Modern mikroszkópiai módszerek

Modern mikroszkópiai módszerek 1

2011 ‐ 2012

MIKROSZKÓPIA AZ ORVOS‐GYÓGYSZERÉSZ GYAKORLATBAN - DIAGOSZTIKA - TERÁPIA például: szemészet nőgyógyászat szövettan bakteriológia patológia gyógyszerek fejlesztése, tesztelése …

Modern mikroszkópiai módszerek

1

Bugyi Beáta - PTE ÁOK Biofizikai Intézet

A mikroszkópia segítségével láthatóvá tehetjük az élő rendszerek különböző szerveződési szintjeit: szervektől (cm 10-2m) egyedi molekulákig (nm 10-9m). 7Modern mikroszkópiai módszerek nagyságrend!! 2

TEMATIKA 1. A mikroszkópiáról általában 2. A mikroszkópiai módszerek csoportosítása 3. A mikroszkóp képalkotásának általános elvei 4. Fénymikroszkópia fáziskontraszt mikroszkópia sztereomikroszkópia fluoreszcencia mikroszkópia konfokális evaneszcens mező: TIRFM emisszió stimulált gyengítése: STED Förster rezonancia energia transzfer: FRET

5. Elektronmikroszkópia 6. Pásztázószondás mikroszkópia


3


MI AZ AMIT TUDNUNK KELL, HOGY MEGÉRTSÜK

HISZEM, HA LÁTOM

1.

Az emberi szem felbontásának hullámoptikai határa függ: hullámhossztól: λ pupillaátmérőtől: d

GEOMETRIKAI OPTIKA

fény törés, visszaverődés lencsék képalkotása fókusz lencsehibák: színi hiba (kromatikus aberráció) gömbi hiba (szférikus aberráció) asztigmatizmus

4

ha λ = 800 nm, d = 2 mm Æ1.68’ szögperc ha λ = 400 nm, d = 2 mm Æ 0.8’ szögperc

!

2. HULLÁMOPTIKA elhajlás (diffrakció) polarizáció lézer

3. FLUORESZCENCIA élettartam anizotrópia kioltás FRET

?

4. LÁTÁS Modern mikroszkópiai módszerek

5


6

1


2011 ‐ 2012

A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA

MIKROSZKÓPIA ‐ MIKROSZKÓP

Képalkotás: TÁRGY Æ KÉP HOGYAN?

az emberi szem számára láthatatlan, apró vizsgálati objektumok, tárgyak megjelenítése

MIKROSZKÓPIA

MIKRO SZKÓPIA MIKRON = kicsi

OPTIKAI (FÉNY) Minta leképezése: fény Lencsék: üveg Jel: fény

SZKOPEIN = nézni 7

A MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK CSOPORTOSÍTÁSA

OPTIKAI (FÉNY)

ELEKTRON

Fluoreszcencia mikroszkópia

Transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM)

10 μm


Atomerő mikroszkópia (AFM ) Közeli mező optikai mikroszkópia (NSOM) Alagútelektron-mikroszkópia (STM) Elektrosztatikus mikroszkópia Mágneses erőmikroszkópia Pásztázó elektronmikroszkópia


8

MIKROSZKÓPIA – TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS

PÁSZTÁZÓSZONDÁS

1 μm

PÁSZTÁZÓSZONDÁS

Minta leképezése: elektronsugár Minta leképezése: mikroszkopikus szonda Lencsék: elektromágnes Jel: a minta és a szonda között fellépő Jel: elektron kölcsönhatás

Fáziskontraszt mikroszkópia Fluoreszcencia mikroszkópia Polarizációs mikroszkópia Sztereomikroszkópia Ultramikroszkópia Ultraibolya mikroszkópia

+


ELEKTRON

Atomerő mikroszkópia (AFM)

~ 1000

Abbas Ibn Firnas (Cordóba)

homokÆüveg „olvasó kő” félgömb alakú lencse

~ 1284

Salvino D'Armate (olasz)

első szemüveg

1590

Zaccharias testvérek (holland)

összetett lencserendszer

1665

Robert Hook (angol)

mikroszkóp fejlesztés, megvilágítás

1674

Anton van Leeuwenhoek

csiszolt lencsék, 270x nagyítás

1830

Joseph Jackson Lister

lencsehibák korrekciója kombinációjával

1872

Ernst Abbe

Abbe Sine Condition felbontási határ

1893

August Köhler

Köhler megvilágítás

1903

Richard Zsigmondy Kémiai Nobel Díj 1925

ultramikroszkóp

1932

Frits Zernike Fizikai Nobel Díj 1953

fázis-kontraszt mikroszkóp

1931

Ernst Ruska Fizikai Nobel Díj 1986

elektron mikroszkóp

1981

Gerd Binnig, Heinrich Rohrer Fizikai Nobel Díj 1986

alagútelektron-mikroszkópia (STM) felbontás: XY: 0.1 nm Z: 0.01 nm

1994

Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Y. Tsien GFP: zöld fluoreszcens fehérje Modern mikroszkópiai módszerek Kémiai Nobel Díj 2008

10 μm

9

MIKROSZKÓPIA ‐ MÉRFÖLDKÖVEK http://www.nature.com/milestones/milelight/timeline.html

lencsék

10

OPTIKAI – FÉNY MIKROSZKÓPIA

A képalkotáshoz látható fényt (λ = 400 – 700 nm) és üvegből készült lencséket használ.

NA = 0.04 – 1.45 Modern mikroszkópiai módszerek

11


12

2


2011 ‐ 2012

AZ EGYSZERŰ NAGYÍTÓ – LUPE – 1 GYŰJTŐLENCSE

AZ EGYSZERŰ MIKROSZKÓP – 2 GYŰJTŐLENCSE

retina szem

TÁRGY

retina szem

k

KÉP 1: objektív

GYŰJTŐLENCSE TÁRGY fókuszponton belül

↓ objektív

OKULÁR - szemlencse

t

F

valódi, nagyított, fordított állású

↓ okulár

F f

KÉP1

OBJEKTÍV - tárgylencse TÁRGY

f

KÉP2 látszólagos, nagyított, egyenes állású

TÁRGY KÉP látszólagos egyenes állású Modern mikroszkópiai módszerek nagyított

↓ objektív + okulár KÉP 2: okulár

látszólagos, nagyított, fordított állású

13

A MODERN MIKROSZKÓP

KÉP


14

A MODERN MIKROSZKÓP ÁTESŐFÉNY transzmissziós MINTA

INVERTÁLT epi

FÉNYFORRÁS

MINTA

FÉNYFORRÁS OKULÁR 2db binokulár

KÉP

TÁRGY

FÉNYFORRÁS KÉP OBJEKTÍV 1db


15

KÉPALKOTÁS – TÁRGYÆ KÉP : FOTON Æ DIGITÁLIS JEL

DETEKTOR

DETEKTOR


16

A KÉPALKOTÁS LEGFŐBB KÖVETELMÉNYEI Képalkotás: TÁRGY Æ KÉP KÖVETELMÉNYEK

TÁRGY-PONT

NAGYÍTÁS elég nagy legyen

FELBONTÁS minden érdekes részlet láthatóvá váljon

KONTRASZT

KÉP-”PONT”: PIXEL

minden érdekes részlet jól elkülönüljön a környezetétől

INTENZITÁS TÉRKÉP Modern mikroszkópiai módszerek

17


18

3


2011 ‐ 2012

NAGYÍTÁS

FELBONTÓKÉPESSÉG hányszor nagyobb a kép, mint a tárgy

FELBONTÓKÉPESSÉG az a legkisebb távolság (d), amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen

OBJEKTÍV: Nobjektív = 1 – 150 OKULÁR: Nokulár = 5 – 30 MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA Nmikroszkóp = Nobjektív x Nokulár Modern mikroszkópiai módszerek

19

FELBONTÓKÉPESSÉG – DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS)

20

FELBONTÓKÉPESSÉG – DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS)

Milyen kicsi dolgokat láthatunk? KÉP


0 rend

0 - 1 rend

0 - 2 rend

0 - 4 rend

DESTRUKTÍV -2 -1

0 +1

kioltás - sötét

+2

kép INTERFERENCIA

KONSTRUKTÍV erősítés - világos objektív

elhajlási irány optikai rács

TÁRGY

fényáteresztő képesség periodikusan változik

ELHAJLÁS DIFFRAKCIÓ

tökéletes kép Æ összes elhajlási rend (nem teljesíthető)

tárgy OPTIKAI RÁCS

kondenzor


fényrekesz

21

FELBONTÓKÉPESSÉG – AIRY KORONG

Minél magasabb rendben elhajlott sugarak vesznek részt a leképezésben annál részletgazdagabb képet kapunk. ↓ ABBE ELV – DIFFRAKCIÓS LIMIT Modern mikroszkópiai módszerek 22

FELBONTÓKÉPESSÉG – AIRY KORONG

George Biddel Airy (1801-1892)

Egyetlen tárgypontról képpontok helyett koncentrikus körök formájában megjelenő erősítési és kioltási helyek sorozata alakul ki Æ elhajlási kép egyetlen tárgypont elhajlási képe: AIRY KORONG

TÁRGY

d

KÉP erősítés

kioltás

3 2

1

kép”pont„ 1

0


23

kép”pont„ 2

felbontott

nem felbontott

Az egyik maximuma éppen a másik első minimumába esik. 24 Modern mikroszkópiai módszerek

4


2011 ‐ 2012

FELBONTÓKÉPESSÉG – ABBE ELV – DIFFRAKCIÓS LIMIT

FELBONTÓKÉPESSÉG ‐ FÉNYMIKROSZKÓP

Ernst Abbe (1840-1905)

XY irányban – a minta síkjában

d x , y = 0.61

Z irányban – optikai tengely mentén

λ

dz =

n sin α

2λ (n sin α ) 2

XY irányban – a minta síkjában

Z irányban – optikai tengely mentén

230 nm

1000 nm

d: az a legkisebb távolság, amelyre lévő két pont (tárgypont) képe még megkülönböztethető egymástól a képen λ: a megvilágítás hullámhossza ω : objektív fél nyílásszöge (apertura szög) n: a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójától 1/d: feloldóképesség

Jobb a mikroszkóp felbontása, ha d kicsi, vagyis 1/d nagy. Modern mikroszkópiai módszerek

25

FELBONTÓKÉPESSÉG ‐ HULLÁMHOSSZ Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi)


26

FELBONTÓKÉPESSÉG ‐ TÖRÉSMUTATÓ d x , y = 0.61

Hogyan?

λ n sin α

λ ↓: a megvilágítás hullámhosszának csökkentése

Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi)

d x , y = 0.61

Hogyan?

λ n sin α

n ↑ : a minta és az objektív közötti közeg törésmutatójának növelése immerziós közeg alkalmazása (nagy törésmutató)

HULLÁMHOSSZ nm

FELBONTÓKÉPESSÉG - XY FELBONTÓKÉPESSÉG - Z nm nm

360

156

367

400

174

408

450

196

459

immerziós közeg

törésmutató n

500

217

510

levegő

1.0002

550

239

561

olaj

1.5

600

261

612

glicerin

1.4695

283

663

víz

1.3333

650 700

305 Modern mikroszkópiai módszerek

714

27

FELBONTÓKÉPESSÉG – APERTURA SZÖG Cél: a felbontóképesség növelése (d kicsi) Hogyan?


28

FELBONTÓKÉPESSÉG – NUMERIKUS APERTÚRA: NA d x , y = 0.61

λ n sin α

α ↑: objektív fél nyílásszögének (apertúra szög) növelése

az optikai lencserendszerek fénygyűjtő képességének egység nélküli mérőszáma az objektív mekkora szögben (α) képes begyűjteni az egy tárgypontból érkező sugarakat

NA = n sin α


29


30

5


2011 ‐ 2012

KONTRASZT

KONTRASZT – ÁTESŐFÉNY (TRANSZMISSZIÓS) MIKROSZKÓPIA

A tárgynak a leképezés szerinti inhomogenitását erősítjük fel ÆKONTRASZT

(a) világos látóterű

A tárgynak azt a tulajdonságát használjuk ki, ami megkülönbözteti a környezetétől.

(b) differenciális interferencia kontraszt (DIC) vastagság, alak, törésmutató

Például:

(c) fázis-kontraszt vastagság, alak, törésmutató

OPTIKAI INHOMOGENITÁS miatt fényelnyelés törésmutató alak szín a tárgyon áthaladó FÉNYSUGARAK SAJÁTSÁGAI MEGVÁLTOZHATNAK irány sebesség fázis hullámhossz… NA = 0.04 – 1.45 Modern mikroszkópiai módszerek

(d) Hoffman modulációs kontraszt (HMC) vastagság, alak, törésmutató (e) ultramikroszkópia - sötétlátóterű kis fényszóró objektumok (f) polarizációs kettősen törő anyagok NA = 0.04 – 1.45

31

KONTRASZT – FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA


32

FÁZIS‐KONTRASZT MIKROSZKÓPIA Frits Zernike (1888-1966)

(a) vékony minta

TÁRGY INHOMOGENITÁSA Æ FÁZISBELI KÜLÖNBSÉGEK Æ INTENZITÁSBELI KÜLÖNBSÉGEK

(b) vastag minta

HOMOGÉN KÉP

(c) DIC + FLUO (d) HMC + FLUO (e) fázis kontraszt + FLUO (f) többszínű fluoreszcencia

KONTRASZTOS KÉP


33

FÁZIS‐KONTRASZT MIKROSZKÓPIA


SZTEREOMIKROSZKÓPIA – 3D KÉP Listeria monocytogenes

sejtmozgás

két mikroszkóptubus 14o 2 objektív + 2 okulár NE KEVERJÜK BINOKULÁRRAL!!!

14o

modell rendszer


34

emberi glia agysejtek egyrétegű kultúrában

35

ÖSSZE

A

tárgy ↓ két 2D kép (bal - jobb) ↓ egy 3D kép Alkalmazás mikrosebészet


36

6

Modern mikroszkópiai módszerek

Recommend Documents