METODIKA HODNOCENÍ REZISTENCE MERUNĚK K VIRU ŠARKY ŠVESTKY (PLUM POX VIRUS)
UPLATNĚNÁ METODIKA
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.
2008
Strana 2 z 22
Autoři:
Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Dr. Ing. Jaroslav Salava
Název:
Metodika hodnocení rezistence meruněk k viru šarky švestky (Plum pox virus)
Vydal:
Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6
Vydáno v elektronické podobě.
Vyšlo v roce:
2008
Vydáno bez jazykové úpravy.
Kontakt na autora:
[email protected]
Odborný oponent:
Ing. Ivan Oukropec, Zahradnická fakulta Lednice, MZLU Brno, 69142, Lednice
Oponent ze státní zprávy:
Ing. Ivan Branžovský, CSc., Ministerstvo zemědělství, Těšnov 17, 110 00, Praha 1
Autoři fotografii:
Jaroslav Polák, Jaroslav Salava a Tomáš Nečas
© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ISBN: 978-80-87011-82-9
Fotografie na obálce: List, plod a pecka meruňky s příznaky šarky Detail plodů meruňky na větvích hybridu rezistentního k PPV
Tato metodika vznikla za finanční podpory Ministerstva zemědělství České republiky a je výstupem řešení projektu MZE0002700603.
VÚRV, v.v.i.
Strana 3 z 22
Obsah
1. 2.
Cíl metodiky....................................................................................................................... 4 Vlastní popis metodiky....................................................................................................... 5 2.1. Umělá infekce hodnoceného rostlinného materiálu ................................................... 5 2.2. Hodnocení příznaků na listech a plodech................................................................... 6 2.3. Detekce PPV pomocí ELISA ................................................................................... 12 2.4. Detekce PPV pomocí IC-RT-PCR ........................................................................... 12 2.5. Biologický test na indikátorové rostlině Prunus tomentosa..................................... 15 2.6. Závěrečné stanovení stupně rezistence..................................................................... 15 3. Srovnání “novosti postupů“ ............................................................................................. 17 4. Popis uplatnění metodiky ................................................................................................. 18 5. Seznam použité související literatury............................................................................... 19 6. Seznam publikací, které předcházely metodice ............................................................... 21
VÚRV, v.v.i.
Strana 4 z 22
1. Cíl metodiky Cílem metodiky je vyhodnotit rezistenci odrůd, klonů, novošlechtění a hybridů meruňky k viru šarky švestky, Plum pox virus (PPV). Metodický postup zahrnuje přípravu hodnocených rostlin, jejich umělou infekci konkrétním kmenem PPV, hodnocení symptomů infekce, objektivní stanovení přítomnosti viru pomocí DAS-ELISA, stanovení relativní koncentrace virového proteinu v listech infikovaných rostlin semikvantitativní metodou ELISA (stanovení titru virového proteinu v listech), potvrzení přítomnosti viru v rostlinách pomocí IC-RT-PCR, případně pomocí biologického indikátoru při ověřování, zda se jedná o vysoký stupeň rezistence nebo o imunitu, a konečné vyhodnocení stupně rezistence hodnocených rostlin meruňky k viru.
VÚRV, v.v.i.
Strana 5 z 22
2. Vlastní popis metodiky Hodnocení rezistence rostlin meruňky k PPV je metodicky a časově náročný proces, který kombinuje objektivní imunochemické a molekulárně biologické postupy stanovení přítomnosti a koncentrace viru se subjektivním hodnocení intenzity a rozsahu příznaků na listech a plodech. S ohledem na vliv ročníkových faktorů a na různé mechanizmy rezistence je nutné nejméně tříleté hodnocení uměle infikovaného rostlinného materiálu.
2.1.
Umělá infekce hodnoceného rostlinného materiálu
Při hodnocení rezistence používáme odrůdy a klony meruňky z udržovacího šlechtění nebo novošlechtění a hybridy meruňky. Pro hodnocení rezistence meruněk k PPV provedeme umělou infekci rostlin meruňky očkováním, nebo roubováním testovaných rostlin na podnož infikovanou silně patogenním kmenem, nejlépe originálním kmenem PPV-M. Pro hodnocení rezistence je třeba použít silně patogenní kmen viru, při použití slabě patogenního kmenu může dojít v přírodních podmínkách k překonání rezistence silněji patogenním kmenem viru a výsledky hodnocení tak ztrácí spolehlivost. Očkováním, nebo roubováním na virem infikovanou náchylnou podnož nebo odrůdu docílíme stálý a rovnoměrný infekční tlak viru na hodnocenou rostlinu. Podle druhu testovaného materiálu volíme infikovanou podnož, přičemž nejvhodnější je stejný druh, tzn. meruňka. Hodnotíme-li jednotlivé rostliny potomstva křížení meruněk, použijeme jednoleté rostliny podnože meruňky MVA-2, která je k PPV náchylná a na infekci PPV reaguje zřetelnými difúzními skvrnami na listech (Obrázek č. 1). Roční rostliny podnože MVA-2 infikujeme kmenem PPV-M metodou “chip-budding“ (Obrázek č. 2) použitím virem infikovaných oček infekčního zdroje náchylné odrůdy meruňky vykazující silné příznaky šarky. Během dalšího vegetačního období ověříme přítomnost viru v rostlinách hodnocením příznaků na listech a sérologicky pomocí ELISA. Na šarkou infikované rostliny meruňky MVA-2 naočkujeme jednotlivé rostliny z hybridního potomstva meruněk ve třech opakováních, tzn. že od každého jedince máme tři rostliny. Rostliny hodnotíme po tři vegetační cykly. Pro hodnocení rezistence odrůd, klonů a hybridů meruněk použijeme jejich roubování ve třech až pěti opakováních na dvou až tříleté stromy odrůdy meruňky náchylné k PPV (Karola, Vegama), uměle infikované virem. Během čtyř vegetačních cyklů pak spolehlivě vyhodnotíme nejen příznaky na listech (4 vegetační cykly hodnocení), ale i příznaky na plodech a peckách (2 vegetační cykly) (viz Polák et al., 1997).
VÚRV, v.v.i.
Strana 6 z 22
Obrázek č. 1: Difúzní skvrny způsobené PPV na listech stromu meruňky
Obrázek č. 2: “Chip-budding“ (Forkertovo očkování) (zleva seřezávání oček, detaily seříznutého očka, naříznutá podnož a zavázané očko)
2.2.
Hodnocení příznaků na listech a plodech
Rostliny meruňky naočkované na podnoži MVA-2 infikované PPV, nebo naroubované na infikované k PPV náchylné odrůdě meruňky pěstujeme a hodnotíme v technickém izolátu (Obrázek č. 3). Hodnocení příznaků na listech provádíme dvakrát během vegetačního období. Poprvé hodnotíme příznaky viru na listech v době, kdy se na náchylné podnoži nebo odrůdě objeví zřetelné příznaky šarky, podruhé za čtyři týdny po prvním hodnocení. Hodnocení příznaků na listech provádíme minimálně po tři vegetační období, nebo cykly. V případě hodnocení rezistence odrůd, klonů nebo hybridů provádíme také hodnocení příznaků PPV na plodech v době začínajícího zrání plodů. Hodnocení příznaků na plodech provádíme po dvě vegetační období.
VÚRV, v.v.i.
Strana 7 z 22
Obrázek č. 3: Hodnocení rezistence hybridů meruněk v technické izolaci
Hodnocení intenzity a typu příznaků. Pro hodnocení příznaků šarky na listech a plodech meruňky používáme pětibodovou stupnici. Stupnice hodnocení příznaků šarky na listech: 0 = žádné příznaky 1 = velmi slabé difúzní skvrny, nebo kroužky na několika málo listech (1 – 5) (Obrázek č. 4) 2 = slabé difúzní skvrny a kroužky na několika listech (6 – 15) (Obrázek č. 5) 3 = středně silné difúzní skvrny a kroužky na větším počtu (cca 50%) listů (Obrázek č. 6) 4 = velmi silné difúzní skvrny a kroužky na většině listů, deformace listů (Obrázek č. 7) Stupnice hodnocení příznaků šarky na plodech: 0 = žádné příznaky 1 = velmi slabé difúzní skvrny na malém počtu plodů (do 15%), 1 – 2 na jednom plodu (Obrázek č. 8) 2 = slabé difúzní skvrny nebo kroužky na menším počtu plodů (15 – 30%) (Obrázek č. 9) 3 = středně silné difúzní skvrny a kroužky na větším počtu plodů (25 – 50%) (Obrázek č. 10) 4 = silné difúzní skvrny a kroužky na většině, nebo všech plodech, malformace plodů. Malformace plodů a příznaky šarky na všech, nebo většině plodů jsou rozhodujícím kritériem pro zařazení do stupně hodnocení 4. Intenzita difuzních skvrn a kroužků může být přitom nižší než v případech, kdy se malformace plodů nevyskytují. (Obrázek č. 11) Je možno použít i mezistupně hodnocení (0-1, 1-2, 2-3, 3-4), v tom případě získáme devítibodovou stupnici.
VÚRV, v.v.i.
Strana 8 z 22
Obrázek č. 4: Listy meruňky se slabým zesílením žilek nebo velmi slabými difúzními skvrnami a kroužky
Obrázek č. 5: Listy meruňky se slabými difúzními skvrnami a kroužky
VÚRV, v.v.i.
Strana 9 z 22
Obrázek č. 6: Listy meruňky se středně silnými difúzními skvrnami a kroužky
Obrázek č. 7: Listy meruňky s velmi silnými difúzními skvrnami a kroužky, deformace listů
VÚRV, v.v.i.
Strana 10 z 22
Obrázek č. 8: Plody meruňky s velmi slabými difúzními skvrnami
Obrázek č. 9: Plody meruňky se slabými difúzními skvrnami a kroužky
VÚRV, v.v.i.
Strana 11 z 22
Obrázek č. 10: Plody meruňky, odrůdy náchylné k PPV, silné difúzní skvrny a kroužky.
Obrázek č. 11: Plody meruňky, hybridu silně náchylného k PPV, malformace a difúzní skvrny.
VÚRV, v.v.i.
Strana 12 z 22
2.3.
Detekce PPV pomocí ELISA
Přítomnost viru v hodnocených rostlinách a stromech meruňky ověřujeme objektivní diagnostickou metodou pomocí ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Pro sérologické testování odebíráme listy s příznaky šarky, listy bez příznaků odebíráme jen v případě, že na testované odrůdě, stromu , resp. výhonu žádné příznaky nejsou. V tom případě odebíráme starší listy ze středu výhonů. Průměrný vzorek připravíme ze šesti listů odebraných na různých místech testovaného jedince. 0,2 g listového pletiva homogenizujeme v poměru 1:20, resp. ve 4 ml v extrakčního pufru PBS (fysiologický roztok pufrovaný fosfátem), pH 7,2 s přísadami 0,05% Tween 20, 2% PVP (polyvinylpyrrolidon) a 0,2% vaječného albuminu v polyetylenových sáčcích s použitím ručního nebo elektrického homogenizátoru. Pro stanovení PPV pomocí DAS-ELISA (Adams, 1978) použijeme komerční ELISA kit (např. fy Bioreba nebo Loewe). IgG a IgG konjugovaných s alkalickou fosfatázou ředíme podle návodu výrobce. Do jedné jamky ELISA desky pipetujeme 0,2 ml homogenizovaného vzorku. Pro testování jednoho vzorku použijeme dvě jamky mikrotitrační destičky. Hodnoty absorbance měříme na fotometru pro ELISA při 405 nm. Hodnocení relativní koncentrace viru pomocí semikvantitativní ELISA (stanovení titru viru v listech) Při stanovení relativní koncentrace viru v listech hodnocené odrůdy, klonu, novošlechtění a hybridu meruňky pomocí ELISA připravíme vzorek stejným postupem jako pro stanovení viru. Získaný vzorek, homogenát listů v extrakčním pufru s přísadami, ředíme aritmetickou řadou (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 atd.) čistým extrakčním pufrem bez přísad. V takto získané řadě zředění vzorku provedeme ELISA test a zjistíme hodnoty absorbance. Relativní koncentraci viru šarky švestky, titr viru ve vzorku, zjistíme jako ředění vzorku s hodnotou absorbance 0,04. Hodnota absorbance negativní kontroly (vzorku ze zdravé rostliny) by měla být 0,01 nebo nižší. Relativní koncentrace viru je převrácenou hodnotou konečného zředění vzorku s hodnotou absorbance 0,04.
2.4.
Detekce PPV pomocí IC-RT-PCR
Odběr vzorků Správný odběr vzorků je kritický pro molekulární detekci viru šarky švestky. Jestliže jsou přítomny listy s typickými příznaky, tak by měly být odebrány. U rostlin bez příznaků standardní vzorek odebereme ze šesti výhonů, po jednom listu odebraném ze střední části každého výhonu. Vzorky odebíráme během měsíce června, později klesá obsah viru v listech. Rostlinný materiál přednostně vybíráme z vnitřní části koruny stromů. Vzorky listů mohou být před zpracováním skladovány ve 4oC ne však po dobu delší než 7 dní. Příprava vzorků pro testování Navážíme 1 g rostlinného materiálu jako průměrný vzorek ze šesti listů, nařežeme ho na malé kousky a vložíme do vhodných plastikových sáčků. Přidáme 20 objemů extrakčního pufru (Cambra et al., 1994) a vzorek rozdrtíme pomocí ručního homogenizátoru Homex 6 (Bioreba) nebo malým ručním válečkem. Extrakční pufr se skládá z fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (phosphate-buffered saline, pH 7,2 - PBS) (viz. Používané pufry), doplněného 2% polyvinylpyrrolidonem (PVP-10) a 0,2 % sodium diethyl dithiokarbamátem (DIECA). Vzorky pro molekulární testy připravujeme v plastikových sáčcích individuálně.
VÚRV, v.v.i.
Strana 13 z 22
Imunopoutání (immunocapture, IC) (Wetzel et al., 1992) Připravíme ředění (1 µg/ml) polyklonálních nebo monoklonálních protilátek (Loewe nebo Bioreba) specifických pro PPV v karbonátovém pufru s pH 9,6 (viz. Používané pufry). Naředěné protilátky rozdělíme po 100 µl do Eppendorfových zkumavek. Inkubujeme 3 hodiny při 37oC. Zkumavky vypláchneme dvakrát 150 µl sterilního promývacího pufru (viz. Používané pufry). Odstředěním (5 min při 13 000 ot. min-1) vyčistíme 100 µl dříve získaného rostlinného extraktu (viz. Příprava vzorků pro testování). Supernatant použijeme k imunopoutání v potažených Eppendorfových zkumavkách (2 hod při 37oC) (Wetzel et al., 1992). Na závěr vypláchneme třikrát Eppendorfovy zkumavky jako v předchozím kroku. Amplifikace pomocí RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction) Detekce PPV s primery P1 a P2 podle Wetzel et al. (1991): Sekvence primerů: P1: 5´- 3´ ACC GAG ACC ACT ACA CTC CC P2: 5´- 3´ CAG ACT ACA GCC TCG CCA GA Součástí reakční směsi (µl) jsou: H2O 15,55; 10x Taq Polymerase Buffer 2,5; 25 mM MgCl2 1,5 (1,5 mM); 4% Triton X-100 2 (0,3%), 25 µm P1 (1 µm); 25 µm P2 (1 µm); 10 U µl-1 AMV 0,1; 5 U µl-1 Taq Polymerase 0,1; do celkového objemu 25 µl. Přidáme 25 µl reakční směsi do vypláchnutých zkumavek. Podmínky pro RT-PCR: 42 oC 45 min; 92 oC 2 min; 40 cyklů (92 oC 30 vteřin, 60 oC 30 vteřin, 72 oC 1 min); 72 oC 10 min; 4oC až do vyjmutí vzorků z teplotního cykleru. Elektroforéza produktů PCR Připravíme 2% agarózový gel v 0,5x TAE pufru (viz. Používané pufry). Na parafilmu vytvoříme kapky nanášecího pufru (viz. Používané pufry) o objemu přibližně 3 µl, přidáme 20 µl produktů PCR, před nanášením pomalu promícháme pipetou. Produkty včetně pozitivní a negativní kontroly naneseme do jamek v gelu. Do první jamky na gelu zařadíme DNA 100 bp marker. Elektroforézu provádíme 20 minut při 120 V (střední vanička na gel: 15x10 cm) nebo 40 minut při 160 V (velká vanička: 15x25 cm) v 0,5x TAE pufru. Pak gel ponoříme na 20 minut do roztoku ethidium bromidu (0,5 µg ml-1). Amplifikované DNA produkty zviditelníme na UV transiluminátoru, kde pozorujeme specifický amplikon dlouhý 243 bp (Obrázek č. 12).
VÚRV, v.v.i.
Strana 14 z 22
M
1
2
243 bp
Obrázek č. 12: Ukázka výsledků detekce PPV pomocí IC-RT-PCR s primery P1 a P2. Dráhy: 1-pozitivní kontrola, 2-negativní kontrola 1 (RNA hostitelské rostliny) a M-velikostní standard GeneRulerTM 100bp DNA Ladder (Fermentas Life Sciences, Litva)
Purifikace virové DNA pomocí RNeasy Plant Mini Kit (kat. č. 74904, Qiagen GmbH, Hilden, SRN) Jako vzorek použijeme 200 µl rostlinného extraktu (viz. Příprava vzorků pro testování). Vzorek intenzivně promícháme s 350 µl pufru RLT. Lyzát přímo pipetujeme do centrifugační kolonky QIA shredder (fialová) umístěné v 2 ml jímací zkumavce a centrifugujeme 2 minuty při maximálních otáčkách. Supernatant, který protekl kolonkou, opatrně přeneseme do nové mikrozkumavky bez porušení sedimentu tvořeného zbytky buněk v jímací zkumavce. V následných krocích používáme pouze tento supernatant. K vyčištěnému lyzátu přidáme 0,5 objemu 96% ethanolu a hned promícháme pipetou. Necentrifugujeme! Bez prodlení pokračujeme následujícím krokem. Vzorek včetně sraženin, které se mohou tvořit, přeneseme do RNeasy mini kolonky (růžová) umístěné ve 2 ml jímací zkumavce. Pomalu zavřeme zkumavku a centrifugujeme 15 vteřin při 8 000 g. Vylijeme obsah jímací zkumavky a zkumavku vyhodíme. Kolonku RNeasy přeneseme do nové 2 ml jímací zkumavky. Do kolonky RNeasy pipetujeme 500 µl pufru RPE. Pomalu zavřeme zkumavku a odstřeďujeme 15 vteřin při >8 000 g, aby se kolonka promyla. Vylijeme obsah jímací zkumavky. Přidáme dalších 500 µl pufru RPE do kolonky RNeasy. Pomalu zavřeme zkumavku a centrifugujeme 2 minuty při >8 000 g, aby se vysušila silikagelová membrána RNeasy. Okamžitě pokračujeme následujícím krokem, aby se vyloučila jakákoliv možnost vzájemné kontaminace pufrem RPE. Kolonku RNeasy umístíme do nové 2 ml jímací zkumavky a vyhodíme starou jímací zkumavku i s jejím obsahem. Centrifugujeme při maximálních otáčkách 1 minutu. K vymytí přeneseme kolonku RNeasy do nové 1,5 ml zkumavky. Na silikagelovou membránu kolonky
VÚRV, v.v.i.
Strana 15 z 22
RNeasy pipetujeme 50 µl vody RNeasy-free. Pomalu uzavřeme zkumavku a centrifugujeme 1 min při >8 000 g, aby došlo k vymytí RNA. Používané pufry: Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) pH 7,2: NaCl 8g, KCl 0,2g, Na2HPO4x12 H2O 2,9g, destilovaná voda 1l. Karbonátový pufr pH 9,6: Na2CO3 1,59 g, NaHCO3 2,93 g, destilovaná voda 1l. Promývací pufr (PBS, pH 7,2-7,4 s 0,05% Tween 20): NaCl 8g, KCl 0,2g, Na2HPO4x12 H2O 2,9g, Tween 20 - 500 µl, destilovaná voda 1l. 50x TAE pufr: Tris 242 g, 0,5 M Na2EDTA pH 8,0 100 ml, ledová kyselina octová 57,1 ml, destilovaná voda do 1l. Nanášecí pufr: 0,10% bromfenolová modř, 0,1% xylen cyanol FF, 0,2% oranž G, 62,5 µM EDTA (pH 8,0), 20% Ficoll 400, sterilní destilovaná voda do 10 ml.
2.5.
Biologický test na indikátorové rostlině Prunus tomentosa
Rostliny, které jsou po třetím růstovém cyklu bez příznaků šarky a výsledky testování pomocí DAS-ELISA a RT-PCR jsou negativní (slabé příznaky, nízká relativní koncentrace viru a pozitivní reakce RT-PCR však mohly být zjištěny v prvním, případně druhém růstovém cyklu) testujeme pomocí biologického indikátoru Prunus tomentosa. Očka ze zdravé rostliny P. tomentosa očkujeme na výhon testované meruňky metodou “chip-budding“. Jedno očko umístíme na bazální část testovaného stromu blízko infikované podnože, zatímco druhé očko na horní část výhonu. Tento způsob testu dovoluje zjistit migraci PPV na krátkou vzdálenost (z buňky do buňky) nebo na dlouhou vzdálenost (cévami). Na listech výhonů P. tomentosa rostoucích z oček zjišťujeme příznaky šarky. Pokud se žádné příznaky neobjeví ani další vegetační období, je hodnocený genotyp meruňky k PPV imunní. Pokud se na P. tomentosa objeví příznaky šarky, je hodnocený genotyp k šarce rezistentní, virus v rostlině migruje na krátkou nebo delší vzdálenost.
2.6.
Závěrečné stanovení stupně rezistence
Závěrečné stanovení stupně rezistence analyzovaných rostlin dané odrůdy, klonu, novošlechtění nebo hybridu meruňky je syntézou hodnocení příznaků PPV na listech, případně na plodech, semikvantitativního hodnocení relativní koncentrace viru v listech pomocí metody ELISA, hodnocení přítomnosti viru pomocí RT-PCR a biologického indikátoru ve čtvrtém růstovém cyklu v případě rozhodovaní, zda se jedná o vysoký stupeň rezistence nebo o imunitu. Hodnocené genotypy meruňky zařazujeme do skupin: 4 3 2 1 0
velmi náchylný náchylný středně rezistentní rezistentní (se zeslabovacím mechanismem přítomnosti viru a příznaků – “silencing“) imunní (absence viru v hodnocené rostlině, odrůdě)
VÚRV, v.v.i.
Strana 16 z 22
Orientační tabulka závěrečného stanovení rezistence meruněk k PPV: Příznaky PPV Relativní koncentrace RT-PCR P. tomentosa Výsledek hodnocení na listech na plodech (titr ELISA) ___________________________________________________________________________ 0 0 0 0 0 imunní -2 + + rezistentní 0 až 1 0 až 1 0 až 10 2 2 10-3 + nt středně rezistentní 3 3 10-4 + nt náchylná -5 4 4 10 + nt velmi náchylná Vysvětlivky: nt = není testováno Poznámky: Vzhledem k tomu, že jsou hodnoceny tři vegetační cykly, nemusí být v jednotlivých letech dosaženy shodné výsledky hodnocení příznaků a relativní koncentrace viru. Pokud je v jedné ze třech kategorií - příznaky na listech, příznaky na plodech a relativní koncentrace viru v listech - dosaženo hodnocení odlišné o jeden stupeň, např. příznaky na listech, plodech i koncentrace viru odpovídají stupni středně rezistentní, avšak v jednom vegetačním cyklu hodnocení příznaků na listech nebo relativní koncentrace viru odpovídaly kategorii náchylná, nebude tato odlišnost brána v úvahu. Bude-li však “horší“ hodnocení dosaženo ve dvou kategoriích, např. silnější příznaky na plodech a vyšší koncentrace viru v listech, byť v jediném roce, přičemž příznaky na listech budou ve všech třech hodnoceních odpovídat kategorii středně rezistentní, bude hodnocená odrůda zařazena jako náchylná k PPV.
VÚRV, v.v.i.
Strana 17 z 22
3. Srovnání “novosti postupů“ Virus šarky švestky způsobuje hospodářsky nejvýznamnější virovou chorobu meruněk. Krátkodobá ochranná opatření proti viru šarky zahrnují odstranění nemocných stromů a pěstování certifikovaného materiálu. Chemická ochrana vůči hmyzím přenašečům je z důvodu neperzistentního přenosu PPV neúčinná. Proto je jediným účinným řešením šlechtění a pěstování nových rezistentních odrůd. Studium rezistence meruněk k viru šarky švestky započalo v Řecku, kde byly zjištěny dvě odrůdy meruňky, Mari de Cenad a Stella rezistentní k šarce (Syrgianidis, 1979). Karayiannis (1988) a Karayiannis a Mainou (1993) objevili další odrůdy meruňky amerického původu rezistentní k šarce. Hodnocení úrovně rezistence k PPV bylo prováděno pozorováním příznaků na listech a plodech přirozeně infikovaných stromů. Dosba et al. (1992) testovali ve Francii řadu kultivarů a hybridů meruňky na rezistenci k PPV. Stromy inokulovali virem šarky švestky buď očkováním pomocí metody “chip-budding“, nebo přenosem viru mšicemi, standardní postup hodnocení nebyl publikován. Virologický program hodnocení rezistence meruněk k viru šarky švestky začal v České republice v roce 1991 (Polák et al., 1995a). Čtyřleté výsledky hodnocení odrůd a hybridů meruněk na rezistenci k PPV byly publikovány (Polák et al., 1997). Podrobný postup hodnocení rezistence, na základě kterého by bylo možno odrůdy a hybridy meruňky hodnotit, nebyl zveřejněn. Hodnocení rezistence meruněk k PPV probíhá i v zahraničí, např. ve Francii (GuilletBellanger a Audergon, 2001), ve Španělsku (Moustafa et al., 2001), v Itálii (Bazzoni et al., 2008). Metody hodnocení rezistence jsou zdokonalovány, výsledky dosažené na jednotlivých pracovištích a v jednotlivých státech jsou srovnávány. Odrůdy v současné době pěstované i nové odrůdy introdukované ze zahraničí včetně novošlechtění je třeba charakterizovat z hlediska náchylnosti, nebo rezistence k viru šarky švestky. Dosud však nebyl v České republice ani v zahraničí vypracován a publikován žádný původní metodický postup hodnocení rezistence meruněk k viru šarky švestky, podle které by bylo možno na různých pracovištích rezistenci jednotně hodnotit a dosažené výsledky srovnávat. Proto jsme vypracovali původní standardní postup hodnocení rezistence. V rámci řešení výzkumného záměru MZE0002700603 odboru rostlinolékařství VÚRV, v.v.i., jehož součástí je výzkum problematiky rezistence meruňky k PPV předkládáme nový postup, metodiku hodnocení rezistence meruněk k viru šarky švestky.
VÚRV, v.v.i.
Strana 18 z 22
4. Popis uplatnění metodiky Metodika hodnocení rezistence meruněk k viru šarky švestky je určena pro Ministerstvo zemědělství ČR, Státní rostlinolékařskou správu, šlechtitele a školkaře jako konkrétní metodický postup pro charakterizaci českých i zahraničních odrůd a klonů meruňky, pro charakterizaci nových novošlechtění a hybridů, pro výběr zdrojů rezistence pro šlechtění odolných odrůd. Vypracovaný metodický postup hodnocení rezistence bude rovněž uplatněn ve výzkumu dědičnosti rezistence meruněk k PPV a vývoji DNA markerů rezistence meruněk k PPV.
VÚRV, v.v.i.
Strana 19 z 22
5. Seznam použité související literatury Adams A.N., 1978: The detection of plum pox virus in Prunus species by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Ann. Appl. Biol. 90: 215-221. Albrechtová L., Karešová R., Pluhař Z., Balcarová, E., 1986: ELISA method used for the evaluation of the resistance of plum cultivars to plum pox virus. Sbor. Ref. X. Čs. Konf. Ochr. Rostl., Brno: 203-204. Audergon J.M., Morvan G., Dicenta I., Chastelliére G., Karayiannis I., 1995: A method to determine the susceptibility of apricot cultivars to plum pox virus. Acta Horticult. 384: 575579. Bazzoni A., Didonna A., Savino V., Palmisano F., 2008: Preliminary results of trials evaluating the behaviour to Plum pox virus of different apricot crosses. Acta Horticult.781: 295-302. Cambra M., Asensio M., Gorris M.T., Pérez E., Camarasa E., García J.A., Moya J.J. LópezAbella D., Vela C., Sanz A., 1994: Detection of plum pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 24: 569577. Dosba F., Orliac S., Duttranoy F., Maison P., Massonié G., Audergon J.M., 1992: Evaluation of resistance to plum pox virus in apricot trees. Acta Horticult. 309: 211-220. Guillet-Bellanguer I., Audergon J.M., 2001: Inheritance of the Stark Early Orange apricot cultivar resistance to Plum pox virus. Acta Horticult. 550: 111-115. Karayiannis I., 1988: Susceptibility of apricot cultivars to Plum pox virus in Greece. Acta Horticult. 235: 271-274. Karayiannis I., Mainou A., 1993: Plum pox resistance in apricots. Conference on Plum Pox. EPPO, Bordeaux, 5. – 8.10.1993, 64-65: abstr.. Komínek P., Bittóová M., Polák J., 1996: To the differentiation of Plum pox virus strains isolated in the Czech Republic. Middle European Meeting ´96 on Plum Pox, Budapest, 2 – 4 October 1996: 43, abstr.. Moustafa T.A., Badenes M.L., Martínez-Calvo J., Llácer G., 2001: Studies on Plum pox (sharka) resistance in apricot. Acta Horticult. 550: 117-120. Polák J., Oukropec I., Chod J., Krška B., Jansta Z., Pívalová J., 1995a: Virological programme in breeding of apricots for resistance to plum pox virus in the Czech Republic. Acta Horticult. 384: 581-585. Polák J., Komínek P., Jokeš M., Oukropec I., Krška B., 1995b: The evaluation of resistance of apricots to plum pox virus by ELISA and ISEM. Acta Horticult. 386: 285-289. Syrgianidis G., 1979: Research on the sensitivity of apricot varieties to Sharka (Plum Pox) virus disease. Agric. Res. III: 42-48.
VÚRV, v.v.i.
Strana 20 z 22
Wetzel T., Candresse T., Ravelonandro M., Dunez J.,1991: A polymerase chain reaction assay adapted to plum pox virus detection. Journal of Virological Methods 33: 355-365. Wetzel T., Candresse T., Macquaire G., Ravelonandro M., Dunez J. 1992: A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox virus detection. Journal of Virological Methods 39: 27-37.
VÚRV, v.v.i.
Strana 21 z 22
6. Seznam publikací, které předcházely metodice Lalli D.A., Abbott A.G., Zhebentyayeva T.N., Badenes M.L., Damsteegt V., Polák J.; Krška B., Salava, J. 2008: A genetic linkage map for an apricot (Prunus armeniaca L.) BC1 population mapping plum pox virus resistance. Tree Genetics and Genomes 4: 481-493. Polák J., Oukropec I., Komínek P., Krška B., Bittóová M., 1997: Detection and evaluation of resistance of apricots and peaches to plum pox virus. J. Plant Dis. Protect. 104: 466-473. Polák J., Komínek P., Salava J., Krška B., Sasková H., 2002: Preliminary studies on the inheritance of resistance to Plum pox virus (PPV) in aprocots. Plant´s Health 6:28-30. Polák, J.; Krška, B.; Pívalová, J.; Svoboda, J., 2005: Apricot cultivars ´Harlayne´ and ´Betinka´ were proved to be highly resistant to the six different strains and isolates of Plum pox virus (PPV). Phytopathologia polonica 36: 53-59. Polák J., Komínek P., Krška B., Pívalová J., 2008: Durable resistance of apricot cultivars Harlayne and Betinka to six different strains of Plum pox virus. J. Plant Pathol. 90 (1, Supplement): 37-40. Salava J., Wang Y., Krška B., Polák J., Komínek P., Miller W. R., Dowler L. W., Reighard L. G., Abbott G. A. 2002: , Identification of molecular markers linked to resistance of apricot (Prunus armeniaca L.) to Plum pox virus. Journal of Plant Diseases and Protection 109: 64-67. Salava J., Abernathy D., Krška B., Polák J., Abbott A., 2004: Mapping of resistance genes to Plum pox virus. In: Proceedings of International Symposium “Advances in Molecular Biology: Methods for Genotype Identification, Plant Breeding and Product Control“, Prague, November 3, 2004: 39-42. Salava, J.; Polák, J.; Krška, B., 2005a: Oligogenic inheritance of resistance to Plum Pox Virus in apricots. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding 41 (4): 167-170. Salava, J.; Abernathy, D.; Polák, J.; Krška, B., Abbott, 2005b: A.G. Identifikace DNA markerů rezistence meruněk k viru šarky švestky a jejich využití ve šlechtění. In: Seminář "Nové metody ve studiu a šlechtění ovocných dřevin", Lednice, 25. 02. 2005, s. 10-14. Salava J., Polák J., Krška B., Lalli D.A., and Abbott A.G., 2007: Construction of a genetic map for apricot with molecular markers and identification of markers associated with Plum pox virus resistance. Acta Horticulturae 738: 657-661 Salava J., Polák J., Krška B., 2008a: Preliminary results on inheritance of resistance to Plum pox virus in apricot cv. Harlayne. J. Plant Pathol. 90 (1, Supplement): S1.79-1.80. Salava J., Polák J., Krška B., 2008b: Two-gene resistance to Plum pox virus in apricot. Acta Horticult., 781: 303-307.
VÚRV, v.v.i.
Strana 22 z 22
VÚRV, v.v.i.
