Modern mikroszkópiai módszerek

Modern mikroszkópiai módszerek 2

2011 ‐ 2012

FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA

A mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcencia emisszióját képezzük le.

1

2

Bugyi Beáta - PTE ÁOK Biofizikai Intézet

FLUOROFÓROK

A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE – SZUPERREZOLÚCIÓS MÓDSZEREK a fluoreszcencia mikroszkópiában

BELSŐ (INTRINSIC) FLUORESZCENCIA klorofil KÜLSŐ (EXTRINSIC) FLUORESZCENCIA fluoreszcens molekulák

FEHÉRJE: zöld fluoreszcens fehérje (GFP) kémiai d = 2-10 nm, 100-100000 atom

KIS MOLEKULA kémiai d = 1 nm, 20 atom

antitest*

másodlagos antitest* elsődleges antitest

biomolekula antigén

KVANTUM GYÖNGY kémiai d = 2-10 nm, 100-100000 atom

biomolekula antigén

IMMUNOFLUORESZCENCIA - DIREKT, INDIREKT kémiai d = 2-10 nm, 100-100000 atom 3

FELBONTÓKÉPESSÉG – ABBE ELV – DIFFRAKCIÓS LIMIT

A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE #1: Z‐irányú felbontás

Ernst Abbe (1840-1905)

XY irányban – a minta síkjában

d x , y = 0.61

λ n sin α

Z irányban – optikai tengely mentén

dz =

emisszió

2λ (n sin α ) 2

μm

d: az a legkisebb távolság, amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen: DIFFRAKCIÓS LIMIT λ: a megvilágítás hullámhossza ω : objektív fél nyílásszöge (apertura szög) n: a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójától

felbontás

4

XY Z nm nm

hagyományos 230 1000 fénymikroszkópia

gerjesztés

HÁTTÉRFLUORESZCENCIA!!! jel/zaj arány ↓

Z IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA háttérfluoreszcencia kiküszöbölése KONFOKÁLIS TECHNIKA EVANESZCENS MEZŐ ALKALMAZÁSA 5

NA = 0.04 – 1.45 6

1


2011 ‐ 2012

Marvin Minsky 1961

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA

SZÉLESLÁTÓTERŰ MIKROSZKÓPIA

detektor

Marvin Minsky 1961



detektor

egy sík van fókuszban

APERTÚRA

egy sík van fókuszban ↓ APERTÚRA: térbeli szűrés

mégis az összes sík hozzájárul a képhez

egy sík járul hozzá a képhez az apertúra „kiszűri a többit”

APERTÚRA fókuszpontból fókuszponton kívüli fókuszponton kívüli

KONJUGÁLT SÍK KONJUGÁLT FOKALITÁS

objektív

objektív

minta fókuszsík

7


minta fókuszsík

apertúra mérete: 1 Airy egység Airy egység:Airy korong átmérője

8


HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA

KONFOKÁLIS

felbontás hagyományos konfokális

XY nm 230 180

Z nm 1000 500

9

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – 3D

10

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – 4D: 3D + idő

minta „felszeletelése” optikai szeletek tárgy ↓ sok 2D kép összefűzése ↓ 3D kép

pollen autofluoreszcencia

11

tengeri csillag petesejt meiozis kromoszómák aktin mikrotubulusok

12

2


2011 ‐ 2012

EVANESZCENS MEZŐ MIKROSZKÓPIA ‐ TIRFM


TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS optikailag sűrűbb közeg: 1 ↓ optikailag ritkább: 2

beesési szög(α ) < törési szög( β )

z I ( z ) = I 0 exp(− ) d

z β1 β2

sin α n2 = sin β n1 n2 < n1

EVANESZCENS (TOVATŰNŐ) MEZŐ EVANESZCENS MEZŐ

β3

α3

αkritikus

90ο

n1

n1

visszaverődés

αkritikus α2

I (z )

d

n2 n2

90ο

I I ( z) = 0 e

I0

d: behatolási mélység - független a beeső nyaláb polarizációjától - függ - a beeső nyaláb hullámhosszától (λ) - a közegek törésmutatójától (n1, n2) - beesési szögtől (α)

exponenciális lecsengés

α1

törés

TELJES BELSŐ VISSZAVERŐDÉS

Beesési α ↑

α := α kritikus → β = 90 o 13

EVANESZCENS MEZŐ MIKROSZKÓPIA ‐ TIRFM HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA

távolság z, nm

intenzitás %-ban

0

100

1

99

10

92

100

43

1000

0

14


TIRFM

felbontás hagyományos TIRFM

B16/F1 melanoma sejtek (EGÉR) – Multi-color TIRF Green: EGFP-Miozin. Excitation 488 nm, Red: mRFP-Aktin. Excitation 514 nm

XY nm 230 230

Z nm 1000 100

15


16


AKTIN

μm

nm

17

aktin formin

18

3


2011 ‐ 2012

A FELBONTÓKÉPESSÉG NÖVELÉSE #2: XY‐irányú felbontás

EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE ‐ STED FLUORESZCENCIA EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE

ABBE ELV – DIFFRAKCIÓS LIMIT XY irányban – a minta síkjában

d x , y = 0.61

λ

gerjesztés Æ gerjesztett állapot - fluoreszcencia

n sin α

nem lineáris le-gerjesztés Æ alapállapot - nonfluoreszcens

XY IRÁNYÚ FELBONTÁS JAVÍTÁSA FIZIKAI MÓDON STED MATEMATIKAI MÓDON dekonvolúció

maradék fluoreszcencia NA = 0.04 – 1.45 19

EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE ‐ STED fázislemez

gerjesztés

20

EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE ‐ STED HAGYOMÁNYOS FLUORESZCENCIA

gyengítés

STED

gyengítő lézer STED lézer

red shift

gerjesztő lézer

dikroikus tükrök

objektív

minta 21

AKTIN FILAMENTUMOK

22

SPECIÁLIS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK

EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE ‐ STED

FRET Förster rezonancia energia transzfer FRAP Fluoreszcencia visszatérése kioltás után

XY Z nm nm hagyományos 230 1000 STED 16 - 20 50 felbontás

FLIM – FADIM Fluoreszcencia élettartam / anizotrópia lecsengés mikroszkópia

23

24

4


2011 ‐ 2012

SPECIÁLIS FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK TÁRGY-PONT

FRET – FÖRSTER REZONANCIA ENERGIA TRANSZFER Theodor Förster 1967 Fernandez és Berlin 1976

„HAGYOMÁNYOS” fluoreszcencia mikroszkópia PIXEL = FLUORESCENE INTENSITY Æ intenzitás térkép

AKCEPTOR

FRET PIXEL = TRANSZFER HATÁSFOK Æhatásfok térkép KÉP-PONT: PIXEL

energia transzfer hatásfoka DONOR

E=

1 ⎛ r ⎞ 1 + ⎜⎜ ⎟⎟ ⎝ R0 ⎠

6

≈

1 (távolság ) 6

AKCEPTOR DONOR

FLIM PIXEL = FLUORESZCENCIA ÉLETTARTAM Æ élettartam térkép FADIM PIXEL = FLUORESZCENCIA ANIZOTRÓPIA Æanizotrópia térkép

távol NINCS FRET donor intenzitás =

25

FRET – FÖRSTER REZONANCIA ENERGIA TRANSZFER

közel (1-10 nm) VAN FRET donor intenzitás ↓

26

FRAP – FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN W. Bähr 1974

BIOMOLEKULÁK - KÖZÖTTI KÖLCSÖNHATÁSOK - ELOSZLÁSA

INTENZÍV LÉZERIMPULZUS ↓ fluoreszcencia kioltás előtte

LIPID RAFTOK LÉTEZÉSE

utána

DIFFÚZIÓ

visszatérés

Rajat Varma & Satyajit Mayor Nature 1998

kioltás

CHO: kínai hörcsög petesejt membrán: PLF GPI (glikosilfoszfatidilinositol) kötő fehérjék

mobilis fluoreszcens molekulák

nem-fluoreszcens molekulák

fluoreszcens molekulák nem-fluoreszcens molekulák 50% immobilis

FRET idő (t)

27

FRAP – FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN

28

FRAP – FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN fluoreszcencia kioltás fluoreszcencia visszatérése

LAMELLIPODIUM DINAMIKÁJA

B16-F1 sejt EGFP-aktin

visszatérés

Fluoreszcencia intenzitás

Lai és mtsai EMBO Journal 2008

visszatérés

kioltás

kioltás mobilis

50%

idő (t)

mobilis

50%

immobilis

immobilis

idő 29

30

5


2011 ‐ 2012

FRAP – FLUORESZCENCIA VISSZATÉRÉS KIOLTÁS UTÁN

FOTOAKTIVÁLHATÓ FLUORESZCENS FEHÉRJÉK

BIOMOLEKULÁK MOZGÁSA

kinetikai analízis visszatérés

fluoreszcencia intenzitás

fluoreszcencia intenzitás visszatérésének sebessége mennyisége

kioltás mobilis

50%

immobilis

idő (t) idő (t)

31

TOVÁBBI KÉPALKOTÁSI ELJÁRÁSOK

B16-F1 sejt mRFP-aktin fotoaktiválható GFP-aktin

32

TOVÁBBI KÉPALKOTÁSI ELJÁRÁSOK

A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY)

A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA OPTIKAI (FÉNY)

ELEKTRON

PÁSZTÁZÓSZONDÁS

ELEKTRON

megvilágítás: látható fény lencsék: üveg jel: fény Abbe elv: IGEN

„megvilágítás”: mikroszkópikus próba jel: a minta és a próba közötti kölcsönhatás Abbe elv: NEM

Fáziskontraszt mikroszkópia Sztereomikroszkópia Fluoreszcencia mikroszkópia

Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

Pásztázó elektronmikroszkópia (SEM)

33

ELEKTRONMIKROSZKÓPIA ‐ EM

34


Ernst Russka (1931) OPTIKAI - FÉNY

EM

képalkotás

fénynyaláb

elektronnyaláb

hullámhossztartomány nm

400 – 600

0.004 – 0.006

felbontás nm

200

0.2

2000 x

2.000.000 x (50.000.000 x)

nagyítás

PÁSZTÁZÓSZONDÁS

„megvilágítás”: elektron nyaláb lencsék: elektromágnes jel: elektron Abbe elv: IGEN

PÁSZTÁZÓ TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM)

NA = 0.04 – 1.45 35

NA = 0.04 – 1.45 36

6


2011 ‐ 2012


ELEKTRONMIKROSZKÓPIA ‐ EM TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) szívizom

TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM) áteresztett e-

PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) trachea epithelium

PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM) visszafelé szórt eÆ rendszámbeli különbségek, nehézatomok másodlagos eÆ felület topográfiája Auger ekarakterisztikus rtg sugárzás spektruma Æ felület kémiai összetétele

NA = 0.04 – 1.45

NA = 0.04 – 1.45

37


38

KIEGÉSZÍTÉS – FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA

NA = 0.04 – 1.45 39

MIKROSZKÓP LEGFONTOSABB KOMPONENSEI

FÉNYFORRÁS ‐ GERJESZTÉS LÁMPA hullámhossztartomány

KÉP SZEM

xenon ív lámpa

FÉNYFORRÁS GERJESZTÉS

TÁRGY MINTA

LÉZER, LED adott hullámhossz

higanygőz lámpa

OKULÁR KÉP DETEKTOR OBJEKTÍV

SZŰRŐK

TÜKRÖK

41

42

7


2011 ‐ 2012

SZŰRŐK ‐ A MEGFELELŐ HULLÁMHOSSZ KIVÁLASZTÁSA

SÁV

FELÜLÁTENGEDŐ

TRANSZMITTANCIA (%)

ALULÁTENGEDŐ

DIKROIKUS TÜKÖR ‐ NYALÁBOSZTÓ

VISSZAVER

HULLÁMHOSSZ (nm)

ÁTENGED

43

44

OBJEKTÍV

nagyítás

GERJESZTÉS

emissziós szűrő

EMISSZIÓ

szűrő kocka dikroikus tükör

fedőlemez

gerjesztési szűrő

tárgylemez 45

típus immerzió típusa immerzió típusa NA fedőlemez típusa nagyítás színkód munka távolság 46

8

Modern mikroszkópiai módszerek

Recommend Documents