na jednom hostiteli. Jednohostitelským cyklem se vyznačují klíšťata rodu Boophilus. Dvojhostitelský cyklus je charakteristický pro klíšťata Rhipicephalus bursa; larvy zůstávají na hostiteli a přeměňují se v nymfy, které po odpadnutí a přeměně v imága vyhledávají dalšího hostitele. Trojhostitelský cyklus je charakteristický pro většinu druhů klíšťat (např. Ixodes ricinus); po kaţdém nasátí následuje odpadnutí, metamorfóza v následující vývojové stadium a opětovné sání na jiném hostiteli (Mehlhorn 2001).
13
1.2.2 Vybrané druhy klíšťat V následujícím textu jsou uvedeny ty druhy klíšťat, u kterých byl prokázán přenos babesií, nebo se moţnost přenosu předpokládá. Ixodes ricinus je rozšířeno téměř v celé Evropě, malé Asii a v severní Africe (Swanson a kol. 2006). U nás se vyskytuje hojně. Preferuje biotopy s dostatečnou vlhkostí, typicky se vyskytuje v listnatých a smíšených lesích mírného pásu do nadmořské výšky asi 700 m. Aktivita klíšťat vrcholí obvykle v květnu aţ červnu, druhý menší vrchol výskytu nastává na začátku podzimu (Hubálek a Rudolf 2007). Klíště obecné je přenašečem celé řady patogenů. Přenáší mimo jiné původce lymské borreliózy, klíšťové encefalitidy, lidské granulocytární anaplasmózy a tularémie (Duh a kol. 2001, Swanson a kol. 2006). Z babesií u něj byla prokázána B. microti (Rudolf a kol. 2005, Duh a kol. 2001, Skotarczak a Cichocka 2001), B. divergens, Babesia. sp. EU1 (Blaschitz a kol. 2008, Becker a kol. 2009, Bonnet a kol. 2007) a Babesia. sp. CH1 (Hilpertshauser a kol. 2006). Ixodes persulcatus obývá východní část Evropy, asijskou část Ruska táhnoucí se aţ k japonským ostrovům a Ţlutému moři (Swanson a kol. 2006). Přenáší flavivirus RSSE (ruské jaro-letní encefalitidy), Borrelia burgdorferi s. l., Babesia microti (Hubálek a Rudolf 2007). Ixodes scapularis se vyskytuje na východním pobřeţí Spojených států. Někdy je nazýváno jako Ixodes dammini. Z babesií můţe přenášet B. microti, B. odocoilei (Homer a kol. 2000a, Spielman a kol. 1984), dále u něj byl prokázán přenos Borrelia burgdorferi (Persing a kol. 1992) a povaţuje se za vektora lidské granulocytární anaplasmózy. Je pozoruhodné, ţe přítomnost Anaplasma phagocytophilum v těle klíštěte indukuje expresi protimrazových glykoproteinů, které mu mohou pomáhat přeţít v zimním období (Neelakanta a kol. 2010). Ixodes pacificus se nachází na západním pobřeţí Spojených států, podél pacifického pobřeţí. Parazituje běţně na hlodavcích Peromyscus maniculatus, Neotoma fuscipes a Dipodomys californicus. Přenáší patogeny Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdorferi s. l., pravděpodobně i Babesia gen. sp. WA1 (Kjemtrup a Conrad 2000, Lane a kol. 2009). Ixodes trianguliceps se vyskytuje v Evropě (Velká Británie, Irsko, severní Itálie). Parazituje výhradně na drobných hlodavcích, člověka nenapadá. Je vektorem pro Anaplasma phagocytophilum a Babesia microti (Bown a kol. 2008). Dermacentor reticulatus, česky piják luţní, je trojhostitelským druhem, vyskytujícím se v Eurasii, v ČR však pouze na jiţní Moravě v zaplavovaných níţinatých oblastech luţních 14
lesů. Člověka napadá jen výjimečně. Přenáší virus středoevropské klíšťové encefalitidy, virus omské hemoragické horečky, rickettsie (R. conorii, R. sibirica) a bakterii Francisella tularensis (Hubálek a Rudolf 2007). Z babesií je významným vektorem Babesia canis (Duh a kol. 2006). V posledních desetiletích je zaznamenán zvýšený výskyt tohoto klíštěte zejména na Slovensku, v Maďarsku, Polsku a Německu (Bullová a kol. 2009). Rhipicephalus sanguineus je klíště obývající subtropické a tropické oblasti světa. Přenáší prvoka Babesia canis vogeli (M’ghirbi a Bouattour 2008). V obr. č. 1.2.2.1 znázorněn R. sanguineus během sání na psu. Rhipicephalus bursa je klíště s dvojhostitelským ţivotním cyklem. Parazituje na domácích zvířatech v jiţní Evropě a střední Asii. Přenáší viry Thogoto, Bhandţa a prvoka Babesia ovis (Hubálek a Rudolf 2007). Boophilus annulatus je druhem klíštěte s jednohostitelským ţivotním cyklem. Vyskytuje se v Asii, Americe a severní Africe a parazituje na skotu; přenáší prvoka Babesia bigemina, který je původce tzv. texaské horečky (Hubálek a Rudolf 2007, Adham a kol. 2009). Boophilus spp. je také vektorem B. bovis (Mehlhorn a Schein 1984). Haemaphysalis punctata je druhem rozšířeným v Evropě, dále v Přední Asii a severní Africe. Je významným přenašečem virů Bhandţa a Tribeč, klíšťové encefalitidy, baktérie Coxiella burnetti (Hubálek a Rudolf 2007) a prvoka B. major (Vial a Gorenflot 2006). Amblyomma americanum se vyskytuje v jihovýchodní části Spojených států a ve Střední Americe. Napadá člověka, volně ţijící savce a skot. Přenáší baktérie Rickettsia rickettsi, R. parkeri, Coxiella burnetti, Ehrlichia spp., Francisella tularensis a prvoka Babesia odocoilei (Goddard a Varela-Stokes 2009).
15
Obr. č. 1.2.2.1: Masivní infestace R. sanguineus v uchu psa. (Upraveno dle M’ghirbi a Bouattour 2008.)
1.2.3 Alternativní cesty přenosu babesií Přirozeným vektorem babesií je klíště. V humánní medicíně však byly popsány případy, kdy byli pacienti nakaţeni při krevních transfúzích, vzácně při transplantacích srdce (1 případ) a ledvin (3 případy) (Gürtler a kol. 2009). Vertikální přenos z matky na dítě byl popsán pouze v jednom případě (Feder a kol. 2003). Od roku 1980 je zaznamenáno více neţ 20 případů posttransfúzních babesióz (Dobroszycki a kol. 1999, Kjemtrup a kol. 2002, Gürtler a kol. 2009, Kain a kol. 2001), z toho nejméně jeden případ skončil fatálně (Bove 1990). Některé odhady však hovoří aţ o 70 případech, kdy byl pacient v důsledku krevní transfúze nakaţen B. microti, z nichţ 12 skončilo fatálně (Johnson a kol. 2009). Protoţe se jedná o poměrně vzácný přenos (v souvislosti s transfúzí), krev dárců se na babesie nebo protilátky proti babesiím rutinně nevyšetřuje, navíc eventuální babesióza by pravděpodobně u 75% imunokompetentních jedinců probíhala asymptomaticky (Gürtler a kol. 2009). Zvýšená pozornost by se měla věnovat dárcům pocházejícím z endemických oblastí výskytu babesiózy (Dobroszycki a kol. 1999), u kterých totiţ můţe onemocnění probíhat bez klinických příznaků, přitom parazitémie v krvi můţe přetrvávat měsíce i roky (Krause a kol. 1998).
16
1.2.4 Přírodní ohniskovost nákaz, endemické oblasti, vybraní hostitelé Teorii přírodní ohniskovosti nákaz formuloval v roce 1946 J. N. Pavlovskij takto: „Přirozená ohniskovost přenosných chorob je zjev, kdy původce, jeho specifický přenašeč a zvířata (rezervoáry) v proudu střídání svých pokolení, existují neomezeně dlouhou dobu v přirozených podmínkách v soustavě rozličných biocenóz, nezávisle na člověku, jak v průběhu své již prošlé evoluce, tak i v současném jejím období.“ (Rosický a Weiser 1952). Rosický a Kučeruk (1984) popisují ohnisko jako nejmenší krajinný biotop, kde se uskutečňuje v současných geobiocenózách koloběh původce bez jeho zánosu z vnějška neurčitě dlouhou dobu. Přírodní ohnisko je jev individuální a jeho hranice mohou být zaznačeny do mapy. Základními sloţkami přírodního ohniska jsou: původce onemocnění, hostitelé (obratlovci), přenašeči, biotop, v němţ je ohnisko umístěno, vnější prostředí (Rosický a kol. 1989). Člověk se můţe nakazit při vstupu do přírodního ohniska nákaz (Hubálek a Rudolf 2007). Babesióza je povaţována za zoonotické onemocnění a její koloběh v přírodě tedy podléhá pravidlům teorie přírodní ohniskovosti nákaz. Významné endemické oblasti výskytu babesiózy se nalézají především ve Spojených státech, a to na ostrově Nantucket, v Middlesex a New London v Connecticut, v Massachusetts, Rhode Island, Long Island, Wisconsin, New Jersey), kde je etiologickým agens Babesia microti, za vektora bývá povaţováno klíště I. scapularis a jako rezervoár slouţí hlodavci Peromyscus leucopus, Microtus pennsylvanicus, Sylvilagus floridanus (Anderson a kol. 1986, Anderson a kol. 1991, Johnson a kol. 2009, Kjemtrup a Conrad 2000). Ze západních částí Spojených států (Washington, Oregon, Kalifornie) byly poměrně nedávno hlášeny babesiózy, jejichţ původci jsou piroplasmata označovaná dříve jako Babesia sp. WA1 (Quick a kol. 1993, Persing a kol. 1995), v současnosti je však doporučováno taxonomické pojmenování Babesia duncani n. sp. (Conrad a kol. 2006, Prince a kol. 2010). Mimo Babesia duncani n. sp. Conrad a kol. (2006) popisují i piroplasmata pocházející od pacientů ze západu Spojených států, která jsou podobná prvoku Babesia duncani n. sp. a označují je prozatímně jako „piroplasmata typu B. duncani.“ Patří mezi ně Babesia sp. WA2, WA3, CA1, CA2, CA3, CA4, CA6 (Conrad a kol. 2006). Klíště Ixodes pacificus, u nějţ byla experimentálně prokázána moţnost přenosu B. microti, se jeví téţ jako moţný kompetentní vektor pro B.duncani n. sp. (Quick a kol. 1993). V Evropě, kde humánní infekce způsobuje ve většině případů B. divergens, se babesiózy vyskytují nejvíce v oblastech s extenzivním způsobem chovu skotu. Tuři (Bovinae) se totiţ povaţují za rezervoár pro B. divergens. Hlavní vektor pro B. divergens je I. ricinus (Vannier a Krause 2009). Endemické oblasti se nalézají ve Velké Británii, Francii a Irsku, sporadické 17
případy babesióz jsou pak hlášeny ze Švýcarska, Španělska, Švédska, Belgie (Nohýnková a kol. 2003, Vannier a Krause 2009). Nově jsou ve střední Evropě hlášeny i případy autochtonních babesióz způsobených prvokem Babesia sp. EU1 (Häselbarth a kol. 2007, Herwaldt a kol. 2003), jehoţ rezervoárem jsou jelenovití (Cervidae) a jako vektor bylo doposud popsáno klíště I. ricinus (Bonnet a kol. 2007, Bonnet a kol. 2009). Mikroorganizmus Babesia sp. EU1 byl dále prokázán v klíšťatech (I. ricinus) ve Slovinsku (Duh a kol. 2005), v severní Itálii a Nizozemsku, (Cassini a kol. 2010), ve Francii (Bonnet a kol. 2007), ve Švýcarsku (Casati a kol. 2006) i v severním Polsku (Cieniuch a kol. 2009). Babesia canis je zvířecí patogen a u psů domácích (Canis lupus familiaris) můţe vyvolat onemocnění s těţkým průběhem. Za obvyklého vektora se povaţují klíšťata rodu Dermacentor a Rhipicephalus. Endemické oblasti byly popsány ve Francii (Languedoc, Gironde, Marne, Ain) (Bourdoiseau 2006), v Nizozemsku (Matjila a kol. 2005), v Itálii (Solano-Gallego a kol. 2008), Německu (Gothe a Wegerdt 1991), Maďarsku (Földvári a kol. 2005) i Polsku (Adaszek a Winiarczyk 2008). Autochtonní případy psí babesiózy zatím nebyly v ČR zaznamenány, pokud bylo onemocnění u psů zjištěno, vţdy se jednalo o import agens z endemických oblastí výskytu babesiózy v Evropě. Prvok B. canis doposud nebyl u nás detegován ani v klíšťatech Dermacentor reticulatus, která slouţí jako kompetentní vektoři pro přenos B. canis ve Střední Evropě (Konvalinová a kol. 2011). V ČR byli popsáni někteří savci, kteří mohou slouţit jako rezervoár pro B. microti. Patří mezi ně především hlodavci, například hryzec vodní (Arvicola terrestris), norník rudý (Clethrionomys glareolus), hraboš polní a podzemní (Microtus arvalis, M. subterraneus), hraboš mokřadní (Microtus agrestis) (Hubálek a Rudolf 2007). Z epidemiologického hlediska je pozouhodné, ţe baktérie Anaplasma phagocytophilum, vyskytující se téţ často v hraboši mokřadním (Microtus agrestis), v něm indukuje zvýšenou vnímavost k infekci B. microti. Jedinci infikováni A. phagocytophilum by tak mohli být suspektní i z infekce B microti (Telfer a kol. 2008). Z dalších hlodavců hraje v ekologii babesií významnou roli i myška drobná (Micromys minutus), myšice lesní a křovinná (Apodemus flavicollis, Apodemus sylvaticus), myš domácí (Mus musculus), potkan a krysa (Rattus norvegicus, Rattus rattus). Mezi hmyzoţravce, kteří slouţí jako rezervoár pro B. microti, mohou patřit například rejsek obecný a malý (Sorex araneus, S. minutus), rejsec vodní a černý (Neomys fodiens, N. anomalus) či krtek obecný (Talpa europaea). Z šelem byla B. microti nalezena u jezevce lesního (Meles meles) (Hubálek a Rudolf 2007).
18
1.3 Onemocnění způsobená babesiemi, možnosti terapie a prevence 1.3.1 Lidská babesióza Babesióza je nebezpečné invazivní onemocnění. Za etiologické agens se povaţují hlavně dva druhy babesií: B. microti způsobující infekce nejvíce ve Spojených státech a B. divergens, která je evropským původcem infekcí (Skotarczak 2008). První případ lidské babesiózy, který byl fatální, zaznamenal v roce 1957 Skrabalo a Deanovic; původcem onemocnění jugoslávského farmáře byla Babesia divergens (Kjemtrup a Conrad 2000, Vannier a Krause 2009). Od té doby je hlášeno v Evropě přes třicet případů babesiózy způsobených nejen B. divergens (Kjemtrup a Conrad 2000). V roce 2003 Herwaldt a kol. publikují práci zabývající se molekulární diagnostikou babesiózy u dvou asplenických muţů (z Rakouska a Itálie). Analýzou kompletního 18S rRNA genu bylo zjištěno, ţe původcem onemocnění není B. divergens, ale příbuzný mikroorganizmus označený jako Babesia sp. EU1. Jednalo se tak o vůbec první případ zoonotické babesiózy, jejímţ etiologickým agens byl prvok Babesia sp. EU1 (Herwaldt a kol. 2003). V prosinci 2005 se babesióza způsobená prvokem Babesia sp. EU1 objevuje i v Německu. Pacientem byl 63 letý muţ po splenektomii (Häselbarth a kol. 2007). Byl popsán i případ importované infekce B. microti do ČR. Pacientem byl zdravý 58 letý muţ, u kterého onemocnění propuklo po návštěvě Spojených států (Nohýnková a kol. 2003). Ve Spojených státech se babesióza objevuje poprvé v roce 1969 na ostrově Nantucket. Dodnes je reportováno přes 300 případů (Nohýnková a kol. 2003) a mimo B. microti tam lidské babesiózy způsobuje i komplex B. duncani (Conrad a kol. 2006). Beattie a kol. (2002) popisují i případ akutní babesiózy způsobené B. divergens. Jednalo by se tak o první případ, kdy byla etiologickým agens babesiózy na severoamerickém kontinentu B. divergens. Jelikoţ za obvyklého vektora tohoto patogenu se povaţuje I. ricinus, které není v Severní Americe rozšířeno, je tento případ dosti unikátní (Beattie a kol. 2002). Naopak v Evropě byl v roce 2007 potvrzen vůbec první případ autochtonní babesiózy způsobené B. microti v Evropě. Onemocnění bylo popsáno u 42 leté pacientky trpící akutní myeloidní leukémií (Hildebrandt a kol. 2007). Průběh onemocnění můţe být velmi rozličný; infekce můţe probíhat zcela asymptomaticky na straně jedné, na straně druhé se můţe manifestovat velmi těţkým průběhem podobným malárii, které ovšem postrádá pro malárii typickou periodicitu (Krause 19
2000). Inkubační doba se obvykle pohybuje mezi 1-4 týdny od přisátí klíštěte. Mezi nejběţnější příznaky lze zařadit malátnost, únavu, nechutenství, úbytek hmotnosti, zimnici a horečku okolo 40°C (Gürtler a kol. 2009). Laboratorní nález se vyznačuje většinou anémií, leukopenií, trombocyopenií, zvýšenou sedimentací, zvýšenou hodnotou alkalické fosfatázy, zýšenou hodnotou bilirubinu (Nohýnková a kol. 2003, Nelson a kol. 2009), při vyšší parazitémii i hematurií a hemoglobinurií (Homer a kol. 2000a). Ohroţenými skupinami pacientů jsou především imunodeficientní jedinci (například HIV pozitivní, pacienti po transplantacích), jedinci, u kterých byla provedena splenektomie, velmi mladí i starší lidé (Vannier a Krause 2009) a těhotné ţeny (Feder a kol. 2003). Terapie se provádí standardně podáváním kombinace chininu a klindamycinu. Dávkování a způsob podání se upravuje podle závaţnosti infekce, podle stavu pacienta a podle parazitémie. Ta bývá obvykle mezi 1% - 20% (Kjemtrup a Conrad 2000), v těţkých případech i 80%. Zde je nutné mimo podávání terapeutik uskutečnit i transfúzní výměnu krve (Brasseur a Gorenflot 1992). Při alternativní léčbě se s úspěchem pouţilo kombinace chininu s azithromycinem (Shih a Wang 1998). Osvědčilo se i pouţití kombinace atovaquonu a azithromycinu; tato terapie je pacienty lépe snášena, má méně vedlejších účinků neţ standardní terapie, je ale i draţší a proto méně pouţívanou (Krause a kol. 2000). U některých imunosuprimovaných jedinců se i po úspěšné terapii dostaví relaps onemocnění. V těchto případech je nutné prodlouţit dobu podávání terapeutik aţ na šest týdnů a bedlivě sledovat parazitémii nejlépe pomocí molekulárně-biologických metod, jelikoţ tyto jsou nejcitlivější (Vannier a Krause 2009). Vakcína pro humánní medicínu v současnosti není vyvinuta (Vannier a Krause 2009). Babesie totiţ mají velmi výkonný systém pro udrţování variability imunodominantních povrchových antigenů (Homer a kol. 2000b). Proto jedinou prevencí je zamezit přisátí potenciálně infikovaného klíštěte (vhodným oděvem, pouţitím repelentu, atd.).
1.3.2 Babesióza zvířat (piroplasmóza) Babesie jsou rovněţ závaţným veterinárním patogenem. Napadají psy (B. canis), ovce (B. ovis), skot (B. bovis, B. bigemina, B. divergens) i koně (B. cabali), ale i volně ţijící druhy jako například kočkovité šelmy (B.rodhaini, B. felis), hlodavce (B. microti) či jelenovité (B. odocoilei) (Vial a Gorenflot 2006, Bonnet a kol. 2007). Infekce můţe probíhat buď zcela inaparentně, nebo se můţe vyvinout v závaţné onemocnění, které můţe končit fatálně. Příznaky onemocnění souvisejí s akutní hemolýzou, která je důsledkem nepohlavního 20
rozmnoţování prvoka uvnitř erytrocytu; patří mezi ně, podobně jako u lidské babesiózy, horečka, ikterus, hematurie, hemoglobinurie, malátnost, nechutenství. Bovinní babesióza, způsobená B. bovis a B. bigemina se vyskytuje hlavně v tropických a subtropických oblastech světa (subtropická Evropa, Jiţní a Severní Amerika, Afrika, Austrálie, subtropická Asie), zatímco B. divergens způsobuje onemocnění ve Velké Británii a severnějších částech Evropy. Zdá se, ţe k nákaze je více vnímavý dospělý skot, kde mortalita můţe u neléčených případů dosahovat aţ 50%. Po prodělané babesióze vzniká dlouhotrvající imunita proti homolognímu kmeni babesií. V současnosti se jako antibabesiální terapeutikum vyuţívá diminazen diaceturát, imidokarb diproprionát a amikarbalid (Vial a Gorenflot 2006). Typicky imidokarb však můţe dlouhou dobu zůstávat v mase a mléce ošetřených zvířat, proto se od jeho pouţívání v mnoha evropských zemích odstoupilo (de Waal a Combrink 2006). Pro úspěšnou léčbu je nezbytná včasná diagnóza a promptní chemoterapie (Vial a Gorenflot 2006). Vakcinace je poměrně spolehlivou ochranou hovězího dobytka. Pouţívá se nejčastěji z atenuovaných babesiálních kmenů, vyprodukovaných ve splenektomovaném skotu (de Waal a Combrink 2006). Nejlepších výsledků se dosahuje, jestliţe je skot imunizován před prvním rokem ţivota. Mladý skot vykazuje účinnější imunitní odpověď proti babesiím (Brown a kol. 2006). Ţivá vakcína však představuje i určitá rizika (moţná kontaminace bovinními patogeny, vznik virulentního kmene), proto je vyvíjena vakcína rekombinantní (Zintl a kol. 2003, Homer a kol. 2000a). Patarroyo a kol. (1995) popisují experimentální pouţití povrchových antigenů oslabeného brazilského kmene B. bovis (BbUFV1) k vakcinaci. Po imunizaci skotu a jeho následnému vystavení heterolognímu virulentnímu kmeni B. bovis pozorovali protektivní imunitní odpověď (Patarroyo a kol. 1995). Hines a kol. (1995) popisují pouţití rekombinantní vakcíny, kdy byl v buňkách E. coli exprimován imunodominantní povrchový antigen B. bovis MSA-1 (42-kDa, angl. merozoite surface antigen-1). Ačkoliv in vitro docházelo k neutralizaci (opsonizaci) merozoitu, skot imunizovaný rekombinantním MSA-1, přestoţe protilátky proti MSA-1 byly v séru pozitivní, nebyl proti experimentální infekci B. bovis imunní (Hines a kol. 1995). Pro přípravu rekombinantní vakcíny bude zřejmě nutné zaměřit se na další povrchové antigenní struktury, zejména na proteiny apikálního komplexu. Účinně byly in vitro pouţity i protilátky Mab BABB75A4 proti antigenu RAP-1 u B. bovis (Mosqueda a kol. 2002). Variabilita povrchových antigenů skupiny VMSA je dána vypínáním a zapínáním genů rodiny vms. Tímto mechanismem parazit uniká imunitnímu systému hostitele. Molekulární podstata tohoto jevu, který je významnou překáţkou pro vývoj účinné rekombinantní vakcíny, není známa (Barbour a Restrepo 2000, Yokoyama a kol. 2006). 21
Psí babesie byly ve světě detegovány takto: ve střední Evropě se vyskytuje převáţně B. canis canis (Földvári a kol. 2005, Duh a kol. 2004, Duh a kol. 2006, Schetters 2005), ale i B. canis vogeli (Duh a kol. 2006), v jiţní Evropě a severní Africe byla nalezena B. canis vogeli (M’ghirbi a Bouattour 2008, Cardoso a kol. 2010), v jiţní Africe B. canis rossi a v Asii B. gibsoni (Schetters 2005). Klinické příznaky onemocnění mohou být klasické (horečka, nechutenství, anémie, bilirubinurie, ţloutenka) či netypické, které mohou komplikovat správnou diagnostiku (oční poruchy, poruchy gastrointestinálního traktu a nekrózy končetin následkem hemoragie a diseminované intravaskulární koagulace). U psů jsou časté i chronické formy babesióz se subklinickými příznaky. K léčbě se, intramuskulárně či perkutánně, pouţívá imidokarb (Bourdoiseau 2006), dále trypanová modř intravenózně nebo diminazen aceturát intramuskulárně. V těle psů však i po úspěšné léčbě zůstává nízká parazitémie, protoţe současná chemoterapie není u psů schopna babesie zcela eliminovat; v budoucnu pak můţe nastat relaps onemocnění. Psi, u kterých byla babesióza léčena, také mohou slouţit jako zdroj nákazy (Vial a Gorenflot 2006). Jendou z moţností profylaxe je vakcinace psů. Vakcína obsahuje SPA (solubilní antigeny parazita) kultury B. canis, neposkytuje však kompletní ochranu psů před babesiózou (Schetters 2005, Bourdoiseau 2006). Babesióza koní se projevuje opět příznaky souvisejícími s hemolytickou anémií. Závaţnost onemocnění se velmi liší, jsou zaznamenány i případy spontánního uzdravení. Za etiologické agens se povaţuje B. equii a B. caballi. Lékem volby je imibokarb (Vial a Gorenflot 2006, Schwint a kol. 2009).
22
1.3.3 Přehled humánně a veterinárně významných druhů babesií (tab. č. 1.3.3.1)
Tab. č. 1.3.3.1: Klinicky výnamné druhy babesií. (Dle Mehlhorn a Schein 1984, Duh a kol. 2004, Duh a kol. 2006, Cardoso a kol. 2010, Schetters 2005, Bonnet a kol. 2007, Bonnet a kol. 2009, Rudolf a kol. 2005, Hubálek a Rudolf 2007, Adham a kol. 2009, M’ghirbi a Bouattour 2008, Hilpertshauser a kol 2006, Herwaldt a kol. 2003.) Druh babesie
B. microti
Velikost v erytrocytech
1,5 - 2,0µm
Vektor
Hostitel
Dermacentor spp. Ixodes spp. hlodavci, člověk Haemaphysalis spp.
Geografické rozšíření
Severní Amerika, Evropa
B. divergens
1,5x0,5µm
Ixodes ricinus
skot, přeţvýkavci, člověk
B. venatorum*
1,5x0,5µm
Ixodes ricinus
jelenovití, člověk
Evropa
B. bovis
2,5x1,5µm
Boophilus spp. Ixodes spp.
skot, přeţvýkavci
jiţní Evropa, Afrika, Asie, Austrálie, Amerika
B. bigemina
5x2µm
Boophilus spp.
skot, přeţvýkavci
B. major
3x1,5µm
Haemaphysalis punctata
skot
B. motasi
4x2,5µm
Haemaphysalis spp. Rhipicephalus bursa
ovce, kozy
jiţní Evropa, Střední Východ, Afrika, Asie
B. ovis
2x1µm
Rhipicephalus bursa
ovce, kozy
jiţní Evropa, Střední Východ, Afrika, Asie
4x2,5µm
Hyalomma spp. Dermacentor spp. Rhipicephalus spp.
koně, osli
Afrika, jiţní Evropa, Asie, Amerika
B. caballi
Evropa
jiţní Evropa, Afrika, Asie, Austrálie, Amerika západní a jiţní Evropa, Britské ostrovy
23
Druh babesie
Velikost v erytrocytech
B. canis canis
5x2,5µm
B. canis rossi
5x2,5µm
B. canis vogeli B. gibsoni
Hostitel
Geografické rozšíření
psovité šelmy
Evropa
Haemaphysalis spp.
psovité šelmy
jiţní Afrika
5x2,5µm
D. reticulatus R. sanguineus
psovité šelmy
1,5 - 2,0µm
Rhipicephalus spp.
psovité šelmy
Vektor
D. reticulatus
severní Afrika, Evropa Asie, Amerika, jiţní Evropa, Austrálie
*B. venatorum bývá též označována jako Babesia sp. EU1
1.4 Diagnostika a kultivace babesií Správný postup při diagnostice babesií by měl zahrnovat nejprve vyšetření cestovatelské minulosti pacienta, zajištění epidemiologických dat dané oblasti, zjištění, zda pacient prodělal splenektomii či krevní transfúzi a v neposlední řadě je vhodné se otázat, zda nebyly u pacienta pozorovány známky pokousání klíštětem. Na základě získaných informací lze potom provést níţe uvedené diagnostické metody (Homer a kol. 2000a, Bourdoiseau 2006).
1.4.1 Mikroskopické pozorování v krevním roztěru Mikroskopické pozorování babesií v erytrocytech je rozšířenou diagnostickou metodou. Kapka vyšetřované krve je rozetřena do tenké vrstvy a po fixaci obarvena Giemsou. Při pozorování světelným mikroskopem jsou v pozitivním nálezu v erytrocytech patrné hruškovité útvary (obr. č. 1.4.1.1). Babesie mohou připomínat prstencové formy plasmodií (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae jsou původci malárie), rozlišujícími znaky mohou být absence pigmentovaných granulí v napadené červené krvince a formace prvoka ve tvaru maltézského kříţe, i kdyţ je poměrně vzácná (Blevins a kol. 2008).
24
Obr. č. 1.4.1.1: Mikroskopický obraz babesiózy způsobené B. divergens. Pozorováno u 34 letého asplenického muže z jihozápadní Francie. Obarveno Giemsou, zvětšení neudáno. (Upraveno dle Berry a kol. 2001.)
1.4.2 Imunologické diagnostické metody Standardizovanou imunologickou metodou pro humánní medicínu je metoda nepřímé fluorescence – IFAT (ang. indirect fluorescent antibody test). Vykazuje vysokou specifitu i citlivost a slouţí v současnosti hlavně pro detekci protilátek třídy IgG a IgM proti B. microti (Kjemtrup a Conrad 2000), přičemţ protilátky IgM mohou indikovat akutní infekci, jsou však méně specifické. Pouţívá se antigenu vyprodukovaného ve zlatém křečkovi (Mesocricetus auratus, Homer a kol. 2000a). Za pozitivní výsledek se povaţuje taková hodnota ředění séra, kdy titr je větší neţ 1:64, ovšem různé laboratoře pouţívají různé hodnoty. Titry bývají obvykle větší neţ 1:1024 (Gürtler a kol. 2009, Homer a kol 2000a). Protilátky jsou většinou detegovatelné s prvními příznaky nemoci a v séru mohou přetrvávat 13 měsíců aţ 6 let. Falešně pozitivní výsledky byly pozorovány u pacientů trpících lupus erythematosus disseminatus, u pacientů s revmatoidní artridiou, téţ u pacientů, u nichţ proběhla infekce prvoky Toxoplasma spp. a Plasmodium spp. (Homer a kol. 2000a, Hildebrandt a kol. 2007). Pro detekci protilátek proti B. divergens byly v humánní medicíně pouţity deriváty antigenů vyprodukovaných v pískomilu mongolském (Meriones unguiculatus). V séru lze protilátky objevit průměrně 7-10 dnů po prvních příznacích hemoglobinurie, a protoţe častý závaţný průběh onemocnění většinou nedovoluje sérologické vyšetření, diagnostika pomocí 25
IFAT můţe být v akutních případech pouze doplňkovou diagnostikou (Homer a kol. 2000a). U imunokomprimovaných pacientů se mohou dlouhou dobu vyskytnout falešně negativní výsledky a protilátky se začnou tvořit i po několika měsících po akutní babesióze (Hildebrandt a kol. 2007, Häselbarth a kol. 2007). Byly popsány i případy zkříţené reaktivity při IFAT. Herwaldt a kol. (2003) popisují dva případy babesiální infekce rakouského a italského pacienta způsobené B. venatorum (EU1), kdy IFAT pro detekci protilátek proti B. divergens vykazoval v obou případech pozitivní výsledky (Herwaldt a kol. 2003). Häselbarth a kol. 2007 publikují stejné výsledky seroreaktivity (Häselbarth a kol. 2007). Protoţe protilátky proti babesiím zůstavají po infekci v séru dlouhou dobu, metoda IFAT je uţitečným nástrojem k mapování endemických oblastí (Hasle a kol. 2010). Testy ELISA (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) se v některých případech pouţívají pro konfirmaci dat získaných z IFAT. Návrh testu ELISA byl popsán při pouţití sekretovaných antigenů z B. microti (Homer a kol. 2003), nebo při pouţití rekombinantních antigenů odvozených od RAP-1 antigenů B. bovis a B. bigemina (Boonchit a kol. 2004). Nicméně pro rutinní klinické pouţití testu ELISA bude nezbytné navrhnout další vhodné rekombinantní antigeny (Zintl a kol. 2003). Pro snadné a rychlé vyšetření se v současnosti vyvíjejí imunochromatografické testy (Kim a kol. 2007).
1.4.3 Molekulárně-biologické metody Molekulárně-biologické metody, vyvinuté pro detekci babesií, resp. jejich DNA, se povaţují za velice spolehlivé a citlivé. Základní metodou je PCR (angl. polymerase chain reaction), při níţ je za přítomnosti templátové DNA, termostabilní DNA polymerázy, primerů a deoxyribonuklesidtrifosfátů amplifikován primery ohraničený úsek DNA. Proces probíhá v cycleru ve třech krocích: nejprve při teplotě nad 90°C dochází k denaturaci templátové DNA, poté se při teplotě asi 55°C navazují primery k jednotlivým řetězcům a nakonec při teplotě
okolo
70°C
dochází
za
pomoci
DNA
polymerázy
k
připojování
deoxyribonukleosidtrifosfátů k templátoým řetězcům a k prodluţování vznikajícího řetězce. Tento cyklus se opakuje přibliţně 40 x, na konci PCR je tak k dispozici 240 kopií úseku DNA. Tuto DNA lze potom vizualizovat elektroforetickými metodami a vhodným obarvením, osekvenovat či podrobit dalším molekulárně biologickým zkouškám. Podmínky pro PCR (počet cyklů, délka trvání cyklů, hodnota teplot a koncentrací, návrh primerů) je třeba pro konkrétní případy optimalizovat. 26
V případě detekce babesií je většinou amplifikován gen pro malou ribozomální podjednotku 18S rRNA, nebo jeho část (Criado-Fornelio a kol. 2003, Hilpertshauser a kol. 2006, Criado-Fornelio a kol. 2007, Duh a kol. 2006). Kompletní genom ţádné z babesií nebyl dosud osekvenován. Jako vhodný marker se jeví i gen pro babesiální β-tubulin. U babesií je tvořen 440 aminokyselinami a kodován genem o velikosti přibliţně 1350 bp, který obsahuje dva introny (Skotarczak 2008). Yamasaki a kol. (2007) popsali moţnost vyuţití genu pro stresový protein HSP70 (angl. heat shock protein 70, neobsahuje introny, přibliţně 520 aminokyselin) při určování příbuznosti mezi babesiemi izolovanými ze psů (B. canis canis, B. canis vogeli, B. canis rossi, B. gibsoni) (Yamasaki a kol. 2007). Wilkowsky a kol. (2009) dokonce popisují moţnost vyuţití genů obsahujících tandemové repetice (geny pro proteiny p200, TRAP, desmoyokin, Bv80/Bb-1, antigen 3) pro molekulární fingerprinting kmenů B. bovis (Wilkowsky a kol. 2009). Obměnou klasické PCR, která je při diagnostice babesií často pouţívaná, je například PCR-RFLP, kdy je výsledný PCR produkt naštěpen restriktázami. Naštěpené fragmenty se elektroforeticky oddělí a jejich počet a velikost se vyhodnocují (Gülanber a kol. 2006, Adaszek a Winiarczyk 2008). RLB hybridizace (angl. reverse line blot hybridisation) je metodou pro genotypizaci PCR produktu, která vyuţívá DNA próbu kovalentně navázanou přes amin na nylonovou membránu. K próbě se přidá PCR produkt značený biotinem, dále streptavidin značený peroxidázou. Jesltiţe se biotinem značený PCR produkt k próbě naváţe, streptavidin s peroxidázou jsou navázány na biotin. K reakční směsi se pak přidá peroxid vodíku a chemiluminiscenční reagens emitující světlo při reakci peroxidu vodíku a peroxidázy. Světelná emise je pak zaznamenána na fotocitlivý film (schema RLB viz. obr. č. 1.4.3.1, Kong a Gilbert 2007).
27
Obr. č. 1.4.3.1: Schema RLB. a: jednořetězcová próba je přes amin kovalentně navázána k nylonové membráně, b: komplementární denaturovaný PCR produkt značený biotinem se naváže k próbě, c: biotin slouží jako vazebné místo pro konjugát streptavidin-peroxidáza, d: k reakční směsi je přidán peroxid vodíku a chemiluminiscenční agens emitující světlo při reakci peroxidu vodíku a peroxidázy. Světelná emise je pak zaznamenána na fotocitlivý film. (Upraveno dle Kong a Gilbert 2007.) Výhodou RLB hybridizace je, ţe v jednom kroku lze DNA PCR produktu testovat s velkým mnoţstvím prób. Matjila a kol. (2008) při vyšetřování krevních vzorků domácích psů z Jiţní Afriky pouţili RLB hybridizaci pro záchyt babesií, theilerií, anaplasmat, ehrlichií a prvoka rodu Hepatozoon se 41 druhy prób (Matjila a kol. 2008). RLB hybridizace bylo téţ pouţito při identifikaci poddruhů psích babesií v Tunisku (M’ghirbi a Bouattour 2008), při vyšetřování autochtonních psích babesióz v Nizozemsku (Matjila a kol. 2005) a při detekci theilerií a babesií v Turecku (Altay a kol. 2008). V tabulce č. 1.4.3.1 jsou uvedeny některé parametry vybraných PCR.
28
29
1.4.4 Kultivace babesií Kultivace babesií in vivo ve vnímavém zvířeti, nejčastěji ve zlatém křečku nebo myši, není jako diagnostická metoda příliš pouţívaná. Hlavními problémy jsou pracnost a časová náročnost (parazitémie je v krevním roztěru detegovatelná za 2-4 týdny, krevní roztěry je třeba dělat kaţdodenně). Některé druhy babesií jsou také specificky vázány k určitému hostiteli, takţe například pískomil mongolský je velice vnímavý k infekci B. divergens, avšak nepodařilo se infikovat jej prvokem Babesia sp. (Hunfeld a kol. 2008), ačkoliv jsou tyto druhy babesií fylogeneticky příbuzné (Herwaldt a kol. 2003). Kultivace babesií in vivo se tedy spíše pouţívá k produkci atenuovaných kmenů, které slouţí jako základ pro přípravu ţivé vakcíny (de Waal a Combrink 2006). Bylo popsáno několik technik k replikaci babesií in vitro. Základními kroky jsou: promytí a zcentrifugování krevních vzorků obsahujících babesie, přenesení promytých erytrocytů do média obsahujícího homologní či heterologní čerstvé erytrocyty, kultivace při vyšším obsahu oxidu uhličitého (vyšším, neţ je jeho atmosferický obsah). Média lze obohatit přídavkem séra (bovinního, králičího, lidského – záleţí na druhu babesie a na účelu kultivace) a antibiotika (Holman a kol. 2005, Malandrin a kol. 2010, Schuster 2002). Pro kontinuální kultivaci B. bovis byly pouţity bovinní erytrocyty s parazitémií 0,1-0,2% a médium pro tkáňové kultury (HEPES 199, RPMI 1640, NCTC 135) s přídavkem antibiotika (penicilin, streptomycin, garamycin, amfotericin B) obohacené čerstvým fetálním bovinním sérem. Kultura byla inkubována při pH 7 a teplotě 37-38°C, 5% obsahu oxidu uhličitého a vyţadovala kaţdodenní přeočkování. Po šesti přeočkováních se parazitémie pohybovala mezi 10-15%. Jinou metodou při pouţití stejných médií je technika MASP (angl. microaerophilous stationary phase), kdy se k replikaci parazita pouţívají vrstevnatě uspořádané erytrocyty (tedy ne jejich suspenze). Těmito technikami parazit neztrácí virulenci (Schuster 2002). B. microti a B. rodhaini se in vitro podařilo kultivovat v médiu RPMI 1640 s 30-40% neošetřeného fetálního bovinního séra v atmosféře 3% oxidu uhličitého a 8% kyslíku. Takto vyprodukovaní paraziti byli infekční pro pokusné myši (Shikano a kol. 1995). Dlouhodobou kultivací babesie často ztrácejí virulenci (Schuster 2002, Gürtler a kol. 2009), nicméně byl popsán případ kultivace B. divergens, kdy ani po dvou letech nedošlo ke ztrátě virulence (Schuster 2002).
30
2 Cíl práce Cílem předkládané diplomové práce bylo ověřit přítomnost a určit minimální prevalenci vybraných
druhů
babesií
v klíšťatech
Ixodes
ricinus,
Dermacentor
reticulatus
a Haemaphysalis concinna ve dvou přírodních ekosystémech na Břeclavsku.
31
3 Materiál a metody 3.1 Materiál 3.1.1 Organizmy K izolaci babesiální DNA byly pouţity následující druhy klíšťat, která byla odchycena metodou vlajkování vegetace v několika terénních sběrech v letech 2008, 2010 a 2011: Ixodes ricinus (nymfy a imága), obr. č. 3.1.1.1-3.1.1.2 Dermacentor reticulatus (imága), obr. č. 3.1.1.3 Haemaphysalis concinna (nymfy a imága)
Obr. č. 3.1.1.1: I. ricinus, vlevo samec, vpravo hladová samice. Měřítko dokresleno ve znázorněném zvětšení dle skutečné velikosti. (Foto: R. Píše.)
32
Obr. č. 3.1.1.2: I. ricinus, nymfa. Měřítko dokresleno ve znázorněném zvětšení dle skutečné velikosti. (Foto: R. Píše.)
Obr. č. 3.1.1.3: D. reticulatus, vlevo samec, vpravo hladová samice. Měřítko dokresleno ve znázorněném zvětšení dle skutečné velikosti. (Foto: R. Píše.)
3.1.2 Laboratorní pomůcky
Pinzeta nerezová
Zkumavka skleněná
Petriho miska
Podloţní sklo
Kuličky kovové, sterilní 5mm (Qiagen, Něměcko)
Eppendorfovy zkumavky plastové (Eppendorf, Německo)
Pipety plastové 1, 10, 25 ml Pipetman® (Gilson, USA)
Pipety automatické (Eppendorf, Německo) 33
Špičky Eppendorf dual filter DNA/RNA clean (Eppendorf, Německo)
PCR mikrozkumavky (Eppendorf, Německo)
Nylonová membrána Biodyne® blotting membrane (Pall, USA)
Podloţka membrány (Immunetics, USA)
Miniblotter (Immunetics, USA)
Pinzety plastové
Gáza bavlněná
Láhev válcovitá skleněná s uzávěrem 35 mm x 150 mm (UVP, USA)
Odměrný válec skleněný 50 ml
Vlajka flanelová (80 cm x 50 cm)
3.1.3 Ochranné prostředky Mezi ochranné prostředky, které jsme pouţívali při práci v laboratoři, ať uţ z bezpečnostních důvodů či z důvodu zabránění kontaminace zpracovávaných vzorků, patřily zejména latexové rukavice, ochranné brýle, laboratorní plášť, sterilní rouška a další. Rizikové kroky zpracovávání vzorků (např. izolace DNA) byly prováděny v biohazard boxu. Biologický odpad a kontaminované laboratorní pomůcky byly po pouţití ponořeny do roztoku chloraminu B, nebo dekontaminovány v autoklávu po dobu 20 minut při teplotě 121°C a přetlaku 105 kPa (dle charakteru pouţitého infekčního materiálu).
3.1.4 Laboratorní přístroje a technika
Stereoskopický mikroskop s transfokátorem Olympus SZ4045TR (Olympus, Japonsko)
Fotoaparát Olympus C-7070 (Olympus, Japonsko)
Světelný zdroj HIGHLIGHT 2100 (Olympus, Japonsko)
Chladnička (Snaige, Litva)
Mrazicí box (Liebherr, Švýcarsko)
Biohazard box BH-EN 2004 (Faster, Itálie)
Homogenizátor TissueLyser II (Qiagen, Německo)
Centrifuga Mikro 20 (Hettich Zentrifugen, Německo)
Termoblok TDB-120 (Biosan, Lotyšsko)
Termoblok TDB-100 (Biosan, Lotyšsko)
Bio Vortex V1 (Biosan, Loyšsko) 34
Multi-Vortex V32 (Biosan, Lotyšsko)
Termoblok ECHOtherm (Torrey Pines Scientific, USA)
Termoblok Thermomixer comfort (Eppendorf, Německo)
Termobloček chladicí (Torrey Pines Scientific, USA)
Centrifuga 5424 (Eppendorf, Německo)
Hybridizační pec HB-1000 (UVP, USA)
Peristaltické čerpadlo PCD 81 (HELAGO, ČR)
Centrifuga Multi-Spin MSC-3000 (Biosan, Lotyšsko)
Laboratorní váhy (Ohaus, USA)
PCR box Aura PCR (Bioair Instruments, Itálie)
Teplotní cykler Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research, USA)
Autokláv Tuttnauer 3870 ELVC (Tuttnauer, Izrael)
Automatický pipetovací dávkovač (Hirschmann, Německo)
3.1.5 Roztoky a chemikálie
Ethanol 96% (Applichem, USA)
PBS pufr (phosphate buffered saline, OXOID, Anglie)
Cloramin B (Bochemie, ČR)
PCR Master mix Combi PPP Master Mix (Top-Bio, ČR)
PCR voda (Top-Bio, ČR)
Primer RLB-F2 (Generi-Biotech, ČR)
Primer RLB-R2 (Generi-Biotech, ČR)
Pozitivní kontroly (DNA z B. microti, B. divergens, B. canis canis, B. canis vogeli) byly darovány od Dr. Monika Zahler-Rinder a Dr. Philippe Mendonca z Institutu Tropické Medicíny v Mnichově).
Sondy pro RLB (Generi-Biotech, ČR)
NaHCO3 (Penta, ČR)
NaOH (Penta, ČR)
N-(3-Dimethylaminopropyl)-Nˈ-ethylcarbodiimid hydrochlorid (zkr. EDAC, Sigma-Aldrich, Německo)
20x SSPE pufr pH 7,4 (3,0 M NaCl, 0,2 M NaH2PO4·H2O, 0,02 M EDTA) DNase RNase free (GIBCO® Invitrogen, USA)
Sodium dodecyl sulfát (zkr. SDS, Sigma-Aldrich, Německo)
Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA, Promega, USA)
Enzym-konjugát (peroxidáza-streptavidin, 500 U, Roche, Francie) 35
Vývojka univerzální (FOMA, ČR)
Ustalovač (FOMA, ČR)
3.1.6 Komerční soupravy K izolaci DNA z homogenátu klíšťat jsme pouţili komerční sadu QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Něměcko). ECL kit pro vizualizaci a zaznamenání RLB testu. ECL Detection fluid (Amersham, USA) byl pouţit jako chemiluminiscenční agens pro detekci PCR produktu značeného biotinem s navázaným konjugátem streptavidin-peroxidáza. Fotocitlivý ECL hyperfilm byl pouţit pro záznam chemiluminiscence.
3.2 Metody 3.2.1 Sběr klíšťat Klíšťata byla sbírána metodou vlajkování, kdy byla klíšťata zachytávána vlasem flanelové tkaniny při smýkání vhodného povrchu (např. travin, nízké vegetace, hrabanky). Takto zachycená klíšťata pak byla kovovou pinzetou přenesena do sterilních uzavíratelných skleněných zkumavek spolu s několika stébly travin, aby se zabránilo jejich vysychání. Klíšťata byla tříděná podle druhu, vývojového stadia a pohlaví a uchovávána v chladničce při 4°C pro další zpracování. Stručná charakteristika lokalit sběru je uvedena níţe. Lokalita Rendezvous se nachází na jihu Moravy v okrese Břeclav, přibliţně 1,5 km severovýchodním směrem od Valtic. Jedná se o rovinatý terén s nadmořskou výškou do 200 m. Geologické podloţí tvoří naplaveniny a sedimenty, především písky, štěrkopísky a jíly. (Chytrý a kol. 2001). Dlouhodobý roční teplotní průměr v letech 1961-1990 udává hodnotu 9,1-10,0°C (URL 1), roční úhrn sráţek sledovaný ve stejném období se pohybuje mezi 501-600 mm (URL 2). V lokalitě sběru převládají dubové lesy s dubem zimním (Quercus petraea), dubem cerem (Quercus cerris) a dubem letním (Quercus robur), z dalších dřevin se zde vyskytují ponejvíce jasan ztepilý (Fraxinus excelsior), javor babyka Acer campestre), lípa srdčitá (Tilia cordata), hloh jednosemenný (Crategus monogyna) či brslen evropský (Euonymus europaeus). Nalezneme zde však i monokultury borovic (Pinus sylvestris). Z bylin lze pak v této lokalitě nalézt především druhy lesní, např. česnáček lékařský (Alliaria petiolata), válečku lesní (Brachypodium sylvaticum), srhu hajní (Dactylis
36
polygama), strdivku jednokvětou (Melica uniflora), silenku nící (Silene nutans), violku lesní (Viola reichenbachiana) a kakost smrdutý (Geranium robertianum) (Chytrý a kol. 2001). Z fauny lze v lokalitě Rendezvous nalézt běţné lesní druhy savců. Z hlodavců to pak jsou především norník rudý (Clethrionomys glareolus), myšice křovinná (Apodemus sylvaticus), hraboš polní (Microtus arvalis), hryzec vodní (Arvicola terrestris) a další. Zajíc polní (Lepus europaeus) je téţ běţným obyvatelem těchto biotopů. Z větších savců lze pak díky stopám a trusu předpokládat výskyt jelenovitých (Cervidae). Pozorováním typických projevů (nápadně rozrytá půda, přítomnost rochnišť, odřené kmeny stromů ve výšce asi 5080 cm) lze odhadnout výskyt prasete divokého (Sus scrofa). Druţicový snímek lokality znázorněn v obr. č. 3.2.1.1.
Obr. č. 3.2.1.1: Lokalita Rendezvous, satelitní fotografie. Oblast vlajkování vyznačena červenou elipsou na snímku. Jedná se o zalesněný rovinatý biotop. Přibližné měřítko udává vzdálenost 360 m. (Zdroj: aplikace Google Earth.) Lokalita Štrosflek, lokalita Hvězda Lokality se nacházejí na jihu Moravy v okrese Břeclav při rakouských hranicích, přibliţně 10 km severně od soutoku Moravy a Dyje. Jedná se o rovinaté terény s nadmořskou výškou do 200 m. Geologické podloţí tvoří především naplaveniny (Chytrý a kol. 2001). Dlouhodobý roční průměr teplot v letech 1961-1990 činí 9,1-10,0°C (URL 1), průměrný roční úhrn sráţek 37
ve stejném období je pro danou lokalitu 501-600 mm (URL 2). Dominujícími dřevinami jsou zde dub letní (Quercus robur), tzv. dřeviny měkkého luhu, mezi něţ patří například vrba křehká (Salix fragilis), vrba trojmuţná (Salix triandra), vrba košíkářká (Salix viminalis), topol bílý (Populus alba), topol osika (Populus tremula). Z dalších dřevin jmenujme alespoň jasan úzkolistý (Fraxinus angustifolia), jasan ztepilý (Fraxinus excelsior), jilm vaz (Ulmus laevis), javor babyka (Acer campestre) nebo lípu srdčitou (Tilia cordata). Bylinné patro je pak tvořeno běţnými bylinami, mezi které patří například bršlice kozí noha (Aegopodium podagaria), blatouch bahenní (Caltha palustris), kostřava obrovská (Festuca gigantea), svízel přítula (Galium aparine), lipnice bahenní (Poa palustris), válečka lesní (Brachypodium sylvaticum) (Chytrý a kol. 2001). Mezi vzácné byliny pak řadíme například bleduli letní (Leucojum aestivum) (Hrib a Kordiovský 2004). Z hlodavců (kteří mohou být významným rezervoárem pro B. microti, se zde vyskytují nejhojněji myšice křovinná (Apodemus sylvaticus), norník rudý (Clethrionomys glareolus) hraboš polní (Microtus arvalis), hraboš podzemní (M. subterraneus) a hryzec vodní (Arvicola terrestris) obývající břehy tekoucích i stojatých vod. V posledních letech je zaznamenáváno i zvyšování počtu bobra evropského (Castor fiber). Z větších savců se v luţních lesích daří běţným druhům, jako například srnci obecnému (Capreolus capreolus), praseti divokému (Sus scrofa) i daňku evropskému (Dama dama). Nutno téţ poznamenat, ţe krajina břeclavských luţních lesů je i jediným hnízdištěm orla královského (Aquila heliaca) u nás (Hrib a Kordiovský 2004). Druţicový snímek lokality Štrosflek je znázorněn v obr. č. 3.2.1.2, lokality Hvězda v obr. 3.2.1.3. Pohled do krajiny břeclavského luţního lesa zachycuje obr. č. 3.2.1.4.
38
Obr. č. 3.2.1.2: Lokalita Štrosflek, satelitní fotografie. Oblast vlajkování vyznačena červenou elipsou na snímku. Vlajkování bylo prováděno na uměle vytvořeném náspu. Přibližné měřítko udává vzdálenost 360 m. (Zdroj: aplikace Google Earth.)
39
Obr. č. 3.2.1.3: Lokalita Hvězda, satelitní fotografie. Oblast vlajkování vyznačena červeně. Přibližné měřítko udává vzdálenost 360 m. (Zdroj: aplikace Google Earth.)
40
Obr. č. 3.2.1.4: Detailní pohled do krajiny luţního lesa. Uprostřed snímku se nachází uměle vytvořený násep, v němž se zdržují hlodavci a divoká lesní zvěř (zvláště při zaplavení lužního lesa v době umělého povodňování nebo záplavách), a s nimi i klíšťata Dermacentor reticulatus. Nalevo i napravo od náspu jsou zřetelné zaplavované oblasti břeclavského lužního lesa. Snímaná lokalita je zároveň přírodním ohniskem tularémie. (Foto: I. Rudolf.)
3.2.2 Izolace DNA Izolace DNA z klíšťat za účelem získání babesiální DNA byla prováděna pomocí komerční sady QIAamp DNA Mini Kit podle protokolu pro izolaci DNA z buněčných tkání. Klíšťata byla v jednotlivých izolačních pokusech zpracovávána většinou po 5 (nymfy a imága Ixodes ricinus, nymfy a imága Haemaphysalis concinna, imága Dermacentor reticulatus) a po 10 (nymfy Ixodes ricinus, imága Dermacentor reticulatus). Úplný přehled izolačních pokusů je uveden v kapitole 4.2.
41
3.2.2.1 Homogenizace klíšťat 1. Ke klíšťatům v Eppendorfově zkumavce byla přidána jedna kovová kulička a 245 µl PBS v pufru, zkumavka byla uzavřena. 2. Homogenizace byla prováděna v přístroji TissueLyser II 3 minuty při 30 Hz/s. 3. Homogenát v Eppendorfově zkumavce byl krátce zcentrifugován (stočeny kapky z víčka), následně bylo odebráno 100 µl homogenátu do nové Eppendorfovy zkumavky. 4. Zbytek homogenátu i s kuličkou byl uzavřen a uloţen do uzavíratelného sáčku k dekontaminaci.
3.2.2.2 Izolace DNA 1. Ke 100 µl homogenátu bylo přidáno 180 µl ATL pufru a 20 µl proteinázy K, homogenát byl vortexován a následná inkubace probíhala 2 hodiny při 56°C. 2. Eppendorfova zkumavka byla krátce zcentrifugována (stočeny kapky z víčka), bylo přidáno 200 µl AL pufru, obsah zkumavky se krátce vortexoval a následná inkubace probíhala 10 minut při 70°C. 3. Eppendorfova zkumavka byla krátce centrifugována (stočeny kapky z víčka), bylo přidáno 200 µl 96% ethanolu, zkumavka byla vortexována cca 15 s, následně krátce centrifugována (stočeny kapky z víčka). 4. Obsah zkumavky byl přepipetován na izolační kolonku se sběrnou zkumavkou (Qiagen), kolonka pak byla centrifugována 1 minutu při 8 000 ot./min/6 000 g. 5. Sběrná zkumavka byla vyměněna, na izolační kolonku bylo napipetováno 500 µl AW1 pufru, kolonka byla centrifugována 1 minutu při 8 000 ot./min/6 000 g. 6. Sběrná zkumavka byla vyměněna, na izolační kolonku bylo napipetováno 500 µl AW2 pufru, kolonka byla centrifugována 3 minuty při 13 000 ot./min/<20 000 g. 7. Sběrná zkumavka byla vylita, znovu umístěna pod izolační kolonku, dále byla centrifugována 1 min. při 13 000 ot./min./<20 000 g (vysušení kolonky). 8. Pod izolační kolonku byla umístěna sterilní Eppendorfova zkumavka, na jejíţ střed bylo napipetováno 150 µl elučního AE pufru, inkubace probíhala 5 minut při pokojové teplotě. 9. Kolonka byla centrifugována 1 minutu při 8 000 ot./min./6 000 g, izolační kolonka se vyhodila, Eppendorfova zkumavka s vyizolovanou DNA byla pevně uzavřena. Takto vyizolovaná DNA byla následně uchovávána v mrazicím boxu při teplotě -20°C pro další zpracování. 42
3.2.3 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Charakteristika jednotlivých komponent: Combi PPP Master Mix (Top-Bio, ČR): 75 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200 µM dATP, 200 µM dCTP, 200 µM dGTP, 200 µM dTTP, 50 U/ml Taq Purple DNA polymeráza, monoklonální protilátka anti-Taq (19nM), stabilizátory a aditiva Primer RLB-F2 (Generi-Biotech, ČR): 5´-GAC ACA GGG AGG TAG TGA CAA G-3´ (Matjila a kol. 2004, Matjila a kol. 2005, Matjila a kol. 2008) Primer RLB-R2 (Generi-Biotech, ČR): biotin-5´-CTA AGA ATT TCA CCT CTG ACA GT-3´ (Matjila a kol. 2004, Matjila a kol. 2005, Matjila a kol. 2008) Primery byly pouţity pro amplifikaci oblasti V4 genu pro malou ribozomální podjednotku 18S rRNA. Očekávaná velikost amplifikonu je 460 bp-540 bp (Matjila a kol. 2004, Matjila a kol. 2005, Matjila a kol 2008). Příprava reakční směsi: Combi PPP Master Mix
25 µl
Primer RLB-F2 (200nM)
0,1 µl
Primer RLB-R2 (200nM)
0,1 µl
PCR H2O
9,8 µl; 14,8 µl
Templátová DNA
10 µl; 15 µl
Celkový objem reakční směsi
50 µl
Míchání mastermixu a nanášení templátové DNA (izolované pomocí soupravy QIAamp DNA Mini Kit, celkový objem roztoku 150 µl) probíhalo vţdy ve dvou oddělených PCR boxech (1. box pro míchání master mixu, 2. box pro přidání vyšetřované DNA z klíšťat) z důvodu minimalizace rizika potenciální kontaminace. Mnoţství nanášeného templátu bylo zvýšeno z 10 µl na 15 µl, aby se dosáhlo jasnější odpovědi při identifikaci DNA pomocí RLB (viz
43
kapitola 3.2.5 Reverse line blot). Proto bylo téţ nutné upravit mnoţství PCR vody, aby finální objem v PCR směsi byl 50 µl.
Program pro PCR: Iniciální denaturace
94°C
3 min.
Denaturace
94°C
20 s
Annealing
od 67°C do 57°C
30 s
72°C
30 s
1x
Extenze
11 x. V kaţdém novém cyklu sníţit teplotu annealingu o 1°C.
Denaturace
94°C
20 s
Annealing
57°C
30 s
Extenze
72°C
30 s
72°C
10 min.
40 x
Závěrečná extenze 1x
PCR probíhala v automatickém teplotním cykleru PTC-200 (MJ Research, USA). PCR produkty byly následně uchovávány v mrazicím boxu při teplotě -20°C pro další zpracování.
3.2.4 Příprava membrány pro RLB Roztoky: 16% EDAC 0,5M NaHCO3, pH 8,8 0,1M NaOH 44
2 x SSPE-0,1% SDS, pH 7,4 20 mM EDTA, pH 8,0 2 x SSPE Sondy pro RLB (v pořadí, v jakém byly nanášeny na membránu, Generi-Biotech, ČR): 1. Babesia spp.
5´-amino-TAA TGG TAA ATA GGA RCR GTT G-3´ (Gubbels a kol. 1999)
2. Babesia microti
5´-amino-CTT CCG AGC GTT TTT TTA TT-3´ (Gubbels a kol. 1999)
3. Babesia divergens
5´-amino-GTT AAT ATT GAC TAA TGT CGA-3´ (Gubbels a kol. 1999)
4. Babesia sp. EU1
5´-CGA TTT CGC TTT TGG GAT T-3´ (Nijhof a kol. 2007)
5. Babesia canis canis
5´-TGC GTT GAC GGT TTG AC-3´ (Matjila a kol. 2005)
6. Babesia canis vogeli
5´-AGC GTG TTT GAG TTT GCC-3´ (Matjila a kol. 2005)
Pracovní postup: 1. Oligonukleotidové sondy byly naředěny na koncentraci 75 pmol/150 µl v roztoku 0,5M NaHCO3. 2. Membrána byla upravena do rozměru 14,5 cm x 14,5 cm. Byl odstřihnut pravý horní roh (orientace membrány). S membránou bylo manipulováno pouze plastovou pinzetou. 3.
Membrána byla zabalena do gázy, vloţena do skleněné válcovité uzavíratelné láhve a aktivována 10 min. ve 20 ml čerstvě připraveného EDAC při laboratorní teplotě. Kývavými a otáčivými pohyby rukou byla membrána plynule přelévána v láhvi roztokem EDAC.
4. Membrána byla vybalena z gázy a promyta 2 min. destilovanou vodou při laboratorní teplotě na třepačce. 5. Promytá membrána byla umístěna na polštářek miniblotteru tak, aby byl odstřiţený roh vpravo dole, miniblotter byl uzavřen pomocí plastových šroubů, voda z jamek byla odsáta peristaltickým čerpadlem. 6.
Do
jamek
miniblotteru
bylo
napipetováno
150
µl
roztoku
0,5M
NaHCO3
s oligonukleotidovými sondami a inkubace probíhala 1 min. při laboratorní teplotě. 7. Roztok se sondami byl odsát z miniblotteru ve stejném pořadí, v jakém byl nanášen.
45
8. Membrána byla inaktivována promýváním ve 100 ml 0,1M NaOH na třepačce po dobu 10 min při laboratorní teplotě. 9. Membrána byla zabalena do nové gázy, vloţena do skleněné válcovité uzavíratelné láhve tak, aby promývací roztok co nejlépe omýval povrch membrány, následně byla promyta v cca 125 ml 2 x SSPE-0,1% SDS v hybridizační peci při teplotě 60°C po dobu 5 min. Míchadlo pece bylo nastaveno na 7 ot./min. 10. Membána byla vybalena z gázy, promyta na třepačce v cca 100 ml 20 mM EDTA při laboratorní teplotě po dobu 15 min. 11. Membrána byla zabalena do gázy, vloţena do skleněné válcovité uzavíratelné láhve, zalita aţ po horní okraj 2 x SSPE. Láhev byla pevně uzavřena a skladována při teplotě 4°C pro další pouţití.
3.2.5 Reverse line blot (RLB) Roztoky: 2 x SSPE-0,1% SDS, pH 7,4 2 x SSPE-0,5% SDS 2 x SSPE konjugát streptavidin-peroxidáza (500U, pouţito v reakci při ředění 1:4 000 v 2 x SSPE-0,5% SDS) Pracovní postup: 1. Membrána byla vyjmuta z uchovávacího roztoku (2 x SSPE), vybalena z gázy, umístěna na polštářek miniblotteru kolmo k nanášeným probám a tak, aby ustriţený roh byl vpravo nahoře. 2. Miniblotter byl uzavřen pomocí plastových šroubů, z jamek byla peristaltickým čerpadlem odsáta nadbytečná tekutina a miniblotter byl vloţen do hybridizační pece k vytemperování (42°C). 3. V Eppendorfových zkumavkách byly naředěny PCR produkty (50 µl) se 110 µl 2 x SSPE0,1% SDS pufru, roztok byl promíchán automatickou pipetou. 4.
Naředěné PCR produkty byly denaturovány v termobloku při teplotě 99°C po dobu 15 min, následně rychle zchlazeny v termobloku při teplotě 2°C alespoň po dobu 5 min.
5. Eppendorfovy zkumavky s naředěným PCR produktem byly centrifugovány při 14 000 ot./min. po dobu 1 min. Po centrifugaci byly chlazeny v termobloku při 2°C. 46
6. Miniblotter byl vyjmut z hybridizační pece, peristaltickým čerpadlem byla z jamek znovu odsáta přebytečná tekutina. 7. Vzorky (160µl) byly nanášeny do dráţek vytemperovaného miniblotteru. Jamky i boční strany byly přelepeny autoklávovací páskou, aby se zabránilo vysychání nanesených vzorků. 8. Hybridizace: membrána byla inkubována se vzorky v miniblotteru při 42°C v hybridizační peci po dobu 60 min. ve vodorovné poloze. 9. Miniblotter byl vyjmut z hybridizační pece, autoklávovací pásky byly odstraněny, vzorky byly odsáty peristaltickým čerpadlem. Po odšroubování plastových šroubů byla z miniblotteru vyjmuta membrána, přemístěna na novou gázu, zabalena tak, aby se posléze přidaný roztok vmýval do ruličky a omýval vzorky a byla vloţena do skleněné válcovité uzavíratelné láhve. 10. Posthybridizace. Láhev byla naplněna do 2/3 vytemperovaným 2 x SSPE-0,5% SDS (42°C), teplota v hybridizační peci byla zvýšena na 51°C, uzavřená láhev byla umístěna do míchadla hybridizační pece (vodorovná poloha láhve) a membrána se promývala při 7 ot./min. po dobu 15 min. 11. 2 x Promytí. Z láhve bylo vylito 2 x SSPE-0,5% SDS a roztok byl vyměněn za čerstvý (vytemperovaný na 51°C). Teplota v hybridizační peci byla sníţena na 42°C, láhev byla vloţena do míchadla pece, membrána byla promývána při 7 ot./min. po dobu 15 min. Toto promytí se opakovalo ještě jedenkrát. 12. Inkubace s enzymem. Do nové skleněné válcovité uzavíratelné láhve bylo napipetováno 20 ml 2 x SSPE-0,5% SDS (vytemperovaný na 42°C) a 10 µl konjugátu streptavidinperoxidáza (ředění 1:4 000), membrána, která byla předtím vyjmuta z promývací láhve a zabalena do nové gázy, byla vloţena do této láhve. Láhev byla umístěna do míchadla hybridizační pece, membrána byla inkubována při 42°C a 7 ot./min. po dobu 60 min. 13. Membrána byla vyjmuta z láhve, zabalena do nové gázy a vloţena do promývací láhve. 14. Láhev byla naplněna do 2/3 čerstvým 2 x SSPE-0,5% SDS (vytemperovaný na 42°C), vloţena do míchadla hybridizační pece a promývána při 42°C a 7 ot./min. po dobu 10 min. Toto promytí se opakovalo ještě jedenkrát. 15. Membrána byla vybalena z gázy, umístěna na Petriho misku, zalita cca 125 ml 2 x SSPE a promývána na třepačce při laboratorní teplotě po dobu 5 min. Toto promytí se opakovalo ještě jedenkrát. Membrána byla umístěna na novou Petriho misku. Takto ošetřená membrána byla připravena pro reakci s chemiluminiscenčním roztokem ECL, kdy případná luminiscence byla zaznamenávána na fotocitlivý film. 47
3.2.6 Vizualizace a vyhodnocení výsledků RLB Roztoky: Kit ECL detection fluid Vývojka univerzální (připravená dle návodu výrobce) Ustalovač (připraven dle návodu výrobce) Pracovní postup (vše provádět v temné komoře): 1. Kit ECL detection fluid obsahující roztok 1 a roztok 2 byl připraven tak, aby finální objem obou roztoků ředěných v poměru 1:1 byl 0,125ml/cm2. 2. Membrána byla v Petriho misce přelita takto připraveným rotokem, opatrným přelévaním membrány roztokem byla takto inkubována 2 min. při laboratorní teplotě. 3. Membrána byla vyjmuta, nechala se řádně odkapat a následně byla vloţena mezi fólie, které byly umístěny ve vyvolávací kazetě. Na svrchní fólii byl umístěn fotocitlivý ECL hyperfilm, vyvolávací kazeta byla uzavřena a nechala se vyvolávat po dobu alespoň 12 min. 4. ECL hyperfilm byl z kazety vyjmut, byl ponořen do vývojky, dokud se neobjevil dostatečný signál. 5. ECL hyperfilm byl krátce opláchnut ve vodě a následně ponořen do ustalovače na 10 min. 6. ECL hyperfilm byl proplachován ve vodě několik minut, poté se nechal oschnout při laboratorní teplotě.
3.2.7 Recyklace membrány pro opětovné použití Roztoky: 1% SDS 2 x SSPE Pracovní postup: 1. Membrána byla zabalena do nové gázy, vloţena do uzavíratelné skleněné válcovité láhve, zalita do 2/3 1% SDS (vytemperovaný na 80°C) a inkubována v hybridizační peci při 80°C a 7 ot./min. po dobu 30 min. 1% SDS roztok byl vyměněn za čerstvý (vytemperovaný na 80°C) a promytí se opakovalo ještě jedenkrát.
48
2. Membrána byla vybalena z gázy, umístěna na Petriho misku s cca 100 ml 2 x SSPE a promývala se při laboratorní teplotě na třepačce po dobu 15 min. Roztok byl vyměněn za čerstvý a promývání se opakovalo ještě jedenkrát. 3. Membrána byla zabalena do nové gázy, vloţena uzavíratelné skleněné válcovité láhve, zalita po horní okraj 2 x SSPE a byla skladována při teplotě 4°C pro opětovné pouţití.
49
4 Výsledky 4.1 Sběr klíšťat Klíšťata, která byla získána v neperiodických sběrech v letech 2008, 2010 a 2011 na lokalitách Rendezvous, Štrosflek a Hvězda na Břeclavsku, byla roztříděna podle druhu, pohlaví a vývojového stadia. Souhrnný výpis je uveden níţe v tabulkách č. 4.1.1-4.1.3. Klíšťata byla nejprve uchovávána v chladničce při 4°C pro další zpracování (sběry 2010 a 2011), nebo jiţ byla zamraţena v -20°C (sběr 2008). Klíšťata byla posléze tříděna do směsí v mikrozkumavkách po několika jedincích stejného druhu, vývojového stadia a pohlaví a dále uskladněna při teplotě -20°C. Tab. č. 4.1.1: Souhrn klíšťat z lokality Rendezvous. Druh I. ricinus I. ricinus I. ricinus D. reticulatus D. reticulatus H. concinna H. concinna H. concinna
Stadium
Počet
samice samec nymfa samice samec samice samec nymfa
12 34 223 26 31 2 1 19
Tab. č. 4.1.2: Souhrn klíšťat z lokality Štrosflek. Druh D. reticulatus D. reticulatus
Stadium
Počet
samice samci
464 251
Tab. č. 4.1.3: Souhrn klíšťat z lokality Hvězda. Druh D. reticulatus D. reticulatus
Stadium
Počet
samice samci
86 139
50
4.2 Izolace DNA Izolace DNA probíhala celkem v sedmi izolačních pokusech (kterým předcházela hmogenizace jednotlivých směsí) v období 1. března - 11. dubna 2011 podle izolačního protokolu. Izolovaná DNA byla potom při -20°C uchovávána pro molekulární diagnostiku babesií. Charakteristika izolačních pokusů je uvedena v tab. č. 4.2.1-4.2.3. Tab. č. 4.2.1: Lokalita Rendezvous. Charakteristika izolačních pokusů. Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 24.6.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010
Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous
I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus H. concinna I. ricinus H. concinna I. ricinus H. concinna H. concinna H. concinna H. concinna I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus
nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa samec samec nymfa samec samice nymfa nymfa nymfa samec samice samice nymfa nymfa nymfa samice samec samec
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1 1 5 5 5 2 5 5 4 1 5 5 10 10 10 5 5 4
51
Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 D1 D2
7.9.2010 7.9.2010 7.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 14.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 22.9.2010 8.10.2010 8.10.2010 8.10.2010 1.9.2008 1.9.2008
Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous Rendezvous
D. reticulatus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus D. reticulatus D. reticulatus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus I. ricinus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus
samice samec samec nymfa nymfa samec nymfa samice samec samice nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa nymfa samec samec samec samice samec samec samice
5 5 5 10 10 5 10 5 5 2 10 10 10 10 10 10 10 7 5 3 5 5 5 7 6
Tab. č. 4.2.2: Lokalita Štrosflek. Charakteristika izolačních pokusů. Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16
23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011
Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek
D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus
samec samice samec samice samec samec samice samice samice samice samice samice samice samice samice samice
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 8 10
52
Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
P17 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42 P43 P44 P45 P46 P47 P48 P49 P50 P51 P52 P53 P54 P55 P56 P57 P58 P59 P60 P61
23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 23.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011
Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek
D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus
samice samice samice samice samice samice samice samice samice samec samec samec samec samec samec samec samec samec samice samec samice samec samice samice samice samec samice samec samice samec samec samec samec samec samec samec samice samice samice samice samice samice samice samice samice
10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
53
Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
P62 P63 P64 P65 P66 P67 P68 P69 P70 P71 P72 D3 D4
24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 24.3.2011 1.9.2008 1.9.2008
Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek Štrosflek
D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus I. ricinus D. reticulatus D. reticulatus
samice samice samice samice samice samice samice samice samice samec nymfa samice samec
10 10 10 10 10 10 10 10 10 1 4 6 10
Tab. č. 4.2.3: Lokalita Hvězda. Charakteristika izolačních pokusů. Označení izolační směsi
Datum odchytu
Lokalita
Druh
Stadium
Počet jedinců
D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27
1.9.2008 1.9.2008 1.9.2008 1.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008 10.9.2008
Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda Hvězda
D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus D. reticulatus
samice samec samec samec samec samice samec samec samec samec samec samec samice samice samice samice samice samice samice samec samec samec samec
7 10 10 11 10 10 10 10 10 10 10 11 10 10 10 10 10 10 9 10 10 10 7
54
4.3 Vyhodnocení RLB Izolovaná DNA jednotlivých izolačních směsí pak byla pouţita jako temlátová DNA pro PCR, která probíhala standardně podle postupu v kapitole 3.2.3 Polymerázová řetězová reakce. Pro PCR bylo nejprve odebíráno 10µl templátové DNA jednotlivých směsí (vzorky 1-58 a D1-D27). Z důvodu nepříliš jasné odpovědi při vyhodnocování RLB filmu jsme se však rozhodli PCR a RLB některých vzorků opakovat, přičemţ jsme pro PCR navýšili mnoţství nanášeného templátu z 10 µl na 15 µl (vzorky D1, D2, D4, D5, D6, D7, D9, D16, D17, D20, D23, 57, 58) tak, aby celkový objem reakční směsi (50µl) zůstal zachován (sníţili jsme mnoţství PCR H2O z 14,8 µl na 9,8 µl). PCR pro vzorky P1-P71 jsme pak po předchozí zkušenosti prováděli rovnou se zvýšeným mnoţstvím (15 µl) nanášeného templátu. PCR produkty jsme tedy dále identifikovali pomocí reverse line blotu celkově v pěti identifikačních pokusech v období od 9.3. do 21.4. 2011. Výsledky a schemata nanášení jednotlivých izolačních směsí jsou uvedeny v obr. č. 4.3.1-4.3.5 a tab. 4.3.1-4.3.5 níţe. Číslice na svislé ose značí pořadí nanášených sond: 1….. Babesia spp. (catch-all) 2….. Babesia microti 3….. Babesia divergens 4….. Babesia sp. EU1 5….. Babesia canis canis 6….. Babesia canis vogeli Obr. č. 4.3.1: RLB film č. 1 (9. března 2011):
55
Tab. č. 4.3.1: Schema nanášení vzorků RLB č. 1, vyhodnocení Číslo jamky
Druh detegované babesie
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
B. microti-p. k. B. divergens-p. k. B. canis canis-p. k. B. canis vogeli-p. k. ---Babesia. sp. EU1 ---------------------Babesia spp. Babesia spp. B. microti Babesia sp. EU1 --
Označení izolační směsi ----1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
----I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV H. concinna, RV I. ricinus, RV H. concinna, RV I. ricinus, RV H. concinna, RV H. concinna, RV H. concinna, RV H. concinna, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV
----N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 N, 5 M, 1 M, 5 N, 5 M, 5 F, 2 N, 5 N, 5 N, 4 M, 1 F, 5 F, 5 N, 10
Vysvětlivky: p. k. – pozitivní kontrola, RV – Rendezvous, M – samec, F – samice, N – nymfa.
56
RLB film č. 2 (17. března 2011): Bohuţel se nám nepodařilo upravit film do podoby, aby z něj bylo moţné po oskenování spolehlivě odečítat výsledky. Suspektní vzorky (ve sloupci Druh detegované babesie) byly hodnoceny zkušeným okem a znovu otestovány v dalších blotovacích pokusech. Tab. č. 4.3.2: Schema nanášení vzorků RLB č. 2, vyhodnocení Číslo jamky 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Druh detegované babesie B. microti-p. k. B. divergens-p. k. B. canis canis-p. k. B. canis vogeli-p. k. B. microti Babesia spp. -Babesia sp. EU1 Babesia spp. Babesia spp. Babesia spp. -Babesia spp. ------Babesia spp. Babesia spp. --Babesia spp. --Babesia spp. --------
Označení izolační směsi ----D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16 D17 D18 D19 D20 D21 D22 D23 D24 D25 D26 D27 33 34 35 36
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
----D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV
----M, 7 F, 6 F, 6 M, 10 F, 7 M, 10 M, 10 M, 11 M, 10 F, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 11 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 9 M, 10 M, 10 M, 10 M, 7 F, 5 M, 5 M, 4 F, 5
57
Číslo jamky
Druh detegované babesie
36 37 38 39 40
---Babesia spp. Babesia spp.
Označení izolační směsi 43 44 56 57 58
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV
F, 5 M, 5 M, 5 F, 5 M, 5
Vysvětlivky: p. k. – pozitivní kontrola, RV – Rendezvous, P – Štrosflek, H – Hvězda, M – samec, F – samice.
Obr. č. 4.3.3: RLB film č. 3 (15. dubna 2011):
Tab. č. 4.3.3: Schema nanášení vzorků RLB č. 3, vyhodnocení: Číslo jamky
Druh detegované babesie
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
B. microti-p. k. B. divergens-p. k. B. canis canis-p. k. B. canis vogeli-p. k. ---Babesia spp. B. canis canis Babesia sp. EU1
Označení izolační směsi ----P1 P2 P3 P4 P5 P6
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
----D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P
----M, 10 F, 10 M, 10 F, 10 M, 10 M, 10 58
Číslo jamky
Druh detegované babesie
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44
--B. vogeli --Babesia spp. B. divergens -B. divergens ---B. divergens B. divergens B. divergens ----B. divergens Babesia sp. EU1 --B. canis canis Babesia sp. EU1 B. divergens Babesia spp. Babesia spp. -B. canis canis B. microti ----
Označení izolační směsi P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P41 P18 P19 P20 P21 P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28 P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35 P36 P37 P38 P39 P40
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P
F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 8 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 F, 10 M, 10 F, 10 M, 10 F, 10 F, 10
Vysvětlivky: p. k. – pozitivní kontrola, P – Štrosflek, M – samec, F – samice.
59
Obr. č. 4.3.4: RLB film č. 4 (19. dubna 2011):
Tab. č. 4.3.4: Schema nanášení vzorků RLB č. 4, vyhodnocení Číslo jamky
Druh detegované babesie
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
B. microti-p. k. B. divergens-p. k. B. canis canis-p. k. B. canis vogeli-p. k. ----B. canis canis --B. canis canis B. canis canis -B. canis canis B. canis canis -B. canis canis Babesia spp. ----
Označení izolační směsi ----P49 P50 P51 P52 P53 P54 P55 P56 P57 P58 P59 P60 P61 P62 P63 P64 P65 P66
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
----D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P
----M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 F, 10
60
Číslo jamky
Druh detegované babesie
23 24 25 26 27 28
B. canis canis Babesia spp. Babesia spp. -B. canis canis Babesia spp.
Označení izolační směsi P67 P68 P69 P70 P71 P72
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P I. ricinus, P
F, 10 F, 10 F, 10 F, 10 M, 1 N, 4
Vysvětlivky: p. k. – pozitivní kontrola, P – Štrosflek, M – samec, F – samice, N nymfa.
Obr. č. 4.3.5: Film č. 5 (21. dubna 2011):
Tab. č. 4.3.5: Schema nanášení vzorků RLB č. 5, vyhodnocení: Číslo jamky
Druh detegované babesie
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
-B. microti-p. k. B. divergens-p. k. B. canis canis-p. k. B. canis vogeli-p. k. -B. microti --B. divergens
Označení izolační směsi -----P42 P43 P44 P45 P46
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
-----D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P D. reticulatus, P
-----M, 10 F, 10 M, 10 F, 10 M, 10 61
Číslo jamky
Druh detegované babesie
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
-B. divergens B. microti B. microti B. microti B. microti ---B. microti -B. microti -B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti -B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti -B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti B. microti --
Označení izolační směsi P47 P48 31 32 37 38 39 40 41 42 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 57 58 D1 D2 D4 D5 D6 D7 D9 D16 D17 D20 D23 P17
Druh klíštěte, lokalita
Stadium, počet
D. reticulatus, P D. reticulatus, P I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV I. ricinus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, RV D. reticulatus, P D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, H D. reticulatus, P
M, 10 M, 10 N, 10 N, 10 M, 5 M, 5 N, 10 N, 10 M, 5 N, 10 F, 2 N, 10 N, 10 N, 10 N, 10 N, 10 N, 10 N, 10 N, 7 M, 5 M, 3 F, 5 M, 5 M, 7 F, 6 M, 10 F, 7 M, 10 M, 10 M, 10 M, 11 F, 10 F, 10 F, 9 F, 10
Vysvětlivky: p. k. – pozitivní kontrola, RV – Rendezvous, P – Štrosflek, H – Hvězda, M – samec, F – samice, N – nymfa.
62
4.4 Minimální prevalence Po odečtení pozitivních výsledků RLB byly vypočítány minimální prevalence pro dané lokality, přitom byl zvolen následující postup: Jestliţe testovaná izolační směs jevila pozitivitu pro některý z druhů babesií (v tomto případě B. microti, B. divergens, Babesia sp. EU1, B. canis canis a B. canis vogeli), nebo pouze pro rod Babesia spp., pouze jeden jedinec z izolační směsi (pouze jedno klíště) byl povaţován za infikovaného. V některých případech nebylo moţné druhově rozlišit babesie v testovaných vzorcích (s testovanou DNA hybridizovala pouze sonda Babesia spp. „catch all“). Tyto případy byly započítávány do celkové minimální prevalence. Výsledky a hodnoty minimální prevalence jsou uvedeny v následujících tabulkách 4.4.1-4.4.3. Izolační směs s označením P72 byla tvořena čtyřmi nymfami Ixodes ricinus, které jako jediní zástupci tohoto druhu klíšťat byly uloveny v lokalitě Štrosflek. Ačkoliv se tato izolační směs jevila jako pozitivní pro Babesia spp., výsledky nebyly dále hodnoceny a započítávány do minimálních prevalencí, jelikoţ vzhledem k dané lokalitě se jednalo o statisticky nevýznamný vzorek.
63
Tab. č. 4.4.1: Minimální prevalence – lokalita Rendezvous Celkový počet klíšťat
Babesia microti
Babesia divergens
Babesia sp. EU1
B. canis canis
B. canis vogeli
Babesia spp. pozitivní celkem
D. reticulatus ♀ 26 Minimální prevalence
2
0
0
0
0
2
7,69 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
7,69 %
D. reticulatus ♂ 31 Minimální prevalence
1
0
0
0
0
2
3,23 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
6,45 %
0
0
0
0
0
0
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
NEGATIVNÍ
0
0
0
0
0
0
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
NEGATIVNÍ
0
0
0
0
0
1
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
5,26 %
1
0
1
0
0
2
8,33 %
0,00 %
8,33 %
0,00 %
0,00 %
16,67 %
4
0
0
0
0
5
11,76 % 0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
14,71 %
9
0
1
0
0
10
4,04 %
0,00 %
0,45 %
0,00 %
0,00 %
4,48 %
H. concinna ♀ Minimální prevalence
2
H. concinna ♂ Minimální prevalence
1
H. concinna N Minimální prevalence
19
I. ricinus ♀ Minimální prevalence
12
I. ricinus ♂ Minimální prevalence
34
I. ricinus N Minimální prevalence
223
Vysvětlivky: N - nymfa Tab. č. 4.4.2: Minimální prevalence – lokalita Štrosflek Celkový počet klíšťat
B. canis B. canis canis vogeli
Babesia spp. pozitivní celkem
0
7
1
20
1,08 %
0,00 %
1,51 %
0,22 %
4,31 %
1
3
4
4
0
14
0,40 %
1,20 %
1,60 %
1,60 %
0,00 %
5,58 %
Babesia microti
Babesia divergens
D. reticulatus ♀ 464 Minimální prevalence
2
5
0,43 %
D. reticulatus ♂ 251 Minimální prevalence
Babesia sp. EU1
64
Tab. č. 4.4.3: Minimální prevalence – lokalita Hvězda Celkový počet klíšťat
Babesia microti
Babesia divergens
Babesia sp. EU1
B. canis canis
B. canis vogeli
Babesia spp. pozitivní celkem
D. reticulatus ♀ 86 Minimální prevalence
1
0
0
0
0
4
1,16 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
4,65 %
D. reticulatus ♂ 139 Minimální prevalence
3
0
0
0
0
4
2,16 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
0,00 %
2,88 %
65
5 Diskuze V Evropě ještě poměrně nedávno nebyla babesiím jako etiologickému agens závaţných zoonóz věnována přílišná pozornost. Nejméně v posledním desetiletí však lze prakticky v celosvětovém měřítku sledovat trend narůstajícího počtu nově hlášených babesióz a jejich výzkum se těší zvýšené pozornosti. Ani střední Evropa tedy není výjimkou (Häselbarth a kol. 2007, Herwaldt a kol. 2003, Nohýnková a kol. 2003, Hildebrandt a kol. 2007, Bonnet a kol. 2007). Zda je tento vzrůstající trend důsledkem dřívějšího podhodnocování suspektních případů a jejich nesprávné diagnostiky (Hildebrandt a kol. 2008), či zda souvisí se změnou klimatu během uplynulých padesáti let a tím pádem i změnou distribuce klíšťaty přenášených zoonóz v důsledku expanze jejich vektorů (Randolph 2004, Gage a kol. 2008), zůstavá, dle mého názoru, otázkou. Cílem předkládané diplomové práce bylo molekulárně-biologickými metodami ověřit přítomnost vybraných druhů babesií a určit minimální prevalenci v klíšťatech Ixodes ricinus, Dermacentor reticulatus a Haemaphysalis concinna ve dvou přírodních ekosystémech na Břeclavsku. Molekulárně-biologické metody jsou povaţovány za vysoce citlivé a spolehlivé a jsou-li správně zvoleny, mohou být cenným nástrojem jak pro diagnostiku babesiózy, tak i pro získávání epidemiologických údajů. V této diplomové práci byla pouţita metoda reverse line blot, díky níţ lze poměrně jednoduše a spolehlivě testovat amplifikovaný PCR produkt s velkým mnoţstvím sond. V předkládané práci byly pro reverse line blot zvoleny především takové sodny, které by mohly zachytit nejočekávanější druhy babesií vyskytující se v lokalitách odchytu klíšťat. Mezi tyto druhy byla zařazena B. microti, jejíţ výskyt byl na jihu Moravy potvrzen v roce 2003 (Rudolf a kol. 2005), B. divergens, která je v Evropě povaţována za významný a rozšířený babesiální patogen, a u níţ údaje o výskytu na území ČR chybí, nově popsaný druh Babesia sp. EU1 (údaje o výskytu v ČR rovněţ chybí) a B. canis canis, jejímţ kompetentním vektorem je Dermacentor reticulatus, který je na jihu Moravy rozšířený (Hubálek a Rudolf 2007). B. canis canis byla navíc detegována v D. reticulatus na jihozápadním Slovensku (Duh a kol. 2006, Kubelová a kol. 2011), ovšem dle zachycených případů psí babesiózy na Slovensku se předpokládá rozšiřování hranic endemické oblasti severozápadním směrem, tedy i na jih Moravy (Kubelová a kol. 2011). B. canis vogeli způsobuje psí babesiózy převáţně v jiţních částech Evropy a v severní Africe (M’ghirbi a Bouattour 2008, Cardoso a kol. 2010), přesto však byl tento mikroorganizmus detegován pomocí PCR z krve nemocných psů ve Slovinsku, přitom jejich majitelé neuváděli cestovatelskou historii psa a současně si byli vědomi, ţe na psu před propuknutím 66
onemocnění sálo klíště (pravděpodobně D. reticulatus či Rhipicephalus sanguineus). Existuje tedy podezření, ţe se jednalo o autochtonní nákazy (Duh a kol. 2004). Tato skutečnost tedy můţe podporovat skutečnost pouţití sondy pro B. canis vogeli v metodě reverse line blotu v předkládané diplomové práci. Souhrnně bylo v diplomové práci vyšetřováno 1288 klíšťat odchycených vlajkováním v lokalitách Štrosflek, Hvězda a Rendezvous. Klíšťata byla z technických důvodů zpracovávána ve směsích po několika jedincích, kteří byli tříděni podle druhu, pohlaví, vývojového stadia a lokality odchytu. Celkově bylo vyšetřováno 156 směsí klíšťat. Lokalita Rendezvous: Z této lokality byla vyšetřována klíšťata Ixodes ricinus (12 samic, 34 samců, 223 nymf), Haemaphysalis concinna (2 samice, 1 samec, 19 nymf) a Dermacentor reticulatus (26 samic, 31 samců). U I. ricinus nebyl v rámci minimální celkové prevalence sledován mezi samicemi a samci významný rozdíl (16,67 % samice a 14,71% samci). Z babesií byla zachycena B. microti (minimální prevalence 8,33 % samice a 11,76 % samci) a u jedné samice dokonce Babesia sp. EU1 (minimální prevalence 8,33 %). Vyšetřované nymfy I. ricinus, jakoţto početně výraznější skupina, představovaly statisticky významnější vzorek. Celková minimální prevalence vykazovala 4,48 % a mimo B. microti (minimální prevalence 4,04 %) se v nymfách podařilo zachytit i Babesia sp. EU1 (minimální prevalence 0,45 %). Ve srovnání s prací Dr. Rudolfa a kol. (2005), který uvádí hodnotu minimální prevalence pro B. microti 1,43 % - 1,55 % při vyšetřování 350 nymf I. ricinus, je minimální hodnota prevalence uváděná v této práci pro B. microti vyšší. Pro srovnání zde uvádím další hodnoty prevalencí některých autorů zabývajících se detekcí prvoků B. microti, resp. Babesia sp. EU1, v klíšťatech Ixodes ricinus, která byla sbírána vlajkováním. Duh a kol. (2001) uvádí pro B. microti hodnotu prevalence 13 % v nymfách (9 pozitivních z 69) a 5,7 % v dospělcích (4 pozitivní z 60) v klíšťatech I. ricinus, která byla sbírána ve Slovinsku v létě 1997 (Duh a kol. 2001). Ve Švýcarsku Foppa
a kol. (2002) vyšetřuje pomocí PCR 408 nymf I. ricinus
odchycených v červenci 1997. Pro B. microti uvádí prevalenci 3,4 % (14 pozitivních z 408) (Foppa a kol. 2002). Skotarczak a Cichocka (2001) udavají prevalenci pro B. microti u klíšťat I. ricinus, která byla sbírána v severozápadním Polsku u města Szczecin, 14,9 % u samic (22 pozitivních ze
67
148), 14,4 % u samců (19 pozitivních ze 132) a 11,1 % u nymf (26 pozitivních z 234) (Skotarczak a Cichocka 2001). Prvoka Babesia sp. EU1 zachytili v larvách (217 testovaných jedinců) a nymfách (138 testovaných jedinců) I. ricinus, které byly sbírány vlajkováním během dubna aţ listopadu 2006, Cassini a kol. v severní Itálii. Prevalenci udávají 0,85 % souhrnně (Cassini a kol. 2010). Cieniuch a kol. (2009) popisují záchyt Babesia sp. EU1 v klíšťatech I. ricinus v severním Polsku. Prevalence udávají 1,3 % u samic (7 pozitivních z 526), 1,1 % u samců (6 pozitivních z 552) a 0 % u nymf (0 nymf pozitivních z 314). V kontrastu s těmito hodnotami prevalencí ještě uvádím práci Blaschitze a kol. (2008). Klíšťata Ixodes ricinus byla odchycena na území Rakouska vlajkováním v období května aţ srpna 2005. Mezi odchycenými jedinci byly larvy, nymfy i dospělci. Z celkově 853 vyšetřovaných klíšťat (Ixodes ricinus) bylo 441 pozitivních pro Babesia spp., coţ odpovídá prevalenci 51,70 % (Blaschitz a kol. 2008). U dospělců Haemaphysalis concinna nebyl detegován ţádný druh babesie. Tento výsledek však nelze povaţovat za statisticky významný, neboť bylo vyšetřováno příliš málo jedinců. Při vyšetřování nymf H. concinna byl zjištěn jeden pozitivní výsledek a celková minimální prevalence tak činila 5,26 %. Detegovaný druh babesie však nemohl být druhově určen. Jedná se o vůbec první záchyt prvoka Babesia spp. v klíštěti H. concinna molkulárněbiologickými metodami. Vyšetřením dospělců Dermacentor reticulatus, kteří byli odchyceni na podzim 2008 a 2010, byly získány poměrně zajímavé výsledky. Byl v nich totiţ pomocí reverse line blotu identifikován prvok Babesia microti, přičemţ minimální prevalence u samic činila 7,69 % (celková minimální prevalence 7,69 %) a u samců 3,23 % (celková minimální prevalence 6,45 %). Za primárního vektora B. microti lze ve střední Evropě povaţovat především klíště Ixodes ricinus. Jelikoţ však larvy a nymfy klíštěte Dermacentor reticulatus často parazitují na hlodavcích, kteří jsou významným rezervoárem pro prvka B. microti (Hubálek a Rudolf 2007), dala by se přítomnost tohoto mikroorganizmu v dospělcích předpokládat. WelcFaleciak a kol. (2008) potvrzují přítomnost DNA, kterou diagnostikovali jako DNA prvoka B. microti, v larvách a nymfách klíšťat Ixodes ricinus a Dermacentor reticulatus sajících na hlodavcích Myodes glareolus, Apodemus flavicollis, Microtus arvalis a Microtus oeconomus, kteří byli odchyceni v oblasti Mazurských jezer v Polsku (Welc-Faleciak a kol. 2008). Dle Mehlhorna (2001) můţe být Dermacentor reticulatus také vektorem pro B. microti.
68
Lokalita Štrosflek: V této lokalitě byla sbírána především klíšťata Dermacentor reticulatus (464 samic a 251 samců). Celková minimální prevalence u samic D. reticulatus byla 4,31 % a u samců 5,58 %. V hodnotách minimální prevalence pro prvoka B. microti nelze hledat přílišné rozdíly (samice 0,43 % a samci 0,40 %). Poměrně unikátní jsou pak záchyty mikroorganizmu B. divergens u obou pohlaví (minimální prevalence u samic 1,08 % a u samců 1,20 %). Záchyt prvoka B. divergens v klíštěti Dermacentor reticulatus s pouţitím reverse line blotu popisuje García-Sanmartín a kol. (2008) při vyšetřování klíšťat Ixodes ricinus, Haemaphysalis punctata, Dermacentor reticulatus, Haemaphysalis inermis a Rhipicephalus bursa, odchycených vlajkováním v hornatých oblastech severního Španělska (Baskicko). Autoři však zdůrazňují, ţe Dermacentor reticulatus dosud nebyl popsán jako vektor pro prvoka B. divergens (García-Sanmartín a kol. 2008). Navíc byla detegována i Babesia sp. EU1 u samců D. reticulatus odchycených na lokalitě Štrosflek. Hodnota minimální prevalence je 1,60 %. Podařilo se také detegovat prvoka Babesia canis canis, přičemţ minimální prevalence se mezi pohlavími významně nelišila (samice 1,51 % a samci 1,60 %). Jde tak o vůbec první záchyt tohoto mikroorganizmu u nás. Česká republika byla doposud povaţována za prostou prvoka Babesia canis canis (Konvalinová a kol. 2011, Kubelová a kol. 2011). Pro porovnání prevalencí uvádím práci autorů Duh a kol. (2006), kteří vyšetřovali 70 samic a 43 samců klíšťat Dermacentor reticulatus, která byla sbírána vlajkováním v pozdním říjnu 2002 ve Slovinsku. DNA byla extrahována ze 100 jedinců a B. canis canis byla detegována u jednoho z nich. Prevalence tedy činí 1 %. Pouze u jedné směsi klíšťat odchycených na lokalitě Štrosflek byl detegován mikroorganismus Babesia canis vogeli. Jednalo se samice a minimální prevalence udává hodnotu 0,22 %. Za obvyklého vektora pro tento druh babesie se povaţuje především Rhipicephalus sanguineus (Duh a kol. 2004). Lokalita Hvězda: V lokalitě Hvězda byla sbírána klíšťata Dermacentor reticulatus. Bylo odchyceno 86 samic a 139 samců. Celková minimální prevalence se mezi pohlavími odlišovala (samice 4,65 % a samci 2,88 %), to by ovšem mohlo být způsobeno nerovnoměrným poměrem mezi celkovými počty obou pohlaví (samců je přibliţně 1,6 krát více). Mezi detegovanými druhy babesií byla pouze B. microti s minimální prevalencí 1,16 % u samic a 2,16 % u samců.
69
Srovnáním výsledků a minimálních prevalencí lze mezi lokalitami nalézt odlišnosti. Především mikroorganizmus Babesia canis canis byl detegován pouze v lokalitě Štrosflek, a to jen z jarních sběrů 2011. Lokalita Štrosflek je mimo jiné téţ významným přírodním ohniskem výskytu tularémie (Hubálek a kol. 1996). Detekce prvoka Babesia canis canis v klíšťatech Dermacentor reticulatus v této lokalitě tedy koresponduje s teorií, podle které se předpokládá expanze endemické oblasti psí babesiózy z jiţního Slovenska jihozápadním směrem (Kubelová a kol. 2011). Lokalita Štrosflek, která je téţ unikátním ekosystémem luţního lesa, se totiţ nachází v blízkosti slovenských hranic. Dále byli pouze v lokalitě Štrosflek v klíšťatech Dermacentor reticulatus detegováni prvoci Babesia canis vogeli a Babesia sp. EU1. Naopak v lokalitách Rendezvous a Hvězda se pak v klíšťatech Dermacentor reticulatus podařilo detegovat pouze prvoka Babesia microti. Jelikoţ v této diplomové práci byly získány i poměrně neočekávané výsledky včetně některých hodnot minimálních prevalencí, bylo by dále vhodné pozitivní výsledky konfirmovat sekvenováním. Pro získání přesnějších výsledků by také bylo vhodné nezpracovávat klíšťata ve směsích, ale vyšetřovat je jednotlivě. Díky tomu bychom měli jasnější představu o tom, které agens (případně která agens) se v daném konkrétním klíštěti vyskytuje (vyskytují).
70
6 Závěr 1) Byl proveden sběr klíšťat v lokalitách Rendezvous, Štrosflek a Hvězda, které se nacházejí na jihu Moravy a náleţí ke dvěma rozdílným ekosystémům. Z celkového počtu odchycených klíšťat (1288) bylo vytvořeno 156 směsí, do nichţ byla klíšťata roztříděna dle druhu, vývojového stadia, pohlaví a lokality sběru. 2) Pro diagnostiku babesií v klíšťatech byla zvolena metoda reverse line blot se sondami pro detekci Babesia spp. „catch all,“ Babesia microti, Babesia divergens, Babesia sp. EU1, Babesia canis canis a Babesia canis vogeli. 3) V lokalitě Rendezvous byla zjištěna celková minimální prevalence (pro Babesia spp.) u samic klíšťat Ixodes ricinus 16,67 %, u samců 14,71 %, a u nymf 4,48 %. Z toho prvok Babesia sp. EU1 byl detegován u samic (minimální prevalence 8,33 %) a nymf (minimální prevalence 0,45 %). Mezi další detegovaný druh babesie patřila Babesia microti, kterou se podařilo zachytit v samicích (minimální prevalence 8,33 %), samcích (minimální prevalence 11,76 %) i nymfách (minimální prevalence 4,04 %). Celková minimální prevalence u klíšťat Dermacentor reticulatus byla pro prvoka Babesia spp. u samic 7,69 % a u samců 6,45 %. Z toho pouze Babesia microti byla detegována u těchto klíšťat v lokalitě Rendezvous (minimální prevalence u samic 7,69 %, u samců 3,23 %). U klíšťat Haemaphysalis concinna byly babesie detegovány pouze u nymf. Celková minimální prevalence činila 5,26 % a babesie nebylo moţné druhově rozlišit. 4) V lokalitě Štrosflek byla zjištěna celková minimální prevalence (pro Babesia spp.) u samic klíšťat Dermacentor reticulatus 4,31 % a u samců 5,58 %. Babesia microti byla detegována u samic (minimální prevalence 0,43 %) i u samců (0,40 %), Babesia divergens byla také detegována u samic (minimální prevalence 1,08 %) i u samců (1,20 %). Psí patogen Babeisa canis canis byl detegován u samic (minimální prevalence 1,51 %) a také u samců (minimální prevalence 1,60 %). Mezi další detegované druhy babesií patřily Babesia sp. EU1 (pouze u samců, minimální prevalence 1,60 %) a Babesia canis vogeli (pouze u samic, minimální prevalence 0,22 %).
71
5) V lokalitě Hvězda byla zjištěna celková minimální prevalence (pro Babesia spp.) u samic klíšťat Dermacentor reticulatus 4,65 % a u samců 2,88 %. Jediným druhem detegované babesie byla Babesia microti zjištěná u samic (minimální prevalence 1,16 %) i u samců (minimální prevalence 2,16 %). 6) Poprvé byl molekulárně-biologickými metodami zachycen prvok Babesia spp. v klíšťatech Haemaphysalis concinna. 7) V České republice byli vůbec poprvé zachyceni prvoci Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia divergens a Babesia sp. EU1 v klíšťatech čeledi Ixodidae.
72
7 Seznam literatury Adaszek L., Winiarczyk S. (2008): Moleular characterization of Babesia canis canis isolates from naturally infected dogs in Poland. Veterinary Parasitology. 152: 235-241. Adham F.K., Abd-El-Samie E.M., Gabre R. M., Hussein H. El. (2009): Detection of tick blood parasites in Egypt using PCR assay I – Babesia bovis and Babesia bigemina. Parasitology Research. 105: 721-730. Allsopp M. T. E. P., Allsopp B. A. (2006): Molecular Sequence Evidence for the Reclassification of Some Babesia Species. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1081: 509-517. Altay K., Aydin M.F., Dumanli N., Aktas M. (2008): Molecular detection of Babesia and Theileria infection in cattle. Veterinary Parasitology. 158: 295-301. Altay K., Dumanli N., Aktas M. (2007): Molecular identification, genetic diversity and distribution of Theileria and Babesia species infecting small ruminants. Veterinary Parasitology. 147: 161-165. Anderson J. F., Johnson R. C., Magnarelli L. A., Hyde F. W., Myers J. E. (1986): Peromyscus leucopus and Microtus pennsylvnticus Simultaneously Infected with Borrelia burgdorferi and Babesia microti. Journal of Clinical Microbiology. 23: 135-137. Anderson J. F., Mintz E. D., Gadbaw J. J., Magnarelli L. A. (1991): Babesia microti, Human Babesiosis, and Borrelia burgdorferi in Connecticut. Journal of Clinical Microbiology. 29: 2779-2783. Barbour A. G., Restrepo B. I. (2000): Antigenic Variation in Vector-Borne Pathogens. Emerging Infectious Diseases. 6: 449-457. Beattie J. F., Michelson M. L., Holman P. J. (2002): Acute Babesiosis Caused by Babesia divergens in a Resident of Kentucky. The New England Journal of Medicine. 347(9): 697-698. 73
Becker C. A. M., Bouju-Albert A., Jouglin M., Chauvin A., Malandrin L. (2009): Natural Transmission of Zoonotic Babesia spp. by Ixodes ricinus Ticks. Emerging Infectious Diseases. 15: 320-322. Berry A., Morassin B., Kamar N., Magnaval J.-F. (2001): Clinical picture: Human Babesiosis. The Lancet. 357: 341. Blaschitz M., Narodoslavsky-Gföller M., Kanzler M., Stanek G., Walochnik J. (2008): Babesia Species Occuring in Austrian Ixodes ricinus Tick. Applied and Environmental Microbiology. 74: 4841-4846. Blevins S. M., Greenfield R. A., Bronze M. S. (2008): Blood smear analysis in babesiosis, ehrlichiosis, relapsing fever, malaria, and Chagas disease. Cleveland clinic journal of medicine. 75: 521-530. Bonnet S., Brisseau N., Hermouet A., Jouglin M., Chauvin A. (2009): Experimental in vitro transmission of Babesia sp. (EU1) by Ixodes ricinus. Vet. Res. 40: 21. Bonnet S., Jouglin M., L´Hostis M., Chauvin A. (2007): Babesia sp. EU1 from Roe Deer and Transmission within Ixodes ricinus. Emerging Infectious Diseases. 13: 1208-1210. Boonchit S., Xuan X., Yokoyama N., Goff W. L., Waghela S. D., Wagner G., Igarashi I. (2004): Improved Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay Using C-Terminal Truncated
Recombinant Antigens of Babesia bovis Rhoptry-Associated Protein-1 for Detection of Specific Antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 42: 1601-1604. Bourdoiseau G. (2006): Canine babesiosis in France. Veterinary Parasitology. 138: 118-125. Bove J. R. (1990): Transfusion-Transmitted Diseases Other than AIDS and Hepatitis. The Yale Journal of Biology and Medicine. 63: 347-351. Bown K. J., Lambin X., Telford G. R., Ogden N. H., Telfer S., Woldehiwet Z., Birtles R. J. (2008): Relative Importance of Ixodes ricinus and Ixodes trianguliceps as Vectors for 74
Anaplasma phagocytophilum and Babesia microti in Field Vole (Microtus agrestis) Populations. Applied and Environmental Microbiology. 74: 7118-7125. Brasseur P., Gorenflot A. (1992): Human babesiosis in Europe. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. 87: 131-132. Brown W. C., Norimine J., Knowles D.P., Goff W.L. (2006): Immune control of Babesia bovis infection. Veterinary Parasitology. 138: 75-87. Bullová E., Lukáň M., Stanko M., Peťko B. (2009): Spatial distribution of Dermacentor reticulatus tick in Slovakia in the beginning of 21st century. Veterinary Parasitology. 165: 357-360. Cardoso L., Yisaschar –Mekuzas Y., Rodriguez F. T., Costa A., Machalo J., Diz-Lopez D., Baneth G. (2010): Canine babesiosis in northert Portugal and molecular characterization of vector-borne co-infections. Parasites and Vectors. 3:27. Casati S., Sager H., Gern L., Piffaretti J. C. (2006): Presence of potentially pathogenic Babesia sp. for human in Ixodes ricinus in Schwitzerland. Ann. Agric. Environ. Med. 13: 65-70. Cassini R., Bonoli C., Montarsi F., Tessarin C., Marcer F., Galuppi R. (2010): Detection of Babesia EU1 in Ixodes ricinus ticks in northern Italy. Veterinary Parasitology. 171: 151154. Cieniuch S., Stańczak J., Ruczaj A. (2009): The First Detection of Babesia EU1 and Babesia canis canis in Ixodes ricinus Ticks (Acari, Ixodidae) Collected in Urban and Rural Areas in Northern Poland. Polish Journal of Microbiology. 58: 231-236. Conrad P.A., Kjemtrup A.M., Carreno R.A., Thomford J., Wainwright K., Eberhard M., Quick R., Telford III S.R., Herwaldt B.L. (2006): Description of Babesia duncani n.sp. (Apicomplexa: Babesiidae) from humans and its differentiation from other piroplasms. International Journal for Parasitology 36: 779-789.
75
Criado-Fornelio A., Martinez-Marcos A., Buling-Saraña A., Barba-Carretero J.C. (2003): Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in Southern Europe Part II. Phylogenetic analysis and evolutionary history. Veterinary Parasitology. 114: 173-194 Criado-Fornelio A., Rey-Valeiron C., Buling A., Barba-Carretero J.C., Jefferies R., Irwin P. (2007): New advences in molecular epizootiology of canis hematic protozoa from Venezuela, Thailand and Spain. Veterinary Parasitology. 144: 261-269. Dobroszycki J., Herwaldt B. L., Boctor F., Miller J. R., Linden J., Eberhard M. L., Yoon J. J., Ali N. M., Tanowitz H. B., Graham F., Weiss L. M., Wittner M. (1999): A Cluster of Transfusion-Associated Babesiosis Cases Traced to a Single Asymptomatic Donor. JAMA. 281: 927-930. Duarte S. C., Linhares G. F. C., Romanowsky T. N., Osvaldo José da Silveira Neto, Borges L. M. F. (2008): Assessment of primers designed for the subspecies-specific diskrimination among Babesia canis canis, Babesia canis vogeli and Babesia canis rossi by PCR assay. Veterinary Parasitology. 152: 16-20. Duh D., Petrovec M., Avšič-Ţupanc T. (2001): Diversity of Babesia Infecting European Sheep Ticks (Ixodes ricinus). Journal of Clinical Microbiology. 347 s. 39: 3395-3397. Duh D., Petrovec M., Avšič-Ţupanc T. (2005): Molecular characterization of human pathogen Babesia EU1 in Ixodes ricinus ticks from Slovenia. Journal for Parasitology. 91: 463-465. Duh D., Slovák M., Saksida A., Strašek K., Petrovec M., Avšič-Ţupanc T. (2006): Molecular detection of Babesia canis in Dermacentor reticulatus ticks collected in Slovakia. Biologia, Bratislava. 61: 231-233. Duh D., Tozon N., Petrovec M., Strašek K., Avšič-Ţupanc T. (2004): Canine babesiosis in Slovenia: Molecular evidence of Babesia canis canis and Babesia canis vogeli. Veterinary Research. 35: 363-368.
76
Feder H. M., Lawlor M., Krause P. J. (2003): Babesiosis in Pregnancy. The New England Journal of Medicine. 349(2): 195-196. Földvári G., Hell É., Farkas R. (2005): Babesia canis canis in dogs from Hungary: detection by PCR and sequencing. Veterinary Parasitology. 127: 221-226. Foppa I. M., Krause P. J., Spielman A., Goethert H., Gern L., Brand B., Telford III. S. R. (2002): Entomologic and Serologic Evidence of Zoonotic Transmission of Babesia microti, Eastern Switzerland. Emerging Infectious Diseases. 8: 722-726. Gage K. L., Burkot T. R., Eisen R. J., Hayes E. B. (2008): Climate and Vectorborne Diseases. American Journal of Preventive Medicine. 35: 436-450. García-Sanmartín J., Barandika J. F., Juste R. A., García-Pérez A. L., Hurtado A. (2008): Distribution and molecular detection of Theileria and Babesia in questing ticks from northern Spain. Medical and Veterinary Entomology. 22: 318-325. Goddard J., Varela-Stokes A. S. (2009): Role of lone star tick, Amblyomma americanum (L), in human and animal diseases. Veterinary Parasitology. 160: 1-12. Gothe R., Wegerdt S. (1991): Babesiosis of dogs in Germany: epidemiologic case analysis. Tierarztl Prax. 19: 170-173. Gubbels J. M., de Vos A. P., van der Weide M., Viseras J., Schouls L. M., de Vries E., Jongejan F. (1999): Simultaneous Detection of Bovine Theileria and Babesia Species by Reverse Line Blot Hybridization. Journal of Clinical Microbiology. 37: 1782-1789. Gülanber A., Gorenflot A., Schetters Theo P.M., Carcy B. (2006): First molecular diagnosis of Babesia vogeli in domestic dogs from Turkey. Veterinary Parasitology. 139: 224230. Gunders A. E. (1977): Piroplasmal sporozoites in the Argasid Ornithodoros erraticus (Lucas). Experientia. 33: 892-893.
77
Gürtler L., Blümel J., Burger R., Drosten Ch., Gröner A., Heiden M., Hildebrandt M., Janses B., Montan-Lessing T., Offergeld R., Pauli G., Seitz R., Schlenkrich U., Schottstedt V., Strobel J., Willkommen H., Wirsing von König C.-H. (2009): Arboprotozoae. Transfusion medicine and hemotherapy. 36: 8-31. Haapasalo K., Soumalainen P., Sukura A., Siikamäki H., Jokiranta T. S. (2010): Fatal Babesiosis in Man, Finland, 2004. Emerging Infectious Diseases. 16: 1116-1118. Häselbarth K., Tenter A. M., Brade V., Krieger G., Hunfeld K.-P. (2007): First case of human babesiosis in Germany – Clinical presentation and molecular characterisation of the pathogen. International Journal of Medical Microbiology. 297: 197-204. Hasle G., Bjune G. A., Christensson D., Röed K. H., Whist A. C., Leinaas H. P. (2010): Detection of Babesia divergens in southern Norway by using an immunofluorescence antibody test in cow sera. Acta Veterinaria Scandinavica. 52: 55. Hausmann K., Hülsmann N. (2003): Protozoologie. Academia, Praha. Herwaldt B. L., Caccio S., Gherlinzoni F., Aspöck H., Slemenda S. B., Piccaluga P., Martinelli G., Edelhofer R., Hollenstein U., Poletti G., Pampiglione S., Löschenberger K., Tura S., Pieniazek N. J. (2003): Molecular Characterization of a Non-Babesia divergens Organism Causing Zoonotic Babesiosis in Europe. Emerging Infectious Diseases. 9: 942-948. Hildebrandt A., Hunfeld K.-P., Baier M., Krumbholz A., Sachse S., Lorenzen T., Kiehntopf M., Fricke H.-J., Straube E. (2007): First confirmed autochtonous case of human Babesia microti infection in Europe. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 26: 595-601 Hildebrandt A., Tenter A. M., Straube E., Hunfeld K.-P. (2008): Human babesiosis in Germany: Just overlooked or truly new? International Journal of Medical Microbiology. 298: 336-346. Hilpertshauser H., Deplazes P., Schnyder M., Gern L., Mathis A. (2006): Babesia spp. identified by PCR in tick collected from domestic and wild Rumnants in southern Switzerland. Applied and Environmental Microbiology. 72: 6503-6507. 78
Hines S. A., Palmer G. H., Jasmer D. P., Goff W. L., McElwain T. F. (1995): Immunization of Cattle with Recombinant Babesia bovis Merozoite Surface Antigen-1. Infection and Immunity. 63: 349-352. Holman P. J., Spencer A. M., Droleskey R. E., Goethert H. K., Telford III S. R. (2005): In Vitro Cultivation of a Zoonotic Babesia sp. Isolated from Eastern Cottontail Rabbits (Sylvilagus floridanus) on Nantucket Island, Massachusetts. Journal of Clinical Microgiology. 43: 3995-4001. Homer M. J., Bruinsma E.S., Lodes M. J., Moro M. H., Telford III S. R., Krause P. J., Reynolds L. D., Mohamath R., Benson D. R., Houghton R. L., Reed S. G., Persing D. H. (2000b): A Polymorphic Multigene Family Encoding an Immunodominant Protein from Babesia microti. Journal of Clinical Microbiology. 38: 362-368. Homer M. J., Lodes M. J., Reynolds L. D., Zhang Y., Douglass J. F., McNeill P. D., Houghton R. L., Persing D. H. (2003): Identification and Characterization of Putative Secreted Antigens from Babesia microti. Journal of Clinical Microbiology. 41: 723-729. Homer M.J., Aguilar-Delfin I., Telford III S.R., Krause P.J., Persing D.H. (2000a): Babesiosis. Clinical Microbiology Reviews. 13: 451-469. Hrib M., Kordiovský E. (2004): Luţní les v Dyjsko-moravské nivě. Moraviapress, Břeclav. 591 s. Hubálek Z., Rudolf I. (2007): Mikrobiální zoonózy a sapronózy. Přírodovědecká fakulta MU, Brno. 176 s. Hubálek Z., Treml F., Halouzka J., Juřicová Z., Hunady M., Janík V. (1996): Frequent isolation of Francisella tularensis from Dermacentor reticulatus ticks in an enzootic focus of tularemia. Medical and Veterinary Entomology. 10: 241-246. Hunfeld K.-P., Hildebrandt A., Gray J.S. (2008): Babesiosis: Recent insights into an ancient disease. International Journal for Parasitology. 38: 1219-1237. 79
Chytrý M., Kučera T., Kočí M. (2001): Katalog biotopů České republiky. Agentura ochrany přírody a krajiny ČR, Praha. 304 s. Johnson S. T., Cable R. G., Tonnetti L., Spencer B., Rios J., Leiby D. A. (2009): Seroprevalence of Babesia microti in blood donors from Babesia-endemic areas of the northeastern United States: 2000 through 2007. Transfusion. 49: 2574-2582. Kain K. C., Jassoum S. B., Fong I. W., Hannach B. (2001): Transfusion-transmitted babesiosis in Ontario: first reported case in Canada. CMAJ. 164(12): 1721-1723. Kim C., Alhassan A., Verdida R.A., Yokoyama N., Xuan X., Fujisaki K., Kawazu S., Igarashi I. (2007): Development of two immunochromatographic tests for the serodiagnosis of bovine babesiosis. Veterinary Parasitology. 148: 137-143. Kim J. Y., Cho S. H., Joo H. N., Tsuji M., Cho S. R., Park I. J., Chung G. T., Ju J. W., Cheun H. I., Lee H. W., Lee Y. H., Kim T. S. (2007): First Case of Human Babesiosis in Korea: Detection and Characterization of a Novel Type of Babesia sp. (KO1) Similar to Ovine Babesia. Journal of Clinical Microbiology. 45: 2084-2087. Kjemtrup A. M., Conrad P. A. (2000): Human babesiosis: an emerging tick-borne disease. International Journal for Parasitology. 30: 1323-1337. Kjemtrup A. M., Lee B., Fritz C. L., Evans C., Chervenak M., Conrad P. A. (2002): Investigation of transfusion transmission of a WA1-type babesial parasite to a premature infant in California. Transfusion. 42: 1482-1487. Kong F., Gilbert G. L. (2007): Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay (mPCR/RLB) – a practical epidemiological and diagnostic tool. Nature Protocols. 1: 26682680. Konvalinová J., Rudolf I., Šikutová S., Hubálek Z., Svobodová V., Svoboda M. (2011): Likely emergence of canine babesiosis in the Czech Republic. Veterinary Parasitology. Article in press. 80
Krause P. J., Lepore T., Sikand V. K., Gadbaw J., Burke G., Telford III S. R., Brassard P., Pearl D., Azlanzadeh J., Christianson D., McGrath D., Spielman A. (2000): Atovaquone and azithromycin for the treatment of babesiosis. The New England Journal of Medicine. 343: 1454-1458. Krause P. J., Spielman A., Telford III S. R., Sikand V. K., McKay K., Christianson D., Pollack R. J., Brassard P., Magera J., Ryan R., Persing D. H. (1998): Persistent parasitemia after acute babesiosis. The New England Journal of Medicine. 339(3): 160-165. Krause P.J. (2000): Babesiosis. Seminars in Pediatric Infectious Diseases. 11: 182-188. Kubelová M., Tkadlec E., Bednář M., Roubalová E., Široký P. (2011): West-to-east differences of Babesia canis canis prevalence in Dermacentor reticulatus ticks in Slovakia. Veterinary Parasitology. Article in press. Lane R. S., Mun J., Stubbs H. A. (2009): Horizontal and vertical movements of hostseeking Ixodes pacificus (Acari: Ixodidae) nymphs in hardwood forest. J Vector Ecol. 34: 252-266. Lang-Unnasch N., Reith M. E., Munholland J., Barta J. R. (1998): Plastids are widespread and ancient in parasites of the phylum Apicomplexa. International Journal for Parasitology. 28: 1743-1754. M’ghirbi Y., Bouattour A. (2008): Detection and molecular characterization of Babesia canis vogeli from naturely infected dogs and Rhipicephalus sanguineus ticks in Tunisia. Veterinary Parasitology. 152: 1-7. Malandrin L., Jouglin M., Sun Y., Brisseau N., Chauvin A. (2010): Redescription of Babesia capreoli (Enigk and Friedhoff, 1962) from roe deer (Capreolus capreolus): Isolation, cultivation, host specifity, molecular characterisation and differentiation from Babesia divergens. International Journal for Parasitology. 40: 277-284.
81
Matjila P.T., Leisewitz A.L., Jongejan F., Penzhorn B.L. (2008): Molecular detection of tick-borne protozoal and ehrlichial infections in domestic dogs in South Africa. Veterinary Parasitology. 155: 152-157. Matjila T. P., Nijhof A. M., Taoufik A., Houwers D., Teske E., Penzhorn B. L., de Lange T., Jongejan F. (2005): Autochtonous canine babesiosis in The Netherlands. Veterinary Parasitology. 131: 23-29. Matjila T. P., Penzhorn B. L., Bekker C. P. J., Nijhof A. M., Jongejan F. (2004): Confirmation of occurence of Babesia canis vogeli in domestic dogs in South Africa. Veterinary Parasitology. 122: 119-125. Mehlhorn H. (2001):Encyclopedic Reference of Parasitology, 2nd Edition. Springer. 676 s. Online-Version: Informatik II, Universität Würzburg [citováno 6. prosince 2010]. Dostupné z: http://parasitology.informatik.uni-wuerzburg.de/login/frame.php Mehlhorn H., Schein E. (1984): The Piroplasms: Life Cycle and Sexual Stages. Advances in parasitology. 23: 37-103. Mosqueda J., McElwain T. F., Stiller D., Palmer G. H. (2002): Babesia bovis Merozoite Surface Antigen 1 and Rhoptry-Associated Protein 1 Are Expressed in Sporozoites, and Specific Antibodies Inhibit Sporozoite Attachment to Erythrocytes. Infection and Immunity. 70: 1599-1603. Neelakanta G., Sultana H., Fish D., Anderson J. F., Fikrig E (2010): Anaplasma phagocytophilum induces Ixodes scapularis ticks to express an antifreeze glycoprotein gene that enhances their survival in the cold. The Journal of Clinical Investigation. 120: 3179-3190. Nelson D. A., Bradley J. K., Arya R., Ianosi-Irimie M., Marques-Baptista A., Merlin M. A. (2009): Babesiosis as a rare case of fever in the immunocompromised patient: a case report. Cases Journal. 2: 7420.
82
Nijhof A. M., Bodaan C., Postigo M., Nieuwenhuijs H., Opsteegh M., Franssen L., Jebbink F., Jongejan F. (2007): Ticks and Associated Pathogens Collected from Domestic Animals in the Netherlands. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 7: 585-595. Nohýnková E., Kubek J., Měšťánková O., Chalupa P., Hubálek Z. (2003): Případ infekce Babesia microti importované do České republiky z USA. Časopis lékařů českých. 142: 377‑381. Patarroyo J. H., Prates A. A., Tavares C. A. P., Mafra C. L., Vargas M. I. (1995): Exoantigens of an attenuated strain of Babesia bovis used as a vaccine against bovine babesiosis. Veterinary Parasitology. 59: 189-199. Persing D. H., Herwaldt B. L., Glaser C., Lane R. S., Thomford J. W., Mathiesen D., Krause P. J., Phillip D. F., Conrad P. A. (1995): Infection with Babesia-like organism in Northern California. The New England Journal of Medicine. 332: 298-303. Persing D. H., Mathiesen D., Marshall W. F., Telford S. R., Spielman A., Thomford J. W., Conrad P. A. (1992): Detection of Babesia microti by Polymerace Chin Reaction. Journal of Clinical Microbiology. 30: 2097-2103. Prince H. E., Lapé-Nixon M., Patel H., Yeh C. (2010): Comparison of the Babesia duncani (WA1) IgG Detection Rates among Clinical Sera Submitted to a Reference Laboratory for WA1 IgG Testing and Blood Donor Specimens from Diverse Geographic Areas of the United States. Clinical and Vaccine Immunology. 17: 1729-1733. Quick R. E., Herwaldt B. L., Thomford J. W., Garnett M. E., Eberhard M. L., Wilson M., Spach D. H., Dickerson J. W., Telford III S. R., Steingart K. R., Pollock R., Persing D. H., Kobayashi J. M., Juranek D. D., Conrad P. A. (1993): Babesiosis in Washington State: A New Species of Babesia? Annals of Internal Medicine. 119: 284-290. Randolph S. E. (2004): Evidence that climate change has caused emergence of tick-borne diseases in Europe? International Journal of Medical Microbiology. 293: 5-15.
83
Ríos L., Alvarez G., Blair S. (2003): Serological and parasitological study and report of first case of human babesiosis in Colombia. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 36: 493-498. Rosický B., Daniel M. a kol. (1989): Lékařská entomologie a ţivotní prostředí. Academia, Praha. 437 s. Rosický B., Weiser J. (1952): Škůdci lidského zdraví. Přírodovědecké vydavatelství, Praha. 830 s. Rudolf I., Golovchenko M., Šikutová S., Rudenko N., Grubhoffer L., Hubálek Z. (2005): Babesia microti (Piroplasmida: Babesiidae) in nymphal Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae) in the Czech Republic. Folia Paraitologica. 52: 274-276. Rudzinska M. A., Spielman A., Lewengrub S., Trager W., Piesman J. (1983): Sexuality in piroplasms as revealed by electron microscopy in Babesia microti. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2966-2970. Shih C. M., Wang C. C. (1998): Ability of azithromycin in combination with quinine for the elimination of babesial infection in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59: 509-512. Shikano S., Nakada K., Haushiguchi R., Shimada T., Ono K. (1995): A short term in vitro cultivation of Babesia rodhaini and Babesia microti. Journal of Veterinary Medical Science. 57: 955-957. Schetters T. (2005): Vaccination against canine babesiosis. Trends in Parasitology. 21: 179184. Schuster F. L. (2002): Cultivation of Babesia and Babesia-Like Blood Parasites: Agents of an Emerging Zoonotic Disease. Clinical Microbiology Reviews. 15: 365-373. Schwint N. O., Ueti M. W., Palmer G. H., Kappmeyer L. S., Hines M. T., Cordes R. T., Knowles D. P., Scoles G. A. (2009): Imidocarb Dipropionate Clears Persistent Babesia 84
caballi Infection with Elimination of Transmission Potencial. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53: 4327-4332. Skotarczak B. (2008): Babesiosis as a disease of people and dogs. Molecular diagnostics: a review. Veterinarni Medicina. 53: 229-235. Skotarczak B., Cichocka A. (2001): Isolation and amplification by polymerase chain reaction DNA of Babesia microti and Babesia divergens in ticks in Poland. Ann. Agric. Environ. Med. 8: 187-189. Solano-Gallego L., Trotta M., Carli E., Carcy B., Caldin M., Furlanello T. (2008): Babesia canis canis and Babesia canis vogeli clinicopathological findings and DNA detection by means of PCR-RFLP in blood from Italian dogs suspected of tick-borne desease. Veterinary Parasitology. 157: 211-221. Spielman A., Levine J. F., Wilson M. L. (1984): Vectorial Capacity of North American Ixodes Ticks. The Yale Journal of Biology and Medicíně. 57: 507-513. Steullet P., Guerin P. M. (1994): Identification of vertebrate volatiles stimulating olfactory receptors on tarsus I of the tick Amblyomma variegatum Fabricius (Ixodidae). Journal of Comparative Physiology A. 174: 39-47. Swanson S. J., Nietzel D., Reed K. D., Belongia E. A. (2006): Coinfections Acquired from Ixodes Ticks. Clinical Microbiology Reviews. 19: 708-727. Telfer S., Birtles R., Bennett M., Lambin X., Paterson S., Begon M. (2008): Parasite interactions in natural populations: insights from longitudinal data. Parasitology. 135: 767781. Uilenberg G. (2006): Babesia – a historical overview. Veterinary Parasitology. 138: 3-10. Vannier E., Krause P. J. (2009): Update on Babesiosis. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases.
85
Vial J., Gorenflot A. (2006): Chemotherapy against babesiosis. Veterinary Parasitology. 138: 147-160. de Waal D. T., Combrink M. P. (2006): Live vaccines against bovine babesiosis. Veterinary Parasitology. 138: 88-96. Ward P.A., Jack R. M. (1981): The Entry Proces of Babesia Merozoites into Red Cells. American Journal of Pathology. 102: 109-113. Welc-Faleciak R., Bajer A., Behnke J. M., Siński E. (2008): Effects of host diversity and the community composition of hard ticks (Ixodidae) on Babesia microti infection. International Journal of Medical Microbiology. 298: 235-242. Wilkowsky S.E., Morreta R., Mosqueda J., Gil G., Echaide I., Lía V., Falcón V., Christensen M. Florin, Fater M. (2009): A new set of molecular markers for the genotyping of Babesia bovis isolates. Veterinary parasitology. 161: 9-18. Yamasaki M., Inokuma H., Sugimoto Ch., Shaw S. E., Aktas M., Yabsley M. J., Yamato O., Maede Y. (2007): Comparsion and phylogenetic analysis of the heat shock protein 70 gene of Babesia parasites from dogs. Veterinary parasitology. 145: 217-227. Yokoyama N., Okamura M., Igarashi I. (2006): Erythocyte invasion by Babesia parasites: Current advances in the elucidation of the molecular interactions between the protozoan ligands and host receptors in the invasion stage. Veterinary Parasitology. 138: 22-32. Zintl A., Mulcahy G., Skerrett H. E., Taylor S. M., Gray J. S. (2003): Babesia divergens, a Bovine Blood Parasite of Veterinary and Zoonotic Importance. Clinical Microbiology Reviews. 16: 622-636. URL 1: Český hydrometeorologický ústav, Odbor klimatologie, Informace o klimatu. [citováno 27. dubna 2011]. Dostupné z: http://old.chmi.cz/meteo/ok/tr6190w.jpg URL 2: Český hydrometeorologický ústav, Odbor klimatologie, Informace o klimatu. [citováno 27. dubna 2011]. Dostupné z: http://old.chmi.cz/meteo/ok/nsrz6190.jpg 86
