Ing. Jitka Stará, Ph.D. doc. RNDr. Ing. František Kocourek, CSc.
Metodika hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům a návrhy antirezistentních strategií
METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2007
Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. 0002700603. Oponenti: Ing. Jana Ouředníčková, VŠÚO Holovousy Ing. Miroslav Lánský, VŠÚO Holovousy Metodika je určena pro orgány státní správy, poradenské privátní firmy a Ovocnářskou unii Čech a Moravy. Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe, odd. NAZV pod č.j. 696/2008-17220. Ministerstvo doporučuje tuto metodiku pro využití orgány státní správy. O uplatnění metodiky byla 27.11.2007 uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku.
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-30-0 2
Autoři: Ing. Jitka Stará, Ph.D., doc. RNDr. Ing. František Kocourek, CSc. Název: Metodika hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům a návrhy antirezistentních strategií Vydal: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Redakce: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 10 CD Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora:
[email protected] Autoři fotografií: Ing. Jitka Stará, Ph.D. Ing. Tereza Zichová Ing. Vladan Falta, Ph.D. © Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-30-0
3
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
4
Jitka Stará & František Kocourek
Metodika hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům a návrhy antirezistentních strategií
METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
5
Metodika hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům a návrhy antirezistentních strategií Předkládaná metodika pro hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům zahrnuje takové metodické přístupy, které umožňují rezistenci prokázat co nejspolehlivěji s ohledem na mechanismus působení insekticidu a na cílové vývojové stádium. Metodika je využitelná pro potřeby orgánů státní správy při provádění monitoringu rezistentních populací škůdců k zoocidům a pro účely postregistrační kontroly vyplývající ze zákona č. 326/2004 Sb., o rostlinolékařské péči a o změně některých souvisejících zákonů, ve znění zákona č. 131/2006 Sb. Metodika zahrnuje hodnocení rezistence obaleče jak k přípravkům s ovicidním, tak s larvicidním účinkem. Součástí předkládané metodiky je návrh opatření pro zabránění nebo zpomalení nástupu rezistence (tzv. antirezistentní strategie). Methodology of evaluation of codling moth resistance to insecticides and antiresistant strategy The methodology of evaluation of codling moth resistance to insecticides includes such approaches, that enable to detect resistance reliably with respect to mode of action of insecticide and target developmental stage of pest. The methodology is usable for state administration bodies at monitoring of pest resistance to insecticides and for purposes of post registration control based on low No. 326/2004 Sb., in version low No. 131/2006 Sb. The methodology includes evaluation of codling moth resistance to insecticides with ovicidal as well as larvicidal mode of action. The methodology includes also proposal of antiresistant strategies to prevent or slow-down development of resistance.
6
Obsah: 1. Úvod ................................................................................................................................... 8 1.1. Charakteristika rezistence .......................................................................................... 8 1.2. Rezistence obaleče jablečného k insekticidům ve světě ............................................ 8 1.3. Metody hodnocení rezistence.......................................................................................... 8 2. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) insekticidů........................................ 9 2.1. Laboratorní chov obaleče jablečného............................................................................ 11 2.2. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) přípravků s ovicidním účinkem .............................................................................................................................................. 12 2.3. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) přípravků s larvicidním účinkem .............................................................................................................................................. 13 2.3.1. Testy na housenkách L1......................................................................................... 13 2.3.2. Topikální aplikace na housenky L5 ....................................................................... 13 2.4. Ukázka výsledků stanovení LC50 a LC90 přípravků s ovicidním účinkem................. 14 3. Testování rezistence polních populací obaleče jablečného.................................................. 15 3.1. Testování rezistence k přípravkům s ovicidním účinkem............................................. 15 3.2. Testování rezistence k přípravkům s larvicidním účinkem........................................... 16 3.3. Výpočet koeficientu rezistence (resistance ratio).......................................................... 18 4. Ukázka výsledků hodnocení rezistence obaleče jablečného ................................................ 18 4.1. Vyhodnocení citlivosti a stupně rezistence polních populací obaleče jablečného k vybraným insekticidům ..................................................................................................... 18 5. Doporučení pro provádění monitoringu rezistence orgány státní správy nebo akreditovanými laboratořemi ................................................................................................... 20 6. Návrhy na antirezistentní strategie....................................................................................... 21 7. Použitá literatura: ................................................................................................................. 22
7
1. Úvod 1.1.
Charakteristika rezistence
Rezistence škůdců k zoocidům je přirozeně se vyskytující dědičně podmíněná schopnost jedinců v populaci škůdců přežít ošetření insekticidem, který by měl za normálních podmínek poskytnout účinnou ochranu zemědělské plodiny. Rezistence k insekticidům je tedy schopnost hmyzu účinnou látku insekticidu tolerovat, detoxikovat nebo obejít, či kompenzovat její účinky. Rezistentní jedinci k jedné účinné látce se buď ve velmi malé frekvenci přirozeně vyskytují v populacích, nebo rezistence vzniká mutací genů, nebo následkem rekombinací genů. Je-li populace po několik generací vystavena selekčnímu tlaku, tj. působení jedné účinné látky některého insekticidu, dříve nebo později se v populaci objeví část jedinců se zvýšenou odolností. Pokračuje-li dále selekční tlak insekticidu, může rezistenci vykazovat celá populace. Rezistence se může vyskytovat současně ke dvěma účinným látkám s různým mechanismem účinku (cross-rezistence) nebo k více účinným látkám (multiplerezistence). Výsledkem dlouhodobé aplikace stejného typu účinných látek je snížená účinnost používaných přípravků a ztráty na produkci, případně zvýšené náklady na ochranu při opakovaných aplikacích přípravků. Problémem je vysoká proměnlivost lokálních populací v citlivosti k insekticidu, a to jak v populacích z jednoho regionu, tak v populacích z rozdílných geografických oblastí. Proto je nezbytné monitoring rezistence k insekticidům pravidelně provádět ve všech regionech.
1.2.
Rezistence obaleče jablečného k insekticidům ve světě
V řadě evropských zemí a v USA byla zjištěna rezistence u obaleče jablečného k širokému spektru přípravků, zahrnujících vedle organofosfátů, pyretroidů a karbamátů i inhibitory syntézy chitinu a juvenoidy. V roce 1991 byla zaznamenána v Kalifornii rezistence obaleče jablečného k azinphosmethylu (Welter et al., 1991). Rezistence k azinphosmethylu byla také zjištěna v roce 1993 v Itálii a o rok později v Jižní Africe (Blomefield, 1994). V Itálii byla zjištěna rezistence také k diflubenzuronu a dalším účinným látkám, jako je indoxacarb a tebufenozid (Waldner, 1993). V roce 1996 se rezistence obaleče jablečného k diflubenzuronu vyskytla také ve Švýcarsku a byla potvrzena rovněž rezistence k tebufenozidu, fenoxycarbu, deltamethrinu a phosalonu (Charmillot et Pasquier, 2002). Sauphanor et al. (1998) potvrzují nárůst rezistence obaleče k diflubenzuronu, deltametrinu a phosalonu ve Francii. Cross-rezistence byla zaznamenána i vůči dalším účinným látkám, jako je teflubenzuron, tebufenozid, bifenthrin a lambda-cyhalothrin. V České republice nebyla vzhledem k relativně nízké intenzitě chemické ochrany rezistence k insekticidům tak závažným problémem, jako například v USA a v zemích západní Evropy. V posledních letech však přibývají v ČR zprávy o snížené účinnosti některých insekticidů proti obaleči jablečnému, což působí pěstitelům ztráty.
1.3. Metody hodnocení rezistence Problematika rezistence škůdců k insekticidům byla výzkumně intenzivně řešena ve světě i v ČR od 60. letech. V počátečním období byly vypracovány a standardizovány postupy a metody hodnocení rezistence k účinným látkám insekticidů s kontaktním účinkem. Dříve se předpokládalo a bylo pro řadu škůdců prokázáno, že po přerušení selekčního tlaku (vyřazení rizikového insekticidu z režimu ochrany) se relativně rychle během několika generací navrací citlivost populace škůdce k této účinné látce. Nově bylo prokázáno, že u některých škůdců a 8
určitých typů insekticidů se rezistence v populaci uchovává u části jedinců po dlouhé období. U obaleče jablečného může například přetrvávat rezistence ještě u 20% populace po 7 letech bez ošetření (Sauphanor et al., 2002). Dalším důvodem pro oživení výzkumu této problematiky je, že rezistence k novým typům účinných látek (inhibitory tvorby chitinu, juvenoidy, antifeedanty, atd.) se v polních podmínkách obtížně prokazuje a že standardní metodiky pro hodnocení rezistence vyvinuté pro klasické insekticidy se v řadě případů nedají použít. Například metodika FAO (Anonymus, 1974) pro hodnocení rezistence obaleče jablečného k insekticidům je založena na testech s dospělci a nelze ji použít pro hodnocení účinnosti insekticidů s požerovými účinky. Přitom metody pro hodnocení rezistence inhibitorů tvorby chitinu a juvenoidů na housenky obaleče jablečného nejsou dosud standardizovány (Sauphanor et al., 2000, Charmillot et Pasquier, 2002), obdobně jako metoda pro hodnocení rezistence vůči insekticidům s ovicidními účinky. Proto byly v rámci řešení projektu MZe ČR č. 0002700603 vyvinuty nové metody hodnocení rezistence, které umožňují zjistit rezistenci obaleče jablečného k přípravkům s ovicidním i larvicidním účinkem. Na základě použití těchto metod byla již prokázána rezistence v populaci obaleče jablečného z jižní Moravy k phosalonu, teflubenzuronu a fenoxycarbu (Stará a Kocourek, 2007).
2. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) insekticidů Pro testování rezistence obaleče jablečného k insekticidům je nezbytné nejprve stanovit diskriminační koncentrace (LC90) insekticidů při aplikaci na vajíčka, housenky L1 a housenky L5 obaleče jablečného z citlivého laboratorního chovu. Stanovení LC50 a LC90 testovaných přípravků, tj. koncentrací způsobujících po aplikaci na cílové stádium mortalitu 50% resp. 90% jedinců, se zjišťuje na základě závislosti mortality testovaného stádia obaleče na koncentraci insekticidu. Jako výchozí koncentrace pro další ředění se volí koncentrace doporučená proti obaleči jablečnému podle Seznamu registrovaných přípravků a evidovaných prostředků na ochranu rostlin, vydávaného každoročně SRS. Pokud je v seznamu uvedena dávka insekticidu na 1ha, provede se přepočet na koncentraci podle množství vody na 1ha, v případě jádrovin tedy obvykle na 400 l/ha. Pro výpočet dalších nižších koncentrací pro testy se používá faktor x*(1/√2), případně x*(½/√2), kde x je % výchozí koncentrace v desetinné formě (Anonymus, 1974). Výpočet vyšších koncentrací se obdobně provádí podle vzorce x + [x*(1/√2)] nebo x + [x*(½/√2)]. Po zjištění mortality v závislosti na koncentraci insekticidu se provádí korekce na mortalitu v kontrolní neošetřené variantě podle Abbotta (1925), tj. A = [(P-C)/(100-C)]*100, kde A je výsledná mortalita v ošetřené variantě po korekci, P je mortalita v ošetřené variantě před korekcí a C je mortalita v kontrolní neošetřené variantě. Podmínkou věrohodnosti výsledku je mortalita v kontrole nepřesahující 20%. Nejnižší počet testovaných koncentrací je 4, přičemž alespoň 1 koncentrace musí způsobit mortalitu pod 50% (po korekci podle Abbotta). Platí, že čím více je testovaných koncentrací, tím přesnější bude výsledek výpočtu LC50 a LC90. Stanovení LC50 a LC90 koncentrací se provede z rovnice probitové tranformace, která umožňuje zjistit vztah mezi dávkou insekticidu (log ppm) a mortalitou testovaného stádia obaleče (probit). Základní data pro probitovou transformaci tedy obsahují koncentraci insekticidu vyjádřenou v ppm a tomu odpovídající mortalitu vyjádřenou v probitech. Příklad výpočtu koncentrací pro testy: Insekticid Zolone 35 EC…………………..1. výchozí koncentrace x = 0,2% výpočet nižších koncentrací ……………… 2. 0,2*(1/√2) = 0,14% 3. 0,14*(1/√2) = 0,1% výpočet vyšších koncentrací……………… 4. 0,2 + [0,2*(1/√2)] = 0,34% 5. 0,34 + [0,34*(1/√2)] = 0,58%
9
Příklad výpočtu korekce mortality: koncentrace Mortalita (%) insekticidu (%) Neošetřovaná 10 kontrola 0,05 25,9 0,1 41,5 0,2 81,0 0,34 91 0,58 99,9
Mortalita po korekci podle Abbotta (%) 17,7 35 78,9 90 99,9
Příklad probitové transformace: Koncentrace Koncentrace Mortalita po insekticidu insekticidu korekci podle (%) (ppm) Abbotta (%) 0,0175 175 17,7 0,035 350 35 0,07 700 78,9 0,119 1190 90 0,203 2030 99,9
log ppm 2,24304 2,54407 2,84510 3,07555 3,30750
probit 4,069283 4,614680 5,802956 6,281552 8,090232
Tabulka hodnot testovaných koncentrací vyjádřených v log ppm a odpovídající mortality (podle Abbotta) vyjádřené v probitech představuje základní datový soubor, který je dále analyzován ve statistickém programu (např. STATISTICA). Z rovnice přímky, která vyjadřuje závislost mezi koncentrací insekticidu v log ppm a mortalitou obaleče v probitech, se vypočítá log LC50 (dosazením probitu 5) a log LC90 (dosazením probitu 6,28) do rovnice. Odlogaritmováním se získají výsledné hodnoty koncentrací LC50 a LC90 vyjádřené v ppm. Příklad zpracování základního datového souboru pro fenoxycarb v programu STATISTICA: Fenoxycarb - vajíčka laboratorní populace probit = 4.1683 + 1.2345*log ppm 6.6 6.4 6.2 6.0 5.8
probit
5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
log ppm
10
Výpočet LC50 a LC90 pro fenoxycarb (Insegar 25 WP) na vajíčka z laboratorního chovu z rovnice: probit = 4,1683 + 1,2345*log ppm LC50: 5 = 4,1683 + 1,2345*log ppm log ppm = (5 – 4,1683)/1,2345 log ppm = 0,67 ppm = 4,72 LC90: 6,28 = 4,1683 + 1,2345*log ppm log ppm = (6,28 – 4,1683)/1,2345 log ppm = 1,71 ppm = 51,51
2.1. Laboratorní chov obaleče jablečného Dlouhodobě udržovaný laboratorní chov obaleče jablečného slouží jako citlivá populace pro stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) testovaných přípravků. Ve Výzkumném ústavu rostlinné výroby, v. v. i. je laboratorní kmen obaleče jablečného chován od roku 1992. Tento chov obaleče pochází z masového chovu v Sant Petersburgu (Vsesajuznyj institut zascity rastenij, Rusko), kde byl založen z přírodní populace obaleče jablečného na Krymu. Spolu s metodikou odchovu bylo převzato i složení semisyntetické diety pro chov (Tabulka 1, Obrázek 1-3). Tabulka 1: Složení semisyntetické diety pro laboratorní chov obaleče jablečného Ingredience Agar Ječné klíčky Pšeničné klíčky Kukuřičná mouka (hladká) Kvasnice – sušené Kyselina askorbová Kyselina citronová Methylparaben B-komplex Kyselina sorbová Kyselina benzoová Voda
Množství 60 g 480 g 75 g 75 g 15 g 15 g 5g 0,21 g 4g 1500 ml
Obr. 1: Miska se semisyntetickou dietou a housenkami obaleče jablečného (housenky se zažírají do diety a na povrch vytlačují trus)
11
Obr. 2: Chovná klícka pro dospělce obaleče
Obr. 3: Kádinka s voskovaným papírem s nakladenými vajíčky
2.2. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) přípravků s ovicidním účinkem Stanovení LC50 a LC90 přípravků s ovicidním účinkem se provádí na semenáčcích jabloní nebo přímo v polních podmínkách na zaizolovaných větvích jabloní, bez reziduí pesticidů. Větve jabloní délky cca 50cm s minimální násadou 5 plodů se ošetří ručním postřikovačem o objemu 0,5 - 1l a po oschnutí se zaizolují do rukávců z monofilu (dodávají prodejny entomologických potřeb). Každá testovaná koncentrace insekticidu se aplikuje na jednu větev. Zaizolovaná větev bez ošetření slouží jako neošetřená kontrola. Do rukávců se po oschnutí aplikovaného insekticidu vypustí vždy po 10 čerstvě vylíhlých dospělcích obaleče jablečného z laboratorního chovu, přičemž poměr pohlaví je 1:1, tj. 5 samců a 5 samic. Dospělci jsou ponecháni v rukávcích po dobu 5 dnů ke spáření a nakladení vajíček. Po 5 dnech dospělce z rukávců vypustíme. Maximální doba 5 dnů je nezbytná proto, aby nakladená vajíčka byla přibližně stejného stáří a pokus bylo možné vyhodnotit. Po 14 dnech jsou z větví odebrána jablka a listy s nakladenými vajíčky a v laboratoři je pod binokulárním mikroskopem vyhodnocena mortalita vajíček v jednotlivých variantách a v kontrolní variantě. Mortalita vajíček se počítá jako % zaschlých (nevylíhlých) vajíček z celkového počtu nakladených vajíček.
12
2.3. Stanovení LC50 a diskriminačních koncentrací (LC90) přípravků s larvicidním účinkem Pro stanovení LC50 a LC90 přípravků s larvicidním účinkem se používají dva typy testů, na housenkách L1 a housenkách L5 obaleče jablečného z laboratorního chovu. Pro testy na housenkách L1 se používají insekticidy rozpuštěné ve vodě, pro testy na housenkách L5 je možné použít insekticidy rozpuštěné ve vodě nebo účinné látky testovaných insekticidů rozpuštěné v acetonu nebo tetrahydrofuranu, podle rozpustnosti dané látky. Typ rozpouštědla pro ředění je zpravidla uveden v bezpečnostním listu, který poskytne společně s účinnou látkou výrobce. V případě, že pro testy na housenkách L5 není k dispozici účinná látka insekticidu, použije se pro testy insekticid rozpuštěný ve vodě. 2.3.1. Testy na housenkách L1 Test na housenkách L1 (Obr. 4) z laboratorního chovu se provádí s použitím kultivačních destiček pro tkáňové kultury (např. IWAKO, obr. 5). Semisyntetická dieta pro chov obaleče jablečného se nanese do otvorů testovacích destiček a na povrch diety je mikropipetou aplikována insekticidní jícha v objemu 100 μl roztoku o dané koncentraci. Do každého otvoru destičky se po oschnutí povrchu diety přenese pomocí štětečku jedna čerstvě vylíhnutá housenka (L1) obaleče jablečného. Jako kontrola slouží destičky s neošetřenou dietou. Pro každou koncentraci insekticidu, resp. neošetřenou kontrolu je třeba použít 20 až 24 housenek. Destičky se po introdukci housenek překryjí perforovanou průhlednou PVC folií a víčkem. Inkubace se provádí v klimatizovaném boxu při teplotě 25 °C a fotoperiodě 16L:8D. Vyhodnocení mortality housenek se provádí po vylíhnutí motýlů v kontrolní neošetřené variantě. Obr. 4: Housenky obaleče L1 instaru
Obr. 5: Inkubace housenek v kultivační destičce IWAKO
2.3.2. Topikální aplikace na housenky L5 Pro stanovení LC50 a LC90 přípravků na housenkách L5 (obr. 6) se používá metoda topikální aplikace insekticidu na housenky. Insekticidní jícha o dané koncentraci se aplikuje dávkovačem nebo mikropipetou v objemu 1 μl na dorsum housenky instaru L5 (obr. 7). Před aplikací insekticidní jíchy je třeba místo aplikace potřít štětečkem navlhčeným v acetonu, aby byla umožněna penetrace přípravku přes kutikulu. Každá koncentrace je testována na 20-25 housenkách. Po aplikaci jsou housenky umístěny do plastových misek s ruličkami vlnité lepenky (obr. 8). Každá miska představuje 1 variantu, tj. koncentraci přípravku, přičemž všechny housenky ošetřené stejnou koncentrací přípravku jsou umístěny do jedné společné
13
misky. Inkubace se provádí v klimatizovaném boxu při teplotě 25 °C a fotoperiodě 16L:8D. Vyhodnocení mortality housenek se provádí po vylíhnutí motýlů v kontrolní neošetřené variantě.
Obr. 6: Housenka obaleče L5 instaru
Obr. 7: Topikální aplikace na housenky L5
Obr. 8: Miska s ruličkami vlnité lepenky
2.4. Ukázka výsledků stanovení LC50 a LC90 přípravků s ovicidním účinkem S využitím metodických postupů popsaných v kapitolách 3.2. a 3.3. byly ve VÚRV, v.v.i stanoveny koncentrace LC50 a LC90 vybraných účinných látek insekticidů s ovicidním, ovo-larvicidním a larvicidním účinkem proti citlivému laboratornímu kmenu obaleče jablečného. Pro stanovení LC50 a LC90 byly vybrány účinné látky ovicidu Insegar 25 WP (fenoxycarb), ovo-larvicidů Dimilin 48 SC (diflubenzuron) a Nomolt 15 SC (teflubenzuron) a larvicidů Zolone 35 EC (phosalone) a Calypso 480 SC (thiacloprid). Pro fenoxycarb byly stanoveny LC50 a LC90 pouze na vajíčkách, pro diflubenzuron a teflubenzuron na vajíčkách, L1 a L5 housenkách a pro phosalone a thiacloprid pouze na L1 a L5 housenkách. Stanovené hodnoty LC50 a LC90 v ppm jsou uvedeny v tabulce č. 2. Tabulka 2: Stanovení LC50 a LC90 účinných látek insekticidů s ovicidním účinkem (fenoxycarb), ovo-larvicidním účinkem (diflubenzuron a teflubenzuron) a larvicidním účinkem (phosalone, thiacloprid) proti vajíčkům, L1 a L5 housenkám citlivého laboratorního kmene obaleče jablečného. Hodnoty LC50 a LC90 jsou uvedeny včetně hodnot konfidenčního intervalu (95% CI).
14
účinná látka
stádium
Počet koncentrací
Fenoxycarb
vajíčka
5
Diflubenzuron
vajíčka
4
L1
5
L5
5
vajíčka
5
L1
6
L5
8
L1
6
L5
5
L1
7
L5
7
Teflubenzuron
Phosalone
Thiacloprid
Rozsah intercept slope correlation LC50 koncentrací coefficient (95% CI) (ppm) 2-75 4,1683 1,2345 0,965 4,72 (1,33-8,91) 30-200 -1,6569 4,1240 0,983 41,13 (13,49-64,56) 0.14-3.4 6,5511 2,4695 0,987 0,24 (0,13-0,35) 86,4-1027 0,6899 1,8024 0,975 246,21 (165,96-371,54) 6-113 3,8571 0,9352 0,970 16,68 (7,94-26,92) 0,2-3,0 6,0353 3,0960 0,939 0,46 (0,20-0,74) 9-1638 3,2733 1,1252 0,972 34,24 (17,78-53,70) 2,4-24 3,5280 2,6748 0,897 3,55 (1,41-9,77) 175-2030 -4,3296 3,6037 0,967 388,06 (190,55-588,84) 0,2-4,0 5,2881 3,8010 0,965 0,84 (0,62-1,16) 10-1500 0,6356 2,1187 0,915 114,78 (41,21-281,84)
LC90 (95% CI) 51,51 (24,55-281,84) 84,13 (51,52-141,25) 0,78 (0,55-1,14) 1265,72 (707,95-4570,88) 391,24 (151,36-4265,79) 1,20 (0,75-2,63) 471,55 (309,03-870,96) 10,70 (5,75-30,90) 880,07 (575,44-1621,81) 1,83 (1,30-3,05) 462,11 (199,53-2398,83)
3. Testování rezistence polních populací obaleče jablečného 3.1. Testování rezistence k přípravkům s ovicidním účinkem Testování rezistence k přípravkům s ovicidním účinkem se provádí obdobně jako u testů s laboratorní populací (kapitola 2.2.) na semenáčcích jabloní nebo přímo v polních podmínkách na zaizolovaných větvích jabloní, bez reziduí pesticidů. Pro testy je třeba získat dospělce polní populace obaleče, u které chceme rezistenci testovat. Dospělce je možné odchytat do světelného lapače (obr. 9a). Lapač je třeba vyvěsit do koruny jabloně v sadu s výskytem populace obaleče s podezřením na rezistenci. Lapač se skládá z přenosné zářivkové lampy napojené na zdroj napětí (dodávají prodejny entomologických potřeb), plastového trychtýře a rukávce z monofilu. Lapač se ponechá v sadu přes noc a ráno se z rukávce odeberou exhaustorem nebo trubičkou o vnitřním průměru min. 7mm nachytaní dospělci obaleče. Termín odchytu dospělců v sadu a následně provádění experimentů je třeba přizpůsobit fenologii obaleče, tj. odchytávat dospělce v období mezi počátkem a vrcholem letové vlny, jednak pro získání vyrovnaného poměru pohlaví a jednak pro zajištění dosud nevykladených samic. Odchycení dospělci se umístí do přenosné klícky (obr. 9b) a transportují se do místa provádění testu rezistence. Další postup je obdobný jako je popsáno v kapitole 2.2. Výběr koncentrací testovaného insekticidu vychází z diskriminační koncentrace stanovené pro laboratorní citlivou populaci. Tato koncentrace je základem pro další ředění. Další testované koncentrace je třeba zvolit s ohledem na předpokládanou nižší citlivost testované populace ve srovnání s laboratorní, tj. volíme cca 2 koncentrace nižší a nejméně 2 vyšší než je diskriminační koncentrace. Obr. 9: Odchyt dospělců obaleče do světelného lapače (A) a jejich transport do přenosné klícky (B)
15
A
B
3.2. Testování rezistence k přípravkům s larvicidním účinkem Pro testování rezistence polních populací obaleče k přípravkům s larvicidním účinkem je možné použít oba typy testů, test na housenkách L1 i topikální aplikace insekticidů na housenky L5, jak je uvedeno v kapitole 2.3. Pro test na housenkách L1 je třeba odchytat v sadu dospělce obaleče, obdobně jako pro testy rezistence k ovicidům. Pro získání dostatečného množství vajíček pro testy je třeba zajistit dospělcům vhodné podmínky pro kladení, tj. simulovat co nejvíce podmínky v přírodě. Proto je třeba umístit po odchytu dospělce do klícky z prodyšného materiálu (nejlépe monofilu), v horní části překryté parafilmem (v nabídce firem dodávajících laboratorní potřeby) pro kladení vajíček. Na dno klícky je vhodné umístit na skleněnou nebo plastovou podložku vatu napuštěnou medovým roztokem (poměr 1:3 med:voda). Klícku s obaleči je třeba umístit do místnosti s přístupem přirozeného světla, protože obaleči se páří a kladou vajíčka při soumraku. Důležitou podmínkou je zajištění dostatečné vlhkosti v místnosti cca 60% RH. Kladení vajíček rovněž podpoří, pokud kolem klícky s dospělci rozmístíme větvičky jabloní (obr. 10). Parafilm s nakladenými vajíčky vyměňujeme po dvou dnech. Vajíčka je třeba pro zabránění kontaminace namočit na cca 2min do 3% roztoku formaldehydu. Poté parafilm s vajíčky opláchneme vodou, necháme oschnout a následně umístíme do kádinky s navlhčeným filtračním papírem na dně a překrytou perforovaným parafilmem. Kádinku s vajíčky umístíme nejlépe do klimatizovaného boxu s teplotou 25 °C a ponecháme do líhnutí vajíček (cca 4-5 dnů). V případě, že není k dispozici klimatizovaný box, je možné ponechat vajíčka v laboratoři, je však třeba zajistit, aby vajíčka do doby vylíhnutí nevyschla a pravidelně vlhčit filtrační papír v kádince. Další postup s vylíhnutými housenkami je popsán v kapitole 2.3.1. Obr. 10: Klícka pro kladení vajíček polní populace obaleče jablečného – simulace přírodních podmínek
16
Pro topikální aplikace insekticidů na housenky L5 je třeba odebrat přezimující housenky obaleče jablečného v sadech pomocí pásů z vlnité lepenky (obr. 11, 12). Pásy z vlnité lepenky šířky cca 30 cm a délky podle obvodu kmene stromu instalujeme na kmeny stromů v červenci ponecháme je v sadu až do doby sklizně jablek. Počet instalovaných pásů v sadu závisí na populační hustotě obaleče na dané ploše a pohybuje se od 50 do 100 pásů na plochu. Např. pokud je červivost na ploše nižší než 4%, je třeba pro získání dostatečného počtu housenek pro testy instalovat nejméně 100 pásů. Naopak při červivosti vyšší než 20%, stačí instalovat 50 pásů na plochu. Pásy instalujeme na stromy s dostatečnou násadou plodů a na odrůdy, které obaleč pro vývoj preferuje, např. Golden Delicious, Šampion, Idared. Housenky obaleče do pásů zalézají, když hledají úkryt ke kuklení (1. generace) a pro přezimování. Pásy s housenkami ze sadů odebereme po sklizni jablek a odvezeme do laboratoře. V laboratoři z pásů housenky vybereme a odstraníme mrtvé housenky nebo housenky s příznaky onemocnění a parazitce. Zdravé housenky umístíme po cca 30 ks do plastových krabiček s ruličkami nové vlnité lepenky. Krabičky s housenkami umístíme do klimatizovaného boxu s teplotou 6 °C a 60% RH a ponecháme je v boxu až do ledna, kdy začneme s experimenty. Před zahájením experimentů je třeba housenkám postupně zvyšovat teplotu v boxu, 14 dní před testy na 16 °C a 2 dny před experimenty krabičky s housenkami vyndáme z boxu a ponecháme je v laboratoři, kde budeme provádět topikální aplikace. Pro testy vybereme pouze zdravé housenky, před příznaků onemocnění. Další postup je uveden v kapitole 2.3.2. Obr. 11: Pás z vlnité lepenky na kmenu jabloně instalovaný pro odběr přezimujících housenek
Obr. 12: Přezimující housenka obaleče v pásu z vlnité lepenky
17
3.3. Výpočet koeficientu rezistence (resistance ratio) Koeficient rezistence (RR) charakterizuje stupeň rezistence testované populace k danému přípravku. Výpočet koeficientu rezistence se provádí na základě porovnání LC50 zjištěné u polní populace (LC50 polní) a LC50 stanovené na laboratorní populaci (LC50 lab) podle vzorce: RR = LC50 polní/LC50 lab.
4. Ukázka výsledků hodnocení rezistence obaleče jablečného 4.1. Vyhodnocení citlivosti a stupně rezistence polních populací obaleče jablečného k vybraným insekticidům Pro testy rezistence obaleče jablečného k insekticidům byly vybrány dvě lokality, Velké Bílovice a Praha-Ruzyně, s rozdílnou intenzitou ochrany proti obaleči jablečnému. Komerční sad na lokalitě Velké Bílovice byl vybrán z důvodu selhávání ochrany proti obaleči jablečnému v posledních letech a tedy podezření na rezistenci k aplikovaným insekticidům. Jedná se o intenzivně chemicky ošetřovaný sad jabloní v režimu integrované ochrany rostlin. Obaleč jablečný má na této lokalitě obvykle dvě generace za rok, přičemž druhá generace je ekonomicky významnější. Červivost při sklizni dosahuje na neošetřovaných plochách 6080%. Na intenzivně chemicky ošetřovaných plochách se červivost v posledních letech pohybovala od 5 do 30%. Populace obaleče jablečného pro testy byla odebírána na 80ha bloku jabloní, obklopeném poli a sady meruněk a broskvoní. Sad byl chemicky ošetřován organofosfáty (Zolone 35 EC a Reldan 40 EC), inhibitory tvorby chitinu (Dimilin 48 SC a Nomolt 15 SC) a juvenoidy (Insegar 25 WP). V posledních letech byly do ochrany zařazeny take neonikotinoidy (Mospilan 20 WP a Calypso 480 SC). V posledním desetiletí se počet aplikací proti obaleči pohyboval od 5 do 8 za sezónu. Druhá lokalita Praha-Ruzyně byla vybrána jako lokalita s očekávanou nízkou úrovní rezistence obaleče jablečného k insekticidům. Jedná se o experimentální sad jabloní VÚRV, v.v.i. Praha o velikosti 3ha. Na této lokalitě má obaleč jablečný zpravidla jednu generaci ročně v chladných letech a dvě neúplné generace v teplých letech. Na neošetřované kontrolní ploše dosahuje červivost při sklizni 20 – 30%. Do roku 1999 nebyl tento sad ošetřován chemickými insekticidy. V letech 1999 a 2000 byl v sadu proti obaleči aplikován Nomolt 15 SC s frekvencí postřiků 3 a 5 za sezónu. Od roku 2001 byla aplikována metoda dezorientace a attract and kill. U vzorků populace obaleče jablečného z lokality Praha-Ruzyně byla testována rezistence k přípravkům Dimilin 48 SC, Nomolt 15 SC a Zolone 35 EC pomocí topikálních aplikací na přezimující housenky odebírané z pásů z vlnité lepenky. Vzorky populace obaleče jablečného z lokality Velké Bílovice byly testovány rovněž na rezistenci k přípravkům Dimilin 48 SC, Nomolt 15 SC a Zolone 35 EC pomocí topikálních aplikací a také byly testovány na rezistenci 18
k přípravkům Dimilin 48 SC a Insegar 25 WP po aplikaci na nakladená vajíčka. Počet testovaných koncentrací byl ovlivněn množstvím odebraných housenek a nakladených vajíček pro experimenty a pohyboval se od 1 do 3. V tabulce č. 3 jsou prezentovány výsledky vyhodnocení rezistence vyjádřené pomocí koeficientu rezistence RR. Hodnoty LC50 a LC90 (a následně také RR) bylo možné stanovit pouze v případě, že byly testovány alespoň 2 koncentrace účinné látky insekticidu. Rozdíly hodnot LC50 stanovené pro testovanou populaci byly považovány za statisticky významné, pokud se nepřekrývaly s konfidenčním intervalem hodnot LC50 stanovených pro citlivou laboratorní populaci (Tabulka č. 2). Tabulka 3: Larvicidní a ovicidní účinnost vybraných účinných látek insekticidů aplikovaných topikální aplikace na housenky (L5) a před kladením vajíček (vajíčka) populací obaleče jablečného ze dvou lokalit Velké Bílovice (V4, V5) a Ruzyně (R3, R4) účinná látka fenoxycarb diflubenzuron
teflubenzuron phosalone
Počet populace Rozsah koncentrací koncentrací (ppm) 2 V5 25-75 2 V5 60-120 2 V4 120-360 3 R3 120-5100 2 R4 120-360 2 V4 110-270 2 R4 110-270 3 V4 700-2030 3 R3 350-1190
stádium
intercept
slope
correlation coefficient
LC50 (ppm)
LC90 (ppm)
RR
vajíčka vajíčka L5 L5 L5 L5 L5 L5 L5
-4,0362 -0,1568 -0,7164 1,6770 2,3183 -14,2668 -2,5672 -18,0681 -4,4004
4,9474 2,3001 2,2362 1,7131 1,4116 7,9243 3,6663 7,0682 3,2864
1,000 1,000 1,000 0,991 1,000 1,000 1,000 0,990 0,998
67,06 174,58 360,00 87,05 79,39 270,00 115,87 1835,04 725,09
121,76 629,74 1347,08 487,36 642,14 391,81 259,14 2785,85 1779,71
14,21 4,24 1,46 0,35 0,32 7,89 3,38 4,73 1,87
Z hodnot RR uvedených v tabulce č. 3 je zřejmé, že byla zjištěna cross-rezistence populace obaleče jablečného z lokality Velké Bílovice k fenoxycarbu (RR=14,21), teflubenzuronu (RR=7,89) a phosalonu (RR=4,73). Populace z lokality Praha-Ruzyně byla mírně rezistentní k phosalonu (RR=1,87) a teflubenzuronu (RR=3,38). Rezistence k diflubenzuronu aplikovaného na housenky L5 nebyla u vzorků z testovaných populací prokázána, protože hodnota LC50 stanovená pro housenky L5 populace z Velkých Bílovic se překrývala s konfidenčním intervalem LC50 pro citlivý laboratorní kmen a hodnoty LC50 stanovené pro housenky L5 z Prahy-Ruzyně ze dvou let byly dokonce nižší než LC50 pro citlivý laboratorní kmen (tabulka č. 2). Výsledky hodnocení rezistence byly vyjádřeny také graficky, a to vynesením hodnot mortality vajíček nebo L5 housenek testované polní populace do grafu závislosti mortality (probit) na koncentraci účinné látky insekticidu (log ppm), společně s výsledky probitové analýzy laboratorního kmene. V případě, že bylo pro experimenty odebráno málo housenek, byla testována pouze jedna koncentrace účinné látky insekticidu a hodnota mortality housenek byla vynesena do grafu jako jednotlivé body (body V5 v grafu č.1B-D a bod R4 v grafu 1D). Umístění bodů V5 v grafech ukazuje nižší larvicidní účinnost diflubenzuronu, teflubenzuronu a phosalonu na housenky L5 z Velkých Bílovic v roce 2005 ve srovnání s citlivým laboratorním kmenem. Naproti tomu umístění bodu R4 v grafu 1D naznačuje srovnatelnou účinnost phosalonu na housenky L5 z Prahy-Ruzyně v roce 2004 ve srovnání s laboratorním kmenem. Graf 1: Srovnání účinnosti vybraných účinných látek insekticidů proti citlivému laboratornímu kmenu a vzorkům populací obaleče jablečného ze dvou lokalit Velké Bílovice (V4, V5) a Ruzyně (R3, R4). (A) Ovicidní účinnost fenoxycarbu (Fe) a diflubenzuronu (De), (B) larvicidní účinnost diflubenzuronu, (C) larvicidní účinnost teflubenzuronu, (D) larvicidní účinnost phosalonu
19
5. Doporučení pro provádění monitoringu rezistence orgány státní správy nebo akreditovanými laboratořemi Pro účely monitoringu rezistence přírodních populací obaleče jablečného k insekticidům lze použít hodnoty LC50 účinných látek přípravků Zolone 35 EC, Dimilin 48 SC, Nomolt 15 SC, Insegar 25 WP a Calypso 480 SC, které byly stanoveny ve VÚRV, v.v.i. na citlivém laboratorním chovu obaleče jablečného. Hodnoty LC50 účinných látek přípravků a přepočtené hodnoty LC50 pro přípravky jsou uvedeny v tabulce č. 4. Pro testování polních populací je nejspolehlivější metodou z hlediska získání dostatečného množství materiálu pro pokusy metoda topikálních aplikací na housenky L5. Získání dospělců pro pokusy na vajíčkách a housenkách L1 vyžaduje určitou zkušenost a je komplikováno omezujícími faktory, jako je nízká plodnost polních populací v podmínkách laboratoře a podmínky počasí v krátkém časovém období, kdy je možné dospělce v přírodě odchytat.
Tabulka č. 4: Zaokrouhlené hodnoty LC50 a LC90 účinných látek (hodnoty tučně) a přípravků (hodnoty v závorce) v % stanovené na citlivém laboratorním kmenu obaleče jablečného
20
účinná látka
stádium
LC50 (%)
Fenoxycarb (Insegar 25 WP) Diflubenzuron (Dimilin 48 SC)
vajíčka
0,0005 (0,002) 0,004 (0,008) 0,00002 (0,00004) 0,02 (0,04) 0,002 (0,01) 0,00005 (0,0003) 0,003 (0,02) 0,0004 (0,001) 0,04 (0,1) 0,00008 (0,00002) 0,01 (0,002)
vajíčka L1 L5
Teflubenzuron (Nomolt 15 SC)
vajíčka L1 L5
Phosalone (Zolone 35 EC)
L1 L5
Thiacloprid (Calypso 480 SC)
L1 L5
LC90 (%) 0,005 (0,03) 0,008 (0,02) 0,00008 (0,0002) 0,1 (0,2) 0,04 (0,3) 0,0001 (0,0007) 0,05 (0,3) 0,001 (0,003) 0,09 (0,25) 0,0002 (0,00004) 0,05 (0,01)
6. Návrhy na antirezistentní strategie Antirezistentní strategie pro zabránění nástupu rezistence obaleče jablečného k insekticidům zahrnuje řadu opatření. Základem je dodržování pravidel integrované ochrany, tj. aplikace pesticidů pouze na základě monitoringu výskytu obaleče a překročení prahu škodlivosti, dále střídání přípravků s různým typem účinné látky, a to v jednom roce i mezi roky na větších plochách. Důležitá je zásada použití přípravků z jedné skupiny účinných látek maximálně 2x za sezónu. Přípravky s různým typem účinných látek jsou uvedeny v následujícím přehledu: • karbamáty (Insegar) • inhibitory syntézy chitinu (Dimilin, Nomolt, Alsystin) • organofosfáty (Zolone, Reldan-poněkud odlišný mechanismus účinku), směsné přípravky (Nurelle – organofosfát + pyretroid)pyretroidy (Decis, Alfametrin, Alimetrin, Cyper, Karate, Talstar, Vaztac, ale i Talstar nebo Trebon-poněkud odlišné mechanismy účinku) – tyto látky však nejsou povoleny pro ochranu v systému integrované produkce ovoce • neonikotinoidy (Mospilan, Calypso) • látky urychlující svlékání hmyzu (Integro) • mikrobiální přípravky (Biobit, přípravky na bázi CpGV-dosud neregistrovány) • přípravky s novými typy účinných látek (Steward) Preventivní metodou pro zabránění nástupu rezistence je metoda dezorientace založená na narušení sexuální komunikace obaleče plošnou aplikací syntetického feromonu. Tato metoda je z hlediska rizika nástupu rezistence bezpečná, protože dosud nebyla prokázána rezistence obaleče k feromonu. Další perspektivou jsou přípravky na bázi viru granulózy obaleče jablečného, jejichž registrace v ČR se v současné době připravuje. Ve světě již byla v laboratoři i v přírodních populacích prokázána rezistence obaleče jablečného k viru granulózy, je tedy třeba s těmito preparáty zacházet obdobně jako s chemickými přípravky a dodržovat střídání s jiným prostředky ochrany. Nepřímo má vliv na zabránění výskytu 21
rezistence také používání přípravků selektivních pro přirozené nepřátele škůdců. Podpora přirozených regulačních mechanismů umožňuje snížit potřebu použití chemických prostředků ochrany a v konečném důsledku tedy vede ke snížení rizika nástupu rezistence. Výsledky testování rezistence obaleče jablečného byly publikovány v časopise Journal of Economic Entomology za finančního přispění projektů MZe ČR 0002700603 a GA ČR 522/04/P181 (Stará J., Kocourek F.: Insecticidal Resistance and Cross-Resistance in Populations of Cydia pomonella (Lep.: Tortricidae) in Central Europe, Journal of Economic Entomology, 100: 1587-1595).
7. Použitá literatura: Abbott, W. S. 1925. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ. Entomol. 18: 265-267. Anonymus, 1974: Recommended Method for the Detection and Measurement of Resistance of Agricultural Pests to Pesticides. Tentative method for adults of the codling moth, Laspeyresia pomonella (L.) - FAO Method No. 11, FAO Plant Prot. Bull. 22 (5/6), 108111. Blomefield, T. 1994. Codling moth resistance: Is it here, and how do we manage it?. Deciduous Fruit Grower 44: 130-132. Charmillot, P. J., and D. Pasquier. 2002. Résistance du carpocapse Cydia pomonella aux insecticides: tests par application topique sur des larves diapausantes collectées en automne 2001. Revue suisse Vitic. Arboric. Hortic. 34: 247-251. Sauphanor, B., J. C. Bouvier, and V. Brosse. 1998. Spectrum of Insecticide Resistance in Cydia pomonella (Lepidoptera: Tortricidae) in South-eastern France. J. Econ. Entomol. 91: 1225-1231. Sauphanor, B., V. Brosse, J. C. Bouvier, P. Speich, A. Micoud, and C. Martinet. 2000. Monitoring resistance to diflubenzuron and deltamethrin in French codling moth populations (Cydia pomonella). Pestic. Manag. Sci. 56: 74-82. Sauphanor B., Bovin T., Beslay D., Bouvier J.C., 2002: Integrated management of insecticide resistance in French codling moth populations, Book of abstracts from 7th European congress of Entomol., October 7-13 2002, Thessaloniki, Greece, p. 161. Stará J., Kocourek F.: Insecticidal Resistance and Cross-Resistance in Populations of Cydia pomonella (Lep.: Tortricidae) in Central Europe, Journal of Economic Entomology, 100: 1587-1595. Waldner, W. 1993. Rückblick und Vorschau auf die Bekämpfung des Apfelwicklers. Obstbau-Weinbau 12: 355-357. Welter, S. C., L. Varela, and R. Freeman. 1991. Codling moth resistance to azinphosmethyl in California. Resist. Pest Manag. Newslett. 3: 12.
22
