Moderne Instrumentele Analyse

Moderne Instrumentele Analyse

Niels Jonker

Isala klinieken

Massa Spectrometrie

 Techniek waarbij de te onderzoeken stof wordt geïoniseerd en waarbij vervolgens van de gevormde (fragment)ionen de massa wordt bepaald. Klopt dit??

Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

2

Principe

 Ionisatie  Scheiding van massa  Meten van de hoeveelheid ionen van elke specifieke massa/lading verhouding


Isala klinieken

3

Massa Spectrometer


Isala klinieken

4

Instrumentatie

Elke MS bestaat uit: 1. Monster inlet 2. Ionenbron 3. Massa Analyser 4. Detector 5. Data System


Isala klinieken

5

Eisen  Vacuum systeem  Het vacuum zorgt ervoor dat de geproduceerde ionen, zonder botsingen met andere gas-fase ionen. Als het vacuum niet toereikend is zal dit de gevoeligheid en resolutie beïnvloeden.


Isala klinieken

6

Ionisatie

 Productie van:  Positieve ionen  Negatieve ionen  (neutrale moleculen)


Isala klinieken

7

Ionisatie  Gas-fase  Electron Impact (EI)  Chemical Ionization (CI)

 Spray  Electrospray (ESI)  Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

 Desorptie  Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)  Fast Atom Bombardment (FAB)


Isala klinieken

8

Electrospray Ionisatie

 Fijne spray van geladen druppels.  Door evaporatie van de druppels, zal door coulombische repulsie de druppel “exploderen” totdat uiteindelijk een ion overblijft. Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

9

Electrospray Ionisatie

Voordelen

Nadelen

 Parent Ion

 Geen fragmentatie

 Hoge Massa range (<200’000Da)

 Polair monster

 Makkelijk te gebruiken

 Ion/signal supressie

 Gevoelig voor zouten

 Interface met HPLC  Hoge gevoeligheid met nano-spray Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

10

APCI


Isala klinieken

11

Massa Analyzers

 Massa analyzer is verantwoordelijk voor de scheiding van de ionen op basis van massa/lading verhouding.  Typen  Magnetische sector  Quadrupole  Time of flight  Ion trap  Tandem massa spectrometrie Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

12

Magnetische Sector  Ionen worden geextraheerd en versneld in de ionen bron met potentiaal V, 0.5 mv2 = zV.  Ionen komen in de vluchtbron en komen in het magnetisch veld H.  Alleen ionen met bepaalde massa/lading verhouding hebben een gelijke centrifugale and centripetal kracht en zullen door de vluchtbuis vliegen: mv2 / r = Hzv  m/z = H2r2/2V Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

13

Magnetische Sector


Isala klinieken

14

Quadrupole  Overstaande poles hebben gelijke polariteit. De naastliggende poles hebben tegengestelde polariteit.


Isala klinieken

15

Quadrupole  Over elke pole staat een RF en een DC-voltage.


Isala klinieken

16

Quadrupole  Alleen ionen met een bepaalde mass-to-charge ratio zal het juiste oscillerende pathway bezitten door de analyzer.


Isala klinieken

17

Quadrupole

Voordelen

Nadelen

 Goedkoop

 Lage accuracy (>100ppm)

 Makkelijk te koppelen met verschillende ionisatietechnieken

 MS/MS meerdere quads nodig  Relatief lage Massa Range (<4000Da)  Trage scanning


Isala klinieken

18

Time of Flight


Isala klinieken

19

Time of flight


Isala klinieken

20

Time of flight

Voordelen  Extreem Hoge Massa Range (>1 MDa)  Snelle scanner

Nadelen  Lage Resolutie  Lage nauwkeurigheid (>200ppm)


Isala klinieken

21

Ion-Trap


Isala klinieken

22

Tandem massa spectrometrie (MS-MS)

 Fragmentatie  De geselecteerde ion botst met een botsingsgas (argon of helium) wat resulteert in fragmentatie.


Isala klinieken

23

Tandem massa spectrometrie (MS-MS)


Isala klinieken

24

MS MS/MS MS/MS/MS…  MS:  Voornamelijk intacte masses zoals eiwitten en peptides.

 MS/MS:  Intacte component → fragmenteert in de mass spectrometer → massa’s van de fragmenten (daughter ions)

 MSn:  Continue isolatie van massa’s en fragmenten. Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

25

Daughter scan


Isala klinieken

26

Parent scan


Isala klinieken

27

Neutral loss


Isala klinieken

28

LC-MS


Isala klinieken

29

Waarom de koppeling tussen LC en MS?  De analyse van mengsel is moeilijk.

 Als de stoffen gescheiden zijn via LC (of een andere scheidingstechniek) is de herhaalbaarheid beter  Er kan signaal of ion suppressie plaatsvinden (ESI)  Analieten die in lage concentratie aanwezig zijn, kunnen mogelijk niet gedetecteerd worden. Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

30

Restrictions  Niet vluchtige zouten moeten worden aangezien deze ion suppressie veroorzaken.

vermeden,

 Sterke ion-pairing agents zoals TFA moeten in sommige gevallen vermeden worden.  Over het algemeen is ESI het best compatibel met polaire oplosmiddelen.  Additieven moet compatibel zijn met het ESI-proces. (bv. DMSO veroorzaakt problemen) Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

31

Welke LC kan gekoppeld worden met MS  Voornamelijk met reversed phase (i.e. C18, C8, C4)  Ion exchange (ion-wisseling)  Affiniteits chromatografie  2D chromatography (ion exchange gevolgd door reversed phase) Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

32

ESI condities  Flow rate: Over het algemeen is het ESI proces optimaal bij lage flow rates (2 - 200 µL/min)  pH van de loopvloeistoffen moeten laag genoeg zijn om de analieten te ioniseren. (Dit aangezien ESI een in-vloeistof ionisatie techniek is)  Matrix effecten: hoge concentraties van zouten kunnen ion suppressie veroorzaken.  Buffers: Vluchtige buffer hebben de voorkeur. Infrarood en Massa Spectrometrie Isala klinieken

33

Off-line LC-MS

 LC may also be coupled with MS by fraction collection (ion exchange, size exclusion chromatography)  Fractions may be analyzed by any compatible MS technique  Off-line automation


Isala klinieken

34

LC-MS  Groot scheidend vermogen waardoor complexe mengels kunnen worden geanalyseerd.  MS heeft een gevoeligheid.

hoge

nauwkeurigheid

 MS biedt additionele informatie molecuulmassa en structuurformule

en

over


Isala klinieken

35

Folium zuur en metabolieten in plasma


Isala klinieken

36

Eiwit analyse


Isala klinieken

37

Eiwit analyse


Isala klinieken

38

Eiwit analyse

 2 pieken, beide eiwit pieken met verschillende ladingen (n en (n+1)) (m/z)n = 1211.8 (m/z)n+1 = 1131.1 We weten dat: de piek n lading op het eiwit geeft dus we weten dat: (m/z)n= [M+Hn]/n en dat (m/z)n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

39

Eiwit analyse

(m/z)n= [M+Hn]/n en dat (m/z)n+1 = [M+H(n+1)]/(n+1) Mbv deze twee formules kunnen we n berekenen, nl; n = [(m/z)n+1 - H(1) ]/[( m/z)n - (m/z)n+1 ] Dus invullend, zien we dat; n = (1131.1 – 1)/1211.8-1131.1 = 14 (ladingen) en nu kunnen we de massa van het eiwit bepalen: Mw= n(m/z)n – nH = 14 * 1211.8 – 14*1 = 16951 Da Infrarood en Massa Spectrometrie

Isala klinieken

40

Eiwit analyse


Isala klinieken

41

Help!!! Graag een methode!


Isala klinieken

42

Moderne Instrumentele Analyse

Recommend Documents